CN119638810A - 植物NtBES1蛋白及其在调控烟草体内6-磷酸-海藻糖水平中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种植物NtBES1蛋白及其在调控烟草体内6‑磷酸‑海藻糖水平中的用途，属于烟草调控技术领域。本发明提供了一个完整的烟草源的基因编码序列，通过遗传转化手段，在烟草体内明确了植物NtBES1蛋白对T6P水平的调控作用，由于植物体内的T6P无法通过直接外源施用T6P进行调节，所以该植物NtBES1蛋白的对T6P水平的调控作用的发现，可后期应用于烟草内源T6P水平的调节，从而提高烟草的产量/质量。

Description

植物NtBES1蛋白及其在调控烟草体内6-磷酸-海藻糖水平中 的用途

技术领域

本发明属于烟草调控技术领域，尤其涉及到一种植物NtBES1蛋白及其在调控烟草体内6-磷酸-海藻糖水平中的用途。

背景技术

在植物中，糖是植物光合作用的直接产物，是物质代谢和能量代谢共同的基础，参与了碳素积累、能量供给等一系列基础的生理生化过程，也是植物体内多糖、蛋白质、脂肪等大分子化合物的物质基础，对提高以叶片为收获对象的烟草产质量具有极其重要的作用。在植物中，光合作用、营养的运输和分配都受到糖的调控。以往，糖对基因表达和植物生长发育的作用常被认为是物质代谢和能量代谢产生的次级效应，但随着研究的深入，越来越多的证据表明糖也是信号分子。尤其是海藻糖及其前体海藻糖-6-磷酸(trehalose-6-phosphate，T6P)是调控植物生长发育的重要信号分子，参与植物的代谢调控及基因表达调控(O’Hara等2013；Schluepmann等2004；vanDijken等2004)。T6P可作为碳代谢的调控器以及光合能力的增强剂(Paul等2001；Eastmond和Graham 2003)。小麦中的研究表明，T6P的增加能够促进籽粒灌浆，进而提高产量。此外，外源施加T6P类似物可以显著促进发育，并改善作物产量(Chemical intervention in plant sugar signaling increases yield andresilience)。

海藻糖(α-D吡喃葡萄糖，α-D吡喃型葡萄糖苷)是由2个分子葡萄糖组成的非还原性双糖。T6P是海藻糖的代谢前体，它是海藻糖-6-磷酸合酶(trehalose-6-phosphatesynthase，TPS)催化UDP-葡萄糖与葡萄糖-6-磷酸进行缩合反应的产物，可进一步被海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trehalose-6phosphate phosphatase，TPP)脱磷酸生成海藻糖(Cabib和Leloir 1958)。现在已知的海藻糖合成至少有5条不同的途径，分别是OtsA-OtsB途径、TreP途径、TreS途径、TreY-TreZ途径和TreT途径(Avonce等2006；Paul等2008)。植物中只存在OtsA-OtsB海藻糖合成途径，包括两步酶促反应，首先由TPS催化尿苷二磷酸-葡萄糖与葡萄糖-6-磷酸形成T6P，然后由TPP催化T6P脱磷酸形成海藻糖，进一步被海藻糖酶催化生成2个分子的葡萄糖(Avonce等2006)。TPS是T6P合成的限速步骤，它的活性对T6P的含量有直接决定作用，TPP决定了T6P的降解，因此TPS和TPP的表达都会影响植物体内T6P的水平(chluepmann，H.，Pellny，T.，van Dijken，A.，et al.(2003)."Trehalose6-phosphate isindispensable for carbohydrate utilization and growth in Arabidopsisthaliana."Proceedings of the National Academy of Sciences，100(11)，6849-6854)。

拟南芥中TPS家族包含11个成员，TPP家族包含10个成员，其中TPS1被认为是控制T6P合成的主要基因。此外，这两个酶不仅在代谢调控中至关重要，还参与信号传递，调控碳代谢和能量平衡。TPS和TPP基因的转录受到复杂的转录调控。研究表明，这些基因在不同的发育阶段和不同的组织中有差异性的表达模式，并且受到诸如糖分状态、激素水平以及环境信号的调控。植物体内的T6P水平可以通过反馈调节TPS和TPP基因的转录。一些调控因子(如bZIP11转录因子)通过与TPS和TPP基因的启动子结合，调控这些基因的转录活动。

油菜素内酯(BRs)是一类重要的植物激素，通过其信号转导途径调控植物的生长、发育和对逆境的响应。BZR/BES是BR信号通路中的关键转录因子，直接受BR信号调控，调节下游基因的表达，进而影响植物的生长发育。目前该基因已在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays L.)、土豆(Solanumtuberosum L.)等物种中进行了家族分析、分离克隆及功能鉴定。

随着目前基因组测序技术的发展，虽然同源基因的功能通过其他物种中鉴定的功能进行推测，但由于不同物种之间可能存在的差异，同时，烟草作为四倍体植物的特殊性，其在烟草中的功能尚需通过科学可靠的技术进行验证。到目前，在烟草中未见到对BZR1/BES1的功能鉴定，更没有其对糖信号T6P调控的机制的解析。

发明内容

本发明提供了一种植物NtBES1蛋白及其在调控烟草体内6-磷酸-海藻糖水平中的用途。经试验证明，该植物NtBES1蛋白可有效调控烟草叶片中糖信号T6P水平，从而可将其应用于烟草内源T6P水平的调节，以提高烟草的产量/质量。

为了达到上述目的，本发明提供了一种植物NtBES1蛋白，包括NtBES1S蛋白和NtBES1T蛋白，前者氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，后者氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的植物NtBES1蛋白的编码基因。

作为优选，所述编码基因选自NtBES1S基因和/或NtBES1T基因，其中NtBES1S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，NtBES1T基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种含有上述技术方案所述编码基因的过表达材料或缺失材料。

本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的植物NtBES1蛋白或上述技术方案所述的编码基因在调控烟草叶片6-磷酸-海藻糖水平中的用途。

作为优选，NtBES1S基因和NtBES1T基因在叶片成熟前，负调控抑制T6P的合成；NtBES1S基因和NtBES1T基因在叶片成熟后，正调控促进T6P的合成。

作为优选，在外源蔗糖作用下，NtBES1T基因对T6P的调控受蔗糖诱导，NtBES1S基因对T6P的调控受蔗糖抑制。

本发明还提供了一种提高烟草产量/质量的方法，通过将上述技术方案所述的编码基因导入烟草中，以提高烟草的产量/质量。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明提供了一个完整的烟草源的基因编码序列，通过遗传转化手段，在烟草体内明确了植物NtBES1蛋白对T6P水平的调控作用，由于植物体内的T6P无法通过直接外源施用T6P进行调节，所以该植物NtBES1蛋白的对T6P水平的调控作用的发现，可后期应用于烟草内源T6P水平的调节，从而提高烟草的产量/质量。

附图说明

图1为本发明实施例提供的烟草、拟南芥、马铃薯、番茄中BES1的系统进化关系，其中红色方框代表普通烟草(N.tabacum)；蓝色三角代表林烟草(N.sylvestris)；灰色三角代表绒毛烟草(N.tomentosiformis)；紫色方框代表物种为马铃薯(S.tuberosum)；蓝色圆圈代表番茄(S.lycopersicum)；绿色圆圈代表拟南芥(Arabidopsis thaliana)；

图2为本发明实施例提供的烟草NtBES1、NtBZR1的转录激活活性分析，其中，酵母中转录激活试验：空的pGBKT7作为阴性对照；AtDREBA-pGBKT7作为阳性对照，pGBKT7是空载体，为阴性对照，100、10^-1、10^-2、10^-3代表酵母的稀释倍数；

图3为本发明实施例提供的烟草NtBES1和NtBZR1的亚细胞定位情况，其中，GFP：在488nm波长的激发光下观察到GFP荧光蛋白的荧光信号；DAPI：在405nm波长的激发光观察到的荧光信号；Merge：明场、暗场共同融合后的图像；Bright：明场下观察到的图像；

图4为本发明实施例提供的NtBES1遗传材料的创制，其中A.NtBES1基因编辑target序列设计；B.基因编辑测序结果；C.编辑后氨基酸序列比对；D.烟草遗传转化过程中转基因植株的再生阶段；E.过表达植株NtBES1T基因相对表达量分析；F.过表达植株NtBES1S基因相对表达量分析；

图5为本发明实施例提供的T6P合成和代谢途径分析；

图6为本发明实施例提供的NtBES1遗传材料中T6P和海藻糖含量(A-B)、TPS和TPP酶含量(C-D)、NtTPS和NtTPP表达量(E-F)；

图7为本发明实施例提供的NtBES1遗传材料蔗糖处理后T6P含量；

图8为本发明实施例提供的NtBES1遗传材料蔗糖处理后TPS含量；

图9为本发明实施例提供的NtBES1遗传材料蔗糖处理后TPP含量；

图10为本发明实施例提供的NtBES1遗传材料蔗糖处理后NtTPS(A)和NtTPP(B)基因表达量；

图11为本发明实施例提供的NtBES1遗传材料蔗糖处理后NtTPP基因表达量。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

植物NtBES1蛋白的系统发育进化树

为了研究BES1成员之间的直系同源关系，利用茄科以及拟南芥的BES1蛋白全基因序列长度构建了一个系统发育树，以便更好的发现潜在直系同源物。基于邻接法(Neighbor-joining)进行系统发育的分析，用不同前缀的名字来命名各同源物以区分不同物种(普通烟草(Nt，N.tabacum，K326)、林烟草(Nsyl，N.sylvestris)、绒毛状烟草(Ntom，N.tomentosiformis)、马铃薯(St，S.tuberosum)、番茄(Si，S.lycopersicum))。如图1所示，同源分析将57个BES1蛋白分为5大类，命名为I到V.。根据他们系统发育树中的聚类和序列分析，NsylBES1s和NtomBES1s的大部分BES基因都是同源的。以上研究证明，经祖先的种间杂交，多数的BES基因被保留下来。

考虑到茄科的进化，烟草中的基因NsylBEH7、NsylBEH7.1、NsylBEH7.2和NsylBEH7.3缺少直系同源基因，普通烟草基因NtBEH2.1、NtBEH6.1、NtBEH6.2、NtBEH6.4S和NtBEH6.5S被单独聚为一类，马铃薯的StBEH5被单独聚为一类，没有在拟南芥和烟草中发现跟它直系同源的基因。这表明普通烟草NtBES1基因家族被分成了三个组。第一组包括7个基因，第二组包括6个基因，第三组包括5个基因，这三个组均能发现与之同源的近缘种绒毛状烟草和林烟草的直系同源基因，同时，NsylBEH4.1、NsylBEH4.2、NtomBEH4、NtBEH4.1S和NtBEH4.2S被归为一组。这表明普通烟草是四倍体，且异源四倍体形成之后仍会发生基因的复制，基因组大小要比已经研究的拟南芥、水稻、玉米等物种大得多，基因的功能分工和冗余的情况更为复杂，这也更需要通过科学的手段，对从烟草基因组数据库中比对获得的基因进行分离克隆及鉴定，才能证实其在烟草中的功能。

烟草NtBES1基因家族成员基本信息

上述普通烟草(N.tabacum，K326)、林烟草(N.sylvestris)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis)、马铃薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum)的最新版的基因组注释信息由SGN(Sol Genomics Network,http://solgenomics.net/)数据库下载获得。从拟南芥信息资源(TAIR:http://www.arabidopsis.org/)中检索先前报道的AtBES1全长和同源域氨基酸序列，与MAFFTv5.3对齐以生成Stockholm文件，然后进行HMMERv3.0用于构建HMM(隐藏马尔可夫模型)配置文件。应用HMM配置文件对带注释的茄科蛋白质数据库进行HMM搜索，E值截止值为1.0。此外，使用AtBESs的全长和同源域氨基酸序列，进行BLASTP搜索以识别E值截止值为0.01的其他潜在WOX蛋白。将从上述两种方法获得的蛋白质序列组合起来，并手动删除多余的条目。然后用Pfam(https://pfam.xfam.org/)和SMART分析(http://smart.embl.de/)得到的命中序列)以确保保守功能域的存在。

分析蛋白质的相对分子质量(Mr)和等电点(pI)，所用的是在线工具ProtParam，其网址为http://web.expasy.org/protparam/。

预测BES1家族基因的亚细胞定位，用的工具为ProtComp 9.0，该工具的网址为http://www.softberry.c-om/berry.phtml？topic＝protcomppl&group＝programs&subgroup＝proloc。

利用ClustalW软件对选择物种的BES1转录因子氨基酸序列进行比对，包括S.lycopersicum、S.tuberosum、N.tabacum、N.tomentosiformis、N.sylvestri以及拟南芥；然后构建进化树，方法为邻接法NJ(Neighbor-Joining)，所用软件为MEGA 6.0。设置参数为泊松校正、成对删除和引导值(1000次重复)。

综合以上，在普通烟草数据库中，共搜索到18条NtBES1同源序列。烟草NtBES1基因家族信息如下表1所示，烟草BES1转录因子家族各成员的蛋白质氨基酸序列含有氨基酸数目为179-415个，平均值为289个；分子量为2.0388104-4.5121104道尔顿(Da)，平均值为3.1433104；理论等电点(PI)在5.12至9.44范围内。从整体看，绝大部分烟草BES1家族蛋白质等电点都大于7，等电点在碱性范围内，蛋白质分子中富含碱性氨基酸；蛋白质疏水性分析结果表明，18条蛋白质的疏水性均小于0，说明烟草BES1蛋白质均为亲水性蛋白质，但是不同蛋白质之间存在差异。考虑到目前BZR1家族和BES1家族在各个物种上研究得比较多，尤其是在BR信号通路中的功能，故进一步筛选NtBES1S、NtBES1T、NtBZR1S和NtBZR1T四个基因进行后续试验。

表1烟草NtBES1基因家族信息

实施例2

2.1NtBES1和NtBZR1均具有转录激活活性

首先利用引物NtBES1S1098F/R、NtBES1T 1227F/R、NtBZR1S1186F/R、NtBZR1T1170F/R分别将烟草NtBES1S、NtBES1T、NtBZR1S和NtBZR1TCDS扩增下来，为了检测NtBES1S、NtBES1T、NtBZR1S和NtBZR1T是否具有转录激活活性，将NtBES1S、NtBES1T、NtBZR1S和NtBZR1T转录本的CDS分别构建到pGBKT7载体上(含有DNA-BD结构域)；空的pGBKT7作为阴性对照；将AtDREBA-pGBKT7作为阳性对照。分别将这些质粒与空AD载体质粒混合后，转化到含有报告基因的酵母(Y2HGold)中，30℃培养3d，检查酵母在SD/-Trp-His选择性培养基上的生长情况，并进行β-gal显色验证。

结果如图2所示，4种酵母菌株均可以在Trp-缺陷型培养基上生长，只有阴性对照pGBKT7不能在Trp-His-Ade-缺陷型培养基上生长，表明NtBES1S、NtBES1T、NtBZR1S和NtBZR1T都具有转录激活活性。

2.2NtBES1和NtBZR1定位于细胞核

对NtBES1S、NtBES1T、NtBZR1S和NtBZR1T的亚细胞定位进行分析。将NtBES1S、NtBES1T、NtBZR1S和NtBZR1T去除终止密码子，利用引物BES1S/TP57F和BES1SP57R、BES1S/TP57F和BES1TP57R、BZR1S/TP57F和BZR1SP57R、BZR1S/TP57F和BZR1TP57R分别扩增NtBES1S、NtBES1T、NtBZR1S、NtBZR1T的片段，通过酶切连接插入P35S::GFP载体的35S启动子和GFP编码序列之间，构建成为表达载体P_35S::NtBES1S:GFP和P_35S::NtBES1T:GFP、P_35S::NtBZR1S:GFP和P_35S::NtBZR1T:GFP。随后，将表达载体分别与p19等比例混合，注射本生烟的叶片，注射后将其置于28℃暗培养24h，再光照培养1-2d后，取注射叶片，剪成直径为0.5cm的圆片，用DAPI(比例为1:1000)浸泡10分钟，再用PBS脱色后，使用激光共聚焦显微镜(TCS-SP8 Leica,Wetzlar,Germany)观察荧光信号。在488nm波长的激发光下观察GFP荧光蛋白的荧光信号，在405nm波长的激发光观察DAPI的荧光信号，明场下观察到的不发荧光时细胞的样子，最后生成明场、暗场共同融合后的图像。

由图3可知，NtBES1S、NtBES1T、NtBZR1S、NtBZR1T定位于细胞核。通过GFP和DAPI信号的观察，发现可检测到的NtBES1表达的数量比NtBZR1的多，亮度比NtBZR1高，四个基因都主要在细胞核中表达。另外，发现NtBZR1T在细胞膜上也有表达。这一结果不仅表明NtBES1S、NtBES1T、NtBZR1S、NtBZR1T主要定位于细胞核中，还表明四个基因的定位有所差异，这意味着功能也有可能存在差异。

实施例3功能缺失材料和组成型过表达材料的创制

结合实施例2中基因的表达结果，我们选择了NtBES1S和NtBES1T进行了烟草遗传材料(功能缺失材料和组成型过表达材料)的创制，来解析其在烟草中的功能。

过表达载体构建

将过表达载体pBI121进行双酶切(Xma I和Sac I)使其线性化，再进行纯化回收；根据载体pBI121的酶切位点和目的基因的序列设计重组引物，以基因CDS序列的载体为模版，利用PCRMix(Vazyme，Nanjing)扩增基因的CDS片段(引物见表2)并进行纯化回收，PCR体系为25μL，具体如下Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，CDS质粒1μL，ddH2O9.5μL，扩增程序如下：95℃5min；95℃15s，60℃20s，72℃1min 36各循环，72℃7min；4℃保持。利用Takara公司的Infusion重组酶将线性化载体和基因片段重组，重组体系如下：Infusion 2μL，目的片段4μL，线性载体4μL。利用热激发将重组之后的质粒转化入DH5a菌株中，选取抗性板上的菌落进行PCR鉴定，检测引物pbi121pJCF/R最终选取PCR阳性且条带大小正确的菌落测序。将测序结果进行DNANAN比对，将结果正确的菌落进行保菌并提取质粒，将质粒经热激发转化农杆菌，最终获得含有目的基因重组的过表达农杆菌。

基因编辑载体构建

对普通烟草NtBES1S和NtBES1T进行了比对分析，找出相似性100％的序列区间，寻找位于编码框起始位置附近的PAM位点，gRNA由红色框标注(图4A)。由此分别设计出NtBES1S和NtBES1T的共同的gRNA，并将符合条件的目标序列构建到以AtU6-26介导gRNA，2×35S启动子驱动Cas9的pORE载体上，以构建pORE_NtBES1编辑载体。

烟草农杆菌介导的叶盘法遗传转化

首先将烟草种子消毒，方法如下：先用75％乙醇浸泡90s，期间不停的翻转离心管；再用50％次氯酸钠+1滴Tween 20灭菌2次，每次15min；最后用无菌水清洗至少3次以上。然后将种子播到含有1/2MS培养基的培养皿上，等苗子长到0.5cm左右，将其转移到含有相同培养基的培养瓶内。等烟草苗子长到5-8片叶的时候，选取绿色叶片，进行农杆菌侵染。取保存的农杆菌的菌液(-80℃)进行活化，之后取100μL加入到YEB液体中(一般使用三角瓶，200ml/瓶)，28℃，200转，黑暗条件下培养，待菌液OD＝0.6-0.8。将上述的菌液离心收集，利用MS0将菌液重悬并稀释到OD600＝0.8，然后加入20mg/L的AS(乙酰丁香酮)作为侵染液待用；将培养的无菌的烟草叶片剪成0.5*0.5cm的大小，上述侵染液中浸泡8min，期间不停的摇晃玻璃瓶。侵染后的叶片以叶脉朝上，平铺到共培养培养基(G)上，22℃或者23℃黑暗共培养3天。经过S1、S2、S3继代培养及生根培养后，获得抗性植株。过表达和基因编辑植株提取植物基因组DNA进行PCR鉴定。

提取过表达PCR检测阳性株系总RNA，进行荧光定量检测，荧光定量引物BES1S-F/R、BES1T-F/R、BZR1S-F/R和BZRT-F/R，其中内参基因引物为NtActinK326F/R。分别选择两个基因过表达株系中表达量较高的株系NtBES1SOE53和NtBES1TOE96，分别命名为OET、OES(图4E、F)，作为后续表型分析的过表达材料。基因编辑抗性株系PCR扩增，扩增引物BES2SCJCF/BES2CJCR、BES2TCJCF/BES2CJCR、BZR1SCJ500F/BZR1CJ500R、BZR1TCJ500F/BZR1TJ500R。

测序结果表明，NtBES1S和NtBES1T两个基因均获得编辑，其中NtBES1S缺失一个碱基，而NtBES1T插入一个碱基(图4B)。对应获得两个编辑株系，一个是NtBES1S单独编辑的NtBES1S^CR(CR1)，另外一个是NtBES1S和NtBES1T同时编辑的NtBES1S^CRNtBES1T^CR(CR3)。对其编码蛋白进一步比对发现NtBES1T^CR只有66个氨基酸，发生提前终止，NtBES1S^CR只有48个氨基酸，发生提前终止(图4C)。获得NtBES1SOE、NtBES1TOE组成型过表达材料，命名为CR3(图4D)。

实施例4NtBES1影响T6P信号途径相关基因表达水平

通过对WT、CR3、OET和OES的转录表达谱分析，从转录组差异基因中筛选Inv、TPP、TPS、FK和SnRK相关的DEGs，结果如图5所示，热图结果显示Inv相关基因普遍在CR3中表达量最高，TPS中的Nitab4.5_0002868g0010和Nitab4.5_0000353g0100在CR3中表达量显著低于其他材料，推测该基因在T6P的生物合成中发挥关键作用。TPP中的Nitab4.5_0001992g0010在OET中表达量最高，OET中SnRK在叶片完全展开时表达量较高，随叶片衰老表达量下降。以上分析结果表明NtBES1参与T6P信号途径中关键基因的表达的调控。

实施例5NtBES1影响叶片T6P信号途径

叶片衰老起始前(YL时期)，与对照野生型WT相比，NtBES1基因缺失(CR3)明显促进T6P的合成，T6P含量升高(图6A)。CR3中T6P含量是WT中的1.50倍，是OET、OES中的2.69、3.10倍。TPS和TPP的活性升高(图6C、D)。当叶片进入衰老后(FEL、SL时期)；NtBES1基因过表达，尤其是NtBES1S(OES)，使T6P的含量上升，同时TPS和TPP的活性升高(图6E、F)。这表明NtBES1在叶片衰老起始前后对T6P信号的调控模式相反，幼嫩(YL)叶片NtBES1S和NtBES1T会抑制TPS和TPP的活性，抑制T6P的合成；衰老起始后，NtBES1S和NtBES1T会提高TPS和TPP的活性，促进T6P的合成。NtBES1T促进完全展开叶中NtTPS1基因的表达，NtBES1T和NtBES1S促进衰老叶中NtTPP基因的表达。

实施例6外源蔗糖对NtBES1遗传材料处理后T6P含量变化

烟草幼苗在人工气候室内生长(16h光照：8h黑暗)，光照强度为250±20μmol m-2s-1，昼夜温度分别为26℃和24℃。待烟苗长至60Day，选取6棵生长健壮、长势一致的烟苗，选取第六片叶(完全展开叶，从底部到顶部有效叶)进行蔗糖处理。蔗糖处理实验所需烧杯、打孔器(直径1cm)、镊子和培养提前进行高压灭菌锅灭菌处理。收集叶片并在自来水中清洗15min，用吸水纸擦干后转移到超净工作台上，重新用ddH₂O洗涤15min，70％乙醇浸泡30～60s，3％次氯酸钠浸泡15min，再用ddH₂O洗涤2～3次，然后在叶片中间打孔，避开主脉和叶片边缘。叶圆片漂浮在含有60mM蔗糖的相应1/2MS(Murasge and Skoog)培养基的50mL培养皿中，蔗糖处理组和对照组各设置3个培养皿，每个培养皿中放约50个叶圆片，随后用封口膜对培养基进行密封，操作过程要求无菌，防止培养基被污染。处理好的培养皿放置在人工气候室相同条件下，实验共处理5天。取样在超净工作台中操作，实验进行三次生物学重复，并且每个培养皿中取三个叶圆片，以减小实验误差。

外源施用蔗糖会促进成熟烟草叶片体内T6P的合成。如图7所示，在对照组中，CR3中T6P的含量(根据试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司提供)的说明测定)随处理时间延长不断下降，而WT、OET和OES中T6P含量变化呈先上升后下降的趋势，其中OET和OES的T6P含量均在第五天(D5)时达到最大值，WT中T6P的含量在第一天(D1)时最高。蔗糖处理后，在WT中，外源蔗糖明显促进叶片中T6P含量的增加，T6P含量在处理后第三天(D3)时达到最大值，是同时期对照组中的3.37倍；CR3在处理D3前，T6P的含量逐渐下降，且低于对照组，D5时，T6P含量显著上升，并且是同时期对照组中含量的2.17倍。在OET中，叶片中T6P的含量在蔗糖处理下持续上升，其中在D5时，T6P含量是同时期对照组的4.37倍；在OES中，T6P的含量在蔗糖处理D1时显著上升，且显著高于对照中含量，随后下降。该结果表明NtBES1显著影响叶片中T6P的含量，促进蔗糖增加后叶片中T6P的积累。并且在外源蔗糖诱导T6P含量升高这一过程中，NtBES1T和NtBES1S的作用不同。具体的，NtBES1T对T6P信号的调控受蔗糖诱导，NtBES1S对T6P信号的调控受蔗糖抑制。

实施例8蔗糖处理对NtBES1遗传材料TPP、TPS酶含量的影响

TPP(6-磷酸海藻糖磷酸酶)、TPS(6-磷酸海藻糖合成酶)测定：使用酶联免疫法测定。根据试剂盒(南京卡米洛生物工程有限公司提供)的说明测定，最后计算拟合曲线，根据标准曲线上计算不同样品对应的浓度。

使用酶联免疫法测定6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)含量，结果如图8所示。处理前，CR3叶片TPS含量显著高于其他材料，分别是WT、OET、OES中TPS叶片中含量的1.78倍、2.82倍和2.23倍。在WT中，随处理时间的延长，TPS的含量在对照和蔗糖处理下呈现先升高后下降的趋势，在D3时含量最高，并且蔗糖处理明显促进叶片中TPS含量的上升；在CR3中，在处理D3前，TPS的含量在对照和蔗糖处理下逐渐下降，而且蔗糖促进叶片中TPS的下降，而在D5时，蔗糖显著促进了TPS含量增加，含量是同时期对照组的2.12倍；在OET中，蔗糖处理明显促进叶片中TPS的积累；在OES中，外源蔗糖从D1时开始促进叶片TPS含量的上升。

使用酶联免疫法测定海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)含量，结果如图9所示。CR3初始TPP含量显著高于其他材料，分别是WT、OET、OES中TPP含量的1.35倍、1.67倍和1.81倍。在WT中，对照和蔗糖处理下叶片中TPP的含量呈先升高后下降的趋势，在Day 1时含量最高，蔗糖处理明显促进了TPP的增加。在CR3中，对照处理下，叶片中TPP的含量随处理时间延长而不断下降，而在蔗糖处理下，TPP的含量在处理Day 3前无显著变化，Day 5时开始显著下降，但始终高于对照组。在OET中，对照处理下，叶片中TPP含量随处理时间延长而不断上升，这与CR3中的结果是完全相反的。OET在蔗糖处理下，叶片中TPP含量持续上升，其中在Day 3和Day 5时含量分别是同时期对照组的3.46倍和3.16倍；OES中TPP的含量在蔗糖处理Day 3时受显著促进，是同时期对照的2.23倍。

以上结果表明NtBES1影响T6P的合成，在外源蔗糖促进TPS和TPP含量增加这一过程中起到促进作用，NtBES1S和NtBES1T缺失延缓蔗糖对TPS和TPP含量的下降，而过表达，尤其是NtBES1T则对TPS和TPP的增加起明显促进作用。

实施例9蔗糖处理对NtBES1遗传材料NtTPS、NtTPP基因表达量的影响

提取Total-RNA的试剂盒购自艾科瑞生物公司，得到RNA后，使用分光光度计(TheImplen OD600 DilμPhotometerTM)测定RNA浓度并记录。反转录的试剂盒购自南京诺唯赞生物公司，具体操作步骤如下：

基因组DNA去除：在200μL离心管(RNase free)中配制混合溶液，体系按TotalRNA:1pg-1μg，4×gDNAwiperMix 4μL，用RNase-free ddH₂O补足体系至16μL。用移液器轻轻吹打混匀后进行短暂离心，随后设置PCR程序42℃2min。第1步的反应液中加入5×HiScriptIII qRT SuperMix 4μL，逆转录反应体系。用移液器轻轻吹打混匀后短暂离心，设置PCR程序37℃，15min；85℃，5sec。反应结束后得到的cDNA，如不立即实验，放入-20℃冰箱冻存。使用艾科瑞试荧光定量试剂盒进行荧光定量PCR扩增，以Actin基因为内参，采用2^-ΔΔCT法进行基因表达量分析。

qPCR体系为2×SYBR GreenPro Taq HS10μL，Primer-F 0.4μL，Primer-R 0.4μL，cDNA 1μL，ddH₂O 8.2μL。反应程序为95℃3min 1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环；溶解曲线程序95℃15s，60℃1min，95℃15s，1个循环。荧光定量引物分别是NtTPSF/R、NtTPPF/R。

海藻糖6-磷酸合成酶(TPS)的编码基因NtTPS的基因表达量结果如图10所示，各材料的NtTPS表达量较低，当叶片进入衰老时，NtTPS表达量先上升后下降。与对照相比，WT在蔗糖处理下D5时，NtTPS显著上调，OET和OES的NtTPS在蔗糖处理Day 1时添加蔗糖组比未添加蔗糖组显著增加；而CR3蔗糖处理后Day 1、5时都与对照WT处理无差异，D 3时比添加蔗糖组显著下降。该结果表明NtBES1影响NtTPS基因对蔗糖的响应。

海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)的编码基因NtTPP的基因表达量结果如图11所示，各材料的NtTPP在对照中表达量较低，随处理时间的延长表达量缓慢上升。在蔗糖处理下，WT和CR3材料中的NtTPP表达量在Day 3时著上升，分别是同时间下对照组的3.66倍和4.13倍，而OET和OES中NtTPP在蔗糖处理Day 1时表达量显著上升，分别是同时间下对照组的1.96倍和1.73倍，表明当NtBES1过表达时，蔗糖处理明显促进叶片中NtTPP基因表达水平升高。其中OET在蔗糖处理后D3和D5时NtTPP分别是同时间下对照组的6.53倍和10.06倍，OES中NtTPP的表达量在D5时是对照组的10.36倍。说明外源蔗糖促进叶片NtTPP基因的表达，NtBES1在该过程中起促进作用。

本发明以上所用到的引物如表2所示，数据处理均使用SPSS软件(version 26.0)分析数据，采用LSD法进行单因素的方差分析(P<0.05)，所有数据以平均值±标准误差(SE)表示。作图使用GraphPadPrism 9.0、Origin2021。

表2本发明所用到的引物

Claims (8)

1.植物NtBES1蛋白，其特征在于，包括NtBES1S蛋白和NtBES1T蛋白，前者氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，后者氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的植物NtBES1蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因选自NtBES1S基因和/或NtBES1T基因，其中NtBES1S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，NtBES1T基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的过表达材料或缺失材料。

5.根据权利要求1所述的植物NtBES1蛋白或权利要求2或3所述的编码基因在调控烟草叶片6-磷酸-海藻糖T6P水平中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，NtBES1S基因和NtBES1T基因在叶片成熟前，负调控抑制T6P的合成；NtBES1S基因和NtBES1T基因在叶片成熟后，正调控促进T6P的合成。

7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，在外源蔗糖作用下，NtBES1T基因对T6P的调控受蔗糖诱导，NtBES1S基因对T6P的调控受蔗糖抑制。

8.一种提高烟草产量/质量的方法，其特征在于，通过将权利要求2或3所述的编码基因导入烟草中，以提高烟草的产量/质量。