CN119562821A - 多硫化物的鼻内施用 - Google Patents

Abstract

用于在神经保护中(例如，在神经退行性疾病中)和为了降低缺血性损伤的风险的包含谷胱甘肽三硫化物(GSSSG)、泛硫乙胺三硫化物(PTN‑SSS)、或硫辛酸三硫化物(LA‑SSS)的组合物的鼻施用的方法和装置。所述方法可以用于例如降低可能由手术、外伤、和减少/损害向神经系统的血流量和/或氧输送的其它病况引起的缺血或低血流量状态对大脑、脊髓、和周围神经造成损伤的风险。

Description

多硫化物的鼻内施用

优先权声明

本申请要求于2020年5月20日提交的美国临时申请序列号63/344,095的权益。前述申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

用于在神经保护中(例如，在神经退行性疾病中)和为了降低缺血性损伤的风险的包含谷胱甘肽三硫化物(GSSSG)、泛硫乙胺三硫化物(PTN-SSS)、或硫辛酸三硫化物(LA-SSS)的组合物的鼻施用(nasal administration)的方法和装置。该方法可以用于例如降低可能由手术、外伤、和减少/损害向神经系统的血流量(blood flow)和/或氧输送的其它病况引起的缺血或低血流量状态对大脑、脊髓、和周围神经造成损伤的风险。

背景技术

大约2至12％的进行胸腹主动脉手术的患者经历破坏性的截瘫并发症^1,2。据报告超过80％的术后截瘫是延迟性的，并且其由脊髓中的继发性神经损伤引起^3,4。虽然继发性神经元损伤的致病机制不完全了解，但是已表明增加的氧化应激、线粒体功能障碍、炎症、细胞凋亡和谷氨酸介导的兴奋性毒性扮演重要角色^5,6。由于截瘫的发生(development)在这些患者中是延迟性的，因此存在潜在的预防性干预机会的窗口。然而，迄今为止没有药物治疗已显示为缓解胸腹主动脉手术之后的延迟性截瘫。

发明内容

如本文所示，当在再灌注之后经鼻递送时，谷胱甘肽三硫化物(GSSSG)和泛硫乙胺三硫化物(PTN-SSS)防止SCI之后的延迟性截瘫。GSSSG的神经保护作用与增加的腰椎脊髓中的局部硫烷硫浓度相关。

因此，本文提供的是使用GSSSG、PTN-SSS、或硫辛酸三硫化物(SSS)的鼻施用用于在受试者中治疗与神经退行性变相关的病症或降低与神经退行性变相关的病症的风险的方法。在一些实施方案中，该方法包括包含通过将结晶形式的GSSSG溶解于pH 3-6(例如，pH4.8-5.0)的盐水中来制备包含GSSSG的组合物。也提供的是用于在受试者中治疗与神经退行性变相关的病症或降低与神经退行性变相关的病症的风险的方法中的用于鼻施用的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的组合物，任选地通过将结晶形式的GSSSG溶解于pH 3-6(例如，pH 4.8-5.0)的盐水中制备的组合物。

在一些实施方案中，病症为缺血后神经元死亡。

在一些实施方案中，病症为慢性脑退行性疾病，例如，多发性梗塞性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、或路易体痴呆。

在一些实施方案中，该方法包括在外伤性损伤发生之后的几分钟至几小时内施用有效量的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的组合物。

在一些实施方案中，该方法包括在预定的胸主动脉和/或腹主动脉外科手术(surgical procedure)之前施用有效量的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的组合物。

在一些实施方案中，该方法包括在预定的胸主动脉和/或腹主动脉外科手术之前的几小时至几天施用有效量的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的组合物。

在一些实施方案中，该方法包括在预定的胸主动脉和/或腹主动脉外科手术之前的2-24小时，和/或1、2、3、4、5、6、和/或7天施用有效量的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的组合物。

本文也提供的是用于将GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS鼻施用至受试者的装置。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其它合适的方法和材料。材料、方法、和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其它参考文献均通过引用整体并入。在冲突的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。

本发明的其它特征和优点将从以下详细描述和附图中，以及从权利要求书中显而易见。

附图说明

图1A-C.多硫化物的化学结构。A.GSSSG和GSH的化学结构。一分子GSSSG由一分子硫烷硫(箭头)和两分子GSH组成。B.PTN-SSS和PTN的化学结构。一分子PTN-SSS由一分子硫烷硫(箭头)和一分子PTN组成。C.LA-SSS和LA的化学结构。一分子LA-SSS由一分子硫烷硫(红色)和一分子LA组成。缩写词：GSH，谷胱甘肽；GSSSG，谷胱甘肽三硫化物；PTN，泛硫乙胺；PTN-SSS，泛硫乙胺三硫化物；LA-SSS，硫辛酸三硫化物。

图2A-B.用于探究多硫化物的神经保护作用的脊髓缺血再灌注损伤的小鼠模型。A.产生延迟性截瘫的外科手术的时间过程的示意图。SCI通过夹紧远端主动脉弓和左锁骨下动脉进行诱导。B.在外科手术和灌注的恢复之后的研究性药物(study drug)的鼻内施用的方案。研究性药物的鼻内施用在手术之后的0、8、23、和32小时在3％异氟烷下进行。在手术之后的0、8、24、48、和72小时测量BMS以评价后肢运动功能。缩写词：BMS，Basso小鼠运动量表(Basso mouse scale for locomotion)；PEEP，呼气末正压；RR，呼吸频率；SCI，脊髓缺血；TV，潮气量。

图3.用GSSSG进行的再灌注后处理在雄性和雌性小鼠中防止脊髓缺血之后的截瘫。在经受假外科手术的雄性和雌性小鼠，或经受SCI并且用GSSSG、GSH、或单独运载体处理的雄性和雌性小鼠中在SCI之后的72小时的BMS分数的变化。雄性小鼠群组中GSSSG、GSH、和单独运载体处理中每一个的n＝11，并且雌性小鼠群组中GSSSG、GSH、和单独运载体处理中每一个的n＝8。假外科手术组的n＝5小鼠。数据表示为平均值和标准偏差。缩写词：BMS，Basso小鼠运动量表；GSH，谷胱甘肽；GSSSG，谷胱甘肽三硫化物；SCI，脊髓缺血。

图4A-B.用GSSSG进行的再灌注后处理防止在脊髓缺血之后的48小时的腰椎脊髓中的运动神经元的丧失。A.来自经受假外科手术的小鼠，或经受SCI并且用GSSSG或单独运载体处理的小鼠的尼氏染色(Nissl-stain)腰椎脊髓横切面的代表性显微照片。方框区域的放大在每个横切面的下方提供。低倍放大图像(40×)中的比例尺＝200μm，并且高倍放大图像(200×)中的比例尺＝100μm。B.在来自经受假外科手术，或SCI和用单独运载体、或GSSSG处理的小鼠的腰椎脊髓切片的腹侧角中在高倍放大(200×)下的每一个视野(0.26mm²)中的可存活神经元的数目。使用具有Tukey多重比较检验的单因素方差分析进行比较。每组n＝5只小鼠。数据表示为平均值和标准偏差。缩写词：GSSSG，谷胱甘肽三硫化物；LSC，腰椎脊髓；SCI，脊髓缺血。

图5A-D.用GSSSG进行的再灌注后处理防止在脊髓缺血之后的48小时的腰椎脊髓中的小胶质细胞激活和胱天蛋白酶-3激活。A.腰椎脊髓从经受假外科手术的小鼠，或经受SCI并且用GSSSG或单独运载体处理的小鼠中获得。显示了用抗Iba-1抗血清染色的腰椎脊髓横切面的代表性显微照片。方框区域的放大在每个横切面的下方提供。低倍放大图像(40×)中的比例尺＝200μm，并且高倍放大图像(200×)中的比例尺＝100μm。B.在来自经受假外科手术的小鼠，或经受SCI并且用GSSSG或单独运载体处理的小鼠的腰椎脊髓切片的腹侧角中在高倍放大(200×)下的每一个视野(0.26mm²)中的Iba-1阳性面积。使用具有Tukey多重比较检验的单因素方差分析进行比较。假手术组的小鼠中Iba-1阳性面积的平均值设置为1。每组n＝5只小鼠。数据表示为平均值和标准偏差。C.用识别裂解的胱天蛋白酶-3的抗体染色的腰椎脊髓横切面中腹侧角的代表性显微照片。比例尺＝100μm。D.在腰椎脊髓切片的腹侧角中在高倍放大(200×)下的每一个视野(0.26mm²)中具有阳性裂解的胱天蛋白酶-3免疫反应性的神经元的数目。使用具有Dunn多重比较检验的克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)进行比较。每组n＝5只小鼠。数据表示为中位数和四分位距。缩写词：GSSSG，谷胱甘肽三硫化物；Iba-1，离子钙结合衔接分子1；LSC，腰椎脊髓；SCI，脊髓缺血。

图6.用GSSSG进行的再灌注后处理抑制在脊髓缺血之后的48小时的腰椎脊髓中的炎症介质的上调。小鼠受到假外科手术，或SCI然后是GSSSG或单独运载体的鼻内施用。收获腰椎脊髓，并且将各基因的mRNA水平标准化为18S核糖体RNA。假手术组中小鼠的腰椎脊髓mRNA水平的平均值设置为1。每组n＝4-5只小鼠。相对于假手术，*P<0.05，**P<0.01。数据对于CCL2、CXCL1、IL-1β、IL-6、和TNF-α表示为中位数和四分位距，并且对于Bcl-2和Bcl-XL表示为平均值和标准偏差。缩写词：Bcl-2，B细胞淋巴瘤2；Bcl-XL，B细胞淋巴瘤超大型；CCL2，C-C基序趋化因子2；CXCL1，C-X-C基序趋化因子配体1；GSSSG，谷胱甘肽三硫化物；IL，白细胞介素；mRNA，信使RNA；SCI，脊髓缺血；TNF-α，肿瘤坏死因子α。

图7A-B.GS³⁴SSG的鼻内施用增加CNS中³⁴S标记的GSSSG的水平和³⁴S标记的硫烷硫类物质与内源性硫烷硫类物质的比例。A.在50mg/kg的GS³⁴SSG的鼻内施用之后的30分钟在OB+FB、BS、C+ThSC、和LSC中检测的³⁴S标记的GSSSG的量。OB+FB、BS、和C+ThSC的n＝4只小鼠。LSC的n＝3只小鼠。数据表示为平均值和标准偏差。B.在50mg/kg的GS³⁴SSG的鼻内施用之后的30分钟的OB+FB、BS、C+ThSC、和LSC中[³²S,³⁴S]GSSH与[³²S₂]GSSH的比例，[³²S,³⁴S]CysSSH与[³²S₂]CysSSH的比例，和[³²S₂,³⁴S]CysSSSCys与[³²S₃]CysSSSCys的比例。每种器官n＝4只小鼠。数据对于[³²S,³⁴S]GSSH与[³²S₂]GSSH的比例和[³²S₂,³⁴S]CysSSSCys与[³²S₃]CysSSSCys的比例表示为平均值和标准偏差，并且对于[³²S,³⁴S]CysSSH与[³²S₂]CysSSH的比例表示为中位数和四分位距。缩写词：BS，脑干；CNS，中枢神经系统；C+ThSC，颈椎和胸椎脊髓；CysSSH，半胱氨酸氢过硫化物；CysSSSCys，半胱氨酸三硫化物；GSSH，谷胱甘肽氢过硫化物；GSSSG，谷胱甘肽三硫化物；LC-MS/MS，液相色谱-串联质谱；LSC，腰椎脊髓；OB+FB，嗅球和前脑。

图8A-B.GSSSG增加腰椎脊髓和原代皮层神经元中的相对硫烷硫水平。A.经受假外科手术的小鼠，或经受SCI并且用GSSSG或单独运载体处理的小鼠中在手术之后的48小时的腰椎脊髓中的相对硫烷硫水平。腰椎脊髓中的相对硫烷硫水平使用荧光探针SSip-1进行估计。每组n＝6只小鼠。数据表示为平均值和标准偏差。B.在用10μM的GSSSG、10μM的Na₂S₃、或单独运载体孵育之后的原代皮层神经元中的相对硫烷硫水平。数据使用具有Dunnett多重比较检验的单因素方差分析进行分析。GSSSG组和运载体组的n＝10。Na₂S₃组的n＝5。数据表示为平均值和标准偏差。缩写词：GSSSG，谷胱甘肽三硫化物；Na₂S₃，三硫化二钠；SCI，脊髓缺血。

图9A-C.GSSSG(而不是GSH或GSSG)改善氧和葡萄糖剥夺/复氧之后的细胞生存力。A.当用不同剂量的GSSSG孵育原代皮层神经元时在OGD/R之后通过结晶紫测定评估的细胞生存力。使用具有Dunnett多重比较检验的单因素方差分析进行比较。每组n＝10。数据表示为平均值和标准偏差。B.当用不同剂量的GSSSG孵育原代皮层神经元时在OGD/R之后通过LDH测定评估的细胞生存力。使用具有Dunnett多重比较检验的单因素方差分析进行比较。每组n＝10。数据表示为平均值和标准偏差。C.当原代皮层神经元用30μM的GSSSG、60μM的GSH、30μM的GSSG、或单独运载体孵育时，OGD/R之后的细胞生存力通过结晶紫测定进行评估。使用具有Dunn多重比较检验的克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行比较。每组n＝10。数据表示为中位数和四分位距。缩写词：CV，结晶紫；GSH，谷胱甘肽；GSSG，谷胱甘肽二硫化物；GSSSG，谷胱甘肽三硫化物；LDH，乳酸脱氢酶；OGD/R，氧和葡萄糖剥夺/复氧。

图10A-D.PTN-SSS作为再灌注后处理改善OGD/R之后的细胞生存力并且防止SCI之后的延迟性截瘫。A.当SH-SY5Y细胞用5μM、10μM、25μM、50μM、100μM的PTN-SSS或单独运载体孵育时，细胞生存力在OGD/R之后使用结晶紫测定进行评估。使用具有Dunnett多重比较检验的单因素方差分析进行比较。对照、单独运载体以及5μM、10μM和25μM的PTN-SSS的n＝12。50μM和100μM的PTN-SSS的n＝6。数据表示为平均值和标准偏差。B.在用5μM、10μM、50μM、100μM、300μM的PTN-SSS或单独运载体孵育之后的SH-SY5Y细胞中的相对硫烷硫水平。使用具有Dunnett多重比较检验的单因素方差分析进行比较。每组n＝6。数据表示为平均值和标准偏差。C.PTN-SSS的鼻内施用之后的30分钟的嗅球和前脑以及全脊髓中的相对硫烷硫水平。相对硫烷硫水平使用荧光探针SSip-1进行估计。使用非配对t检验进行比较。每组n＝5只小鼠。数据表示为平均值和标准偏差。D.在经受SCI并且用单独运载体、PTN、或PTN-SSS处理的雄性小鼠中在SCI之后的72小时的BMS分数的变化。使用具有Dunn多重比较检验的克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行比较。每组n＝9只小鼠。数据表示为平均值和标准偏差。缩写词：BMS，Basso小鼠运动量表；CV，结晶紫；LDH，乳酸脱氢酶；OB+FB，嗅球和前脑；OGD/R，氧和葡萄糖剥夺/复氧；PTN，泛硫乙胺；PTN-SSS，泛硫乙胺三硫化物；SCI，脊髓缺血。

图11.GSSSG和GSSG对SCI之后的后肢运动功能的神经保护作用的比较。在经受SCI并且用GSSSG或GSSG处理的雄性小鼠中在SCI之后的72小时的BMS分数的变化。每组n＝6只小鼠。数据表示为平均值和标准偏差。缩写词：BMS，Basso小鼠运动量表；GSSG，谷胱甘肽二硫化物；GSSSG，谷胱甘肽三硫化物；SCI，脊髓缺血。

图12.在手术之后的48小时获得的腰椎脊髓中合成或代谢硫化物或过硫化物的酶的相对mRNA水平。小鼠受到假外科手术，或经受SCI然后是GSSSG或单独运载体的鼻内施用。收获腰椎脊髓，并且将各基因的mRNA水平标准化为18S核糖体RNA。假手术组中小鼠的腰椎脊髓mRNA水平的平均值设置为1。每组n＝4-5只小鼠。相对于假手术，*P<0.05，****P<0.0001。数据对于CBS、TST、和SUOX表示为中位数和四分位距，并且对于CSE、3-MST、SQOR、ETHE1、CARS1、和CARS2表示为平均值和标准偏差。缩写词：CARS，半胱氨酰-tRNA合成酶；CBS，胱硫醚β合成酶；CSE，胱硫醚γ裂解酶；ETHE1，乙基丙二酸脑病蛋白1(ethylmaronicencephalopathy 1)；GSSSG，谷胱甘肽三硫化物；mRNA，信使RNA；SCI，脊髓缺血；SQOR，硫化物:醌氧化还原酶；SUOX，亚硫酸盐氧化酶；3-MST，3-巯基丙酮酸硫转移酶；TST，硫代硫酸盐硫转移酶。

图13.GSSSG对细胞生存力的细胞毒性作用。原代皮层神经元用10μM、30μM、60μM、100μM的GSSSG，或单独运载体进行孵育。细胞生存力使用LDH测定进行评估。与仅运载体处理的细胞相比，100μM的GSSSG的孵育显著增加LDH释放(单独运载体与GSSSG(100μM)；105[85-110]％与149[133-159]％；P<0.0001)。使用具有Dunn多重比较检验的克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行比较。每组n＝10。数据表示为中位数和四分位距。缩写词：LDH，乳酸脱氢酶；GSSSG，谷胱甘肽三硫化物。

图14.PTN-SSS对细胞生存力的细胞毒性作用。SH-SY5Y细胞用5μM、10μM、25μM、50μM、100μM的PTN-SSS，或单独运载体进行孵育。细胞生存力使用结晶紫测定进行评估。与仅运载体处理的细胞相比，100μM的PTN-SSS的孵育显著减少细胞生存力(单独运载体与PTN-SSS(100μM)；1.00±0.25与0.59±0.21；P＝0.0105)。使用具有Dunnett多重比较检验的单因素方差分析进行比较。单独运载体以及5μM、10μM、和25μM的PTN-SSS的n＝12。50μM和100μM的PTN-SSS的n＝6。数据表示为平均值和标准偏差。缩写词：CV，结晶紫；PTN-SSS，泛硫乙胺三硫化物。

图15A-C.硫化物和多硫化物对用MPP⁺孵育的SH-SY5Y细胞和原代皮层神经元的细胞生存力的影响。(A)SH-SY5Y细胞或(B和C)鼠原代皮层神经元在37℃下在有或没有三硫化物化合物的情况下用或不用MPP⁺孵育24h。细胞生存力使用结晶紫测定进行测量(每组n＝4或5)。相对于没有三硫化物处理的对照，*、**、***p<0.05、0.01、0.001。

图16.GSSSG的鼻内施用对MPTP诱导的神经退行性变的影响。代表性的免疫印迹显示在有或没有Na₂S₃处理的情况下在MPTP或盐水的施用之后7天的小鼠的黑质纹状体区域中的酪氨酸羟化酶的水平。酪氨酸羟化酶的相对水平的定量使用密度测定法确定，比较酪氨酸羟化酶与粘着斑蛋白的水平(分别为n＝5、4、5只小鼠)。相对于盐水+盐水，**p<0.01。相对于MPTP+盐水，##p<0.05。

具体实施方式

硫化氢(H₂S)，是一种具有特征性臭鸡蛋气味的无色气体，其是由各种自然和工业来源产生的环境危害。H₂S也被认为是信号分子，其发挥多种生理作用⁷。H₂S的许多作用已归因于诸如过硫化物(RSSH)和多硫化物(RS_nH)等硫烷硫类物质(sulfane sulfur species)⁸。硫烷硫类物质的细胞保护作用可以通过多种机制介导，所述机制包括抗氧化剂作用^9,10和抗炎作用^10,11、通过清除自由基抑制脂质过氧化和铁死亡¹²、和蛋白质的翻译后修饰^13,14。硫烷硫类物质在蛋白质中产生翻译后修饰，这是因为硫烷硫(S⁰)(具有6个价电子但没有电荷的硫原子)在称为过硫化的过程中很容易供至目标蛋白中的受体硫醇，这调节了目标蛋白的功能^13,14。在先前的研究中，我们显示出呼吸H₂S防止经受短暂脊髓缺血(SCI)的小鼠中的延迟性截瘫。H₂S的神经保护作用似乎与核因子κB(NF-kB)p65的过硫化相关¹⁵。

全身施用H₂S供体化合物调节目标组织中反应性硫类物质的浓度的机制未明确定义，部分原因是血中H₂S的短半衰期¹⁶。这种涉及硫化物的体内药代动力学的知识空白阻碍了将基于硫化物的疗法应用至患者护理。为了允许未来使用多硫化物来治疗神经退行性疾病，必不可少的是确定多硫化物的施用是否调节中枢神经系统(CNS)中硫烷硫类物质的局部浓度。

谷胱甘肽三硫化物(GSSSG)是内源性多硫化物(图1A)，并且其与包括谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽氢过硫化物(GSSH)、谷胱甘肽氢多硫化物、和其它谷胱甘肽多硫化物在内的各种反应性硫类物质处于动态平衡^9,17。GSSSG可以是硫烷硫类物质的重要内源性储库(reservoir)。观察到的是硫烷硫类物质的水平在患者中根据疾病的类型和严重性变化，表明硫烷硫类物质可以在病理条件中具有保护作用^18,19。

GSH，其是谷氨酸、半胱氨酸、和甘氨酸的天然三肽，其在哺乳动物细胞中是遍在的并且是哺乳动物细胞中最普遍的硫醇(RSH)。GSH是亲核试剂并且在哺乳动物细胞中起主要的细胞内抗氧化剂的作用²⁰。据报道，GSH具有针对缺血-再灌注损伤的神经保护作用²¹。谷胱甘肽二硫化物(GSSG)是GSH的氧化形式，并且其主要由GSH过氧化物酶介导的催化作用产生或从GSH与诸如自由基类物质等亲电化合物的直接反应中产生²⁰。GSH和GSSG二者可以通过“谷胱甘肽化”产生蛋白质的翻译后修饰，谷胱甘肽化保护蛋白质半胱氨酸免受不可逆氧化并且调节各种各样的蛋白质的结构和功能^20,22-24。

泛硫乙胺(PTN)，是辅酶A的合成的前体，其将来自丙酮酸的乙酰基转移至草酰乙酸，起始三羧酸循环²⁵。临床前研究表明PTN在神经退行性疾病的小鼠模型中的有益作用^26,27。泛硫乙胺三硫化物(PTN-SSS)，是一种多硫化物，其由一分子硫烷硫和一分子PTN组成(图1B)；参见WO2022/045052。

硫辛酸三硫化物是预期穿过血脑屏障并且递送到CNS中的相对小的分子(MW＝238.39；参见，例如WO2022/045212)。硫辛酸三硫化物(而不是硫辛酸)在帕金森病的细胞模型中改善细胞生存力，类似于GSSSG。在将其“硫烷硫”递送到细胞中之后，所得硫辛酸和二氢硫辛酸可以发挥它们自己的生物特性，例如抗氧化剂、金属螯合剂、线粒体酶的辅因子。LA-SSS由一分子硫烷硫和一分子LA组成。在一些实施方案中，LA-SSS是α硫辛酸、或LA-SSS-βCD(硫辛酸三硫化物-β环糊精或LA-SSS-CE(胆碱酯)；参见WO2022/045212。

本研究在已经确立的脊髓缺血的小鼠模型中探究了多硫化物的鼻内施用的神经保护作用和药代动力学。在该小鼠模型中，神经退行性变主要在再灌注之后的24-48小时在腰椎脊髓的腹侧角中发生^6,28,29。实验确定了多硫化物的鼻内施用是否会优先增加CNS中的多硫化物的水平^30-32。假设CNS靶向的、硫化物的鼻内施用会通过增加硫烷硫类物质的局部浓度来防止腰椎脊髓中的神经退行性变，并且将会从延迟性截瘫中挽救小鼠。

在本研究中，我们显示出GSSSG(而不是GSH或GSSG)的再灌注后鼻内施用防止腰椎脊髓的腹侧角中的可存活神经元的大量丧失，并且从SCI之后的延迟性截瘫中挽救小鼠。在原代皮层神经元中，GSSSG(而不是GSH或GSSG)在OGD/R之后改善细胞生存力。GSSSG的有益效果与炎症细胞因子增加水平的抑制以及小胶质细胞激活和胱天蛋白酶-3激活的抑制相关。几种³⁴S标记的硫烷硫类物质的明显增加在GS³⁴SSG的鼻内施用之后不久在腰椎脊髓中检测到。此外，我们观察到GSSSG的保护作用与在GSSSG的鼻内施用之后的腰椎脊髓中增加的硫烷硫水平以及在用GSSSG孵育之后的原代皮层神经元中增加的硫烷硫水平相关。此外，用PTN-SSS孵育SH-SY5Y细胞增加细胞内硫烷硫水平并且改善OGD/R之后的细胞生存力，而PTN-SSS(而不是PTN)的再灌注后鼻内施用从SCI之后的延迟性截瘫中挽救小鼠。PTN-SSS在鼻内施用之后不久增加中枢神经系统中的硫烷硫水平。这些观察结果表明，硫烷硫可以随着多硫化物的鼻内施用容易地递送至中枢神经系统，并且表明这种处理防止腰椎脊髓中的延迟性神经退行性变，缓解延迟性截瘫。该研究的结果强调了多硫化物在防止脊髓的神经退行性变中的重要治疗潜力。

先前，我们使用用SH-SY5Y细胞的化学诱导的细胞毒性模型来显示出H₂S供体化合物的细胞保护作用与它们增加细胞内硫烷硫水平的能力相互关联⁴⁵。我们也报道了硫代硫酸钠的施用改善经受全脑缺血-再灌注的小鼠的生存和神经功能；细胞保护作用与血浆和脑组织中硫代硫酸盐(一种硫烷硫类物质)的明显增加相关⁴⁶。这些结果表明，增加硫烷硫的浓度在病理条件中可以是神经保护性的。在该研究中，我们显示出鼻内GSSSG在SCI诱导的脊髓损伤中的神经保护作用与腰椎脊髓中增加的硫烷硫水平相关。结果支持GSSSG的神经保护作用通过增加的硫烷硫来介导的假设。

先前的临床前研究表明，GSH的施用减轻脑缺血-再灌注之后的神经元细胞死亡^21,47。因为GSH是GSSSG的代谢产物^9,17，有可能的是GSH的增加的浓度可以解释GSSSG的神经保护作用。然而，在目前的研究中，我们观察到GSSSG(而不是GSH)的鼻内施用防止SCI之后的延迟性截瘫。关于GSH的效果的目前报道与先前报道之间的差异的原因可以由GSH的剂量、施用的途径、和动物模型的差别引起。特别地，目前的研究中使用的GSH的剂量是先前的研究中使用的GSH的剂量的十分之一。该研究的结果支持GSSSG介导的神经保护的机制不依赖向GSH的转化的假设。

细胞内硫烷硫类物质可以与GSH反应，导致GSSH的生成⁹。与GSH相比，GSSH是更加亲核的，并且是更好的细胞内抗氧化剂。此外，GSSH可以直接由GSSSG生成⁹。Akaike和其同事报道了小鼠的脑中的内源性GSSH的浓度为222pmol/mg蛋白质，其显著大于其它内源性硫烷硫类物质的浓度，包括GSSSG(1pmol/mg蛋白质)、CysSSH(2pmol/mg蛋白质)、或CysSSSCys(未检测出)^9,37。在目前的研究中，³⁴S标记的GSSSG在GS³⁴SSG的鼻内施用之后的30分钟在腰椎脊髓中以317±111pmol/mg蛋白质被检测到。此外，基于先前报道的内源性GSSH和CysSSH的水平³⁷，在GS³⁴SSG的鼻内施用之后的腰椎脊髓中的³⁴S标记的GSSH和³⁴S标记的CysSSH的水平分别为大约1,600pmol/mg蛋白质和18pmol/mg蛋白质^9,37。这些结果显示出GSSSG的鼻内施用可以在腰椎脊髓(SCI之后的神经元死亡的中心)中将多种硫烷硫类物质的水平增加约10至100倍。考虑到GSSH是GSSSG的鼻内施用之后在腰椎脊髓中数量上最主要的硫烷硫类物质，GSSSG的神经保护作用的大部分可以经由GSSH赋予。

先前的研究显示出，在全身施用之后，大于500Da的分子无法穿过血脑屏障和血脊髓屏障³¹。由于GSSSG的大尺寸(644.7Da)，我们选择鼻内施用该化合物。在鼻内施用之后，大分子可以通过嗅觉和三叉神经通路绕过血脑屏障和血脊髓屏障，并且可以迅速到达中枢神经系统的实质^30,32。外周嗅觉系统连接鼻道与嗅球和喙脑(rostral brain)，并且外周三叉神经系统连接鼻道与脑干和脊髓³⁰。例如，先前的报道在到达脊髓的甲泼尼龙琥珀酸钠(497.5Da)的量方面比较了静脉内和鼻内施用途径⁴⁸。虽然相对大的量的甲泼尼龙在鼻内施用之后的脊髓的实质中检测到，但是小得多的量的甲泼尼龙在静脉施用之后检测到⁴⁸。各种其它高分子量治疗剂(>500Da)通过鼻内施用成功地递送至中枢神经系统⁴⁹。在目前的研究中，我们观察到中枢神经系统中³⁴S标记的GSSSG的浓度(268±140pmol/mg蛋白质)在GS³⁴SSG的鼻内施用之后的30分钟时明显高于小鼠的脑中内源性GSSSG的浓度(1pmol/mg蛋白质)³⁷。相反地，血浆中³⁴S标记的GSSSG的浓度(25±10nM)显著低于野生型小鼠的血浆中的内源性GSSSG(125nM，Akaike和其同事未发表的数据)。这些结果表明，鼻内施用的GSSSG容易并且优先通过嗅觉和三叉神经通路(而不是血流(blood stream))到达包括脊髓在内的中枢神经系统。

存在对该研究的一些限制。第一，除了这些作用与硫烷硫在目标器官中的增加水平、炎症细胞因子的增加水平的抑制、以及小胶质细胞激活和胱天蛋白酶-3激活的抑制相关，并且不太可能归因于反式谷胱甘肽化(transglutathionylation)的事实之外，我们无法确定负责多硫化物的有益作用的详细机制。多硫化物似乎经由多种机制呈细胞保护作用，所述机制包括充当抗氧化剂^9,10和抗炎剂^10,11、抑制脂质过氧化和铁死亡¹²、和增强蛋白质的翻译后修饰^13,14。负责多硫化物的神经保护作用的精确机制仍要在未来的研究中阐明。第二，我们没有探究GSSSG抑制SQOR(一种将硫化物分解代谢为GSSH的蛋白质)的mRNA水平的机制。GSSSG的鼻内施用之后的增加水平的GSSH可以经由负反馈下调SQOR的表达。第三，尽管GSSSG和PTN-SSS在轻度镇静下鼻内施用，但是一些小鼠从它们的鼻子中咳出药物或吞下药物。由本研究中的多硫化物赋予的细胞保护作用很可能反映了成功施用较低剂量的效果。随着更适合临床应用的更好的药物制剂得到开发，我们预计多硫化物的有益效果将使用较低剂量实现。

目前的研究揭示了GSSSG或PTN-SSS(而不是GSH、GSSG、或PTN)的再灌注后鼻内施用从延迟性截瘫中挽救经受SCI的小鼠。鼻内施用的GSSSG在腰椎脊髓中积累，增加过硫化物、多硫化物、和硫烷硫的局部浓度，并且减少神经炎症、细胞凋亡、和神经退行性变。鼻内施用的GSSSG的强效神经保护作用与吸入H₂S的强效神经保护作用相似，但是使用包括GSSSG和PTN-SSS在内的多硫化物比气态H₂S的施用在临床医学中更加实用。特别地，PTN-SSS的优异物理特性值得进一步评价用于临床开发。该研究开辟了新型基于多硫化物的疗法的可能性，以在胸腹主动脉手术和其它脊髓的神经退行性疾病之后防止延迟性截瘫的发生。

我们也观察到三硫化物化合物在MPTP/MPP⁺诱导的细胞损伤(PD的模型)中的保护作用。Na₂S₃的小尺寸允许我们腹腔内递送分子，期望其会穿过血脑屏障。由于GSSSG的大尺寸，我们在PD的动物模型中鼻内递送该化合物，结果显示看到了保护作用，证明了在神经退行性疾病中提供神经保护的有用性。

治疗的方法

本文描述的方法包括用于在受试者，例如，哺乳动物受试者，例如，人类受试者或非人类兽医受试者中治疗与神经退行性变相关的病症或降低与神经退行性变相关的病症的风险的方法。在一些实施方案中，病症为缺血后神经元死亡，例如，脊髓中的缺血后神经元死亡。在一些实施方案中，病症为慢性脑退行性疾病(例如，多发性梗塞性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、或路易体痴呆)。通常，该方法包括将治疗有效量的如本文所述的包含结晶形式的GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的组合物鼻施用至需要此类治疗或已经确定为需要此类治疗的受试者。

如在本文中使用的，“治疗”意指减轻与神经退行性变相关的病症的至少一种症状。可以使用本文描述的方法治疗的病况可以与运动控制的丧失、瘫痪或截瘫相关。治疗有效量的本文描述的化合物的施用可以导致改善的运动控制、降低的瘫痪或截瘫。

此外，该方法可以导致发生运动控制的丧失、瘫痪或截瘫的风险的降低。处于发生运动控制的丧失、瘫痪或截瘫的风险的受试者可以包括患有外伤性损伤的那些受试者以及即将受到胸主动脉和/或腹主动脉手术的那些受试者。这些方法可以包括在外伤性损伤发生之后的几分钟至几小时内和/或在例如在预定的胸主动脉和/或腹主动脉外科手术之前的几小时至几天之前鼻施用有效量的如本文所述的GSSSG、PTN-SSS或LA-SSS组合物。

“有效量”为足以实现有益结果或期望结果的量。例如，治疗量为达到期望的治疗效果的量。该量可以与预防性有效量相同或不同，预防性有效量为预防疾病或疾病症状的发作所必需的量。有效量可以在一次或多次施用、应用或剂量中施用。组合物可以从每天一次或多次至每周一次或多次(包括每隔一天一次)施用。在一些实施方案中，GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS在预定的胸主动脉和/或腹主动脉外科手术之前的至少2、3、4、5、6、或7天每天施用。技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄、和存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的本文描述的治疗性化合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。

治疗性化合物的剂量、毒性和治疗功效可以在细胞培养或实验动物中通过标准药物程序来确定，例如，用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性效果与治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且其可以表示为比例LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。虽然可以使用表现出毒副作用的化合物，但是应当注意设计将此类化合物靶向受影响组织的部位的递送系统，以便使对未感染细胞的潜在损害最小化并且由此降低副作用。

从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用于制定用于人类的剂量的范围。此类化合物的剂量优选在包括具有很小毒性或无毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以根据采用的剂型和利用的施用途径在该范围内变化。对于在本发明的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以初步从细胞培养测定中估计。可以在动物模型中制定剂量以达到包括如在细胞培养中确定的IC50(即，达到症状的半数最大抑制的试验化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可以用于更准确地确定在人体中有用的剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱进行测量。

药物组合物和施用的方法

本文描述的方法包括使用包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS作为活性成分的药物组合物。在一些实施方案中，组合物使用结晶形式的GSSSG、使用EP 3560947中描述的方法、通过将结晶GSSSG溶解于pH 3-6(例如，pH 4.8-5)的缓冲液(例如，盐水)中进行制备。pH可以用诸如盐酸或氢氧化钠等酸或碱进行调节。包含PTN-SSS或LA-SSS的组合物可以通过溶解于pH 4-9(例如，5-8)的缓冲液(例如，盐水或水)中来制备。

用于生产晶体形式的谷胱甘肽三硫化物脱水物的示例性方法可以包括在溶解有谷胱甘肽三硫化物的水溶液中使谷胱甘肽三硫化物二水合物的晶体沉淀，并且收集沉淀的谷胱甘肽三硫化物二水合物的晶体。PTN-SSS或LA-SSS可以按照WO2022/045212(LA-SSS)和WO2022/045052(PTN-SSS)中所述进行制备。

药物组合物通常包括药学上可接受的载体。如本文所用，语言“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充活性化合物也可以并入组合物中。

用于本方法的药物组合物配制为与鼻施用相容。施用的途径的实例包括肠胃外施用，例如静脉内施用。

配制合适的药物组合物的方法是本领域已知的，参见，例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第21版,2005；和系列Drugs and thePharmaceutical Sciences:a Series of Textbooks and Monographs(Dekker,NY)中的书籍。

为了粘膜治疗施用的目的，活性化合物(例如，GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS)可以与适合通过吸入或吸收而施用的赋形剂或载体合并，例如，经由鼻喷雾剂或滴剂。对于鼻施用，制剂可以是密封小瓶或其它适合容器中的气雾剂。

药物组合物和鼻剂型可以进一步包含一种或多种降低活性成分将分解的速率的化合物。因此，本文描述的鼻剂型可以加工成速释剂型或缓释剂型。速释剂型可以在相当短的时间内例如在几分钟内至在几小时内释放GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS。缓释剂型可以在几个小时的时间内例如如果需要则多达24小时或更长时间释放GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS。在任一情况下，递送可以在递送期间内控制为实质上处于一定的预定速率。

鼻递送被认为是用于无针的全身药物递送的有吸引力的途径，尤其是当期望快速吸收和作用时。此外，鼻递送可以帮助解决胃肠道中与差的生物利用度、缓慢吸收、药物降解、和不良事件(AE)有关的问题，并且避免肝脏中的首过代谢。

液体鼻制剂主要是水溶液，但是悬浮液和乳剂也可以递送。在传统的喷雾泵系统中，通常需要抗菌防腐剂来维持液体制剂中的微生物稳定性。

计量喷雾泵自从引入以来一直占据鼻药物递送市场。该泵通常递送约25-200μL/喷雾，并且它们提供喷射剂量和羽流几何形状(plume geometry)的高再现性。颗粒尺寸和羽流几何形状可以在一定限度内变化，并且取决于泵、制剂、致动器的孔口、和施加的力的特性。传统的喷雾泵用空气代替喷射的液体，并且因此需要防腐剂来防止污染。

避免需要防腐剂的可选喷雾系统或装置也可以使用。这些系统使用可折叠袋、可移动活塞、或压缩气体来补偿喷射的液体体积。使用补偿喷射的液体体积的可折叠袋和可移动活塞的解决方案提供额外的优势，即它们可以倒置喷射，而没有将空气吸入汲取管并且损害后续喷雾的风险。这可以对于其中患者卧床不起并且其中建议低头施加的一些产品是有用的。用于避免防腐剂的另一方法是，代替喷射的液体的空气通过无菌空气过滤器进行过滤。此外，一些系统在尖端处具有球阀以防止涂抹器尖端内部的液体的污染。

对于通过吸入的施用，GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS化合物可以从含有合适推进剂(例如，诸如二氧化碳等气体)的压力容器或分配器，或者雾化器中以干粉或气雾剂喷雾的形式递送。此类方法包括美国专利No.6,468,798中描述的那些。

本文也提供了例如如本文所述的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的用于鼻施用的装置。

本文描述的是试剂盒，所述试剂盒可以包括包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的组合物，例如作为准备施用的已经制备好的干粉形式或液体鼻形式，或者可选地，所述试剂盒可以包括包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的组合物作为可以用溶剂重构(reconstitute)以提供液体鼻剂型的固体药物组合物。当试剂盒包括GSSSG组合物作为可以用溶剂重构以提供液体剂型(例如，用于口服施用或鼻施用)的固体药物组合物时，该试剂盒可以任选地包括pH 3-6(例如，pH 4.8-5.0)的重构溶剂。当试剂盒包括PTN-SSS、或LA-SSS组合物作为可以用溶剂重构以提供液体剂型(例如，用于口服施用或鼻施用)的固体药物组合物时，该试剂盒可以任选地包括pH 4-9(例如，pH 5-8)的重构溶剂。在这种情况下，构成或重构溶剂与活性成分结合以提供活性组分的液体口服剂型。通常，活性成分可溶于溶剂中并且形成溶液。溶剂可以是例如水、非水性液体、或非水性组分和水性组分的组合。合适的非水性组分包括但不限于油类；醇类，诸如乙醇，甘油；和二醇类，诸如聚乙二醇和丙二醇。在一些实施方案中，溶剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

药物组合物可以与用于施用的说明书一起包含在容器、包装、或分配器中。例如，GSSSG可以以结晶形式与用于溶解晶体以制备用于鼻施用的溶液的pH 3-6的无菌缓冲液(例如，盐水)在试剂盒中提供。

实施例

本发明在以下实施例中进一步描述，以下实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。

材料和方法

以下材料和方法用于下文实施例中。

材料

稳定形式的GSSSG二水合物由Kyowa Hakko Bio Co.,Ltd.(Tokyo,Japan)合成和提供。将GSSSG悬浮于蒸馏水中并且通过用碳酸氢钠(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO,USA)将pH滴定至4.8-5.0之间进行溶解。为了避免化合物的降解，新鲜GSSSG溶液在每次实验之前即刻制备。将GSH(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO,USA)和GSSG六水合物(由KyowaHakko Bio Co.,Ltd.提供)溶于蒸馏水中。在GSSSG研究中，单独运载体是蒸馏水，pH用盐酸调节至4.8-5.0之间。

PTN-SSS由Kyowa Hakko Bio Co.,Ltd合成和提供。PTN-SSS的纯度为96.3％，并且PTN-SSS是高度水溶性的(>50g/L)。PTN-SSS和PTN(Toronto Research Chemicals,Toronto,ON,Canada)悬浮于蒸馏水中。PTN-SSS在室温下在pH 4.0-9.0的溶液中稳定至少4天。在PTN-SSS研究中，蒸馏水用作单独运载体。

体内研究

动物

所有动物程序按照由美国马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会以及美国国家研究委员会的“实验动物护理和使用指南”批准的方案执行。研究设计和实验的描述遵循ARRIVE指南。两种性别的成年C57BL/6J小鼠(12-18周龄)购自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME,USA)。雄性小鼠和雌性小鼠二者用于实验中，以探究GSSSG对SCI之后的运动功能的神经保护作用。因为GSSSG的神经保护作用似乎不依赖于性别，所以随后的体内实验仅在雄性小鼠中执行。所有小鼠均饲养在具有12小时光/暗循环的动物中心的温度和湿度受控制的室内，并且自由提供食物和水。为了允许正从手术中恢复的小鼠接近，将额外的食物颗粒插入放置在垫子(bedding)上的水合凝胶中。随机配对设计用于使各处理组之间的变异性最小化。小鼠基于体重、年龄、递送日期、以及在可能的情况下的所待的笼子进行配对。配对之后，小鼠随机分配至不同的处理。

诱导脊髓缺血的手术和研究性药物的施用

在小鼠中产生延迟性截瘫的外科手术如先前所述⁶执行(图2A)。小鼠用100％ O₂中的5％异氟烷进行麻醉并且用20号导管进行气管插管(静脉留置针(Angiocath)；BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)。对小鼠进行机械通气(MiniVent型号845；HarvardApparatus,Holliston,MA,USA)并且麻醉用100％O₂中的2％异氟烷进行维持，其中潮气量8μl/g。椎旁肌肉温度使用T型植入式热电偶探头(IT-18)和T型pod(ADInstruments,Colorado Springs,CO,USA)进行测量。在背部进行皮肤切口，使用18号针头将探头的尖端放置在L1-L3的水平，并且使用加热垫和DC温度控制器(FHC,Bowdoin,ME,USA)将温度维持在37.5±0.5℃。正中胸骨切开术从胸骨柄的顶端延伸至第二肋骨。将主动脉弓轻轻地隔离在左颈总动脉(LCCA)和左锁骨下动脉(LSA)之间，避开迷走神经和左喉返神经。将第一个血管夹(clip)(直型显微血管夹，RS-5424；Roboz Surgical Instrument Company,Inc.,Gaithersburg,MD,USA)放置在LCCA和LSA之间的主动脉弓上，然后，在15秒内，将第二个血管夹(45°角显微血管夹，RS-5435；Roboz Surgical Instrument Company,Inc.,Gaithersburg,MD,USA)放置在LSA的起源。缺血之后，以相反的顺序去除血管夹。逐层缝合切口并且停止机械通气。确认稳定的自主呼吸之后，对小鼠进行拔管。

先前描述的外科手术⁶如下进行修改。手术期间的呼吸频率增加至230次呼吸/分钟，这是因为过度换气促进由脊髓缺血引起的延迟性截瘫的发生³³。激光多普勒灌注监测仪(moorVMS-LDF1；Moor Instruments,Millwey,UK)用于监测股动脉血流量^28,29。将塑料纤维(POF500；Moor Instruments,Millwey,UK)垂直于左股动脉固定，以确认主动脉的闭塞导致股动脉血流量的立即和持续降低(>90％)^28,29。为了改善外科手术的准确性，使用显微镜(Leica MZ95；Leica Microsystems,Buffalo Grove,IL,USA)隔离主动脉弓并且放置血管夹。基于试点研究的结果，我们选择在所有小鼠中诱导延迟性截瘫的缺血时间(雄性小鼠为3分钟，雌性小鼠为3.5分钟)，其中最低死亡率在手术之后的72小时(表1)。

表1.造成每种性别的延迟性截瘫的脊髓缺血时间。

缩写词：SCI，脊髓缺血。

研究性药物使用单通道移液器进行鼻内施用。小鼠使用具有小鼠鼻锥的非再呼吸回路(VetEquip,Inc.,Livermore,CA,USA)用3％异氟烷进行麻醉。在施用药物时，去除鼻锥并且允许小鼠呼吸空气。将大约6μL的每种药物施用到小鼠的鼻孔中，并且小鼠在吸气期间吸入液滴。该程序有间隔地重复，直至施用总体积的药物，这花费大约10分钟。每次鼻内剂量的异氟烷施用的中断时间为约10秒。鼻内药物在手术之后的0、8、23、和32小时施用(图2B)。在假手术组(sham procedure group)中，进行了上述外科手术，但是主动脉没有被交叉夹闭(cross-clamped)。

为了疼痛控制，0.1mg/kg的丁丙诺啡在手术之前腹腔内施用，并且在手术之后每12小时腹腔内施用直至60小时。我们也在手术之后立即在伤口切口部位周围皮下施用0.5mg/kg的0.25％布比卡因。

脊髓缺血之后的运动功能的评估

后肢运动功能在手术之后的0、8、24、48、和72小时使用Basso小鼠运动量表(BMS)³⁴进行定量(图2B)。该分数范围从完全截瘫的0至正常运动功能的9。BMS分数<6(0-5)表示截瘫或轻截瘫，而BMS分数≥6(6-9)表示小鼠能够行走。

探究用GSSSG进行的灌注后处理对脊髓缺血之后的运动功能的神经保护作用的研究

小鼠随机分配至各处理组，并且执行外科手术的研究者对组分配不知情。基于试点研究，施用50mg/kg的GSSSG、45.2mg/kg的GSH(两倍的GSSSG的摩尔量，因为一分子GSSSG含有两分子GSH)(图1A)、或53mg/kg的GSSG(等摩尔剂量的GSSSG)。

组织学研究

脊髓的腰膨部在手术之后的48小时移除，并且使用低温切片机(CM1850UV；LeicaBiosystems,Heidelberger,Germany)切片至5μm厚度。尼氏染色根据由制造商推荐的方案使用尼氏染色试剂盒(VitroVivo Biotech,Rockville,MD,USA)进行。用于离子钙结合衔接分子1(Iba-1)和裂解的胱天蛋白酶-3的免疫组织化学染色如前所述^6,15执行。染色的切片使用落射荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i；Nikon Instruments,Inc.,Melville,NY,USA)检查。

染色细胞的数目由对样本的身份不知情的研究者在来自每只小鼠的3个不同脊髓切片中在高倍放大(200×)下在一个视野(0.26mm²)中进行计数。计算每只小鼠的平均染色细胞数。对于Iba-1染色的定量分析，在每只小鼠的3个不同腹侧角切片中在高倍放大(200×)下的每一个视野(0.26mm²)中的Iba-1阳性面积使用ImageJ图像处理程序(NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,USA)进行计算。假手术组中小鼠的脊髓中的Iba-1染色的平均面积设置为1，并且确定各实验组小鼠的Iba-1染色相对量。每组包括5只小鼠。

基因表达的测量

信使RNA(mRNA)水平如前所述¹⁵在手术之后的48小时使用腰椎脊髓进行测量。C-C基序趋化因子2(CCL2)、C-X-C基序趋化因子配体1(CXCL1)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、B-细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、B-细胞淋巴瘤超大型(Bcl-XL)、胱硫醚β合成酶、胱硫醚γ裂解酶、3-巯基丙酮酸硫转移酶、硫化物:醌氧化还原酶(SQOR)、乙基丙二酸脑病蛋白1、硫代硫酸盐硫转移酶、亚硫酸盐氧化酶、半胱氨酰-tRNA合成酶1、和半胱氨酰-tRNA合成酶2的mRNA水平使用定量实时聚合酶链式反应(7500快速实时PCR系统，ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)标准化至18S核糖体RNA的水平。引物序列在表2中列出。

表2.用于定量聚合酶链式反应的引物序列的列表。

缩写词：Bcl-2，B细胞淋巴瘤2；Bcl-XL，B细胞淋巴瘤超大型；CARS，半胱氨酰-tRNA合成酶；CBS，胱硫醚β合成酶；CCL2，C-C基序趋化因子2；CSE，胱硫醚γ裂解酶；CXCL1，C-X-C基序趋化因子配体1；ETHE1，乙基丙二酸脑病蛋白1；IL，白细胞介素；SQOR，硫化物:醌氧化还原酶；SUOX，亚硫酸盐氧化酶；3-MST，3-巯基丙酮酸硫转移酶；TNF-α，肿瘤坏死因子α；TST，硫代硫酸盐硫转移酶。

液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析

我们使用LC-MS/MS分析测量GS³⁴SSG(内源性GSSSG的同位素)的鼻内施用之后的CNS和血浆中³⁴S标记的GSSSG([³²S₂,³⁴S]GSSSG)的量^9,35,36。也对³⁴S标记的硫烷硫类物质([³²S,³⁴S]GSSH、[³²S,³⁴S]半胱氨酸氢过硫化物(CysSSH)、和[³²S₂,³⁴S]半胱氨酸三硫化物(CysSSSCys))与内源性硫烷硫类物质([³²S₂]GSSH、[³²S₂]CysSSH、和[³²S₃]CysSSSCys)的比例进行定量评价。在50mg/kg的GS³⁴SSG的鼻内施用之后的30分钟时，获得血液并且收获四种不同的中枢神经组织：嗅球和前脑；脑干；颈椎和胸椎脊髓以及腰椎脊髓。总计30mg的每种组织在含有5mMβ-(4-羟基苯基)乙基碘乙酰胺(HPE-IAM；Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX,USA)的300μl的冰冷甲醇溶液中均质化。25μl的血浆与含有5mM HPE-IAM的75μl的冰冷甲醇溶液混合。样本在黑暗中在37℃下孵育20分钟。离心之后(组织为14,000×g，血浆为1,870×g，10分钟，4℃)，分离上清并且用0.1％甲酸稀释用于LC-MS/MS分析，并且对沉淀物(pellet)进行超声处理以通过BCA测定来测量蛋白质浓度。[³²S₂，³⁴S]GSSSG的量用前体离子(647.14m/z)、产物离子(389.1m/z)、和更高能量碰撞解离(21v)在选择性反应监测(SRM)中定量。[³²S,³⁴S]GSSH与[³²S₂]GSSH的比例、[³²S,³⁴S]CysSSH与[³²S₂]CysSSH的比例、和[³²S₂,³⁴S]CysSSSCys与[³²S₃]CysSSSCys的比例从通过Dionex UltiMate 3000RS UPLC-Orbitrap Exploris 480质谱仪(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)测量的它们的峰面积中计算得出。简言之，样本经受具有Hypersil Gold C-18(100×2.1mm,3.0μm,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)柱的UPLC系统，然后在40℃下以0.2ml/分钟的流速在0.1％甲酸的存在下通过流动相的线性甲醇梯度(0-90％，15min)洗脱。原始数据通过Compound Discoverer 3.3软件(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)进行分析。这些硫烷硫类物质与HPE-IAM结合的分子量基于先前的报道^9,11,37确定。

脊髓缺血之后的腰椎脊髓中的相对硫烷硫水平的测量

腰椎脊髓在手术之后的48小时收获并且在液氮中快速冷冻。脊髓随后在含有SSip-1(5μM)的Hanks平衡盐溶液(HBSS；Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)中均质化，在室温下在黑暗中孵育20分钟，然后经受离心。SSip-1由Hanaoka laboratory合成和提供³⁸。上清的荧光强度使用酶标仪(SpectraMax M5；Molecular Devices,San Jose,CA,USA)在λex/λem＝491nm/525nm的波长下测量。荧光强度标准化为脊髓的重量。

在PTN-SSS的鼻内施用之后的嗅球和前脑以及全脊髓中的相对硫烷硫水平的测量

在50mg/kg的PTN-SSS的鼻内施用之后的30分钟时，收获嗅球和前脑以及全脊髓。组织在含有10μM的SSip-1的HBSS中均质化。测量上清的荧光强度。

体外研究

鼠原代皮层神经元培养

如先前所述，原代皮层神经元在胚胎第15天从两种性别的C57BL/6J小鼠的大脑皮层中分离³⁹。原代皮层神经元在具有5％ CO₂的加湿组织培养室中在37℃下维持，并且细胞在收获之后的第11天使用。

在用多硫化物孵育之后的原代皮层神经元或SH-SY5Y细胞中的相对硫烷硫水平的测量

将原代皮层神经元或SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞系)(American TypeCulture Collection,Manassas,VA,USA)在黑暗中在37℃下用SSip-1 DA(5μM)³⁸孵育20分钟。将细胞用预热的含有钙和镁的HBSS(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)进行清洗，然后细胞在黑暗中在37℃下用GSSSG、三硫化二钠(Na₂S₃；Dojindo MolecularTechnologies,Inc.,Rockville,MD,USA)、PTN-SSS、或单独运载体孵育20分钟。荧光强度使用酶标仪测量。

多硫化物对氧和葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)之后的细胞生存力的影响

在原代皮层神经元或SH-SY5Y细胞在孵育室(MIC-101；Billups-Rothenberg,Inc.,San Diego,CA,USA)中经受2.5或15小时的OGD之后，细胞用GSSSG、GSH、GSSG、PTN-SSS、或仅运载体孵育，然后经受21(原代皮层神经元)小时或24(SH-SY5Y细胞)小时的复氧，如先前所述³⁹。复氧之后，细胞生存力和细胞损伤使用结晶紫和乳酸脱氢酶(LDH)测定进行评估，如先前所述³⁹。

GSSSG对细胞生存力的细胞毒性作用

原代皮层神经元在37℃下在具有95％空气和5％ CO₂的加湿培养箱中用0μM(单独运载体)、10μM、30μM、60μM、或100μM的GSSSG孵育21小时。细胞生存力使用LDH测定进行评估。

PTN-SSS对细胞生存力的细胞毒性作用

SH-SY5Y细胞在37℃下在具有95％空气和5％ CO₂的加湿培养箱中用0μM(单独运载体)、5μM、10μM、25μM、50μM、或100μM的PTN-SSS孵育24小时。细胞生存力使用结晶紫测定进行评估。

统计分析

数据表示为平均值和标准偏差(参数化数据)或中位数和四分位距(非参数化数据)表示。描述性统计用于描述研究群体。我们使用夏皮罗-威尔克检验(Shapiro-Wilktest)和Q-Q图来评估数据的正态性。使用非配对t检验分析参数化数据以比较两组，并且使用具有Tukey多重比较检验或Dunnett多重比较检验的单因素方差分析(ANOVA)分析参数化数据以比较三组或更多组。使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)分析非参数化数据以比较两组，并且使用具有Dunn多重比较检验的克鲁斯卡尔-沃利斯检验分析非参数化数据以比较三组或更多组。显著性被认为在P<0.05的水平。统计分析使用GraphPad Prism9.2.0(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)进行。

比较GSSSG组、GSH组、和单独运载体组之间的手术之后72小时的BMS分数的实验的样本量计算使用固定效应单因素方差分析的F检验(G*Power3.1；Heinrich-Heine-Düsseldorf,Germany)进行⁴⁰。基于我们对于该实验的试点研究，我们推测每组需要11只雄性小鼠和8只雌性小鼠(α＝0.05，β＝0.1[功效＝0.9]，雄性小鼠的效应量f＝0.7022756并且雌性小鼠的效应量f＝0.8709832，组数＝3)。比较PTN-SSS组、PTN组、和单独运载体组之间的手术之后72小时的BMS分数的实验的样本量计算使用固定效应单因素方差分析的F检验进行。基于我们对该实验的试点研究，我们推测每组需要9只小鼠(α＝0.05，β＝0.1[功效＝0.9]，效应量f＝0.7747206，组数＝3)。

间歇性H₂S吸入-硫化物预处理(SPC)

我们先前报道，以80ppm呼吸H₂S明显增加H₂S和硫代硫酸盐(H₂S的氧化产物)的血浆和脑水平^50,51。雄性C57BL6/J小鼠在定制的塑料室中呼吸单独空气和与80ppm H₂S(Airgas Inc.,Radnor,PA)混合的空气每天4h连续5天。如先前所述⁵¹，H₂S呼吸时间段(session)从第1天到第5天从上午8点直至下午12点执行(图1)。H₂S浓度以及FiO₂使用便携式气体监测仪(VENTIS MX4 Multi-Gas Monitor,Industrial Scientific Corporation,Oakdale,PA)连续测量。

MPTP-诱导的小鼠帕金森病模型

雄性C57BL6/J和CD-1小鼠每2小时接受四次腹腔内注射MPTP(20mg/kg)或盐水，总计四次剂量的MPTP(总计，80mg/kg)或等量的盐水，如先前所述³。为了评价MPTP对多巴胺能神经元的影响，所有小鼠在MPTP施用之后的7天收获。然后，酪氨酸羟化酶蛋白质水平通过免疫印迹检测。

神经元细胞的细胞生存力

执行细胞生存力测定以在添加MPP⁺(SH-SY5Y为5mM，原代皮层神经元为50μM)与运载体(PBS)、Na₂S(Sigma-Aldrich)、Na₂S₃(Dojindo Molecular Technologies,Inc)、GSSSG(谷胱甘肽三硫化物，Kyowa Hakko Bio Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)、LA(α-硫辛酸，Sigma-Aldrich)或LASSS(α-硫辛酸三硫化物，Kyowa Hakko Bio Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)之后的24h检查SH-SY5Y细胞或鼠原代皮层神经元的细胞生存力。细胞生存力使用结晶紫测定进行测量。

向MPTP处理后小鼠的Na₂S₃施用

为了确定多硫化物对用MPTP处理的小鼠中黑质和纹状体中酪氨酸羟化酶的丧失的影响，我们每2h腹腔内施用Na₂S₃(20mg/kg)或盐水，在第0天首次注射MPTP之后立即开始。随后，小鼠从第1天至第6天每12h接受两次腹腔内注射Na₂S₃(20mg/kg)或盐水。所有小鼠在MPTP施用之后的7天收获。然后，酪氨酸羟化酶蛋白质水平通过免疫印迹检测。

向MPTP处理后小鼠的GSSSG施用

为了确定多硫化物对用MPTP处理的小鼠中黑质和纹状体中酪氨酸羟化酶的丧失的影响，我们在第0天第一次和第三次注射MPTP之后立即经由鼻内途径施用GSSSG(50mg/kg)或盐水。随后，小鼠从第1天至第6天每12h接受两次鼻内注射GSSSG(50mg/kg)或盐水。所有小鼠在MPTP施用之后的7天收获。然后，酪氨酸羟化酶蛋白质水平通过免疫印迹检测。

实施例1.GSSSG的鼻内施用从短暂脊髓缺血之后的延迟性截瘫中挽救小鼠

为了探究多硫化物是否可以防止延迟性截瘫，小鼠经受SCI并且在手术之后的0、8、23、和32小时用GSSSG、GSH、或单独运载体处理。36只雄性小鼠经受SCI；然而，这些小鼠中的三只因为没有实现股动脉血流量的大于90％降低而排除在进一步研究之外。其余33只雄性小鼠接受以下三种处理中的一种：GSSSG(n＝11)、GSH(n＝11)、或单独运载体(n＝11)。后肢运动功能使用Basso小鼠运动量表(BMS)进行定量，BMS评价后肢移动、前肢-后肢协调、和躯干稳定性。如先前由Kakinohana和其同事所述，如果神经功能缺损(BMS<6)发生在小鼠能够行走的一段时间(BMS≥6)之后，那么认为小鼠具有延迟性截瘫⁶。

手术之后大约36小时开始，用单独运载体处理的小鼠的后肢运动功能逐渐恶化，并且所有用单独运载体处理的小鼠到手术之后48小时之前发生截瘫(图3)。相反地，GSSSG的鼻内施用在11只小鼠的8只(73％)中防止延迟性截瘫的发生，并且与单独运载体相比，改善手术之后72小时的BMS分数(GSSSG与单独运载体，BMS；9[4-9]与0[0-0]；通过具有Dunn’s多重比较检验的克鲁斯卡尔-沃利斯检验的P<0.0001，图3)。GSH的鼻内施用也在11只小鼠的3只(27％)中防止延迟性截瘫，但是没有改善手术之后72小时的BMS分数(GSH与单独运载体，BMS；1[0-7]与0[0-0]；P＝0.0914，图3)。结果显示出GSSSG(而不是GSH)在雄性小鼠中防止SCI之后的延迟性截瘫的发生。

为了探究性别对GSSSG防止SCI之后的延迟性截瘫的能力的影响，28只雌性小鼠经受SCI并且在手术之后的0、8、23、和32小时用GSSSG、GSH、或单独运载体处理。28只雌性小鼠的4只在拔管之后立即经历呼吸困难并且被安乐死。其余24只雌性小鼠用GSSSG(n＝8)、GSH(n＝8)、或单独运载体(n＝8)处理。与用单独运载体处理的小鼠相比，接受鼻内GSSSG的小鼠在手术之后72小时具有改善的BMS分数(GSSSG与单独运载体，BMS；6.5[1.5-9.0]与0.0[0.0-0.0]；通过具有Dunn多重比较检验的克鲁斯卡尔-沃利斯检验的P＝0.0060，图3)。相反地，GSH的鼻内施用没有改善手术之后72小时的BMS分数(GSH与单独运载体，BMS；0.5[0.0-6.7]与0.0[0.0-0.0]；P＝0.2887，图3)。这些结果显示出GSSSG(而不是GSH)能够在两种性别中防止SCI之后的延迟性截瘫。

GSSG可以通过谷胱甘肽化与蛋白质中的硫醇反应²³。GSSSG潜在地也可以通过相同的过程与蛋白质中的硫醇反应⁴¹。为了探究GSSSG的有益作用是否与谷胱甘肽化有关，我们在雄性小鼠中比较GSSSG或GSSG的鼻内施用对SCI之后的结局的影响。GSSSG的鼻内施用从延迟性截瘫中挽救6只雄性小鼠的5只(83％)；相反地，GSSG的鼻内施用没有从延迟性截瘫中挽救任何雄性小鼠(0％)。GSSSG组中的手术之后72小时的BMS分数显著高于GSSG组中的手术之后72小时的BMS分数(GSSSG与GSSG，BMS；8.0[5.2-9.0]与0.0[0.0-0.0]；通过曼惠特尼检验的P＝0.0152，图11)。因为GSSSG潜在地可以通过与GSSG相同的过程介导目标蛋白质的谷胱甘肽化，但是仅GSSSG防止延迟性截瘫，结果表明GSSSG的神经保护作用不是谷胱甘肽化的结果。

实施例2.GSSSG的鼻内施用减少在腰椎脊髓中的脊髓缺血之后的神经退行性变以及小胶质细胞激活和胱天蛋白酶-3激活

脊髓缺血与腰椎脊髓的腹侧角中的神经元的退行性变化相关，并且受影响的神经元的生存力可以使用尼氏染色进行评估⁶。尼氏染色检测神经元的细胞质中的尼氏小体，并且这种紫色的细胞质染色的存在是神经元完整性的指标^6,42。为了探究GSSSG对神经退行性变的影响，GSSSG或单独运载体在手术之后的0、8、23、和32小时施用。腰椎脊髓在手术之后的48小时收获，固定，切片，并且用尼氏染色孵育。与受到假外科手术的小鼠相比，脊髓缺血与尼氏染色呈阳性的神经元的明显减少相关，这表明大多数细胞不是可存活的(图4A-B)。与受到SCI并且用单独运载体处理的小鼠相比，GSSSG的鼻内施用与可存活神经元的数目的显著增加相关(图4A-B)。

先前的研究显示出腰椎脊髓的腹侧角中增加的小胶质细胞激活与SCI之后的延迟性截瘫的发作并行^6,29，并且小胶质细胞激活的抑制减弱神经元损伤并且防止SCI之后的延迟性截瘫的发生⁴³。离子钙结合衔接分子1(Iba-1)的增加表达是小胶质细胞的激活的敏感标志物⁴⁴。为了探索GSSSG防止神经退行性变的机制，小鼠经受SCI并且用GSSSG或单独运载体处理。切片由腰椎脊髓制备并且进行Iba-1染色。与从假手术之后48小时的小鼠中获得的脊髓的染色相比，来自经受SCI的小鼠的脊髓的染色具有明显增加的Iba-1阳性染色的相对面积(图5A、5B)。结果表明，SCI与增加的小胶质细胞的激活相关。相反地，受到SCI并且用鼻内GSSSG处理的小鼠具有Iba-1染色的显著降低，表明减少的小胶质细胞激活(图5A、5B)。

先前的研究者显示，胱天蛋白酶-3的激活是SCI之后在腰椎脊髓的腹侧角中发生的神经退行性变的核心组分⁶。裂解的胱天蛋白酶-3的免疫组织化学染色用于探究胱天蛋白酶-3激活的减弱是否可能是GSSSG防止SCI之后的神经退行性变的机制。与来自假手术之后48小时的小鼠的脊髓相比，来自经受SCI的小鼠的腰椎脊髓在腹侧角中具有增加数目的裂解的胱天蛋白酶-3阳性神经元(图5C、5D)。GSSSG的鼻内施用防止SCI诱导的腰椎脊髓中的裂解的胱天蛋白酶-3阳性神经元的数目的增加(图5C、5D)。这些结果表明，GSSSG的鼻内施用防止腰椎脊髓的腹侧角中的神经退行性变，并且与小胶质细胞激活减少和胱天蛋白酶-3激活减弱相关。

实施例3.GSSSG的鼻内施用减弱脊髓缺血之后的促炎细胞因子的上调

先前的研究显示，由激活的小胶质细胞产生的促炎细胞因子的明显增加先于SCI之后的延迟性截瘫的发作^15,29。小胶质细胞激活的抑制阻止促炎细胞因子的上调并且防止SCI之后的延迟性截瘫的发生⁴³。为了进一步评估GSSSG对由SCI诱导的促炎细胞因子的影响，我们测量来自经受SCI并且用GSSSG或单独运载体处理的小鼠的腰椎脊髓中的编码CCL2、CXCL1、IL-1β、IL-6、和TNF-α的mRNA的水平。腰椎脊髓在手术之后48小时收获。与受到假手术的小鼠相比，经受SCI的小鼠具有编码与炎症相关的细胞因子的mRNA的水平的明显增加。相反地，GSSSG在手术之后48小时减弱编码促炎细胞因子的mRNA的上调(图6)。GSSSG的鼻内施用也减少编码SQOR(一种将硫化物氧化为过硫化物的酶)的mRNA的水平。GSSSG对编码合成或代谢硫化物或过硫化物的其它酶的mRNA水平没有影响(图12)。在包括Bcl-2和Bcl-XL在内的抗凋亡基因的mRNA水平方面，在单独运载体和GSSSG处理组之间没有显著差异(图6)。这些结果表明，GSSSG的有益作用可以通过促炎细胞因子的抑制介导。

实施例4.³⁴S-标记的GSSSG在鼻内施用之后不久到达脊髓，并且代谢为其它硫烷硫类物质

为了研究鼻内施用的GSSSG的药代动力学，我们使用³⁴S-标记的GSSSG来探究鼻内施用之后的GSSSG和其代谢物(GSSH、CysSSH、和CysSSSCys)在CNS中的分布。在GS³⁴SSG的鼻内施用之后30分钟，LC-MS/MS用于测量[³²S₂，³⁴S]GSSSG的量，并且用于确定脑、脊髓、和血浆中³⁴S-标记的硫烷硫类物质与内源性硫烷硫类物质的比例。[³²S₂，³⁴S]GSSSG在嗅球和前脑(128±67pmol/mg蛋白质)、脑干(226±101pmol/mg蛋白质)、颈椎和胸椎脊髓(414±98pmol/mg蛋白质)、和腰椎脊髓(317±111pmol/mg蛋白质)中检测到(图7A)。此外，[³²S₂，³⁴S]GSSSG以25±10nM的浓度在血浆中检测到。脑和脊髓中[³²S,³⁴S]GSSH与[³²S₂]GSSH的比例、[³²S,³⁴S]CysSSH与[³²S₂]CysSSH的比例、和[³²S₂,³⁴S]CysSSSCys与[³²S₃]CysSSSCys的比例分别为6.5±2.8、10.6[9.8-12.5]、和31.8±9.8(图7B)。这些结果显示，GSSSG在鼻内施用之后的30分钟内到达包括脊髓在内的中枢神经系统的不同部位，并且转化为其它硫烷硫类物质。

实施例5.GSSSG的鼻内施用增加脊髓缺血之后的腰椎脊髓中的硫烷硫水平

GSSSG在SCI之后的48小时保护腰椎脊髓免受神经退行性变。为了探究腰椎脊髓中增加水平的硫烷硫是否会有助于神经保护作用，我们测量SCI之后48小时的硫烷硫水平的变化。与受到假手术的小鼠相比，SCI然后是用单独运载体进行处理不会改变腰椎脊髓中的硫烷硫水平(假手术与SCI然后是单独运载体；1.00±0.30与0.56±0.13；通过具有Dunnett多重比较检验的单因素方差分析的P＝0.0870，图8A)。相反地，受到SCI并且接受GSSSG的鼻内施用的小鼠的腰椎脊髓中硫烷硫的水平大于受到SCI并且接受单独运载体的小鼠中的那些(SCI然后是GSSSG与单独运载体；1.37±0.50与0.56±0.13；P＝0.0023，图8A)。这些结果表明，GSSSG在防止延迟性截瘫中的有益作用与腰椎脊髓中增加的硫烷硫水平相关。

实施例7.GSSSG对原代皮层神经元的影响

为了确定多硫化物是否增加神经元内的硫烷硫水平，我们在多硫化物的存在和不存在下使用SSip-1 DA测量原代皮层神经元中的相对硫烷硫水平。SSip-1 DA是可以用于测量细胞内部硫烷硫的浓度的荧光探针³⁸。相对于未处理的原代皮层神经元，用GSSSG或Na₂S₃孵育的神经元具有增加水平的细胞内硫烷硫(图8B)。

体内研究显示，GSSSG可以防止SCI之后的神经退行性变。为了确定GSSSG是否可以在体外保护神经元免受类似损伤，原代细胞在氧和葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)之后用GSSSG孵育。细胞生存力使用结晶紫和乳酸脱氢酶(LDH)测定进行评估，如先前所述³⁹。结晶紫染料对细胞中的DNA和蛋白质进行染色，并且确认细胞是活的并且尽管OGD/R也能够维持对组织培养板的附着。LDH测定测量组织培养基中乳酸脱氢酶的水平，并且是质膜损坏的间接测量。与对照细胞相比，用OGD/R进行的处理与活的贴壁细胞的数目的明显减少相关(图9A)并且与组织培养基中LDH的浓度的明显增加相关(图9B)。与仅运载体处理的细胞相比，30μM的GSSSG增加了如通过结晶紫测定所测量的细胞生存力(图9A)，并且30μM或60μM的GSSSG减少了OGD/R之后的LDH的释放(图9B)。较高剂量的GSSSG(100μM)本身增加组织培养基中的LDH水平(图13)，并且不能改善OGD/R之后的细胞生存。这些结果显示，GSSSG剂量依赖性地保护神经元免受OGD/R的影响。

体内研究显示，GSSSG(而不是GSH或GSSG)防止SCI之后的延迟性截瘫的发生，并且表明GSSSG的神经保护作用源自于硫烷硫。为了确定GSSSG对原代培养神经元的神经保护作用是否源自于硫烷硫，我们试验了GSSSG、GSH、和GSSG保护神经元免受OGD/R的能力。与仅运载体处理的细胞相比，30μM的GSSSG改善了OGD/R之后的细胞生存力(图9C)。相反地，60μM的GSH和30μM的GSSG没有改善OGD/R之后的细胞生存力(图9C)。这些结果表明，GSSSG的神经保护作用源自于硫烷硫。

实施例8.PTN-SSS对SH-SY5Y细胞的影响

我们使用体外研究显示GSSSG在OGD/R之后保护神经元，并且表明GSSSG的神经保护作用源自于硫烷硫。为了探究其它多硫化物是否在OGD/R之后是细胞保护性的，我们检查另一多硫化物PTN-SSS对OGD/R之后的SH-SY5Y细胞的生存力的影响。与用原代皮层神经元一样，用OGD/R进行的处理降低SH-SY5Y细胞的生存力。与仅运载体处理的细胞相比，用10μM、25μM、或50μM的PTN-SSS进行的孵育以剂量依赖性方式显著改善OGD/R之后的SH-SY5Y生存力(图10A)。相反地，由于PTN-SSS在高剂量下的直接细胞毒性作用，PTN-SSS在100μM下没有改善细胞生存力(图14)。这些结果显示，PTN-SSS在OGD/R之后剂量依赖性地挽救SH-SY5Y细胞，并且支持多硫化物在OGD/R之后是细胞保护性的。

为了确定PTN-SSS的细胞保护作用是否与细胞内硫烷硫的量有关，我们使用SSip-1 DA测量用PTN-SSS进行孵育之后的SH-SY5Y细胞中的硫烷硫水平。SH-SY5Y细胞内部的硫烷硫的水平随着PTN-SSS的浓度的增加而增加(图10B)。SSip-1 DA(5μM)测量细胞内硫烷硫的能力在100μM的PTN-SSS的浓度时达到最大值(图10B)。与仅运载体处理的细胞相比，SH-SY5Y细胞中的硫烷硫水平在PTN-SSS(10-50μM)的剂量下显著增加，这显著改善OGD/R之后的细胞生存力。这些结果表明，PTN-SSS的细胞保护作用与从PTN-SSS中释放的硫烷硫的量有关。

实施例10.PTN-SSS在鼻内施用之后不久增加嗅球和前脑、以及全脊髓中的硫烷硫水平

为了研究PTN-SSS是否在鼻内施用之后不久增加中枢神经系统中的硫烷硫水平，我们使用SSip-1在PTN-SSS的鼻内施用之后的30分钟测量嗅球和前脑以及全脊髓中的硫烷硫水平。与接受单独运载体的鼻内施用的小鼠相比，PTN-SSS的鼻内施用增加嗅球和前脑以及全脊髓中的硫烷硫水平(图10C)。这些结果表明，PTN-SSS在鼻内施用之后的30分钟内增加中枢神经系统中的硫烷硫水平。

实施例11.PTN-SSS的鼻内施用从短暂脊髓缺血之后的延迟性截瘫中挽救小鼠

体外研究显示，PTN-SSS在OGD/R之后是细胞保护性的，并且PTN-SSS的细胞保护作用与从PTN-SSS中释放的硫烷硫的量有关。由于GSSSG防止SCI之后的延迟性截瘫的发生，并且GSSSG的神经保护作用与硫烷硫相关，我们假设PTN-SSS也可以从SCI之后的延迟性截瘫中挽救小鼠。此外，与用GSSSG一样，我们试验了PTN-SSS(而不是单独PTN)中的硫烷硫是否是神经保护性的。雄性小鼠在手术之后的0、8、23、和32小时接受PTN-SSS、PTN、或单独运载体的鼻内施用。施用等摩尔剂量的PTN-SSS(50mg/kg)或PTN(47.3mg/kg)。PTN-SSS的鼻内施用从延迟性截瘫中挽救9只雄性小鼠中的6只(66％)。相反地，PTN的鼻内施用没有从延迟性截瘫中挽救任何雄性小鼠。PTN-SSS组中手术之后72小时的BMS分数显著高于PTN组或单独运载体组中手术之后72小时的BMS分数(PTN-SSS与PTN，BMS；7.0[1.5-9.0]与1.0[0.0-2.0]；P＝0.0323。PTN-SSS与运载体单独，BMS；7.0[1.5-9.0]与1.0[0.0-1.5]；P＝0.0258，图10D)。这些结果显示，PTN-SSS(而不是PTN)在小鼠中防止SCI之后的延迟性截瘫的发生，表明PTN-SSS的神经保护作用源自于硫烷硫，而不是PTN。

实施例12.H₂S的吸入在PD动物模型中提供神经保护

硫化物水平在脑中严格控制。我们最近报道了硫化物分解代谢在缺氧/缺血性脑损伤中的稳健保护作用。参见Marutani等人，Nature Communications12,Article number:3108；25May 2021。因为脑损伤的其它形式可以由改变的硫化物稳态造成，所以我们检查硫化物分解代谢在作为最常见的神经退行性病症之一的帕金森病(PD)中的影响。也参见Kida,K.,Ichinose,F.(2015).Hydrogen Sulfide and Neuroinflammation.In:Moore,P.,Whiteman,M.(eds)Chemistry,Biochemistry and Pharmacology of HydrogenSulfide.Handbook of Experimental Pharmacology,vol 230.Springer,Cham；Kida等人,Antioxidants&Redox Signaling 2010；15:343-352；和Kida等人,Antioxidents andRedox Signaling 15(2):343-52(2011)。

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的施用造成小鼠中以黑质中酪氨酸羟化酶(TH)的水平衡量的多巴胺能神经元的丧失以及运动障碍。在MPTP的施用之前呼吸与80ppm H₂S混合的空气每天4h连续5天(硫化物预处理)，保护小鼠免受由MPTP诱导的多巴胺能神经元的丧失和运动障碍。硫化物预处理的保护作用与黑质和纹状体中硫化物:醌氧化还原酶(SQOR)水平的明显增加相关。AAV介导的黑质纹状体区域中的SQOR表达在小鼠中防止MPTP诱导的多巴胺能神经元的丧失。

该研究揭示了在MPTP诱导的PD小鼠模型中通过SQOR的硫化物分解代谢的神经保护作用。SQOR的上调的保护作用可以通过增加过硫化物水平介导。

实施例13.H₂S的吸入在PD动物模型中提供神经保护

因为SQOR催化硫化物向多硫化物的转化，并且因为SPC或AAV介导的SQOR过表达防止MPTP施用之后的硫烷硫的减少，所以我们假设MPTP施用之后的上调的SQOR的有益作用由增加水平的多硫化物介导。为了考虑这种可能性，我们检查多硫化物对用MPP⁺孵育的SH-SY5Y细胞的生存力的影响。细胞用MPP⁺(5mM)处理24h，并且生存力通过结晶紫测定进行评估⁴¹。与对照细胞相比，用Na₂S(剂量在1与100μM之间)进行的处理没有改善用MPP⁺处理的SH-SY5Y细胞的生存力⁴²。相反地，用Na₂S₃或GSSSG(各10μM)进行的处理增加MPP⁺处理的SH-SY5Y细胞的生存力(图15A)。

为了在生理相关背景下进一步检查多硫化物的细胞保护作用，我们检查GSSSG、谷胱甘肽(GSH，没有硫烷硫的GSSSG的母体分子)、α-硫辛酸三硫化物(1,2,3-三噻烷-4-戊酸，LA-SSS)、和α-硫辛酸(没有硫烷硫的LA-SSS的母体分子)对用MPP⁺孵育的鼠原代皮层神经元的影响。细胞用MPP⁺(50μM)与上述各化合物一起孵育24小时。多硫化物化合物GSSSG和LA-SSS(而不是母体化合物GSH和LA)保护鼠原代皮层神经元免受MPP⁺处理的影响(图15B和C)。这些结果表明，硫烷硫释放分子保护神经元免受MPP⁺诱导的细胞毒性。

实施例14.GSSG的鼻施用在PD动物模型中提供神经保护

GSSSG的大分子量(Mw：644.7DA)使其在全身施用之后无法越过血脑屏障。然而，最近的研究表明，鼻内施用可以允许使相对大的分子成功地通过进入中枢神经系统⁴³。为了考虑GSSSG可以在鼻内施用时具有对MPTP诱导的神经退行性变的保护作用的可能性，GSSSG(50mg/kg)或盐水在第0天在MPTP或盐水(对照)的施用之后立即IN施用。在第1天与第6天之间，小鼠每12小时IN接受50mg/kg的GSSSG或盐水。我们观察到GSSSG IN施用防止MPTP诱导的黑质纹状体区域中的酪氨酸羟化酶的减少(图16)。综上所述，这些结果表明，多硫化物在PD的小鼠模型中具有稳健的治疗作用效果。

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其它实施方案

应当理解的是，虽然本发明已经结合其详细说明书进行描述，但是前述说明书旨在说明并且不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点、和修改在所附权利要求书的范围内。

Claims (20)

1.一种用于在受试者中治疗与神经退行性变相关的病症或降低与神经退行性变相关的病症的风险的方法，所述方法包括向有需要的受试者鼻施用治疗或预防有效量的组合物，所述组合物包含谷胱甘肽三硫化物(GSSSG)、泛硫乙胺三硫化物(PTN-SSS)、或硫辛酸三硫化物(LA-SSS)。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步其中包含GSSSG的所述组合物通过将结晶形式的GSSSG溶解于pH 3-6的缓冲盐水中来制备。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述病症为缺血后神经元死亡。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述病症为慢性脑退行性疾病。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述慢性脑退行性疾病为多发性梗塞性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、或路易体痴呆。

6.根据权利要求1所述的方法，其包括在外伤性损伤发生之后的几分钟至几小时内施用有效量的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的所述组合物。

7.根据权利要求1所述的方法，其包括在预定的胸主动脉和/或腹主动脉外科手术之前施用有效量的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的所述组合物。

8.根据权利要求7所述的方法，其包括在预定的胸主动脉和/或腹主动脉外科手术之前的几小时至几天施用有效量的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的所述组合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其包括在所述预定的胸主动脉和/或腹主动脉外科手术之前的2-24小时和/或1、2、3、4、5、6、和/或7天施用有效量的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的所述组合物。

10.一种包含谷胱甘肽三硫化物(GSSSG)、泛硫乙胺三硫化物(PTN-SSS)、或硫辛酸三硫化物(LA-SSS)的用于鼻施用的组合物，其用于在受试者中治疗与神经退行性变相关的病症或降低与神经退行性变相关的病症的风险的用途，所述方法包括向有需要的受试者鼻施用治疗或预防有效量的。

11.根据权利要求10所述的用于所述用途的组合物，其中所述组合物通过以下方法来制备，所述方法包括将结晶形式的GSSSG溶解于pH 3-6的缓冲盐水中。

12.根据权利要求10所述的用于所述用途的组合物，其中所述病症为缺血后神经元死亡。

13.根据权利要求10所述的用于所述用途的组合物，其中所述病症为慢性脑退行性疾病。

14.根据权利要求10所述的用于所述用途的组合物，其中所述慢性脑退行性疾病为多发性梗塞性痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、或路易体痴呆。

15.根据权利要求10所述的用于所述用途的组合物，其中所述方法包括在外伤性损伤发生之后的几分钟至几小时内施用有效量的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的组合物。

16.根据权利要求10所述的用于所述用途的组合物，其中所述方法包括在预定的胸主动脉和/或腹主动脉外科手术之前施用有效量的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的组合物。

17.根据权利要求16所述的用于所述用途的组合物，其中所述方法包括在预定的胸主动脉和/或腹主动脉外科手术之前的几小时至几天施用有效量的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的组合物。

18.根据权利要求17所述的用于所述用途的组合物，其中所述方法包括在所述预定的胸主动脉和/或腹主动脉外科手术之前的2-24小时和/或1、2、3、4、5、6、和/或7天施用有效量的包含GSSSG、PTN-SSS、或LA-SSS的组合物。

19.一种装置，其用于包含谷胱甘肽三硫化物(GSSSG)、泛硫乙胺三硫化物(PTN-SSS)、或硫辛酸三硫化物(LA-SSS)的组合物的鼻施用。

20.根据权利要求19所述的装置，其是进一步包含推进剂的雾化器或压力容器或气雾剂分配器。