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CN119569839A - 油菜BnaREV3蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

油菜BnaREV3蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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CN119569839A
CN119569839A CN202411855439.2A CN202411855439A CN119569839A CN 119569839 A CN119569839 A CN 119569839A CN 202411855439 A CN202411855439 A CN 202411855439A CN 119569839 A CN119569839 A CN 119569839A
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刘蓉
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Hunan Agricultural University
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Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，具体为一种油菜BnaREV3蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的SEQ ID No：1；2)将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一至五个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对改善油菜耐寒作用的蛋白质。本发明还包括含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌。油菜BnaREV3蛋白的编码基因在油菜中的表达能显著提高油菜的抗寒能力。本发明为油菜抗寒提供了一种全新的途径。

Description

油菜BnaREV3蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种油菜BnaREV3蛋白及其编码基因与在抗寒方面的应用。
背景技术
油菜是重要的经济作物。来自油菜的菜籽油是人类最主要的食用油来源之一，是我国粮油安全保障的重要一环，为我国重要的战略物质之一。目前，我国的食用油将近60％依赖进口。为提高我国食用油安全，扩大甘蓝型油菜的种质面积是国家层面采取的一项重要措施。在长江中下游以南，冬闲田超过6000万亩没有被利用，主要原因是稻稻油耕作方式下，水稻与油菜种植之间存在接茬冲突。为了解决这种接茬冲突，需要缩短油菜的生育期，将油菜的开花提前到1月，而1月份是冬闲田区气温最低的月份，油菜在1月开花，油菜的幼荚会冻死，不能结实，最终没有产量。通过对油菜种质选育获得一份耐寒材料，并利用这份材料成功定位一个耐寒基因BnaREV3。通过基因工程方法，先克隆耐寒基因BnaREV3，并构建该基因的过表达质粒；然后将BnaREV3蛋白基因转入不耐寒的甘蓝型油菜中，以期获得具有抗寒的油菜种质资源。本发明通过基因工程的方法，首次发现BnaREV3蛋白及其编码基因，该基因可显著提高油菜对寒害的抗性。
发明内容
本发明的目的是，针对上述现有技术的不足，提供一种耐寒基因资源BnaREV3蛋白及其编码基因，同时提供该基因在油菜抗寒中的应用。
为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种BnaREV3蛋白，来源于油菜基因突变，是下述氨基酸残基序列之一：
1)序列表中的SEQ ID No:1；
2)将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一至五个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对提高油菜抗寒作用的蛋白质。
编码本发明BnaREV3蛋白的基因(BnaREV3)，是下述核苷酸序列之一：
1)序列表中的SEQ ID No:2的核苷酸序列；
2)编码序列表中的SEQ ID No:1蛋白质序列的DNA；
3)与序列表中的SEQ ID No:2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；
序列表中的SEQ ID No:2由891个碱基组成，其编码框为自5’端第1-891位碱基，编码具有序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列的蛋白质。
本发明还包括含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该基因中任一片段的引物对。
本发明还提供上述的BnaREV3蛋白基因在调控油菜抗寒中的应用。
本发明还提供将编码上述BnaREV3蛋白的基因转入油菜中，经培育得到转基因油菜，该转基因油菜的抗寒能力得到提高，从而得到抗寒的油菜种质资源。
本发明的为BnaREV3蛋白基因的过表达转基因油菜对低温抗性显著提高。本发明为油菜提高油菜抗寒提供了一个优质基因。本发明的蛋白质及其编码基因具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
附图说明
图1是从油菜叶片中分离出的总RNA电泳图。
其中：M为指示DNA片段大小的DNA分子标记，1为提取的RNA；样品来源的RNA有明显18S rRNA和28S rRNA二条带，说明RNA质量可靠，能用于下一步反转录合成cDNA。
图2是油菜BnaREV3蛋白基因全长CDS的PCR扩增产物电泳图。
其中，M为DNA片段分子量大小的100bp plus Ladder DNA标记，1、2、3为扩增产物。
图3过表达质粒pFGC5941-BnaREV3CDS构建的酶切检测结果，1-4为不同菌落提取质粒载体酶切片段，大小与预期的一致。
图4是BnaREV3转基因植株的PCR验证电泳图。
其中：M为指示DNA片段大小的DNA分子标记，1-14为抗性植株，CK为空白对照，图中显示有4株为转基因植株。
图5是BnaREV3过表达转基因油菜的抗寒试验。
其中：随着在低温中的处理时间加长，对照77gao明显收到危害；而BnaREV3过表达转基因油菜还没有显现出危害症状，说明BnaREV3过表达能促进油菜耐寒。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。所用引物和测序工作由擎科生物科技有限公司完成。
实施例1.油菜总RNA分离与BnaREV3蛋白基因全长CDS的克隆
一、油菜总RNA分离与第一互补链cDNA的合成
用RNA试剂盒(普洛麦格，上海)提取油菜幼苗叶片总RNA，将带有总RNA沉淀的离心管放入生物安全柜中吹干，至沉淀为半透明状，然后加入40μL无RNA酶水(RNase-free水)溶解RNA 5min左右；整个操作要带口罩及一次性手套。取RNA溶液5μL与1×loading buffer(6×loading buffer：30mM EDTA,36％(v/v)甘油,0.05％(w/v)溴酚蓝)混合，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测(图1)。结果显示：第1泳道的28S rRNA与18S rRNA带明显，没有降解，表明提取的核盘菌RNA质量较好，纯度较高，可用于下一步反转录合成cDNA。
吸取1μg RNA至无菌无核酸酶的200μL的PCR管中，先加入1μL Oligd(T)，用ddH20补至总体积11μL，65℃水浴5min，后放置冰上3min；之后按照反转录试剂盒RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher Scientific,Shanghai)的体系加入各试剂，轻轻混合，短暂地离心。然后放入PCR仪中42℃反应1hr孵育，70℃反应5min终止整个反应。最后将反转得到的cDNA储于-20℃，用于下一步BnaREV3基因全长CDS的克隆的PCR模板。
二、BnaREV3基因全长CDS克隆
从https://yanglab.hzau.edu.cn/BnTIR网站上查找BnaREV3基因的参考序列为BnaA10G0004700ZS，根据参考的CDS全长序列，使用Primer Premier 5软件设计BnaREV3基因全长CDS的PCR引物对，引物序列分别为正向引物BnaREV3CDS-F：5’－TCTAGAATGAATATGAGCTTACCGGGTTTCAG－3’(SEQ ID No:3，下划线表示为XbaI酶切位点)和反向引物BnaREV3CDS-R：5’－CCATGGTCACTGTTGTATGATGATATTAACCTCCTCTG－3’(SEQ ID No:4，下划线表示为NcoI酶切位点)。以前述反转录成的cDNA为模板，高保真PCR扩增BnaREV3基因的全长CDS序列。50μl PCR反应体系包含：模板2μl，高保真酶Phusion High-fidelity DNAPolymerase(Invitrogen)1μl，10×缓冲液5μl，2.5uM dNTP 8μl，20μM的正向和反向引物各1μl，水32μl。反应条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分钟，共30个循环。反应结束后，将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增得到一条903bp大小的DNA片段，与预期的目标片段大小相符(图2)。将扩增片段回收并纯化后，将其克隆到载体pEASY-Blunt Cloning(购自全式金公司)中，得到含有目的片段的重组质粒pEASY-BnaREV3CDS，经转化、筛选后测序，结果见SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，其由891个碱基组成，其编码框为自5’端第1-891位碱基(最后三个碱基为终止密码子TGA)，编码具有SEQ ID No:1的氨基酸残基序列的蛋白质,为311个氨基酸残基，编码的蛋白命名为BnaREV3。
实施例2.BnaREV3基因过表达质粒的构建
选择测序正确的pEASY-BnaREV3CDS重组质粒，与pFGC5941质粒分别同时用FastDigest Enzyme NcoI和XbaI(Fermetans)两种质粒进行双酶切，酶切温度37℃，酶切时间为30-40min，反应体系40μL(1μg质粒DNA，2μL10×FastDigest Green Buffer，0.5μLFastDigestNcoI，0.5μL FastDigestXbaI，加水至40μL)，具体按照Fermetans公司试剂盒说明进行；酶切产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，切下目的条带，用胶回收试剂盒纯化回收，将回收的两个目标DNA片段通过T4连接酶连接，连接产物通过热激法转化大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α，转化细胞在液体LB培养基中，37℃、200rpm的条件下复苏1h；将经过恢复培养的细胞均匀涂于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养皿上，37℃培养16h。挑取LB固体培养基上的单菌落，以引物35SF：5'-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3'(SEQ ID No.5)和BnaREV3CDS-R(SEQ ID No.4)进行菌落PCR鉴定，显示PCR扩增产物电泳带在1000bp与900bp之间，结果与预期的片段大小一致。选择PCR检测正确的单菌落扩大培养，提取质粒，以FastDigest Enzyme NcoI和XbaI进行双酶切验证，见图4，双酶切片段弱大于1000bp，与预期的片段大小一致。PCR鉴定和双酶切鉴定两种结果都说明过表达质粒pFGC5941-BnaREV3CDS构建成功。
实施例3.甘蓝型油菜转化及分子鉴定与转基因油菜抗寒检测
一、甘蓝型油菜转化
一)外植体的准备
选取甘蓝型油菜易感病品种“77gao”完整饱满的种子约100颗，置于150mL三角瓶中。向装有种子的三角瓶中加入20-30mL 75％乙醇，振荡消毒30s，弃去酒精；再加入20mL0.1％HgCl2和1滴TWEEN-20的消毒液，剧烈摇晃至起泡，静置20min，弃去消毒液，用无菌水反复冲洗3-5遍以洗净泡沫；加入50mL经高温灭菌的无菌水浸泡种子，浸泡时间为1h；倒掉无菌水，把种子均匀铺在1/2MS固体培养基上，22℃暗培养4-5d。待油菜幼苗长到4-5cm后将其转移到光照条件下生长6-8h，使幼苗子叶转绿。子叶柄作为转化的外植体。
二)农杆菌的准备
幼苗生长到1-2cm时，开始准备菌液。将分别带有pFGC5941-BnaREV3CDS质粒的农杆菌LBA4404菌株在含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL链霉素和100mg/mL利福平的YEB固体培养基上划线，28℃恒温培养3d。挑取单菌落于10mL含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL链霉素和100mg/mL利福平的YEB液体培养基中，28℃、200rpm扩大培养16-18h。吸取1mL菌液加入到50mL含50mg/mL卡那霉素、50mg/mL链霉素和100mg/mL利福平的YEB液体培养基中，扩大培养至菌液OD600达到0.4-0.8。
三)子叶柄的农杆菌转化与抗性苗筛选
将油菜幼苗子叶柄从生长点以上的分支处切下，转移到BM液中。将扩大后的农杆菌菌液从三角瓶转移至50mL离心管，6000rpm/min离心10min，去上清后于离心管中加入25mL BM液，振荡使农杆菌重悬；再加入10μLβ-巯基乙醇和20μL乙酰丁香酮，摇匀后作为工作液倒入已灭菌的平皿中。将切好的子叶柄转到该工作液中浸泡10min。浸泡后，将子叶柄转移到已灭菌的吸水纸上。用镊子翻动子叶柄使子叶柄表面残留工作液被吸水纸吸干。最后将子叶柄均匀铺放在共培培养基(1升MS+1mg 6-苄氨基嘌呤+30g蔗糖+1.6g植物凝胶)上，22℃，暗共培养36h。共培完成后，将外植体转移到筛选培养基(1升MS+2mg 6-苄氨基嘌呤+20mg草铵膦+500mg头孢霉素+30g蔗糖+1.6g植物凝胶)中。22℃，长日照培养；每10-14d更换一次筛选培养基。
当外植体分化出若干簇抗性不定芽后，将不定芽切开分离后放入生根培养基(1升1/2MS+20mg草铵膦+10g蔗糖+1.6g植物凝胶)上继续培养。分化苗长出足够的根系后，将其从生根培养基中取出，并用无菌水将根上残留的培养基清洗干净。然后将分化苗移入蛭石中，炼苗10天。炼苗之后转入土壤中，共获得草铵膦抗性苗14株。抗性苗用于下一步PCR转基因检测鉴定。
四)抗性苗转基因鉴定与BnaREV3基因表达检测
用CTAB方法从转pFGC5941-BnaREV3CDS质粒的抗性苗叶组织中提取总DNA，以总DNA作为模板，35SF(SEQ ID No.5)和BnaREV3CDS-R(SEQ ID No.4)为引物，进行PCR检测(扩增片段为1915bp)，检测结果显示与质粒为阳性对照扩增片段大小一致的有14株，说明总共获得了4株BnaREV3基因过表达转基因植株(见图4)。待转基因植株开花结实后，收取种子，选取其中的11号做抗寒鉴定。
二、转基因油菜抗寒检测
受体油菜77gao作为对照，将对照与BnaREV3基因过表达转基因植株进行低温处理，温度为-4℃，处理时长分别为6、12和24h，结果显示BnaREV3基因过表达转基因植株的耐寒能力显著高于对照(图5)。
相关序列
SEQ ID No.1，油菜BnaREV3蛋白
MNMSLPGFSTTLPHSKTTMPVSARSHTMSFSEDPTKKIRKPYTITKSRENWTEQEHDKFIEALHLFDRDWKKIEAFVGSKTVIQIRSHAQKYFLKVQKNGTNEHLPPPRPKRKANHPYPQKASKSVALTTSNALLEHEYLYPTDPQPVISTPNHGLMRCNVITPIPVIKEELGVLENCCSTSRSRSIRDKMRTRTVTETDDQRVMPNFAEVYSFIGSVFDPKTTGHVQRLKQMDPINLETVLLLMKNLSVNLSSPEFEEQVSVTHRYTKFVKSSFFGLRGMIGLFYTEEVNIIIQQ
SEQ ID No.2
ATGAATATGAGCTTACCGGGTTTCAGTACTACTCTTCCCCACTCGAAGACAACGATGCCTGTTTCTGCACGGAGCCATACGATGTCGTTCAGCGAGGATCCAACAAAGAAGATTAGAAAGCCATACACAATCACCAAGTCTAGAGAGAACTGGACGGAGCAAGAACACGACAAGTTCATTGAAGCTCTCCATTTGTTTGACCGTGATTGGAAGAAAATAGAGGCCTTTGTTGGATCAAAAACAGTTATCCAGATACGAAGCCACGCGCAGAAATACTTTCTAAAGGTTCAGAAGAATGGGACTAACGAACATCTTCCTCCTCCTCGACCAAAGAGGAAAGCTAATCATCCCTATCCACAAAAGGCTTCCAAAAGTGTGGCTCTTACAACTTCAAACGCATTGCTTGAACATGAGTACTTGTACCCCACTGATCCACAACCGGTGATTAGTACTCCTAATCACGGATTAATGCGTTGCAATGTTATTACGCCAATTCCAGTGATCAAAGAGGAATTGGGTGTCCTAGAGAACTGTTGCAGCACTAGTCGTAGTAGGAGTATTAGAGATAAGATGAGGACGAGAACAGTTACGGAGACAGATGACCAGAGAGTGATGCCGAATTTCGCTGAAGTTTACAGCTTTATAGGAAGTGTATTCGATCCAAAAACAACAGGTCATGTCCAGAGGTTAAAGCAAATGGATCCTATCAATCTAGAAACGGTCCTCTTATTGATGAAAAACTTGTCTGTAAACCTGTCAAGCCCCGAGTTTGAAGAACAAGTAAGTGTTACTCATCGCTACACAAAGTTTGTTAAATCTTCATTTTTTGGCTTACGGGGCATGATTGGTCTGTTTTATACAGAGGAGGTTAATATCATCATACAACAGTGA
SEQ ID No.3
5’－TCTAGAATGAATATGAGCTTACCGGGTTTCAG－3’(BnaREV3CDS-F，下划线表示为XbaI酶切位点)
SEQ ID No.4
5’－CCATGGTCACTGTTGTATGATGATATTAACCTCCTCTG－3’(BnaREV3CDS-R，下划线表示为NcoI酶切位点)
SEQ ID No.5
5'-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3'(35SF)。

Claims (7)

1.一种油菜BnaREV3蛋白，是由SEQ ID No:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
3.含有权利要求1所述油菜BnaREV3蛋白取代和/或缺失和/或添加1-5个氨基酸残基且对改善油菜耐寒作用的蛋白质。
4.含有权利要求2所述基因的重组表达载体、工程菌和转基因细胞系。
5.权利要求1所述蛋白在油菜抗寒中的应用。
6.权利要求2所述基因在植物抗含中的应用。
7.一种培育抗寒能力提高的油菜的方法，其特征在于：将编码权利要求1所述蛋白的基因或权利要求2所述的基因转入油菜中，经培育得到转基因油菜，该转基因油菜的抗菌核病能力得到提高。
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