CN119684406A - 一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药、其制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药、其制备及应用；属于多肽前药及制备方法和应用的技术领域，本发明通过固相有机合成反应合成荷载喜树碱的酶响应多肽前药，可与成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶特异性识别剪切，发生原位自组装形成纳米纤维，并释放小分子化疗药物喜树碱；本发明的响应型自组装多肽前药合成简单，稳定性高；由于多肽前药可以在肿瘤细胞过表达的成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶的作用下发生高特异性的原位自组装及喜树碱释放，因此实现药物向肿瘤区域的高效递送及长滞留；本发明填补了可响应两种酶标志物以形成纳米自组装体及喜树碱缓释的多肽前药的设计及其制备方法方面的空白。

Description

一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药、其制备及应用

技术领域

本发明属于多肽前药及制备方法和应用的技术领域，涉及了一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药、其制备及应用。

背景技术

胰腺癌是一种高度致命的恶性肿瘤，其五年总体存活率不足10％；化疗在胰腺癌的临床治疗中发挥着重要作用；在胰腺癌的一线化疗药物中，核作用药物(如吉西他滨、5-氟尿嘧啶、喜树碱等)通过影响核酸生物合成、损伤DNA或干扰转录过程发挥抗肿瘤活性；但这些药物常伴有严重的脱靶毒性和耐药性；因此，开发有效的药物递送体系，将这类药物精准递送进入肿瘤细胞中，将有利于其高效发挥作用，同时降低药物的脱靶毒性；酶促自组装(EISA)通过将酶催化与超分子组装相结合，已成为癌症治疗中一种理想的药物递送方法；利用癌细胞中过表达的酶来触发多肽-药物偶联物在肿瘤部位特异性地自组装，形成纳米结构，从而实现药物向肿瘤部位的选择性递送、积累或原位激活；但未见荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药性质的研究。

发明内容

针对上述问题，本发明目的是提供了一种具有肿瘤特异性响应的肿瘤原位自组装及喜树碱的原位释放的用于肿瘤治疗的荷载喜树碱的多肽前药。

本发明另一目的是提供了一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药的制备方法。

本发明的第三目的是提供了一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药在肿瘤治疗中的应用。

本发明的技术方案是：本发明所述的一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药，其化学结构式如下式所示：

进一步的，其制备步骤如下：

步骤(1)：将喜树碱加入适当有机溶剂中，使之溶解良好，随后向其中加入丁二酸酐和缚酸试剂，在惰性气体保护下过夜反应；通过色谱法纯化得到喜树碱丁二酸，记为P1；

所述合成步骤中的惰性气体可独立选自：氮气、氦气、氩气，其中优选：氮气、氩气；

步骤(2)：将2-氯三苯甲基氯树脂在有机溶剂中溶胀，加入L-苯丙氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去苯丙氨酸的保护基；加入活化的L-苯丙氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去苯丙氨酸的保护基；加入活化的L-赖氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去赖氨酸的保护基；加入活化的L-丙氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去丙氨酸的保护基；加入活化的L-脯氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去脯氨酸酸的保护基；加入活化的甘氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去甘氨酸的保护基；加入活化的L-苏氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去苏氨酸的保护基；加入活化的L-赖氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去赖氨酸的保护基；加入活化的L-苏氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去苏氨酸的保护基；加入活化的L-天冬氨酸衍生物及缚酸试剂反应；随后使用碱裂解液脱去赖氨酸侧链的保护基；加入活化的P1及缚酸试剂过夜反应；随后，使用含有酸裂解液将多肽从树脂上切下，使用不良溶剂将产物沉淀析出，冷冻离心弃掉上清，沉淀物经过色谱法纯化后得到荷载化疗药物喜树碱的多肽：叔丁氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-苏氨酸(叔丁氧基)-赖氨酸(叔丁氧羰基)-苏氨酸(叔丁氧基)-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸-赖氨酸(喜树碱丁二酸)-苯丙氨酸-苯丙氨酸，记为P2；

合成步骤中的不良溶剂包括：石油醚、乙醇、异丙醇、乙醚、环己烷；其中优选：乙醚、环己烷；

步骤(3)：将活化后的多肽P2、2-萘甲胺和缚酸试剂溶解于有机溶剂中反应；通过色谱法纯化后得到多肽：叔丁氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-苏氨酸(叔丁氧基)-赖氨酸(叔丁氧羰基)-苏氨酸(叔丁氧基)-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸-赖氨酸(喜树碱丁二酸)-苯丙氨酸-苯丙氨酸-萘乙酸，记为P3；

步骤(4)：使用酸裂解液脱去P3上的保护基；通过色谱法纯化后得到荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药；

进一步地，合成步骤中的有机溶剂可独立选自：甲醇、异丙醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜、四氢呋喃；其中优选：二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；

所述合成步骤中的缚酸试剂可独立选自：三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、哌啶、吡啶；

其中优选：三乙胺、4-二甲氨基吡啶；

所述步骤中的保护基可独立选自：叔丁氧基，叔丁氧碳基，芴甲氧羰基，1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基；

所述合成步骤中的碱裂解液可独立选自：哌啶/甲醇(5-30％，v/v)、哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(5-30％，v/v)，哌啶/二氯甲烷(5-30％，v/v)，吡啶/二氯甲烷(20-60％，v/v)、吡啶/N,N-二甲基甲酰胺(20-60％，v/v)，水合肼/N,N-二甲基甲酰胺(1-10％，v/v)，水合肼/甲醇(1-10％，v/v)；

其中优选：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(5-30％，v/v)，哌啶/二氯甲烷(5-30％，v/v)，水合肼/N,N-二甲基甲酰胺(1-10％，v/v)；

所述合成步骤中的氨基酸活化指添加如下试剂进行，试剂选自：O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、O-(5-氯苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐，

所述其中优选：1-羟基苯并三唑、O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯；

合成步骤中的酸裂解液可独立选自：三氟乙酸/甲醇(1-99％，v/v)、三氟乙酸/N,N-二甲基甲酰胺(1-99％，v/v)，三氟乙酸/二氯甲烷(1-99％，v/v)，其中优选：三氟乙酸/N,N-二甲基甲酰胺(1-99％，v/v)，三氟乙酸/二氯甲烷(1-99％，v/v)；

进一步的，上述合成的化合物P1、P2和P3，其特征结构分别为：

进一步的，所述制备方法制备的一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药在抗肿瘤治疗中的应用；

所述肿瘤包括消化系癌及白血病、肺癌、膀胱癌等。

本发明的有益效果是：本发明基于串联酶控自组装及药物释放的策略设计合成一种成纤维细胞活化蛋白α和羧酸酯酶响应型多肽-喜树碱偶联物，以实现化疗药物喜树碱的精准递送和缓释，并通过纳米纤维在细胞内的原位组装增强药物在肿瘤区域的积累以及喜树碱进入癌细胞细胞核，有望增强化疗药物的化疗效果；本发明拟开发一种新型的多肽-喜树碱偶联物以改善喜树碱的水溶性和稳定性，降低其对正常组织的毒副作用，提升药物在肿瘤细胞的特异性累积及特异性智能缓释；该多肽-喜树碱偶联物合成简单，同时由于多肽中含有一段能被成纤维细胞活化蛋白α特异性识别并剪切的片段，其可在成纤维细胞活化蛋白α的作用下被缓慢酶切掉多肽中的亲水部分，转变为相对疏水的多肽-喜树碱偶联物并在细胞中组装成纳米纤维，从而延长药物在肿瘤部位的驻留时间；本发明中多肽与喜树碱通过酯键连接，其可以在细胞内羧酸酯酶的作用下水解，从而使喜树碱从多肽侧链缓慢释放，酶切后的多肽片段可以促进喜树碱进入细胞核中发挥化疗效果。

附图说明

图1是本发明中的合成路线图；

图2是本发明实施例1中合成的纯化合物P1的质谱图；

图3是本发明实施例2中合成的纯化合物P2的质谱图；

图4是本发明实施例2中合成的纯化合物P3的质谱图；

图5是本发明实施例2中合成的纯化合物P4的质谱图；

图6是本发明实施例2中合成的纯化合物P4的核磁共振氢谱图；

图7是本发明实施例2中合成的纯化合物P4的核磁共振碳谱图；

图8是本发明实施例3中合成的纯化合物P4在体外环境完成成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶的识别剪切后进行透射电子显微镜表征结果示意图；

图9是本发明实施例3中合成的纯化合物P4在体外环境完成成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶的识别剪切前后进行高效液相色谱分析的结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明的具体技术方案做进一步的详细说明；具体，如图所示。

实施例1：纯化合物P1喜树碱丁二酸的合成方法，其中纯化合物P1的结构为：

本实施例中第一种化合物P1的合成路线如下：

将喜树碱加入适当有机溶剂中，使之溶解良好，随后向其中加入过量的丁二酸酐和缚酸试剂，在惰性气体保护下过夜反应；通过色谱法纯化得到喜树碱丁二酸，记为P1；

合成步骤中的有机溶剂可独立选自：甲醇、异丙醇、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜、四氢呋喃，其中优选：二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜；所述合成步骤中的缚酸试剂可独立选自：三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、哌啶、吡啶，其中优选：三乙胺、4-二甲氨基吡啶；所述合成步骤中的惰性气体可独立选自：氮气、氦气、氩气，其中优选：氮气、氩气；

采用液相色谱-质谱联用仪对纯化合物P1进行电喷雾电离质谱分析，得到图2所示的质谱图：

图2是本实施例中合成的第一种化合物P1的质谱图；由图2可见，第一种化合物P1的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H)⁺]:m/z 449.1。

实施例2：纯化合物P2：叔丁氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-苏氨酸(叔丁氧基)-赖氨酸(叔丁氧羰基)-苏氨酸(叔丁氧基)-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸-赖氨酸(喜树碱丁二酸)-苯丙氨酸-苯丙氨酸，P3：叔丁氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-苏氨酸(叔丁氧基)-赖氨酸(叔丁氧羰基)-苏氨酸(叔丁氧基)-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸-赖氨酸(喜树碱丁二酸)-苯丙氨酸-苯丙氨酸-萘乙酸，和P4：天冬氨酸-苏氨酸-赖氨酸-苏氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸-赖氨酸(喜树碱丁二酸)-苯丙氨酸-苯丙氨酸-萘乙酸的合成方法，其中纯化合物P2，P3和P4的结构分别为：

本实施例中的化合物P2，化合物P3及化合物P4的合成路线如下：

将2-氯三苯甲基氯树脂在有机溶剂中溶胀，加入L-苯丙氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去苯丙氨酸的保护基；加入活化的L-苯丙氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去苯丙氨酸的保护基；加入活化的L-赖氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去赖氨酸的保护基；加入活化的L-丙氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去丙氨酸的保护基；加入活化的L-脯氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去脯氨酸酸的保护基；加入活化的甘氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去甘氨酸的保护基；加入活化的L-苏氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去苏氨酸的保护基；加入活化的L-赖氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去赖氨酸的保护基；加入活化的L-苏氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去苏氨酸的保护基；加入活化的L-天冬氨酸衍生物及缚酸试剂反应；随后使用碱裂解液脱去赖氨酸侧链的保护基；加入活化的P1及缚酸试剂过夜反应；随后，使用含有酸裂解液将多肽从树脂上切下，使用不良溶剂将产物沉淀析出，冷冻离心弃掉上清，沉淀物经过色谱法纯化后得到荷载化疗药物喜树碱的多肽：叔丁氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-苏氨酸(叔丁氧基)-赖氨酸(叔丁氧羰基)-苏氨酸(叔丁氧基)-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸-赖氨酸(喜树碱丁二酸)-苯丙氨酸-苯丙氨酸，记为P2；

合成步骤中的不良溶剂包括：石油醚、乙醇、异丙醇、乙醚、环己烷；其中优选：乙醚、环己烷；

将活化后的多肽P2、2-萘甲胺和缚酸试剂溶解于有机溶剂中反应；通过色谱法纯化后得到多肽：叔丁氧羰基-天冬氨酸(叔丁氧基)-苏氨酸(叔丁氧基)-赖氨酸(叔丁氧羰基)-苏氨酸(叔丁氧基)-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸-赖氨酸(喜树碱丁二酸)-苯丙氨酸-苯丙氨酸-萘乙酸，记为P3；

使用酸裂解液脱去P3上的保护基；通过色谱法纯化后得到荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药；

进一步地，合成步骤中的有机溶剂可独立选自：甲醇、异丙醇、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜、四氢呋喃，其中优选：二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜；所述合成步骤中的缚酸试剂可独立选自：三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、哌啶、吡啶，其中优选：三乙胺、4-二甲氨基吡啶；所述步骤中的保护基可独立选自：叔丁氧基，叔丁氧碳基，芴甲氧羰基，1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基；合成步骤中的碱裂解液可独立选自：哌啶/甲醇(5-30％，v/v)、哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(5-30％，v/v)，哌啶/二氯甲烷(5-30％，v/v)，吡啶/二氯甲烷(20-60％，v/v)、吡啶/N,N-二甲基甲酰胺(20-60％，v/v)，水合肼/N,N-二甲基甲酰胺(1-10％，v/v)，水合肼/甲醇(1-10％，v/v)其中优选：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(5-30％，v/v)，哌啶/二氯甲烷(5-30％，v/v)，水合肼/N,N-二甲基甲酰胺(1-10％，v/v)；合成步骤中的氨基酸活化指添加如下试剂进行，试剂选自：O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、O-(5-氯苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐等，其中优选：1-羟基苯并三唑、O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯；合成步骤中的酸裂解液可独立选自：三氟乙酸/甲醇(1-99％，v/v)、三氟乙酸/N,N-二甲基甲酰胺(1-99％，v/v)，三氟乙酸/二氯甲烷(1-99％，v/v)，其中优选：三氟乙酸/N,N-二甲基甲酰胺(1-99％，v/v)，三氟乙酸/二氯甲烷(1-99％，v/v)；合成步骤中的酰胺化反应、碱裂解反应、酸裂解反应，其反应条件为：室温下0.5-10小时；

采用液相色谱-质谱联用仪对纯化合物P2，P3和P4进行电喷雾电离质谱分析，得到图3，图4和图5所示的质谱图：

图3是本实施例中合成的化合物P2的质谱图；图4是本实施例中合成的化合物P3的质谱图；图5是本实施例中合成的化合物P4的质谱图；由图3可见，化合物P2的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M-H)^-]:m/z 1907.2；由图4可见，化合物P3的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+2H)²⁺]/2:m/z 1025.6，[(M-Boc+2H)²⁺]/2:m/z 975.1；由图5可见，化合物P4的质谱结果为obsvd.ESI-MS[(M+H)⁺]：m/z1680.6，[(M+2H)²⁺]/2:m/z 841.0。

采用核磁软件解析本实施例中合成的纯化合物得到如图6和图7所示的核磁共振谱图；

图6是本实施例中合成的纯化合物P4的核磁共振氢谱图；图7是本实施例中合成的纯化合物P4的核磁共振碳谱图。由图6可见，化合物P4的核磁共振氢谱(d₆-二甲亚砜，500MHz)：δ8.64(s，1H)，8.49–8.38(m，1H)，8.15(dd,J＝28.1，19.8Hz，5H)，7.89–7.78(m，10H)，7.69–7.62(m，2H)，7.55–7.45(m，4H)，7.25–7.12(m，10H)，5.47(s，2H)，5.24(s，2H)，4.57–4.21(m，12H)，4.06–3.98(m，3H)，3.52–3.39(m，2H)，2.91(s，14H)，2.76–2.69(m，4H)，2.35(d，J＝15.9Hz，2H)，2.15–2.10(m，2H)，1.77(d，J＝47.0Hz，2H)，1.54(s，3H)，1.32(s，4H)，1.16(q，J＝9.2，8.5Hz，4H)，1.08–0.99(m，6H)，0.91(t，J＝7.4Hz，3H)。由图7可见，化合物P4的核磁共振碳谱(d₆-二甲亚砜，151MHz)：δ172.60，172.06，172.04，171.64，171.16，171.11，170.52，170.42，169.80，168.43，167.76，167.44，167.33，161.47，157.02，152.82，148.37，146.37，145.97，137.99，137.91，137.11，135.53，133.32，133.28，132.84，132.51，130.88，130.19，129.63，129.59，129.40，129.00，128.86，128.57，128.42，128.40，128.24，128.13，128.09，127.96，127.94，126.98，126.67，126.57，126.26，126.19，125.70，119.22，95.72,76.31，67.10(2C)，66.71，59.78(2C)，58.94(2C)，58.42(2C)，54.69，54.06，50.64，49.29，48.75，48.44(2C)，46.35，42.73，38.18，37.87，36.03，31.69，30.76，30.10，29.68，29.42，29.24，27.11，24.61，23.04，22.60，22.04，20.06，19.92，18.18，8.03。

实施例3：体外条件下多肽-喜树碱偶联物酶响应性自组装和药物喜树碱释放的检测实验

本实施例检测实验中采用浓度为50微摩尔每升的第四种纯化合物P4，在含有浓度为200毫摩尔每升的磷酸缓冲液中，加入100微升20毫克每升的成纤维细胞活化蛋白α及100微升1000个单位每毫升的猪肝脏来源的羧酸酯酶，37摄氏度下孵育24小时，完成成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶的识别与剪切。

图8为实施例3中合成的化合物P4在体外环境完成成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶的识别剪切后进行透射电子显微镜表征结果；图8给出的透射电子显微镜表征结果表明，在成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶的作用下，P4分子自组装形成纳米纤维的结构。

图9为实施例3中合成的化合物P4在体外环境完成成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶的识别剪切前后进行高效液相色谱分析的结果；曲线a为第四种化合物P4的色谱分析结果，其色谱峰a₁即表示第四种化合物P4；色谱峰b₁表示化合物P4被成纤维细胞活化蛋白α酶识别剪切后的多肽化合物(Ala-Lys(SA-CPT)-Phe-Phe-Nap)；色谱峰c₁表示化合物P4被成纤维细胞活化蛋白α酶和羧酸酯酶识别剪切的自组装多肽骨架(Ala-Lys(SA)-Phe-Phe-Nap)；色谱峰d₁表示化疗药物喜树碱(CPT)；曲线e为第四种化合物P4与成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶共孵育24小时得到的色谱分析结果，其中色谱峰e₁与曲线d的色谱峰d₁保留时间相同，证明纯化合物P4在体外环境中可以被羧酸酯酶识别剪切并释放化疗药物喜树碱(CPT)；色谱峰e₂与曲线c的色谱峰c₁保留时间相同，证明纯化合物P4在体外环境中被成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶识别剪切后产生自组装多肽骨架；色谱峰e₃与曲线a的色谱峰a₁保留时间相同，色谱峰e₄与曲线b的色谱峰b₁保留时间相同，表示化合物P4经过酶识别剪切24小时后有少部分残留。

通过上述实施例及其检测实验的结果可知：本发明的荷载化疗药物喜树碱的酶响应自组装多肽前药通过简单的有机合成得到，制备容易，同时可与成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶特异性识别剪切，发生原位自组装形成纳米纤维，并释放化疗小分子药物喜树碱；综上，利用本发明的荷载化疗小分子药物的响应性自组装多肽，实现通过成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶双酶控制的肿瘤细胞高特异性原位自组装及化疗药物释放，实现药物向肿瘤区域的高效递送及长滞留；本发明填补了可响应成纤维细胞活化蛋白α及羧酸酯酶并原位自组装成纳米纤维及化疗小分子药物缓释的多肽前药及其制备方法方面的空白，并实现在体外条件下多肽前药酶响应发生自组装形成纤维并释放化疗小分子药物的检测实验。

Claims (10)

1.一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药，其特征在于，其化学结构式如下式所示：

2.根据权利要求1所述的一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药的制备方法，其特征在于，其制备步骤如下：

步骤(1)：将喜树碱溶解于有机溶剂中溶解，随后向其中加入丁二酸酐和缚酸试剂，在惰性气体保护下过夜反应；通过色谱法纯化得到喜树碱丁二酸，记为P1；

步骤(2)：将2-氯三苯甲基氯树脂在有机溶剂中溶胀，加入苯丙氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去苯丙氨酸的保护基；加入活化的苯丙氨酸衍生物及缚酸试剂反应，使用碱裂解液脱去苯丙氨酸的保护基；重复上述酰胺缩合和碱裂解脱保护步骤，在每一次重复的步骤中分别添加赖氨酸衍生物、丙氨酸衍生物、脯氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、苏氨酸衍生物、赖氨酸衍生物、苏氨酸衍生物、天冬氨酸衍生物；随后使用碱裂解液脱去赖氨酸侧链的保护基；加入活化的P1及缚酸试剂过夜反应；

随后，使用含有酸裂解液将多肽从树脂上切下，使用不良溶剂将产物沉淀析出，冷冻离心弃掉上清，沉淀物经过色谱法纯化后得到荷载化疗药物喜树碱的多肽，记为P2；

步骤(3)：将活化后的多肽P2、2-萘甲胺和缚酸试剂溶解于有机溶剂中反应；通过色谱法纯化后得到多肽，记为P3；

步骤(4)：使用酸裂解液脱去P3上的保护基；通过色谱法纯化后得到荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药。

3.根据权利要求2所述的一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药的制备方法，其特征在于，所述合成步骤中的有机溶剂选自：甲醇、异丙醇、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜或四氢呋喃。

4.根据权利要求2所述的一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药的制备方法，其特征在于，所述合成步骤中的缚酸试剂选自：三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、哌啶或吡啶。

5.根据权利要求2所述的一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药的制备方法，其特征在于，所述合成步骤中的保护基选自：叔丁氧基、叔丁氧碳基、芴甲氧羰基或1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基。

6.根据权利要求2所述的一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药的制备方法，其特征在于，所述合成步骤中的碱裂解液选自：哌啶/甲醇(5-30％，v/v)、哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(5-30％，v/v)、哌啶/二氯甲烷(5-30％，v/v)、吡啶/二氯甲烷(20-60％，v/v)、吡啶/N,N-二甲基甲酰胺(20-60％，v/v)、水合肼/N,N-二甲基甲酰胺(1-10％，v/v)或水合肼/甲醇(1-10％，v/v)。

7.根根据权利要求2所述的一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药的制备方法，其特征在于，所述合成步骤中的氨基酸活化通过添加如下试剂进行，所述试剂选自：O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯或O-(5-氯苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐。

8.根据权利要求2所述的一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药的制备方法，其特征在于，所述合成步骤中的酸裂解液选自：三氟乙酸/甲醇(1-99％，v/v)、三氟乙酸/N,N-二甲基甲酰胺(1-99％，v/v)或三氟乙酸/二氯甲烷(1-99％，v/v)。

9.根据权利要求2所述的一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药的制备方法，其特征在于，

在步骤(1)中，所述惰性气体选用氮气；

在步骤(2)中，所述重复酰胺缩合和碱裂解脱的保护步骤即：加入活化的N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸和缚酸剂反应，使用20％的哌啶脱去苯丙氨酸的N-芴甲氧羰基保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-N'-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基]-L-赖氨酸和缚酸剂反应，使用20％的哌啶脱去赖氨酸的N-芴甲氧羰基保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸和缚酸剂反应，使用20％的哌啶脱去丙氨酸的N-芴甲氧羰基保护基；加入活化的N-叔丁芴甲氧羰基-L-脯氨酸和缚酸剂反应，使用20％的哌啶脱去脯氨酸酸的N-芴甲氧羰基保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-甘氨酸和缚酸剂反应，使用20％的哌啶脱去甘氨酸的N-芴甲氧羰基保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-苏氨酸和缚酸剂反应，使用20％的哌啶脱去苏氨酸的N-芴甲氧羰基保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-N-叔丁氧羰基-L-赖氨酸和缚酸剂反应，使用20％的哌啶脱去赖氨酸的N-芴甲氧羰基保护基；加入活化的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-苏氨酸和缚酸剂反应，使用20％的哌啶脱去苏氨酸的N-芴甲氧羰基保护基；加入活化的N-(叔丁氧羰基)-L-天冬氨酸-4-叔丁酯和缚酸剂反应；随后，使用2％的水合肼溶液脱去赖氨酸侧链的1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基保护基；

所述不良溶剂选用乙醚。

10.如权利要求1-9任意一项所述制备方法制备的一种荷载喜树碱的酶响应自组装多肽前药在抗肿瘤治疗中的应用；

所述肿瘤包括消化系癌、白血病、肺癌及膀胱癌。