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CN119569896A - 一种融合蛋白及其在靶向易团聚化蛋白降解中的应用 - Google Patents

一种融合蛋白及其在靶向易团聚化蛋白降解中的应用 Download PDF

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CN119569896A
CN119569896A CN202411601415.4A CN202411601415A CN119569896A CN 119569896 A CN119569896 A CN 119569896A CN 202411601415 A CN202411601415 A CN 202411601415A CN 119569896 A CN119569896 A CN 119569896A
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CN
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protein
seq
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e3tcd
sequence shown
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CN202411601415.4A
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胥国勇
罗明
温晴
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Wuhan University WHU
Original Assignee
Wuhan University WHU
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Publication date
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Abstract

本发明提供了一种融合蛋白及其在靶向易团聚化蛋白降解中的应用。所述融合蛋白由靶蛋白基因X的蛋白与E3TCD蛋白融合组成，即X‑E3TCD，所述X为靶蛋白基因；通过瞬时表达或转基因方法，将X‑E3TCD的基因转入植物体中，进而表达出X‑E3TCD的融合蛋白，可以靶向降解植物内源性蛋白质团聚体；本发明提供的方法不仅可以实现作物的性状改良，也可能成为治疗人类疾病的潜在基因治疗途径。

Description

一种融合蛋白及其在靶向易团聚化蛋白降解中的应用
技术领域
本发明属于蛋白质靶向降解技术领域，具体涉及一种融合蛋白及其在靶向易团聚化蛋白降解中的应用。
技术背景
在植物生物学领域，蛋白质稳态的动态调控机制构成了植物适应多变生长条件及抵御生物与非生物胁迫的核心策略之一。这一过程涵盖蛋白质的从头合成、翻译后修饰、细胞内精确定位以及最终降解等多个关键环节，共同维持着细胞内蛋白质组分的平衡与功能优化。近期研究发现相分离现象介导的蛋白质聚集在蛋白质稳态调控中发挥着重要作用。相分离允许蛋白质在特定条件下自发聚集形成无膜结构的液-液相分离体，这一过程不仅调控了蛋白质的局部浓度与相互作用网络，还可能在信号传导、细胞器形成与功能分区等方面发挥关键作用，从而深刻影响植物的生长发育及胁迫响应能力。鉴于蛋白质稳态对于植物生理活动的重要性，其调控策略正逐渐成为作物遗传改良的新靶点。与广泛应用的CRISPR-Cas9基因编辑技术和RNA干扰等基于DNA或RNA层面的遗传操作手段相平行，调控蛋白质稳态提供了一种在蛋白质功能层面直接介入、精准调控植物性状的新途径。这种策略不仅能够针对特定蛋白质的功能与活性进行微调，还可能解锁传统育种方法难以触及的性状改良空间，展现出作为未来农业生物技术革新的巨大潜力。因此，深入研究蛋白质稳态的调控机制及其在植物中的应用潜力，对于推动农业可持续发展、提升作物抗逆性与产量具有重要意义。
在蛋白质稳态调控的复杂网络架构中，泛素-蛋白酶体系统(UPS)与自噬系统占据着不可或缺的核心地位，共同维系着细胞内蛋白质的动态平衡。基于这两大系统的深入探索，科研人员已成功设计出多种创新工具，诸如生长素诱导的降解子(AID)、自噬靶向嵌合体(AUTAC)、蛋白质水解靶向嵌合体(PROTAC)以及Trime等，这些工具通过精准靶向并促进蛋白质的降解，极大地丰富了人类对生命过程的基本理解，并在药物研发领域展现出巨大的应用潜力与宝贵价值。然而，尽管这些技术在生物医学研究中取得了显著进展，它们在农业领域的推广与应用却面临诸多挑战。核心难题在于，这些技术大多依赖于小分子化学诱导物、特异性抗体或需通过基因编辑手段将降解子序列整合至内源蛋白质中，这一过程不仅技术复杂度高，而且耗时冗长、成本高昂，限制了其在农业实践中的广泛应用。
鉴于此，开发一种直接、高效且经济的策略，用于内源植物蛋白质的特异性修饰，已成为农业科学研究领域亟待解决的关键问题。此策略旨在通过简化操作流程、降低技术门槛及成本，促进作物性状的定向改良，进而与可持续农业发展的宏伟目标相契合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合蛋白及其在靶向易团聚化蛋白降解中的应用。本发明在模式植物拟南芥中筛选到了5个具有团聚能力和自我降解特性的可运用于靶向团聚体蛋白降解(TCD)方法体系的E3TCD1，并进一步在烟草、水稻以及动物水平上证明了TCD方法靶向降解内源性蛋白质团聚体的有效性。
为了实验上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白由靶蛋白基因X的蛋白与E3TCD蛋白融合组成，所述融合蛋白的结构如式I所示：
所述X为靶蛋白基因，即目标需要被降解的蛋白基因；所述E3TCD蛋白为具有固有无序蛋白质特征的E3连接酶，可通过相分离聚集从而实现自我降解；编码所述E3TCD蛋白的基因包括以下中的一种：
拟南芥的E3TCD蛋白，简称AtE3TCD1，核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；
水稻的E3TCD蛋白，简称OsE3TCD1，核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；
玉米的E3TCD蛋白，简称ZmE3TCD1，核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
小麦的E3TCD蛋白，简称TaE3TCD1，核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；
大豆的E3TCD蛋白，简称GmE3TCD1，核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；
拟南芥的E3TCD2蛋白，简称AtE3TCD2，核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
拟南芥的E3TCD3蛋白，简称AtE3TCD3，核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；
拟南芥的E3TCD4蛋白，简称AtE3TCD4，核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；
拟南芥的E3TCD5蛋白，简称AtE3TCD5，核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示。
进一步地，所述靶蛋白基因X与所述E3TCD蛋白直接连接或者通过Linker连接。
所述linker选用柔性linker即可，比如氨基酸GGGSSGGGS。
作为一种具体实施方式，所述linker的核苷酸序列为：
5’-gcacggctcttctcctcactcgaccagatctcgtacgcgtcccggggcggtggctcatctggcggaggtggatct-3’(SEQ ID NO.37)，氨基酸序列为：ARLFSSLDQISYASRGGGSSGGGGS(SEQ IDNO.38)。
进一步，编码所述E3TCD蛋白的基因由下述引物对经PCR扩增获得：
1)引物对AtP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；从拟南芥cDNA中扩增出2001bp的扩增片段，即编码拟南芥的E3TCD蛋白的核酸分子；
2)引物对OsP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示；从水稻cDNA中能够扩增出2004bp的扩增片段，即编码水稻的E3TCD蛋白的核酸分子；
3)引物对ZmP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；从玉米cDNA中能够扩增出1992bp的扩增片段，即编码玉米的E3TCD蛋白的核酸分子；
4)引物对TaP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示；从小麦cDNA中能够扩增出2007bp的扩增片段，即编码小麦的E3TCD蛋白的核酸分子；
5)引物对GmP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示；从大豆cDNA中能够扩增出2148bp的扩增片段，即编码大豆的E3TCD蛋白的核酸分子；
6)引物对AtP2，核苷酸序列如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示；从拟南芥cDNA中扩增出1485bp的扩增片段，即编码拟南芥的E3TCD2蛋白的核酸分子；
7)引物对AtP3，核苷酸序列如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14所示；从拟南芥cDNA中扩增出1461bp的扩增片段，即编码拟南芥的E3TCD3蛋白的核酸分子；
8)引物对AtP4，核苷酸序列如SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16所示；从拟南芥cDNA中扩增出1038bp的扩增片段，即编码拟南芥的E3TCD4蛋白的核酸分子；
9)引物对AtP5，核苷酸序列如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18所示；从拟南芥cDNA中扩增出996bp的扩增片段，即编码拟南芥的E3TCD5蛋白的核酸分子。
在本发明的第二方面，提供了一种编码所述的融合蛋白的核酸分子。
在本发明的第三方面，提供了一种含有所述的核酸分子的重组载体。
在本发明的第四方面，提供了一种重组载体的启动子。
在本发明的第五方面，提供了包含所述的重组载体的转化体。
在本发明的第六方面，提供了一种靶向降解植物内源性蛋白质团聚体方法，所述方法包括：通过瞬时表达或转基因的方法，将所述的核酸分子或所述的重组载体转入植物体中，进而表达出所述的融合蛋白，实现对植物内源性蛋白质团聚体的靶向降解。
在本发明的第六方面，提供了所述的融合蛋白或所述的核酸分子或所述的重组载体在改良植物性状中的应用。
上述应用中，通过在作物中表达上述融合蛋白，可以实现对目标内源性蛋白质团聚体的靶向降解，从而在蛋白质的水平上改善作物的抗病性、抽穗期、结实率等性状。
在本发明的第七方面，提供了所述的融合蛋白或所述的核酸分子或所述的重组载体在动物研究领域基于蛋白质靶向降解方面的应用。
在本发明的第七方面，提供了所述的融合蛋白或所述的核酸分子或所述的重组载体在医学治疗或药物研究方面的应用。
进一步，上述靶基因-E3TCD的基因序列及其表达的融合蛋白可以在医学治疗和药物研发等方面应用。上述TCD技术，作为潜在的基因治疗途径，可用于治疗和/或预防与蛋白质团聚体相关和/或由其所致的任何疾病或病症，包括但不限于神经退行性疾病、代谢性疾病等。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明创新性地提出了一种基于新型靶向易团聚化蛋白降解(TCD)机制的方法，并深入探讨了其在蛋白质功能基础研究中的应用。该方法利用转基因技术精确调控内源性蛋白质的降解过程，展现出操作简便、效率显著且对生物体无不良反应的优越性。鉴于现代农业领域所面临的全球性挑战，迫切需求开发出具备高产、抗逆等优良特性的作物品种以实现农业的可持续发展。在此背景下，转基因技术的迅猛发展，尤其是与TCD策略相结合，连同DNA编辑、RNA沉默等先进遗传工程手段，为培育能够有效应对上述挑战的新型作物品种提供了强有力的技术支持。在本项研究中，我们成功验证了拟南芥中的E3TCD1蛋白在烟草和水稻等异源表达体系中的降解活性，揭示了其功能的广泛保守性。进一步地，通过系统筛选与鉴定，我们在多种植物物种中发现了E3TCD1的同源基因，这一发现不仅拓展了TCD机制的适用范围，也为后续在多物种间开展功能验证与改良提供了丰富的遗传资源。尤为重要的是，本研究中TCD方法的展现出的普适性与高效性，预示着其在生物医学领域同样具备巨大的应用潜力。作为一种潜在的基因治疗策略，TCD技术有望为治疗因蛋白质异常积累所导致的遗传性疾病提供新的思路与手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方法，下面将对实施例描述中相关的附图作一介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1.，TCD示意图。TCD系统针对由易凝结蛋白X形成的特定凝结物。这些蛋白质通常会聚集成凝结物，从可溶性相转变为有序结构，在不同规模的凝结物(低聚物、低序和高序)之间达到平衡。为了去除这些凝结物，将泛素-蛋白酶体系统(UPS)中的E3连接酶与X融合形成X-E3。这种融合蛋白模拟X，有助于其渗透进入凝结物内部。一旦进入，X-E3就会触发降解过程。在生成用于表型分析的转基因植物之前，在N.benthamiana或原生质体中进行涉及X-E3与X-YFP瞬时表达的预实验至关重要，这些实验可通过显微镜观察或免疫印迹分析等方法评估TCD效率。为了控制X-E3的空间和时间表达以及表达强度，需要使用不同的启动子。
图2.a,b，在N.benthamiana中通过微观观察(a)和免疫印迹分析(b)的初步实验中，E3TCD1对E3TCD1-YFP和E3TCD1ΔRING-YFP凝结物的降解作用。目标蛋白X被YFP标记，而TCD由X-E3TCD1表示。在微观观察中，35S::CFP作为对照(a)。比例尺，10微米。CBB，考马斯亮蓝。
图3.a，使用PLAAC和D2P2算法预测OsTB1为固有无序蛋白(IDP)，分别由类朊病毒域(PrD)评分和无序评分表示。底部部分显示了由SMART网站注释的低复杂度区域和RING域。b,c，初步实验展示了通过微观观察(b)和免疫印迹分析(c)TCD系统对OsTB1的降解作用。在微观观察中，35S::CFP作为对照(b)。使用NbUBQ作为内参，对YFP进行半定量RT-PCR分析(c)。比例尺，10微米。d,e，在转化了35S::E3TCD1或35S::OsTB1-E3TCD1的水稻中花11(ZH11)植株中的分蘖数。每种构建体使用两个独立的转基因系(#1和#2)。条形图显示分蘖数的平均值±标准差(n＝30)，并使用双侧Student's t检验确定显著性。比例尺，10厘米。f，定量RT-PCR显示转基因系中内源性OsTB1 mRNA的相对水平。使用结合到非翻译区的引物(未包含在OsTB1-E3TCD1转基因中)扩增内源性OsTB1基因。条形图显示相对于ZH11标准化后的平均值±标准差(n＝3)，并使用双侧Student's t检验确定显著性。
图4.a,b，初步实验展示了通过微观观察(a)和免疫印迹分析(b)TCD系统对OsELF3-1和OsELF3-2的降解作用。在微观观察中，35S::CFP作为对照(a)。使用NbUBQ作为内参，对YFP进行半定量RT-PCR分析(b)。比例尺，10微米。CBB，考马斯亮蓝。c,d，转化了35S::E3TCD1、35S::OsELF3-1-E3TCD1或35S::OsELF3-2-E3TCD1的水稻中花11(ZH11)植株的开花表型。比例尺，10厘米。每种构建体使用两个独立的转基因系(#1和#2)。条形图显示在自然长日照(LD)条件下播种后至抽穗的天数的平均值±标准差(n＝15)，并使用双侧Student'st检验确定显著性。
图5.a,b，转化了ProHSP::OsELF3-1-E3TCD1的水稻中花11(ZH11)植株的生长表型。使用两个独立的转基因系(#1和#2)。c,e，f转化了ProHSP::OsELF3-1-E3TCD1的水稻中花11(ZH11)植株的结实率表型。d,自然长日照(LD)条件下播种后至抽穗的天数。
图6.通过微观观察TCD系统对OCT4的降解作用。mCherry作为对照。比例尺，10微米。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，进一步阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本发明实施例提供一种融合蛋白及其在靶向易团聚化蛋白降解中的应用，总体思路如下：
我们在植物上进行TCD方法的应用探索，这里我们提出了一种新型靶向降解植物内源性蛋白质团聚体方法。前期研究中，我们在模式植物拟南芥中筛选到了5个具有团聚能力和自我降解特性的可运用于TCD方法体系的E3TCD1，并进一步在烟草和水稻上证明了TCD方法靶向降解内源性蛋白质团聚体的有效性。
TCD方法是在蛋白质水平上进行遗传物质的修饰和改造，在作物育种、动物研究、医学治疗和药物研发等领域均具有重要潜在应用价值。
作为本发明实施例一种典型的实施方式，提供了一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由靶蛋白基因X的蛋白与E3TCD蛋白融合组成，所述融合蛋白的结构如式I所示：
所述X为靶蛋白基因，即目标需要被降解的蛋白基因；所述E3TCD蛋白为具有固有无序蛋白质特征的E3连接酶，可通过相分离聚集从而实现自我降解；编码所述E3TCD蛋白的基因包括由下述引物对经PCR扩增获得的基因中的一种：
1)引物对AtP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；
2)引物对OsP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示；
3)引物对ZmP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；
4)引物对TaP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示；
5)引物对GmP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示；
6)引物对AtP2，核苷酸序列如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示；
7)引物对AtP3，核苷酸序列如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14所示；
8)引物对AtP4，核苷酸序列如SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16所示；
9)引物对AtP5，核苷酸序列如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18所示。
表1
作为一种具体的实施方式，当靶蛋白基因X为OsTB1，可通过SEQ ID NO.39-SEQ IDNO.40的引物对扩增得到。
作为一种具体的实施方式，当靶蛋白基因X为ELF3，提供了ELF3-E3TCD1的核酸分子在该融合基因序列植物开花时间改良上的应用。编码ELF3蛋白的核酸分子选自如下中的一种：
1)AtELF3，核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示；可通过SEQ ID NO.42-SEQ ID NO.43的引物对扩增得到。
2)OsELF3，核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；可通过SEQ ID NO.45-SEQ ID NO.46的引物对扩增得到。
3)ZmELF3，核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示；可通过SEQ ID NO.48-SEQ ID NO.49的引物对扩增得到。
4)TaELF3，核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示；可通过SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.52的引物对扩增得到。
5)GmELF3，核苷酸序列如SEQ ID NO.53所示；可通过SEQ ID NO.54-SEQ ID NO.55的引物对扩增得到。
编码ELF3蛋白的核酸分子可采用如表2所示的引物对PCR扩增得到。
表2
作为一种具体的实施方式，当靶蛋白基因X为OCT4，提供了OCT4-E3TCD1的核酸分子在该融合基因序列海拉细胞体系蛋白降解上的应用。编码OCT4蛋白的核酸分子如下：
OCT4，核苷酸序列如SEQ ID NO.57所示；可通过SEQ ID NO.58-SEQ ID NO.59的引物对扩增得到。
作为一种具体的实施方式，提供了ProHSP::OsELF3-1-E3TCD1的核酸分子在该融合基因序列水稻结实率改良上的应用。编码ProHSP启动子的核酸分子通过如下引物对中的一种PCR扩增得到：
1)引物对HSP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20所示；从水稻基因组DNA中能够扩增出2043bp的扩增片段，即水稻的HSP1启动子，简称ProHSP1，核苷酸序列如SEQID NO.34所示；
2)引物对HSP2，核苷酸序列如SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.22所示；从水稻基因组DNA中能够扩增出825bp的扩增片段；即水稻的HSP2启动子，简称ProHSP2，核苷酸序列如SEQID NO.35所示；
3)引物对HSP3，核苷酸序列如SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.24所示。；从水稻基因组DNA中能够扩增出829bp的扩增片段；水稻的HSP3启动子，简称ProHSP3，核苷酸序列如SEQ IDNO.36所示。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种融合蛋白及其在靶向易团聚化蛋白降解中的应用进行详细说明。
实施例1TCD方法确定TB1是水稻分蘖的负调控因子
一、构建TB1-E3TCD1载体
1.引物的设计合成
在Rice Genome Annotation Project网站中下载OsTB1基因组序列，设计特异性扩增引物，以中花11(ZH11)的总cDNA为模板，进行OsTB1基因片段的扩增。我们前期研究已经进行了TCD方法体系中对E3TCD1的筛选与验证，成功构建了35S::E3TCD1质粒载体，构建方法为：将通用启动子35S和E3TCD1(核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示)用酶切连接的方式，分别采用Ecor1和Sac1双酶切，以及Kpn1和Bamh1双酶切连接至pCAMBIA1300载体上。
鉴于我们载体构建体系使用的是LIC连接方法，我们在用于扩增的上下游引物片段5′端分别加上LIC序列接头CGA CGA CAA GAC CGT ACC和GA GGA GAA GAG CCG TGC。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，各引物的序列和编号如下:
上游引物OsTB1-F：
5′--3′:CGA CGA CAA GAC CGT ACC ATGCTTCCTTTCTTCGATTCCC(SEQ ID NO.39)；
下游引物OsTB1-R：
5′--3′:GA GGA GAA GAG CCG TGC GCAGTAGTGCCGCGAATTGGCG(SEQ ID NO.40)；
2.PCR扩增
以ZH11的cDNA为模板，用步骤1合成的引物，PCR扩增OsTB1片段，扩增反应体系和具体反应条件如下：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：95℃变性5min,再95℃30Sec，56℃30Sec，72℃2min进行35个循环；72℃5min。
扩增后的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用胶回收试剂盒对目的片段进行回收和纯化。
3.目的片段和载体LIC处理
将步骤2所述回收后的目的片段进行LIC处理，具体反应体系和步骤如下：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：12℃30min，75℃10min。
将前期研究构建的35S::E3TCD1载体进行LIC处理，具体反应体系和步骤如下：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：12℃40min，75℃10min。
4.35S::TB1-E3TCD1载体构建
将步骤3所述LIC处理好的载体和目的片段各取出1.5ul混匀，放入PCR热循环仪上反应：75℃5min，22℃5min。
将上述3ul连接产物转移到30ul超感受态大肠杆菌DN5α中，手指轻弹3-5次，随后在冰上静置20至30min。静置后将其放入42℃热激1min，立即转移至冰上冰浴2min。向其中添加200ul无抗LB，在220rpm，37℃的摇床复苏45-60min。以6000rpm的速度沉淀大肠杆菌2min，并将其均匀涂在具有Kana抗性的培养皿中，放在37℃的培养箱里生长一夜。
次日，将8个菌落划线到新平板上，并在下午进行菌落PCR。选择一个阳性菌落进行测序，测序结果无误后，从公司返回质粒进行农杆菌转化。
同时，将35S::E3TCD1、35S::TB1-mYFP载体作为对照，其中35S::TB1-mYFP载体的构建方法为：将通用启动子35S和TB1-mYFP(核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示)用酶切连接的方式，分别采用Ecor1和Sac1双酶切，以及Kpn1和Bamh1双酶切连接至pCAMBIA1300载体上。
将含有35S::TB1-E3TCD1的质粒转入农杆菌GV3101(用于烟草注射等相关实验)和农杆菌EHA105(用于获得水稻转基因植株)。
具体农杆菌转化步骤如下：将上述3ul质粒转移到30ul超感受态农杆菌GV3101或EHA105中，手指轻弹3-5次，随后在冰上静置10min。先将其放入液氮中冰冻1min，再将其放入42℃热激1min，接着立即转移至冰上冰浴2min。向其中添加200ul无抗LB，在220rpm，28℃的摇床复苏45-60min。以6000rpm的速度沉淀农杆菌2min，并将其均匀涂在具有Kana抗性的培养皿中，放在28℃的培养箱里生长两天。挑取农杆菌单克隆菌落摇菌，并和50％的甘油以1：1混合保管在-80℃的冰箱中。
二、在烟草中异源表达35S::TB1-E3TCD1可有效降解TB1
1、烟草注射
在温室种植Nicotiana benthamiana烟草，培养环境如下：14h光照/10h黑暗，温度25℃，相对湿度70％；培养烟草大概4～5周便可注射使用。
通过上述步骤，获得含有35S::TB1-E3TCD1、35S::E3TCD1、35S::TB1-mYFP载体的农杆菌GV3101。将含构建好的载体的农杆菌挑取部分至含有Kana抗生素的3ml LB培养基中，在28℃的摇床里，200rpm的条件下培养18h。(OD600约1.0-2.0)
取100ul菌液，在室温下，6000rpm离心5min以收集菌体。将菌体重悬于2mL浸染液(含10mM MgCl2,10mM MES，150μM乙酰丁香酮(AS)，pH＝5.6)。随后室温静止2-3h。(至少0.5h，至多不超过3h。)
用去掉针头的针管吸取菌液，将35S::TB1-E3TCD1和35S::TB1-mYFP共注射到烟草叶片中，并以35S::E3TCD1和35S::TB1-mYFP的共注射为对照。用记号笔标记烟草叶片水渍状区域。
注射过的植株于21℃左右培养36-48h后，进行蛋白质免疫印迹测定TB1的蛋白质含量。
2、蛋白质免疫印迹(Western-blot)
用抗-YFP为一抗，Western blotting分析TB1蛋白表达。具体步骤包括：
1)样品处理
取0.1g上述注射后的烟草叶片进行研磨，实验组和对照组各加入100ul的样品缓冲液(Loading buffer)混匀，随后在水浴锅煮沸5min，冷却备用。
2)蛋白质组分SDS-PAGE电泳分离
采用5％浓缩胶、10％分离胶进行电泳。具体按《分子克隆，实验手册》进行。为便于比较，电泳加样时使用相同体积的各样品。
3)转膜与抗体反应
待电泳结束，取出凝胶并用清水洗涤。同时用转膜缓冲液浸泡硝酸纤维膜(NC)和滤纸5min，按阴极-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵-阳极顺序铺设凝胶和NC膜，放入电泳槽，88V电压低温条件下电泳3h。取出NC膜用1×TBST(％Tween-20的TBS)洗涤5min，加入含5％脱脂奶粉的TBST封闭缓冲液(blocking buffer)，37℃孵育2h。TBST洗涤NC膜3次，每次10min。加入鼠抗YFP(1:500PBST稀释)，37℃孵育2h。TBST充分洗涤NC膜3-5次，每次10min。加入HRP标记羊抗鼠IgG抗体(TBST 1:3000稀释)，37℃孵育1h，TBST充分洗涤NC膜3-5次，每次10min。加入DAB显色液(具体配方见《分子克隆，实验手册》)，室温避光显色5-10min，清水洗NC膜观察记录结果。
我们观察到在共表达TB1-E3TCD1和TB1-mYFP后，TB1-mYFP的蛋白含量减少，表明TB1-E3TCD1能够降解TB1。(见图三b,c)
三、35S::TB1-E3TCD1转基因水稻分蘖数显著增加
1、获得转基因水稻
将上述步骤一获得的含有35S::TB1-E3TCD1、35S::E3TCD1载体的农杆菌EHA105送到武汉伯远生物科技有限公司进行水稻转化。我们使用的水稻品种为中花11(ZH11)。在获得转基因水稻后，我们先进行转基因阳性植株的筛选。在确定好阳性转基因植株后，我们将其种植在武汉大学花山水稻试验基地。
2、转基因水稻表型观测
上述转基因水稻在自然环境下生长，管理措施同大田。
经过观察，我们发现ZH11和35S::E3TCD1对照系之间的分蘖数没有显著差异。这表明E3TCD1的自降解特性可以防止对植物生长的负面影响。与35S::E3TCD1转基因相比，35S::TB1-E3TCD1转基因显示出分蘖数增加，与文献报导的具有TB1 DNA突变的植物表型一致。(见图3d,e)
实施例2、TCD方法可以靶向降解水稻ELF3-1延迟水稻开花
一、构建OsELF3-1-E3TCD1载体
1、引物的设计合成
在Rice Genome Annotation Project网站中下载OsELF3-1基因组序列，设计特异性扩增引物，以中花11(ZH11)的总cDNA为模板，进行OsELF3-1基因片段的扩增。我们前期研究已经进行了TCD方法体系中对E3TCD1的筛选与验证，成功构建了35S::E3TCD1质粒载体。鉴于我们载体构建体系使用的是LIC连接方法，我们在用于扩增的上下游引物片段5′端分别加上LIC序列接头CGACGACAAGACCGT ACC和GAGGAGAAGAGCCGTGC。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，各引物的序列和编号如下:
上游引物OLM707
5′--3′:CGA CGA CAA GAC CGT ACC ATGGCGACGAGGGGAGGAGG(SEQ ID NO.45)；
下游引物OLM708
5′--3′:GA GGA GAA GAG CCG TGC ATCATCTCGTTGCCGTTCCATTTG(SEQ ID NO.46)；
2、PCR扩增
以ZH11的cDNA为模板，用步骤1合成的引物，PCR扩增OsELF3-1片段，扩增反应体系和具体反应条件如下：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：95℃变性5min,再95℃30Sec，56℃30Sec，72℃2min进行35个循环；72℃5min。
扩增后的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用胶回收试剂盒对目的片段进行回收和纯化。
3、目的片段和载体LIC处理
将步骤2所述回收后的目的片段进行LIC处理，具体反应体系和步骤如下：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：12℃30min，75℃10min。
将前期研究构建的35S::E3TCD1载体进行LIC处理，具体反应体系和步骤如下：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：12℃40min，75℃10min。
4、35S::OsELF3-1-E3TCD1载体构建
将步骤3所述LIC处理好的载体和目的片段各取出1.5ul混匀，放入PCR热循环仪上反应：75℃5min，22℃5min。
将上述3ul连接产物转移到30ul超感受态大肠杆菌DN5α中，手指轻弹3-5次，随后在冰上静置20-30min。静置后将其放入42℃热激1min，立即转移至冰上冰浴2min。向其中添加200ul无抗LB，在220rpm，37℃的摇床复苏45-60min。以6000rpm的速度沉淀大肠杆菌2min，并将其均匀涂在具有Kana抗性的培养皿中，放在37℃的培养箱里生长一夜。
次日，将8个菌落划线到新平板上，并在下午进行菌落PCR。选择一个阳性菌落进行测序，测序结果无误后，从公司返回质粒进行农杆菌转化。
将含有35S::OsELF3-1-E3TCD1的质粒转入农杆菌GV3101(用于烟草注射等相关实验)和农杆菌EHA105(用于获得水稻转基因植株)。
具体农杆菌转化步骤如下：将上述3ul质粒转移到30ul超感受态农杆菌GV3101或EHA105中，手指轻弹3-5次，随后在冰上静置10min。先将其放入液氮中冰冻1min，再将其放入42℃热激1min，接着立即转移至冰上冰浴2min。向其中添加200ul无抗LB，在220rpm，28℃的摇床复苏45-60min。以6000rpm的速度沉淀农杆菌2min，并将其均匀涂在具有Kana抗性的培养皿中，放在28℃的培养箱里生长两天。挑取农杆菌菌落摇菌，并和50％的甘油以1：1混合保管在-80℃的冰箱中。
二、在烟草中异源表达35S::OsELF3-1-E3TCD1可有效降解OsELF3-1
1、烟草注射
在温室种植Nicotiana benthamiana烟草，培养环境如下：14h光照/10h黑暗，温度25℃，相对湿度70％；培养烟草大概4～5周便可注射使用。
通过上述步骤，获得含有35S::OsELF3-1-E3TCD1、35S::E3TCD1、35S::OsELF3-1-mYFP载体的农杆菌GV3101。将含构建好的载体的农杆菌挑取部分至含有Kana抗生素的3mlLB培养基中，在28℃的摇床里，200rpm的条件下培养18h。(oD600约1.0-2.0)。
取100ul菌液，在室温下，6000rpm离心5min以收集菌体。将菌体重悬于2mL浸染液(含10mM MgCl2,10mM MES，150μM乙酰丁香酮(AS)，pH＝5.6)。随后室温静止2-3h。(至少0.5h，至多不超过3h。)
用去掉针头的针管吸取菌液，将35S::OsELF3-1-E3TCD1和35S::OsELF3-1-mYFP共注射到烟草叶片中，并以35S::E3TCD1和35S::OsELF3-1-mYFP的共注射为对照。用记号笔标记烟草叶片水渍状区域。
注射过的植株于21℃左右培养36-48h后，进行蛋白质免疫印迹测定OsELF3-1的蛋白质含量。
2、蛋白质免疫印迹(Western-blot)
用抗-YFP为一抗，Western blotting分析OsELF3-1蛋白表达。具体步骤包括：
(1)样品处理
取0.1g上述注射后的烟草叶片进行研磨，实验组和对照组各加入100ul的样品缓冲液(Loading buffer)混匀，随后在水浴锅煮沸5min，冷却备用。
(2)蛋白质组分SDS-PAGE电泳分离
采用5％浓缩胶、10％分离胶进行电泳。具体按《分子克隆，实验手册》进行。为便于比较，电泳加样时使用相同体积的各样品。
(3)转膜与抗体反应
待电泳结束，取出凝胶并用清水洗涤。同时用转膜缓冲液浸泡硝酸纤维膜(NC)和滤纸5min，按阴极-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵-阳极顺序铺设凝胶和NC膜，放入电泳槽，88V电压低温条件下电泳3h。取出NC膜用1×TBST(％Tween-20的TBS)洗涤5min，加入含5％脱脂奶粉的TBST封闭缓冲液(blocking buffer)，37℃孵育2h。TBST洗涤NC膜3次，每次10min。加入鼠抗YFP(1:500PBST稀释)，37℃孵育2h。TBST充分洗涤NC膜3-5次，每次10min。加入HRP标记羊抗鼠IgG抗体(TBST 1:3000稀释)，37℃孵育1h，TBST充分洗涤NC膜3-5次，每次10min。加入DAB显色液(具体配方见《分子克隆，实验手册》)，室温避光显色5-10min，清水洗NC膜观察记录结果。
我们观察到OsELF3-1-E3TCD1和OsELF3-1-mYFP的共表达可以减少OsELF3-1-mYFP的聚集，表明OsELF3-1-E3TCD1能够降解OsELF3-1。(图4a,b)
三、35S::OsELF3-1-E3TCD1转基因水稻开花延迟
1、获得转基因水稻
将上述步骤获得的含有35S::OsELF3-1-E3TCD1、35S::E3TCD1载体的农杆菌EHA105送到武汉伯远生物科技有限公司进行水稻转化。我们使用的水稻品种为中花11(ZH11)。在获得转基因水稻后，我们先进行转基因阳性植株的筛选。在确定好阳性转基因植株后，我们将其种植在武汉大学花山水稻试验基地。
2、转基因水稻表型观测
上述转基因水稻在自然环境下生长，管理措施同大田。
我们观察到，与35S::E3TCD1对照系相比，35S::OsELF3-1-E3TCD1转基因水稻的开花明显延迟(图4c,d)。
实施例3、温度响应启动子调控靶向降解水稻ELF3-1可以提高水稻结实率
一、构建ProHSP1::OsELF3-1-E3TCD1载体
1、引物的设计合成
在Rice Genome Annotation Project网站中下载HSP1启动子序列，设计特异性扩增引物，以中花11(ZH11)的基因组为模板，进行HSP1启动子片段的扩增。前期研究已经成功构建了35S::OsELF3-1-E3TCD1质粒载体(见实施例1)。鉴于我们载体构建体系使用的是LIC连接方法，我们用Ecor1和Kpn1双酶切将35S替换为LIC序列tcgacgacaagaccgggcccggctcttctcctca。我们在用于扩增的上下游引物片段5′端分别加上LIC序列接头CGACGACAAGACCGT和GAGGAGAAGAGCCGT。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，各引物的序列和编号如下:
上游引物HSP1-F
5′--3′:CGA CGA CAA GAC CGT GGTGGCAAAGAAAGAGGTTGGTTTA(SEQ ID NO.19)；
下游引物HSP1-R
5′--3′:GA GGA GAA GAG CCGT GCTCGGTGGGAGGAGGGGTTTAAAT(SEQ ID NO.20)；
2、PCR扩增
以ZH11的基因组DNA为模板，用步骤1合成的引物，PCR扩增HSP启动子片段，扩增反应体系和具体反应条件如下：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：95℃变性5min,再95℃30Sec，56℃30Sec，72℃2min进行35个循环；72℃5min。
扩增后的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用胶回收试剂盒对目的片段进行回收和纯化。
3、目的片段和载体LIC处理
将步骤2所述回收后的目的片段进行LIC处理，具体反应体系和步骤如下：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：12℃30min，75℃10min。
将前期研究构建的Pro::OsELF3-1-E3TCD1载体进行LIC处理，具体反应体系和步骤如下：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：12℃40min，75℃10min。
4、ProHSP::OsELF3-1-E3TCD1载体构建
将步骤3所述LIC处理好的载体和目的片段各取出1.5ul混匀，放入PCR热循环仪上反应：75℃5min，22℃5min。
将上述3ul连接产物转移到30ul超感受态大肠杆菌DH5α中，手指轻弹3-5次，随后在冰上静置20-30min。静置后将其放入42℃热激1min，立即转移至冰上冰浴2min。向其中添加200ul无抗LB，在220rpm，37℃的摇床复苏45-60min。以6000rpm的速度沉淀大肠杆菌2min，并将其均匀涂在具有Kana抗性的培养皿中，放在37℃的培养箱里生长一夜。
次日，将8个菌落划线到新平板上，并在下午进行菌落PCR。选择一个阳性菌落进行测序，测序结果无误后，从公司返回质粒进行农杆菌转化。
将含有ProHSP::OsELF3-1-E3TCD1的质粒转入农杆菌EHA105(用于获得水稻转基因植株)。
具体农杆菌转化步骤如下：将上述3ul质粒转移到30ul超感受态农杆菌GV3101或EHA105中，手指轻弹3-5次，随后在冰上静置10min。先将其放入液氮中冰冻1min，再将其放入42℃热激1min，接着立即转移至冰上冰浴2min。向其中添加200ul无抗LB，在220rpm，28℃的摇床复苏45-60min。以6000rpm的速度沉淀农杆菌2min，并将其均匀涂在具有Kana抗性的培养皿中，放在28℃的培养箱里生长两天。挑取农杆菌菌落摇菌，并和50％的甘油以1：1混合保管在-80℃的冰箱中。
二、ProHSP::OsELF3-1-E3TCD1转基因水稻开花延迟
1、获得转基因水稻
将上述步骤获得的含有ProHSP::OsELF3-1-E3TCD1载体的农杆菌EHA105送到武汉伯远生物科技有限公司进行水稻转化。我们使用的水稻品种为中花11(ZH11)。在获得转基因水稻后，我们先进行转基因阳性植株的筛选。在确定好阳性转基因植株后，我们将其种植在武汉大学花山水稻试验基地。
2、转基因水稻表型观测
上述转基因水稻在自然环境下生长，管理措施同大田。
我们观察到，与ZH11对照系相比，ProHSP::OsELF3-1-E3TCD1转基因水稻的开花明显延迟，并且结实率显著提高(图5c,e,f)。
实施例4、TCD方法可以靶向降解Hela细胞OCT4蛋白
一、构建OCT4-EGFP和OCT4-E3TCD1载体
1.引物的设计合成
在NCBI网站中下载OCT4基因组序列，设计特异性扩增引物，以Hela细胞的总cDNA为模板，进行OCT4基因片段的扩增。引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，各引物的序列和编号如下:
上游引物OLM1132：
5′--3′:CGA CGA CAA GAC CGT ACC ATGGCGGGACACCTGGCTTC(SEQ ID NO.58)；
下游引物OLM1133：
5′--3′:gaggagaagagccgtagaccctccgcc GTTTGAATGCATGGGAGAGCC
(SEQ ID NO.59)；
2.PCR扩增
以Hela细胞的总cDNA为模板，用步骤1合成的引物，PCR扩增OCT4片段，扩增反应体系和具体反应条件如下：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：95℃变性5min,再95℃30Sec，56℃30Sec，72℃2min进行35个循环；72℃5min。
扩增后的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用胶回收试剂盒对目的片段进行回收和纯化。
3.目的片段和载体LIC处理
将步骤2所述回收后的目的片段进行LIC处理，具体反应体系和步骤如下：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：12℃30min，75℃10min。
将CMV promoter::EGF和PGK promoter::E3TCD1载体进行LIC处理，具体反应体系和步骤如下：
用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：12℃40min，75℃10min。
将上述3ul连接产物转移到30ul超感受态大肠杆菌DH5α中，手指轻弹3-5次，随后在冰上静置20至30min。静置后将其放入42℃热激1min，立即转移至冰上冰浴2min。向其中添加200ul无抗LB，在220rpm，37℃的摇床复苏45-60min。以6000rpm的速度沉淀大肠杆菌2min，并将其均匀涂在具有Kana抗性的培养皿中，放在37℃的培养箱里生长一夜。
次日，将8个菌落划线到新平板上，并在下午进行菌落PCR。选择一个阳性菌落进行测序，测序结果无误后，提取质粒。
二、在Hela细胞中表达OCT4-E3TCD1可有效降解OCT4-EGFP
转染OCT4-EGFP和OCT4-E3TCD1质粒
将1微克OCT4-EGFP质粒和1微克OCT4-E3TCD1质粒混合加入准备好的Hela细胞并加入侵染液，随后培养细胞48小时；将单独转化1微克OCT4-EGFP质粒的Hela细胞作为对照组。用激光共聚焦显微镜观察OCT4-EGFP蛋白的荧光强度，发现在共表达OCT4-E3TCD1和OCT4-EGFP后，OCT4-EGFP的蛋白含量减少，表明OCT4-E3TCD1能够降解OCT4。(见图6)。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由靶蛋白基因X的蛋白与E3TCD蛋白融合组成，所述融合蛋白的结构如式I所示：
所述X为靶蛋白基因，即目标需要被降解的蛋白基因；所述E3TCD蛋白为具有固有无序蛋白质特征的E3连接酶，可通过相分离聚集从而实现自我降解；编码所述E3TCD蛋白的基因包括以下中的一种：
拟南芥的E3TCD蛋白，简称AtE3TCD1，核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；
水稻的E3TCD蛋白，简称OsE3TCD1，核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；
玉米的E3TCD蛋白，简称ZmE3TCD1，核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
小麦的E3TCD蛋白，简称TaE3TCD1，核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；
大豆的E3TCD蛋白，简称GmE3TCD1，核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；
拟南芥的E3TCD2蛋白，简称AtE3TCD2，核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
拟南芥的E3TCD3蛋白，简称AtE3TCD3，核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；
拟南芥的E3TCD4蛋白，简称AtE3TCD4，核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；
拟南芥的E3TCD5蛋白，简称AtE3TCD5，核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示。
2.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于，编码所述E3TCD蛋白的基因由下述引物对经PCR扩增获得：
1)引物对AtP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；从拟南芥cDNA中扩增出2001bp的扩增片段；
2)引物对OsP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示；从水稻cDNA中能够扩增出2004bp的扩增片段；
3)引物对ZmP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；从玉米cDNA中能够扩增出1992bp的扩增片段；
4)引物对TaP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示；从小麦cDNA中能够扩增出2007bp的扩增片段；
5)引物对GmP1，核苷酸序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10所示；从大豆cDNA中能够扩增出2148bp的扩增片段；
6)引物对AtP2，核苷酸序列如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12所示；从拟南芥cDNA中扩增出1485bp的扩增片段；
7)引物对AtP3，核苷酸序列如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14所示；从拟南芥cDNA中扩增出1461bp的扩增片段；
8)引物对AtP4，核苷酸序列如SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16所示；从拟南芥cDNA中扩增出1038bp的扩增片段；
9)引物对AtP5，核苷酸序列如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18所示；从拟南芥cDNA中扩增出996bp的扩增片段。
3.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述靶蛋白基因X与所述E3TCD蛋白直接连接或者通过Linker连接。
4.一种编码权利要求1-3任一所述的融合蛋白的核酸分子。
5.一种含有权利要求4所述的核酸分子的重组载体。
6.一种包含权利要求5所述的重组载体的转化体。
7.一种靶向降解植物内源性蛋白质团聚体方法，其特征在于，所述方法包括：通过瞬时表达或转基因的方法，将权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组载体转入植物体中，进而表达出权利要求1-3任一所述的融合蛋白，实现对植物内源性蛋白质团聚体的靶向降解。
8.权利要求1-3任一所述的融合蛋白或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组载体在改良植物性状中的应用。
9.权利要求1-3任一所述的融合蛋白或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组载体在制备基于蛋白质靶向降解产品中的应用。
10.权利要求1-3任一所述的融合蛋白或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组载体在药物筛选中的应用。
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