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CN119506134A - 一种高效降解烟草秸秆的复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种高效降解烟草秸秆的复合菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高效降解烟草秸秆的复合菌剂及其制备方法和应用，涉及微生物技术领域。所述复合菌剂命名为复合菌剂J‑2024‑2，包括花椒芽孢杆菌ZY2(Bacillus zanthoxyli ZY2)，枯草芽孢杆菌WP‑2022(Bacillus subtilis WP‑2022)和芽孢杆菌YP‑2023‑01(Bacillus YP‑2023‑01)。本发明提供的多功能高效降解复合菌剂J‑2024‑2，能够在田间直接使用在烟草秸秆上，加速降解烟草秸秆中的木质素和纤维素，对烟草秸秆具有很强的分解能力，且发现该复合菌剂还对烟草生长无显著性影响。充分说明该复合菌剂在秸秆降解领域的创新性、生态适应性及其对作物的友好性，充分展示其市场潜力与实际应用价值。

Description

一种高效降解烟草秸秆的复合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种高效降解烟草秸秆的复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
目前，我国农作物产生的秸秆资源总产量高达8.65亿吨，具有巨大的潜在利用价值。因此，有效处理和利用秸秆显得尤为重要。其中，秸秆，尤其是烟草秸秆，由于其高纤维素和木质素含量，降解难度较大。其次，自然环境中不利的气候条件如低温、干旱，会进一步抑制微生物的活性。例如温度超过50℃会使许多微生物受到热应激，降低降解效率；而低于10℃时，微生物代谢减缓，降解过程变慢，甚至进入休眠状态。此外，除了不利的气候因素外，微生物之间的复杂相互作用，如营养竞争和交叉喂养，也会显著影响它们降解纤维素和木质素的能力。例如，细菌可能会分泌抗生素、酶等次生代谢物，抑制某些真菌的生长，或者通过释放抗菌素或挥发性有机物抑制其他细菌的繁殖。同样，真菌也可能通过分泌化学物质影响细菌的存活。这种微生物之间的抑制作用，导致其在秸秆降解方面的效率不显著。因此，迫切需要找到一种能够在自然环境中高效降解秸秆的微生物菌剂。
然而，一方面，单一微生物很难分泌完整的酶系，另一方面，田间自然环境对秸秆降解的影响显著，现有的复合菌剂在这种环境中效果不佳。由于土壤条件、气候变化和微生物群落的多样性等因素，复合菌剂的活性和降解能力受到制约，无法充分发挥其应有的效果。这导致秸秆的降解过程变得缓慢，影响了资源的有效利用。因此，发明一种复合菌剂对自然环境适应性的研究显得尤为重要，以增强其在田间条件下的降解效果。
因此，发明一种能适应自然环境，以增强其在田间条件下的降解效果，同时对作物生长无负面影响的复合菌剂是本发明急需解决的问题。
发明内容
本发明提供的一种高效降解烟草秸秆的复合菌剂及其制备方法和应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：
第一方面，本发明公开了一种高效降解烟草秸秆的复合菌剂，所述复合菌剂命名为复合菌剂J-2024-2，包括花椒芽孢杆菌ZY2(Bacillus zanthoxyli ZY2)，枯草芽孢杆菌WP-2022(Bacillus subtilis WP-2022)和芽孢杆菌YP-2023-01(Bacillus YP-2023-01)。
在本发明的较佳实施方式中，所述花椒芽孢杆菌ZY2保藏号为CCTCC NO：M2021897，枯草芽孢杆菌WP-202保藏号为CCTCC NO：M 20241187，芽孢杆菌YP-2023-01保藏号为CCTCC NO：M 20241188。
在本发明的较佳实施方式中，所述复合菌剂由花椒芽孢杆菌ZY2，枯草芽孢杆菌WP-202和芽孢杆菌YP-2023-01的种子液按1：1：1的活菌数添加比例进行发酵而成。。
在本发明的较佳实施方式中，所述复合菌剂中有效活菌数不小于1×1010CFU。
第二方面，本发明公开了一种如第一方面所述的高效降解烟草秸秆的复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将植烟土壤样本富集培养后静置取上清液，经振荡培养，将稀释菌液梯度涂布于无菌培养基上培养，挑选代表性菌落进行划线纯化，直至获得单菌落；
2)将分离纯化的菌株点接于脱脂奶粉培养基上，每株3个重复，于37℃培养，观察水解透明圈大小，筛选出蛋白质降解能力最强的菌株；
3)将单菌株接种于CMC-Na培养基上，每株3个重复，于30℃培养后，用刚果红透明圈染色法进行检测，筛选透明圈最大的纤维素降解菌株；
4)将菌株分别点接于PDA-苯胺蓝和PDA-愈创木酚培养基上，每株3个重复，于30℃静置培养24小时，观察是否产生褪色圈或显色圈，筛选木质素降解能力最强的菌株；
5)通过对筛选到的三株菌进行拮抗实验，若无拮抗作用，则将所述三株菌的种子液按1：1：1的活菌数添加比例进行发酵，即复配成复合菌剂J-2024-2。
第三方面，本发明公开了一种如第一方面所述的高效降解烟草秸秆的复合菌剂在降解烟草秸秆中的应用。
在本发明的较佳实施方式中，将所述复合菌剂喷施于烟草秸秆上。
优选地，所述复合菌剂按6％的接种量喷施于烟草秸秆上。
在本发明的较佳实施方式中，所述复合菌剂降解秸秆中纤维素及木质素。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的多功能高效降解复合菌剂J-2024-2，能够在田间直接使用在烟草秸秆上，加速降解烟草秸秆中的木质素和纤维素，对烟草秸秆具有很强的分解能力，且发现该复合菌剂还对烟草生长无显著性影响。充分说明该复合菌剂在秸秆降解领域的创新性、生态适应性及其对作物的友好性，充分展示其市场潜力与实际应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为复合菌剂J-2024-2与单菌降解率对比图；
图2为复合菌剂J-2024-2降解烟秆腐解率图；
图3为复合菌剂J-2024-2菌株之间拮抗结果图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施案例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1复合菌剂的制备
1.降解菌株的分离与纯化方法
从贵州省安顺市采集植烟土壤样本，称取10.00g新鲜土样于富集培养基中培养1小时。静置5分钟后，取2mL上清液置于新的已灭菌冷却的富集培养基中，28℃、180r/min振荡培养3天。按无菌操作要求，将菌液稀释至10-3、10-4、10-5倍，分别取0.1mL涂布于无菌培养基上，28℃倒置培养2～3天，每个梯度设置3组平行实验。根据菌落形态和颜色，挑选具有代表性的菌落，通过划线法进行纯化，直至获得单菌落。
2.菌株功能筛选方法
2.1蛋白质降解能力筛选
将分离纯化的菌株点接于脱脂奶粉培养基上，每株3个重复，于37℃培养24小时，观察水解透明圈大小，筛选蛋白质降解能力最强的菌株。
2.2纤维素降解能力筛选
将菌株接种于CMC-Na培养基上，每株3个重复，于30℃培养24小时后，用刚果红透明圈染色法进行检测，筛选透明圈最大的纤维素降解菌株。
2.3木质素降解能力筛选
将菌株分别点接于PDA-苯胺蓝和PDA-愈创木酚培养基上，每株3个重复，于30℃静置培养24小时，观察是否产生褪色圈(分泌MnP和LiP的能力)或显色圈(分泌Lac的能力)，筛选木质素降解能力最强的菌株。
3.菌株的分子生物学鉴定
通过PCR扩增16S rDNA，对筛选到的不同功能菌株分别进行分子生物学鉴定。菌株DNA提取后，利用16S rDNA通用引物进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物测序，并与GeneBank数据库中的序列进行同源性比对，以确定菌株的种属。
经16S rRNA鉴定分别为：Bacillus zanthoxyli ZY2，一种高效的蛋白质降解菌；Bacillus subtilis WP-2022，一种高效纤维素降解菌；Bacillus YP-2023-01，一种高效木质素降解菌。通过对三株菌进行拮抗实验，结果表明三者之间无拮抗作用(如图3)。将上述三株菌的种子液按1：1：1的活菌数添加比例进行发酵，即复配成复合菌剂J-2024-2。
试验例1细菌拮抗实验
将分离纯化得到的不同功能性单菌株在无菌LB固体培养基上进行两两交叉划线接种实验：首先，在平板一端沿直线划线接种待测菌株；随后，在另一端以相同方式接种受测菌株，使两菌的划线区域彼此靠近但不重叠。接种后的平板在28℃下培养，直至菌株形成明显的菌落或菌丝带，然后观察两菌交界处是否出现生长抑制区，如有抑菌区则表明存在拮抗作用。每组实验重复3次，以确保结果可靠。
本申请从贵州省安顺市杨武乡的植烟土壤中筛选出三株不同功能性芽孢杆菌，经16SrRNA鉴定分别为：Bacillus zanthoxyli ZY2，一种高效的蛋白质降解菌；Bacillussubtilis WP-2022，一种高效纤维素降解菌；Bacillus YP-2023-01，一种高效木质素降解菌。通过对三株菌进行拮抗实验，结果表明三者之间无拮抗作用(如图3)，因此可复配成复合菌剂J-2024-2。
试验例2复合菌与单菌能力对比实验
选取无拮抗作用的菌株复配成复合菌，并将其和单菌按6％的接种量(菌株含量≥1×1010CFU)喷施于500g烟杆上，与适量土壤混匀后倒入盆钵。分别在0d、7d、15d、21d和35d取出秸秆，用蒸馏水冲洗，再用稀酸溶液去除附着的菌体和CaCO3沉淀，最后用蒸馏水冲洗3次，80℃烘干至恒重。通过失重法计算秸秆降解率：秸秆降解率％＝(W0-Wt)/W0×100％
其中，W0为初始秸秆干重，Wt为培养t时间后秸秆干重。
复合菌剂J-2024-2与单菌株的降解率如图1所示。ZY2菌株主要为蛋白质降解菌，因此在秸秆降解方面效果不显著。相比之下，木质素降解菌YP-2023-01和纤维素降解菌WP-2022的降解率明显高于对照组(CK)，其中纤维素降解菌WP-2022的降解率显著，显示其较好的降解潜力。总体来看，复合菌剂J-2024-2在整个降解过程中始终表现优于单菌株，表明其具有更稳定和更有效的降解能力。这一优势可能源于复合菌剂中多种功能菌株的协同作用，使其能更全面地分解秸秆中的各类有机成分。
试验例3复合菌剂田间应用效果研究
在大田实验中，选用烟草秸秆作为材料，设置复合菌剂J-2024-2处理组与无菌水处理组(CK)，每组3次重复。每个重复中加入5％的菌液或无菌水，菌液有效活菌数≥1×10-8。通过计算秸秆腐解率评估降解效果。为进一步验证复合菌剂对烟草生长的影响，将处理后的秸秆进行还田，种植烟草，并依据《烟草农艺性状调查测量方法》(YC/T 142—2010)记录烟草的生长情况。
结果如图2所示：经105天的处理后，复合菌剂J-2024-2表现出优异的秸秆降解效率。该复合菌剂的降解率始终显著高于对照组(CK)，表明该复合菌剂在整个处理期间均保持高效的降解能力。在第105天，复合菌剂的降解率达到峰值，分别为：复合菌剂处理组为64.20％，对照组为26.75％。在同一时期，J-2024-2菌剂的降解率显著优于文献报道中复合菌系F和G的降解率，分别为32.96％和36.24％(王子苑，2024)。这些数据表明，复合菌剂J-2024-2具备持续高效的降解效果，具有广泛的应用前景，能够有效解决秸秆还田过程中的降解难题。
试验例4复合菌剂J-2024-2对烟草生长的影响
优质的复合菌剂不仅应具备高效的秸秆降解能力，还应对作物生长无不良影响。为此，本发明将复合菌剂处理后的秸秆与对照组秸秆进行还田，并种植烟草。通过调查烟草团棵期的农艺性状，包括叶数、最大叶长、最大叶宽、株高、茎围等指标，结果如表1所示，复合菌剂处理组与对照组在上述生长指标上未出现显著差异。这表明复合菌剂对烟草生长无不利影响，进一步证明了该复合菌剂在农业中的友好性和可行性。
表1复合菌剂J-2024-2对烟草团棵期农艺性状的影响
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种高效降解烟草秸秆的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂命名为复合菌剂J-2024-2，包括花椒芽孢杆菌ZY2(Bacillus zanthoxyli ZY2)，枯草芽孢杆菌WP-2022(Bacillus subtilis WP-2022)和芽孢杆菌YP-2023-01(Bacillus YP-2023-01)。
2.根据权利要求1所述的高效降解烟草秸秆的复合菌剂，其特征在于，所述花椒芽孢杆菌ZY2保藏号为CCTCC NO：M 2021897，枯草芽孢杆菌WP-202保藏号为CCTCC NO：M20241187，芽孢杆菌YP-2023-01保藏号为CCTCC NO：M 20241188。
3.根据权利要求1所述的高效降解烟草秸秆的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂由花椒芽孢杆菌ZY2，枯草芽孢杆菌WP-202和芽孢杆菌YP-2023-01的种子液按1：1：1的活菌数添加比例进行发酵而成。
4.根据权利要求1所述的高效降解烟草秸秆的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中有效活菌数不小于1×1010CFU。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的高效降解烟草秸秆的复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将植烟土壤样本富集培养后静置取上清液，经振荡培养，将稀释菌液梯度涂布于无菌培养基上培养，挑选代表性菌落进行划线纯化，直至获得单菌落；
2)将分离纯化的菌株点接于脱脂奶粉培养基上，每株3个重复，于37℃培养，观察水解透明圈大小，筛选出蛋白质降解能力最强的菌株；
3)将单菌株接种于CMC-Na培养基上，每株3个重复，于30℃培养后，用刚果红透明圈染色法进行检测，筛选透明圈最大的纤维素降解菌株；
4)将菌株分别点接于PDA-苯胺蓝和PDA-愈创木酚培养基上，每株3个重复，于30℃静置培养，观察是否产生褪色圈或显色圈，筛选木质素降解能力最强的菌株；
5)通过对筛选到的三株菌进行拮抗实验，若无拮抗作用，则将所述三株菌的种子液按1：1：1的活菌数添加比例进行发酵，即复配成复合菌剂J-2024-2。
6.如权利要求1-4任一项所述的高效降解烟草秸秆的复合菌剂在降解烟草秸秆中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述复合菌剂喷施于烟草秸秆上。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述复合菌剂按6％的接种量喷施于烟草秸秆上。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述复合菌剂降解烟草秸秆中纤维素及木质素。
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