CN1194701C - 淫羊藿素或去甲基淫羊藿素在制备雌激素受体调节剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含淫羊藿素和去甲基淫羊藿素的药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的淫羊藿素和/或去甲基淫羊藿素及药用载体和/或赋形剂。本发明提供的药物组合物具有植物雌激素样作用，可在制备对激素依赖性癌症、心血管疾病以及绝经后骨质疏松和更年期不适症、早老年性痴呆、肝脏炎症、肝纤维化、糖尿病、高血脂、免疫系统、病毒感染等疾病的药物中应用。也具有作为药物先导化合物的潜在新用途。本发明涉及的是中药单体的活性，组分明确，并从细胞层面上进行了论证，为寻找中药物质基础和中药现代化提供借鉴，为植物雌激素样作用药物研究提供理论依据，具有较大应用和开发价值。

Description

淫羊藿素或去甲基淫羊藿素在制备雌激素受体调节剂中的应用

技术领域

本发明属药物组合物及其用途，主要涉及植物雌激素样作用的药物组合物，尤其涉及含淫羊藿素(Icaritin)和去甲淫羊藿素(Desmethylicaritin)的药物组合物，及其在医药上的用途。

背景技术

植物雌激素(Phytoestrogens)是一类具有雌激素样活性的天然植物化合物，具有抗氧化、抗血管生成、抑制癌细胞分化等作用，研究表明，植物雌激素通过受体调节和非受体调节途径(如抗自由基、调节酶活性、离子通道)对激素依赖性癌症、心血管疾病以及绝经后骨质疏松和更年期不适症、早老年性痴呆、肝脏炎症、肝纤维化、糖尿病、高血脂、免疫系统、病毒感染等疾病等有较好的预防和治疗作用。

一、植物雌激素和骨质疏松

骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病，以骨量减少，骨的微结构退化，骨强度减低，脆性增加，导致骨折易感性增高为特征的系统性骨骼疾病。目前临床上使用的抗骨质疏松药物可大致分成三类：(1)抑制骨吸收药物：如雌激素、降钙素、双膦酸盐、活性维生素D衍生物等；(2)增加骨形成药物：如活性维生素D衍生物、氟化物、同化性皮质醇(雄性激素及衍生物)、孕激素、PTH片段、生长激素、骨生长因子(BGP、BMP等)。(3)改善骨质量药物：如降钙素、活性维生素D衍生物，PTH片段，第二代、第三代双膦酸盐等。然而，摄入维生素D或维生素D类似物能否预防预防骨折尚无法确定；氟化物易导致成骨不全；长期应用雌激素可能导致乳腺癌、子宫内膜癌等的发病危险性增加。而植物雌激素是一种天然的选择性雌激素受体调节剂，它具有雌激素和抗雌激素样作用，如有些植物雌激素对骨表现出雌激素样作用，增加骨密度，而对乳腺却有抗增生作用。其机制可能是通过雌激素受体介导或非雌激素受体介导的机制，促进骨的形成和骨的矿化，通过细胞内钙离子信号传递，引起细胞凋亡而抑制破骨细胞的骨吸收，对骨发挥保护作用。

二、植物雌激素和心血管疾病

植物雌激素通过对血脂、血小板、血管平滑肌等许多因素的影响，有利于减少心血管疾病危险性。植物雌激素如异黄酮降血脂的机制是通过改变LDL受体的数量和活性；抗脂质过氧化的途径实现的。植物雌激素另一重要机制是抑制血小板聚集。Williams等用猴子做实验研究，发现异黄酮能降低胶原诱导的血小板激活后血小板聚集率。血小板激活后释放出5-HT等收缩血管物质，使血液流速下降。同样，Schoene等研究发现，喂食异黄酮后，大鼠血小板体积明显减小，且处于不易激活状态。有研究认为，genistein具有蛋白酪氨酸激酶抑制剂活性，可减少酪氨酸磷酸化，抑制血小板激活和聚集，从而抑制血管收缩和血栓形成。

Dubey等研究了植物雌激素对体外培养的入主动脉平滑肌细胞的影响，发现植物雌激素能抑制血小板原生长因子等引起的平滑肌细胞迁移、增殖和细胞外基质的合成，并抑制或下调丝裂原激活的蛋白激酶活性，从而抑制血管重构和新生内膜的形成，其作用机制可能是通过雌激素受体介导的。

除上述作用之外，植物雌激素抗心绞痛、心律失常的作用，已在动物模型中得到了证实。植物雌激素还具有钙离子拮抗作用、促进内皮细胞合成并分泌NO、降低血压等，这些均有利于防治心血管疾病。

以淫羊藿为主要成分的心神宁胶囊的作用说明，来自药材淫羊藿的提取物有作用于心血管病防治作用，但其中的活性成份尤其是单体化合物及作用机制未明。

三、植物雌激素和激素依赖性肿瘤

研究表明植物雌激素可以减少性激素依赖性肿瘤的发生率，绝经前妇女肿瘤预防作用主要体现在调节雌激素代谢，减少潜在致癌代谢物的产生；绝经后妇女植物雌激素通过雌激素代谢产物发挥抗肿瘤作用，表明对雌激素依赖性肿瘤有预防作用。目前植物雌激素主要作为食品添加剂用于预防女性乳腺癌等，作为药物的开发尚在研究阶段。

淫羊藿(Herba Epimedii)又名仙灵脾，为小檗科(Berberbidaceae)淫羊藿属(Epimedium)多种植物的地上干燥部分，具有补肾壮阳、强筋健骨、祛风除湿之功效，常用于治疗阳痿不举、小便淋漓、腰膝无力以及冠心病、慢性支气管炎、神经衰落和小儿麻痹等症。现代药理研究证明，淫羊藿含有特殊的化学成分和显著的生物活性，是一种具有广泛药理活性的中药材，已报道的活性有：

1、雄性激素样作用：商品淫羊藿提取物给雄性小鼠注射，能增加前列腺、贮精囊及提肛肌的重量，说明具有雄性激素样作用。

2、心血管的作用：淫羊藿煎膏，20％浓度0.5ml注入侧管，使离体豚鼠心脏冠脉流量增加；有效部分25％0.3ml/只使小鼠心肌对⁸⁶Rb的摄取增加；100％8mg/kg静脉注射对垂体后叶素引起的心肌缺血有保护作用。淫羊藿煎膏1g/kg或淫羊藿苷1mg/kg静脉注射，使兔心室内压下降，心室内压上升速率下降，表示对心室收缩有抑制，动脉压下降，脉压差和收缩压差均增大，示降低外周阻力，减轻心脏负荷。

3、骨质增长：用鸡胚股骨体外培养法，证明淫羊藿注射液1mg/ml(注射液∶培养基＝2∶100～3∶100)剂量条件下具有促进骨质生长作用，其股骨长度、干重，和³⁵S掺入强度均大于对照组。

4、对免疫功能的影响：淫羊藿的70％甲醇提取物200mg/kg或500mg/kg灌胃，可增强网状内皮系统的吞噬能力，使小鼠碳粒廓清速率加速。

5、抗“阳虚”及抗衰老：淫羊藿、肉苁蓉合剂0.5g/只，对羟基脲所致“阳虚”小鼠，能增加体重，增加肝、脾DNA的合成，耐冻时间延长。淫羊藿黄酮0.7g/kg灌胃，能显著恢复D-半乳糖衰老小鼠T和B淋巴细胞的增殖反映，提高小鼠肝脏总超氧化物歧化酶(SOD)的活性，减少肝组织过氧化脂质的形成，减少心、肝等组织脂褐素形成。

6、对血小板聚集的作用：淫羊藿煎剂25～100mg/ml，多糖2.5～7.5mg/ml及粗黄酮体外试验有促进ADP诱导的大鼠血小板聚集，三者100mg/kg灌胃，也促进ADP诱导的大鼠血小板聚集。

7、抗病毒：商品淫羊藿煎剂对脊髓灰质炎和其他肠道病毒有抑制作用。

但到目前为止，关于淫羊藿苷单体及其衍生物活性研究的报道较少。

淫羊藿苷(Epimedium Icariine，EI)是从淫羊藿中分离提纯的天然产物，为一单体化合物，是淫羊藿的有效成分。另外还含有淫羊藿素、去甲基淫羊藿素等其它化学成分，其化学结构式为：

淫羊藿苷         R＝CH₃，R1＝-Rha，R2＝-Glc

淫羊藿素         R＝CH₃，R1＝R2＝H

去甲基淫羊藿素   R＝R1＝R2＝H

到目前为止，还未见国内外有关对淫羊藿素和去甲基淫羊藿素雌激素样作用药理活性以及作为选择性雌激素受体调节剂的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有植物雌激素样作用的药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的淫羊藿素和去甲基淫羊藿素及药用载体和赋形剂。

本发明的药物组合物中，淫羊藿素和去甲基淫羊藿素可以各自单独使用或以组合形式使用。

本发明提供的药物组合物，其制剂形式主要包括片剂、口嚼剂，胶囊剂、悬浮液剂、溶液剂等。

本发明提供的药物组合物的制剂，其给药途径主要包括口服、非胃肠道、局部途径。非胃肠道给药制剂主要包括注射剂、吸入剂、栓剂、载体靶向给药系统。局部给药制剂主要包括霜剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂、皮下植入剂。

本发明提供的药物组合物，在制备作为选择性雌激素受体调节剂中的应用。

本发明提供的药物组合物，在制备预防或治疗绝经期综合征有关的药物中的应用。

本发明提供的药物组合物，在制备防治或预防心脑血管疾病，保护心血管功能药物中的应用。

本发明提供的药物组合物，在制备预防或治疗造血系统疾病，包括再生障碍性贫血、粒细胞性白血病、淋巴性白血病、血小板降低药物中的应用。

本发明提供的药物组合物，在用于制备药物先导化合物中的应用。

全合成或经结构修饰而来的含该两个化合物的组合物的用途，应视为与植物来源相同。

本发明从淫羊藿诸多的药理活性出发，在细胞、组织层面和整体上对淫羊藿素、去甲基淫羊藿素的植物雌激素样活性进行了论证。本发明具有以下特点：

1.本发明涉及的是中药单体的活性，组分明确，为寻找中药物质基础、全合成解决药源和中药现代化提供借鉴。全合成或经结构修饰而来的该两个化合物用途，应视为与植物来源相同。

2.本发明申请受保护的两个主要单体化合物——淫羊藿素、去甲基淫羊藿素的植物雌激素样作用理论及应用价值显著。

附图说明

图1为雌激素敏感细胞株MCF-7/BUS在不同测试物培养条件下的形态图。

图2为淫羊藿苷、淫羊藿素、去甲基淫羊藿素对MCF-7细胞增殖影响的量效关系图。

图3为雌激素敏感细胞株MCF-7/BUS在不同测试物条件下增殖率。

具体实施方式

实施例1    淫羊藿素、去甲基淫羊藿素的雌激素样活性

本实验以MCF-7雌激素依赖性乳腺癌细胞为生物测试载体，采用经典的E-SCREEN法(检测化合物雌激素样活性的经典方法)测定其雌激素样活性。

A、MCF-7乳腺癌细胞的常规培养

培养条件：DMEM培养基含5％胎牛血清，37℃，5％CO2培养箱中培养。2～3天换液一次；待细胞增殖至70％～80％融合时胰酶消化，传代。

B、去激素人血清的制备

5％活性碳和0.5％葡聚糖T-70在4℃搅拌条件下共孵育18～24小时，离心获得葡聚糖包被的活性炭(DCC)，将DCC以5％的浓度与血清混合，4℃条件下搅拌1小时，5000×g离心15min，过滤除菌，即可除去其中的激素。

C、E-SCREEN增殖试验

MCF-7细胞消化后混悬于常规DMEM培养基中，以细胞密度为8000～10000个/ml/孔接种于24孔板，常规培养基培养(DMEM+5％胎牛血清)48hr，待其贴壁后更换无酚红条件培养基(无酚红DMEM培养基+5％去激素人血清)，预培养48hr后，更换条件培养基并加入受试物。本实验设DMSO溶剂对照组(阴性)、1nM雌二醇阳性对照组、淫羊藿苷、淫羊藿素、去甲基淫羊藿素各浓度梯度组。培养7天后MTT法测细胞活性。

D、结果

参见图1，是MCF-7细胞在阴性(0.1％DMSO)、阳性对照物(0.1nM雌二醇)、测试物(淫羊藿苷、淫羊藿素、甲基淫羊藿)0.1μM、1μM浓度条件下的生长状况(放大倍数10×10)，可以看出，阴性对照组MCF-7细胞呈固缩圆形的细胞较多，细胞处于缓慢增殖或停滞状态，淫羊藿苷(0.1μM、1μM)组无明显影响，而阳性对照组(0.1nM雌二醇)、淫羊藿素(0.1μM、1μM)、去甲基淫羊藿(0.1μM、1μM)组MCF-7细胞成贴壁立体状生长，增殖旺盛。

E-SCREEN模型的测试结果(参见图2、图3)显示淫羊藿苷并无雌激素样作用，而淫羊藿素和去甲基淫羊藿素则能显著的促进MCF-7细胞的增殖，表现了较强的雌激素样活性，并成一定的量效关系(见图2，n＝5)。与DMSO溶剂对照组比较，淫羊藿素的最大增殖倍数为3.85±0.26倍，去甲基淫羊藿素的最大增殖倍数为3.75±0.25倍，接近于1nM雌二醇产生的促增殖作用。在0.1nM时，淫羊藿素和去甲淫羊藿素与阴性对照比较有显著性差异(P≤0.05)，1nM～10μM各浓度与阴性对照比较均有极显著差异(P≤0.01)，图3是淫羊藿苷、淫羊藿素、去甲基淫羊藿素在不同浓度条件下(0.1nM-10μM)对MCF-7细胞的促增殖作用比较，阳性对照为1nM雌二醇，n＝5，^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs 0.1％DMSO。

D、结论

淫羊藿苷对MCF-7细胞无促增殖作用，淫羊藿素和去甲基淫羊藿素则能显著的促进MCF-7细胞的增殖，具有雌激素样作用。

实施例2    淫羊藿素和去甲基淫羊藿素在防治骨质疏松症和绝经期综合征方面应用

鉴于淫羊藿素和去甲基淫羊藿素的植物雌激素样活性，此两个化合物可以作为预防和治疗骨质疏松和绝经期综合征的有效药物加以开发。依据：a、植物雌激素结构上与内源性雌激素相似，对骨组织有雌激素样作用，流行病学调查、动物试验、体外试验及人体试验发现植物雌激素通过促进骨形成、抑制骨吸收，在防治雌激素缺乏所致的骨质疏松中有重要作用。国外研究较成熟的植物雌激素金雀异黄酮和大豆黄酮已经作为食品添加剂和辅助药物用于预防和治疗骨质疏松和绝经期综合征；基于植物雌激素结构而进行结构改造开发的结构类似物依普黄酮(ipriflavone)作为抗骨质疏松药已经广泛在临床上使用。b、淫羊藿水提液具有促进成骨细胞生长，增加骨质钙化的作用；去甲基淫羊藿素为药材淫羊藿中天然存在的成分，淫羊藿素参与淫羊藿苷的体内代谢，两者很有可能是药材淫羊藿真正的活性物质。本发明实施例1结果支持这一观点，极有希望开发成为抗骨质疏松的天然药物。

实施例3    作为HRT替代药的应用

绝经后女性激素替代疗法(HRT)的目的是控制绝经引起的症状，预防骨质疏松和心血管疾病。目前只有35％-40％的女性接受HRT，且很多人不能坚持应用，其原因是雌激素作为HRT药物有许多副作用，如乳腺癌、子宫内膜癌危险性升高、阴道出血等，而植物雌激素作为天然产物很多具有选择性调节雌激素受体的活性，同时表现出雌激素活性和抗雌激素样活性，如能拮抗乳腺阴道等组织的雌激素受体，而激动心血管和骨骼等处的雌激素受体。因此在对心血管的保护作用、降低血胆固醇水平、控制绝经期症状和预防骨质疏松方面的研究展现出可喜的前景。

淫羊藿素和去甲基淫羊藿素可作为黄酮类植物雌激素加以开发，可能为一类新的选择性雌激素受体调节剂用于雌激素样活性的替代疗法。

实施例4    淫羊藿素和去甲基淫羊藿素作为心血管保护剂的应用

淫羊藿具有多种药理活性，以淫羊藿为主要成分的中药制剂已经用于预防和治疗心血管疾病，但其成分复杂，机理未明。

去甲基淫羊藿素为药材淫羊藿中天然存在的成分，淫羊藿素参与淫羊藿苷的体内代谢，两者很有可能是药材淫羊藿真正的活性物质。并表现出较强的扩张血管、抗氧化活性，有可能是体内真正的活性成分，本发明实施例1结果支持这一观点。另外，申请者尚有研究结果表明，淫羊藿苷能显著的诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞，提示对心肌生物学有特异作用；同时有研究表明淫羊藿苷能够抑制血管磷酸酯酶(PDE)活性，具有血管舒张作用。因此作为淫羊藿苷的衍生物，淫羊藿素和去甲基淫羊藿素极有可能具有同样甚至是更强的心血管保护作用。

实施例5

基于淫羊藿药材的壮阳补肾作用提示具有雄激素调节作用及同化作用，也具有拟雄激素治疗造血系统疾病如再生障碍性贫血、粒细胞性白血病、淋巴性自血病、血小板降低。

实施例6

文献报道苷元的形成主要是在胃肠道环境下代谢形成，用于非口服用药淫羊藿素生物活性不大，本发明实施例1结果支持这一观点，因此全合成该两个化合物，既解决了药源，又增加了非口服途径给药的生物活性。

实施例7

将淫羊藿素和去甲基淫羊藿素制成微粒体给药系统，如制成脂质体、纳米粒给药系统等可以增加药物作用的靶向性和作用的特异性和有效性。

实施例8

基于淫羊藿素、去甲基淫羊藿素的雌激素样活性及从此延伸出的诸多可能的雌激素受体调节或非受体调节药理活性，可将淫羊藿素和去甲基淫羊藿素作为药物主要成分，用以制备预防和治疗相关疾病的药物。

本发明涉及的部分参考文献

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无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.淫羊藿素或去甲基淫羊藿素在制备选择性雌激素受体调节剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，淫羊藿素或去甲基淫羊藿素的制剂形式包括片剂、口嚼剂，胶囊剂、悬浮液剂、溶液剂。

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