CN119736228A - 一种化学酶级联体系合成手性1，3-二取代四氢异喹啉的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化学酶级联体系合成手性1，3‑二取代四氢异喹啉的方法，属于生物工程技术领域。本发明建立了一种酶级联催化制备手性1,3‑二取代四氢异喹啉的方法，将简单的非手性酮作为原料，通过筛选获得的转氨酶生成手性胺，再经B‑N环化反应得到手性亚胺，最后经亚胺还原酶生成1，3‑二取代四氢异喹啉。该方法产率高，最高可接近100％，且具有优异的非对映选择性与对映选择性，de值与ee值均接近99％，具有很好的应用价值与前景。

Description

一种化学酶级联体系合成手性1，3-二取代四氢异喹啉的方法

技术领域

本发明涉及一种化学酶级联体系合成手性1，3-二取代四氢异喹啉的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

四氢异喹啉(THIQ)生物碱是目前规模最大的天然产物之一，在药物研发中占有不可或缺的地位。近几十年来THIQ类天然产物已被深入研究，其具有广泛的结构多样性和生物活性。

在这些不同的THIQ中，至少有两个手性碳中心的1,3-二取THIQ是一种特殊的THIQ生物碱，区别于人们普遍认为通过醛和芳香族氨基酸衍生的芳基乙胺之间的Pictet-Spengler(P-S)反应形成的四氢异喹啉，是由醋酸-丙二酸途径形成的聚酮类化合物进一步反应生成，该途径涉及尚未确定的聚酮合成酶和其它酶。然而，1，3-二取代THIQ不寻常的取代模式，特别在C1和C3位置存在甲基，由于难以通过生物催化在芳香氨基酸预安装α-甲基以构建C3甲基和NCS底物限制乙醛构建C1甲基，这些重要化合物通过传统的P-S路径存在巨大的障碍。

尽管它们的生物合成仍然具有挑战性，但许多开创性的化学合成方法已经被开发出来构建这些有价值的手性结构，包括过渡金属催化的1,3-二取代异喹啉的不对称还原、手性3,4-二氢异喹啉的不对称亲核加成、手性四氢异喹啉的烷基化反应、手性苯乙胺衍生物与醛类之间的P-S反应，手性酰化苯乙胺Bischler-Napieralski(B-N)/还原级联反应和钯催化三组分Catellani/金催化环化/还原级联反应。尽管这些策略是有效的，但它们往往依赖于具有预先构建手性中心的复杂底物、重金属催化剂、易燃和危险的氢气，以及高温和高压的恶劣条件。因此，开发一种新颖的、高效的、绿色的方法，从简单的非手性底物构建手性1,3-二取代THIQ是非常可取的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明设计了一种非对映和对映选择性模块化合成1，3-二取代THIQ的方法(图1)。

本发明提供了一种表达转氨酶的重组大肠杆菌，以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)为宿主，表达a1～a9任一所示的转氨酶：

a1、来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)的转氨酶ArR-TA，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；

a2、来源于紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)的转氨酶CV-TA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

a3、来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)的转氨酶ArRmut-11，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示；

a4、来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的转氨酶AT-TA，其氨基酸序列如SEQID NO.4所示；

a5、来源于人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)的转氨酶OA-TA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

a6、来源于鲁杰氏菌(Ruegeria sp.)TM1040的转氨酶RS-TA，其氨基酸序列如SEQID NO.6所示；

a7、来源于异物外瓶霉(Exophiala xenobiotica)的转氨酶EX-TA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

a8、来源于副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia phymatum)的转氨酶PP-TA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

a9、来源于河流孤菌(Vibrio fluvialis的转氨酶VF-TA，其氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。

在一种实施方式中，以pET系列质粒为表达载体；所述pET系列质粒包括但不限于pET-21b(+)。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pET-21b(+)为表达载体，表达编码SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示转氨酶的基因。

本发明还提供了所述重组大肠杆菌制备的转氨酶蛋白。

在一种实施方式中，所述转氨酶蛋白的制备方法包括：将表达所述转氨酶的重组大肠杆菌接种至培养基中，培养菌株至对数生长期，诱导，收集菌体，重悬，破碎，离心收集裂解液，纯化蛋白。

在一种实施方式中，所述步骤：将所述重组大肠杆菌接种至LB培养基，20-40℃培养10-12h，转接至2YT培养基，20-40℃培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8左右，降温至15-25℃，加入终浓度为0.05-0.5mM的IPTG诱导10-20h，收集菌体。

本发明还提供了所述转氨酶在合成1,3-二取代THIQ的应用。

在一种实施方式中，所述转氨酶是选自a1～a13任一的转氨酶。

在一种实施方式中，所述应用是将所述转氨酶蛋白与底物在乳酸脱氢酶(LDH)循环系统参与的反应体系中混合反应。

在一种实施方式中，所述应用包括以下步骤：

(1)将所述转氨酶蛋白与底物在乳酸脱氢酶(LDH)循环系统的参与下进行混合反应，制备胺2；所述底物为酮类1，D-丙氨酸或L-丙氨酸，磷酸吡哆醛(PLP)；所述LDH循环系统包括LDH、葡萄糖脱氢酶(GDH)、NADH、葡萄糖；

(2)将步骤(1)所得胺2与酰氯进行反应，收集反应产物，再将所得产物与三氯氧磷反应，获得亚胺3；

(3)将步骤(2)所得亚胺3作为底物，以亚胺还原酶蛋白和GDH循环系统进行催化反应，得到1,3-二取代THIQ；所述GDH循环系统包括GDH、NADP⁺、葡萄糖。

在一种实施方式中，所述亚胺还原酶蛋白是来源于斯塔克布朗氏菌(Stackebrandtia nassauensis)的亚胺还原酶SnIR，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在一种实施方式中，所述步骤(3)中亚胺3的添加量为1mM，所述亚胺还原酶突变体的添加量为1.6-3mol％，所述GDH的添加量为1mol％，所述NADP⁺的添加量为10mol％，所述葡萄糖的添加量为100mM。

在一种实施方式中，所述步骤(2)的反应体系中含有0.5M胺2溶于二氯甲烷，1.5当量三乙胺，至少1当量酰氯。0.5M酰胺溶于乙腈，5当量三氯氧磷。所述乙腈优选干燥的乙腈。所述三氯氧磷优选新鲜蒸馏三氯氧磷。

在一种实施方式中，所述步骤(2)中反应温度均为90℃。

在一种实施方式中，所述底物包括酮类1，D-丙氨酸或L-丙氨酸，磷酸吡哆醛(PLP)。

在一种实施方式中，所述LDH循环系统包括LDH、葡萄糖脱氢酶(GDH)、NADH、葡萄糖。

在一种实施方式中，所述反应的温度为20-40℃，所述反应的pH为7.0-8.0。

在一种实施方式中，所述反应的时间为12-24h，或所述反应的时间为不低于12h。

在一种实施方式中，所述酮类1的添加量为5-10mM；所述D-丙氨酸或L-丙氨酸添加量为100mM，所述PLP添加量为1mM，所述葡萄糖添加量为100mM，所述NADH添加量为1mM。

在一种实施方式中，所述转氨酶的添加量为0.2-0.4mol％，所述GDH的添加量为0.15-0.3mol％，所述LDH的添加量为0.03-0.06mol％，其中，所有摩尔百分比均基于底物酮类1计算。

在一种实施方式中，所述酮类1的添加量为5-10mM；所述D-丙氨酸或L-丙氨酸添加量为100mM，所述PLP添加量为1mM，所述葡萄糖添加量为100mM，所述NADH添加量为1mM。

在一种实施方式中，所述转氨酶的添加量为0.2-0.4mol％，所述GDH的添加量为0.15-0.3mol％，所述LDH的添加量为0.03-0.06mol％；上述摩尔百分比均基于所在步骤的相应底物计算。

在一种实施方式中，所述酮类1包括以下1a-1d,1f至少一种：

在一种实施方式中，所述酰氯包括以下A-G至少一种：

在一种实施方式中，所述亚胺包括以下(R)-3a、(R)-3b、(R)-3c、(R or S)-3d、(R)-3e、(R)-3f、(R)-3g、(R)-3h、(R)-3i、(R)-3j、(R)-3k、(R)-3l中的至少一种：

在一种实施方式中，所述1，3-二取代THIQ结构如下：

本发明还提供了所述突变体，或所述重组细胞，或所述方法在制备1，3-二取代THIQ的应用。

有益效果：

(1)本发明提供了一种转氨酶(ArR-TA)，该酶可以将底物酮高效转化为(R)-2a，转化率为>90％，ee值>99％；

(2)本发明提供了一种转氨酶(CV-TA)，该酶可以将底物酮高效转化为(S)-2a，转化率为>99％，ee值>99％；

(3)本发明提供了一种亚胺还原酶(SnIR)，该酶可以将底物外消旋亚胺转化为(1S，3R)-4a，转化率为11％，de值44，ee值59％；

(4)本发明还提供了一种以非手性酮为原料合成1，3-二取代THIQ的方法，(1S,3R)-4a～(1S,3R)-4l的HPLC产率分别为47％,83％,92％,86％,98％,>99％,92％,62％,28％,16％,15％,16％。de值分别为14％,99％,>99％,>99％,>99％,>99％,77％,53％,>99％,>99％,64％,47％。ee值分别为>99％,>99％,98％,>99％,>99％,>99％,97％,>99％,>99％,>99％,99％,99％。

(5)本发明的方法，以酮1a为原料化学酶模块化级联合成179.8mg的(1S,3R)-4a，产率为81％，>99de，>99ee。以酮1d为原料化学酶模块化级联合成31.1mg的(1S,3R)-4d，产率为76％，97de，>99ee。

附图说明

图1为1，3-二取代THIQ的合成路线。

图2为转氨酶模块液相分析图。

图3为化学模块液相分析图。

图4为亚胺还原酶模块液相分析图。

图5为酶催化合成(1S,3R)-4a手性鉴定。

图6为酶催化合成(1S,3R)-4a的核磁共振波谱分析¹H NMR和¹³C NMR。

图7为利用亚胺还原酶进行底物谱扩展。

图8为化学酶模块化级联合成(1S,3S)-4d手性鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

(一)化合物

在本发明的一些实施方式中，酮类1包括以下1a-1d,1f：

酰氯包括以下A-G：

亚胺包括以下(R)-3a、(R)-3b、(R)-3c、(R or S)-3d、(R)-3e、(R)-3f、(R)-3g、(R)-3h、(R)-3i、(R)-3j、(R)-3k、(R)-3l：

化合物1，3-二取代THIQ结构如下任一：

(二)氨基酸及核苷酸序列

表1相关蛋白氨基酸序列

表2编码相关蛋白的核苷酸序列

(三)试剂材料

本发明所用氨苄青霉素钠，硫酸卡那霉素，硫酸链霉素等抗生素均来自于上海生工；NADP⁺，NADH来自于上海毕得医药科技股份有限公司；本发明中分子实验所涉及到的PCR酶采购于宝生物工程(大连)有限公司；本发明中所使用的化学试剂甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯(EtOAc)、石油醚(PE)、乙腈(MeCN)、硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、二乙胺(DEA)、氨、氢氧化钠、盐酸等化学试剂均购自中国制药集团有限公司和上海泰坦科技股份有限公司。

(四)检测方法

转氨模块酶活检测：底物1a(10mM)、转氨酶(0.2mol％)、GDH(0.15mol％)、LDH(0.03mol％)、D,L-丙氨酸(100mM)、PLP(1mM)、葡萄糖(100mM)、NADH(1mM)和DMSO(5％v/v)在含有100mM的200μL反应系统(pH＝8)30℃培养24h，反应结束后，加入24倍体积的甲醇淬灭反应，振荡，低温高速离心，20000g离心5min，取20μL样品上样色谱柱分析转化率。然后，将剩余的反应溶液用5M氢氧化钠溶液调为pH至10，用乙酸乙酯提取3次。组合有机层并真空浓缩去除有机溶剂，经正向HPLC分析产品的ee值。

化学模块检测：胺2a(1当量)和三乙胺(TEA)(1.5当量)在二氯甲烷(0.5M)中溶解，在0℃下滴加乙酰氯。在反应完成后，用二氯甲烷稀释溶液，用盐水洗涤两次，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到粗酰胺，无需纯化直接用于下一步。一个双颈圆底烧瓶(50mL)装有一个磁性搅拌棒，用氩气彻底冲洗3个循环。粗酰胺(1当量)在干燥的MeCN(0.5M)中溶解，然后加入三氯氧磷(5当量)。加入到混合物中，在90℃下回流2小时。取1μL样品色谱级甲醇稀释1000倍液相分析反应。

亚胺还原酶酶活检测：亚胺rac-3a(1mM)、亚胺还原酶(1.6mol％)、GDH(1mol％)、NADP⁺(10mol％)、葡萄糖(100mM)和DMSO(5％v/v)，在含有100mM Tris-HCl的200μL反应体系中30℃孵育24小时。反应完成后，用色谱级甲醇将反应混合物30μL稀释至300μL，用HPLC和标准曲线测定转化率和de值。然后，将剩余的反应溶液用5M氢氧化钠溶液调为pH至10，用乙酸乙酯提取3次。组合有机层并真空浓缩去除有机溶剂，经正向HPLC分析产品的ee值。

高效液相色谱(HPLC)检测条件：ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱，色谱柱柱温为25℃，检测波长为280nm。检测方法采用甲醇(含0.1％(v/v)三氟乙酸)、乙腈(含0.1％(v/v)三氟乙酸)和双蒸水(含0.1％(v/v)三氟乙酸)的三相溶剂体系进行梯度分离，流动相流速为1mL min^-1。线性梯度如表3。

表3高效液相色谱(HPLC)检测条件

蛋白纯化方法：利用裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，300mmol/L NaCl，20mM咪唑，pH＝8)对收集的菌体进行重悬，然后通过高压匀浆机破碎重悬液。将破碎后的重悬液进行低温高速离心，4℃、10000rpm离心30min，得到粗酶液。通过镍柱亲和层析，脱盐柱(HistrapTM 5mL Desalting)脱盐，最终得到纯化后的蛋白。

实施例1：转氨酶蛋白表达与纯化

1、表达转氨酶的质粒构建

以ArR-TA为例，将节杆菌Arthrobacter sp来源的酶ArR-TA(SEQ ID NO.1所示)进行密码子优化，将优化后的基因序列合成并连接在pET-21b(+)载体上，获得质粒pET-21b-ArR-TA。

以CV-TA为例，将紫色色杆菌Chromobacterium violaceum来源的酶CV-TA(SEQ IDNO.2所示)进行密码子优化，将优化后的基因序列合成并连接在pET-21b(+)载体上，获得质粒pET-21b-CV-TA。

按照上述相同方法，分别构建携带AT-TA、CV-TA、EX-TA、LS-TA、ML-TA、MM-TA、OA-TA、PP-TA、PJ-TA、RS-TA、VF-TA的重组质粒。

2、蛋白表达与纯化

将步骤1构建的重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，验证正确的菌株即为表达相应转氨酶的重组大肠杆菌。挑取各E.coli BL21单菌落于5mL LB含抗生素(氨苄青霉素)培养基中，于温度37℃，转速220rpm的摇床上培养8h,然后以1％(v/v)的接种量转接到500mL 2xYT培养基中，并在培养基中加入500ul 100mg/mL氨苄青霉素于37℃培养至菌体在600nm(OD600)处生长的光密度为0.5-0.7，然后将培养物降温至18℃，添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至最终浓度为0.2mM进行蛋白诱导表达。

将上述培养物离心(8000rpm，5min，4℃)收集细胞，弃上清。随后将细胞颗粒重悬于35mL预冷(4℃)Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 8.0)中，该缓冲液中含有0.1mM吡哆醛-5-磷酸(PLP)、0.3M氯化钠、20mM咪唑和10％(v/v)甘油。重悬细胞经高压匀浆机(800bar)破碎，离心(18300rpm，30min，4℃)去除细胞碎片。采用金属亲和层析法(IMAC)纯化蛋白，镍柱用10个柱体积裂解液进行平衡。非特异性结合的蛋白通过应用十个柱体积的20mM咪唑去除。特异性结合蛋白用两个柱体积的250mM咪唑从镍柱洗脱。纯化的转氨酶馏分汇集，随后经30KDa超滤管进行浓缩且置换储藏液(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，10％(v/v)甘油，0.1mMPLP，pH 8.0)，获得终浓度为10mg/mL的纯化的酶溶液，分装存储在-80℃待使用。

实施例2：SnIR蛋白表达与纯化

1、SnIR质粒获得

将编码斯塔克布朗氏菌Stackebrandtia nassauensis来源的SnIR(SEQ ID NO.10所示)进行密码子优化，将优化后的基因序列合成并连接在pET-21b(+)载体上，获得质粒pET-21b-SnIR。

2、蛋白表达与纯化

将步骤1构建的重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，验证正确的菌株即为表达亚胺还原酶的重组大肠杆菌。按照实施例1的方法进行蛋白表达和纯化，获得SnIR酶蛋白，分装并调节终浓度为10mg/mL，存储在-80℃待使用。

实施例3：LDH，GDH的制备

1、表达LDH，GDH的质粒构建

将编码枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis来源的GDH(SEQ ID NO.11所示)进行密码子优化，将优化后的基因序列合成并连接在pET-21b(+)载体上，获得质粒pET-21b-GDH。

将编码发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum JN248来源的LDH(SEQ ID NO.12所示)进行密码子优化，将优化后的基因序列合成并连接在pET-21b(+)载体上，获得质粒pET-21b-LDH。

2、蛋白表达与纯化

按照实施例1的方法进行蛋白的表达和纯化，分别获得比酶活为903U/mg的LDH，和比酶活为885U/mg的GDH，分装并调节终浓度为10mg/mL，存储在-80℃待使用。

实施例4：模式产物的化学酶模块化级联反应途径构建与验证

如图1所示，第一步(验证转氨酶模块)：以(3，5-二甲氧基苯基)乙酮(1a)为模式底物，通过实施例1构建的转氨酶，辅因子PLP，D,L-丙氨酸，葡萄糖，实施例3构建的乳糖脱氢酶(LDH)、葡萄糖脱氢酶(GDH)，在辅因子NADH作用下转化为相应的胺(R-(2a)或S-(2a))。第一步(验证化学模块)：外消旋(3,5-二甲氧基苯基)乙胺2a与酰氯作用形成酰胺，紧接着在三氯氧磷作用下生成外消旋6,8-二甲氧基-1,3-二甲基-3,4-二氢异喹啉(rac-3a)。第三步(验证亚胺还原酶模块)：以rac-3a为底物通过实施例2构建的亚胺还原酶，葡萄糖，GDH，辅因子NADH作用下转化为相应的4a。

具体步骤如下：

(1)第一步反应：底物1a(10mM)、转氨酶(0.2mol％)、GDH(0.15mol％，885U/mg)、LDH(0.03mol％，903U/mg)、D,L-丙氨酸(100mM)、PLP(1mM)、葡萄糖(100mM)、NADH(1mM)和DMSO(5％v/v)在含有100mM的200μL反应系统(pH＝8)30℃培养24小时，反应结束后，加入24倍体积的甲醇淬灭反应，振荡，低温高速离心，20000g离心5min，取200μL样品上样色谱柱分析转化率。然后将剩余的反应混合物用5M氢氧化钠溶液碱化至pH 10，用二氯甲烷提取3次。真空浓缩去除组合有机层的溶剂，正向HPLC测定ee值。

表4以1a作为底物的转氨酶筛选结果

(2)第二步反应：胺2a(1当量)和三乙胺(TEA)(1.5当量)在二氯甲烷(0.5M)中溶解，在0℃下滴加乙酰氯。在反应完成后，用二氯甲烷稀释溶液，用盐水洗涤两次，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到粗酰胺，无需纯化直接用于下一步。一个双颈圆底烧瓶(50mL)装有一个磁性搅拌棒，用氩气彻底冲洗3个循环。粗酰胺(1当量)在干燥的MeCN(0.5M)中溶解，然后加入三氯氧磷(5当量)。加入到混合物中，在90℃下回流2小时。取1μL样品色谱级甲醇稀释1000倍液相分析反应。

(3)第三步反应：亚胺rac-3a(1mM)、亚胺还原酶(1.6mol％)、GDH(1mol％)、NADP⁺(10mol％)、葡萄糖(100mM)和DMSO(5％v/v)，其中，各反应物的摩尔百分比均基于底物亚胺rac-3a。在含有100mM Tris-HCl的200μL反应体系中30℃孵育24小时。反应完成后，用色谱级甲醇将反应混合物30μL稀释至300μL，用HPLC和标准曲线测定转化率和de值。然后，将剩余的反应溶液用5M氢氧化钠溶液调为pH至10，用乙酸乙酯提取3次。组合有机层并真空浓缩去除有机溶剂，经正向HPLC分析产品的ee值。结果显示，亚胺还原酶SnIR的转化率为11％，de值44，ee值为59％。

实施例5：底物谱扩展

根据实验结果得知主要限速步骤为亚胺还原酶模块，底物谱进行扩展中产率计算主要集中于亚胺还原模块，de值，ee值可表示化学酶模块化级联反应以底物酮制备终产物的结果。相应产物的结构式如图7所示。

按照实施例按照实施例1的方法制备转氨酶ArR-TA，按照实施例2的方法制备亚胺还原酶SnIR，按照实施例3的方法制备葡萄糖脱氢酶GDH和乳糖脱氢酶LDH，按照如下步骤进行对映体富集亚胺3的制备：

底物1(5mM)、ArR-TA(0.4-1mol％)、GDH(0.15-0.3mol％)、LDH(0.03-0.06mol％)、D,L-丙氨酸(100mM)、PLP(1mM)、葡萄糖(100mM)、NADH(1mM)和DMSO(5％v/v)在含有100mMTris-HCl的200μL反应系统(pH＝8)30℃培养24小时，反应结束后，反应溶液用5M氢氧化钠溶液调至pH 10，用二氯甲烷提取3次。组合有机层，硫酸钠干燥，并真空浓缩去除有机溶剂，粗品胺2直接用于下一步反应。

胺2(1当量)和三乙胺(TEA)(1.5当量)在二氯甲烷(0.5M)中溶解，在0℃下滴加酰氯(≥1当量)。在反应完成后，用二氯甲烷稀释溶液，用盐水洗涤两次，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到粗酰胺，无需纯化直接用于下一步。一个双颈圆底烧瓶(50mL)装有一个磁性搅拌棒，用氩气彻底冲洗3个循环。粗酰胺(1当量)在干燥的MeCN(0.5M)中溶解，然后加入三氯氧磷(5当量)。加入到混合物中，在90℃下回流2小时。真空蒸发溶剂，残渣用氨水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，饱和碳酸氢钠洗涤3次，硫酸钠干燥，真空蒸发溶剂，柱层析纯化获得亚胺3。

亚胺3(1mM)、SnIR(1.6mol％)、GDH(1mol％)、NADP⁺(10mol％)、葡萄糖(100mM)和DMSO(5％v/v)，在含有100mM Tris-HCl的200μL反应体系中30℃孵育24小时。反应完成后，用色谱级甲醇将反应混合物30μL稀释至300μL，用HPLC和标准曲线测定转化率和de值。然后，将剩余的反应溶液用5M氢氧化钠溶液调为pH至10，用乙酸乙酯提取3次。组合有机层并真空浓缩去除有机溶剂，经正向HPLC分析产品的ee值。

结果显示，所有底物(图7中a-l)都能转化为相应的产物(1S,3R)-4a至(1S,3R)-4l，具体产率、de值和ee值如下表所示。

表5 1,3-二取代THIQ的产率、de和ee

实施例6：(1S,3R)-4a的放大制备

按照实施例按照实施例1的方法制备转氨酶ArR-TA，按照实施例2的方法制备亚胺还原酶SnIR，按照实施例3的方法制备葡萄糖脱氢酶GDH和乳糖脱氢酶LDH，按照如下步骤进行制备(1S,3R)-4a的放大体系反应。

底物1a(5mM)、ArR-TA(0.4mol％)、GDH(0.15mol％)、LDH(0.03mol％)、D-丙氨酸(100mM)、PLP(1mM)、葡萄糖(100mM)、NADH(1mM)和DMSO(5％v/v)在含有100mM Tris-HCl的200mL反应系统(pH＝8)30℃培养24小时，反应结束后，反应溶液用5M氢氧化钠溶液调至pH10，用二氯甲烷提取3次。组合有机层，硫酸钠干燥，并真空浓缩去除有机溶剂，粗品胺(R)-2a直接用于下一步反应。

粗胺(R)-2a(1当量)和三乙胺(1.5当量)在二氯甲烷(0.5M)中溶解，在0℃下滴加酰氯(≥1当量)。在反应完成后，用二氯甲烷稀释溶液，用盐水洗涤两次，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到粗酰胺，无需纯化直接用于下一步。一个双颈圆底烧瓶(50mL)装有一个磁性搅拌棒，用氩气彻底冲洗3个循环。粗酰胺(1当量)在干燥的MeCN(0.5M)中溶解，然后加入三氯氧磷(5当量)。加入到混合物中，在90℃下回流2小时。真空蒸发溶剂，残渣用氨水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，饱和碳酸氢钠洗涤3次，硫酸钠干燥，真空蒸发溶剂，柱层析纯化获得粗品亚胺(R)-3a。

粗亚胺(R)-3(1mM)、SnIR(3mol％，均分3次添加，间隔16h)、GDH(1mol％，均分3次添加，间隔16h)、NADP⁺(10mol％)、葡萄糖(100mM)和DMSO(5％v/v)，在含有100mM Tris-HCl的1L反应体系中30℃孵育48小时。然后用盐水洗涤组合有机层，硫酸钠干燥，浓缩得到粗混合物，经柱层析纯化获得77.8mg的(1S,3R)-4a，分离产率35％，74％de,>99％ee。

实施例7：(1S,3S)-4d的放大制备

为了规模化制备(1S,3S)-4d，进行了体系放大反应。按照实施例1的方法制备转氨酶CV-TA，按照实施例2的方法制备亚胺还原酶SnIR，按照实施例3的方法制备葡萄糖脱氢酶GDH和乳糖脱氢酶LDH。

底物1d(5mM)、CV-TA(1mol％)、GDH(0.15mol％)、LDH(0.03mol％)、L-丙氨酸(100mM)、PLP(1mM)、葡萄糖(100mM)、NADH(1mM)和DMSO(5％v/v)在含有100mM Tris-HCl的40mL反应系统(pH＝8)30℃培养24小时，反应结束后，反应溶液用5M氢氧化钠溶液调至pH10，用二氯甲烷提取3次。组合有机层，硫酸钠干燥，并真空浓缩去除有机溶剂，粗品胺(S)-2d直接用于下一步反应。

粗胺(S)-2d(1当量)和三乙胺(1.5当量)在二氯甲烷(0.5M)中溶解，在0℃下滴加酰氯(≥1当量)。在反应完成后，用二氯甲烷稀释溶液，用盐水洗涤两次，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到粗酰胺，无需纯化直接用于下一步。一个双颈圆底烧瓶(50mL)装有一个磁性搅拌棒，用氩气彻底冲洗3个循环。粗酰胺(1当量)在干燥的MeCN(0.5M)中溶解，然后加入三氯氧磷(5当量)。加入到混合物中，在90℃下回流2小时。真空蒸发溶剂，残渣用氨水淬灭，乙酸乙酯萃取3次，饱和碳酸氢钠洗涤3次，硫酸钠干燥，真空蒸发溶剂，柱层析纯化获得粗品亚胺(S)-3d。

粗亚胺(S)-3d(1mM)、SnIR(2mol％，均分3次添加，间隔16h)、GDH(1mol％，均分3次添加，间隔16h)、NADP⁺(10mol％)、葡萄糖(100mM)和DMSO(5％v/v)，在含有100mM Tris-HCl的200mL反应体系中30℃孵育48小时。然后用盐水洗涤组合有机层，硫酸钠干燥，浓缩得到粗混合物，经柱层析纯化获得31.1mg的(1S,3S)-4d，分离产率76％，97％de,>99％ee。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.表达转氨酶的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)为宿主，表达a1～a9任一所示转氨酶：

a1、来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)的转氨酶ArR-TA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

a2、来源于紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)的转氨酶CV-TA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

a3、来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)的转氨酶ArRmut-11，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；

a4、来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的转氨酶AT-TA，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；

a5、来源于人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropic)的转氨酶OA-TA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

a6、来源于鲁杰氏菌(Ruegeria sp.)TM1040的转氨酶RS-TA，其氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示；

a7、来源于异物外瓶霉(Exophiala xenobiotica)的转氨酶EX-TA，其氨基酸序列如SEQID NO.7所示；

a8、来源于副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia phymatum)的转氨酶PP-TA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

a9、来源于河流孤菌(Vibrio fluvialis)的转氨酶VF-TA，其氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示。

2.制备转氨酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组大肠杆菌在培养基中培养诱导产酶，收集酶蛋白。

3.一种合成1,3-二取代THIQ的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将转氨酶与底物在乳酸脱氢酶循环系统的参与下进行混合反应；所述底物为酮类1，D-丙氨酸或L-丙氨酸，磷酸吡哆醛；所述LDH循环系统包括LDH、葡萄糖脱氢酶、NADH、葡萄糖；所述转氨酶含有SEQ ID NO.1～9任一所示的氨基酸序列；

(2)将步骤(1)所得胺2与酰氯进行反应，收集反应产物，然后所得产物与三氯氧磷反应，收集反应产物亚胺3；

(3)将步骤(2)所得亚胺3作为底物，以亚胺还原酶蛋白和GDH循环系统进行催化反应，得到1,3-二取代THIQ；所述GDH循环系统包括GDH、NADP⁺、葡萄糖。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，生物催化反应pH为5～10，所述反应的温度为20-40℃，反应时间为1h-24h。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，在所述的生物反应体系中，所述的酮类1的初始浓度为1-50mM，所述的亚胺3的初始浓度为1-50mM。

6.根据权利要求3～5任一所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述乳酸脱氢酶来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)JN248，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

7.根据权利要求3～6任一所述的方法，其特征在于，所述酮类1包括以下1a-1e至少一种：

所述亚胺3包括以下至少一种：

8.根据权利要求3～7任一所述的方法，其特征在于，所述酰氯包括以下A-G至少一种：

9.根据权利要求3～8任一所述的方法，其特征在于，所述1，3-二取代THIQ结构包括如下任一：

10.权利要求1所述的重组大肠杆菌，或权利要求2～9任一所述方法在制备手性1，3-二取代四氢异喹啉的应用。