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CN119409839B - 一种Fel D1与Fel D4融合蛋白及其应用 - Google Patents

一种Fel D1与Fel D4融合蛋白及其应用 Download PDF

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CN119409839B CN202510013857.5A CN202510013857A CN119409839B CN 119409839 B CN119409839 B CN 119409839B CN 202510013857 A CN202510013857 A CN 202510013857A CN 119409839 B CN119409839 B CN 119409839B
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Abstract

本发明公开了一种Fel D1与Fel D4融合蛋白及其应用，本发明通过原核表达的方式获得了Fel D1与Fel D4融合蛋白，融合表达的蛋白在诱导蛋白表达、纯化、浓缩和免疫等方面大大简化了操作程序，降低了经济成本。本发明提供了一种卵黄抗体的制备方法，通过融合蛋白免疫蛋鸡获得的卵黄抗体可分别与Fel D1和Fel D4发生抗体‑抗原发应，并且效价高于单一抗原蛋白免疫组和联合免疫组。本发明还提供了一种功能性猫粮的制备方法，将蛋黄粉以一定比例添加到猫粮中，喂食一段时间后，猫毛发和唾液中的Fel D1和Fel D4含量显著降低，并且融合蛋白卵黄抗体制备的猫粮可同时抗Fel D1和Fel D4，并且阻断效果显著提高。

Description

一种Fel D1与Fel D4融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种Fel D1与Fel D4融合蛋白及其应用。
背景技术
全球范围内约有10%至20%的人群对猫过敏，过敏症状包括打喷嚏、流鼻涕、皮肤瘙痒和眼睛流泪等，严重时还可引起过敏性休克。频繁清洁卫生和长期服用抗过敏药物可减轻或防止过敏反应，通过重复注射递增剂量的粗猫皮屑提取物也可能有助于猫过敏患者脱敏，但这些方法耗时耗力。
当首次接触致敏原时，机体免疫细胞对过敏原进行加工、处理和记录。当机体再次接触同种过敏原时，肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的特异性IgE被激活，释放组胺等活性介质，作用于皮肤、呼吸道及消化道等组织器官，引起毛细血管扩张、黏液分泌和平滑肌收缩，最终导致鼻炎、哮喘，甚至过敏性休克等过敏反应。因此，阻断过敏原和IgE的相互作用是防治过敏反应关键环节。
随着分子生物学技术的发展，很多过敏原的分子结构已经确定。已经有8种猫过敏原分子被世界卫生组织（WHO）和国际免疫学会（IUIS）记录在过敏原数据库中，这些过敏原大多分布在唾液和皮屑里，在猫舔舐毛发或皮屑脱落时散播到毛发和环境中。Felis catus(domestic cat) allergen 1 (Fel D1) 是致敏活性最高的猫过敏原，可导致约93%的猫过敏患者产生过敏反应。Fel D4被人类IgE识别的频率和致敏活性仅次于Fel D1，可导致约63%的猫过敏患者产生过敏反应。因此，Fel D1和Fel D4是猫过敏患者防范过敏的重点。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。
本发明提供一种Fel D1与Fel D4融合蛋白：将Fel D1基因的CH1和CH2基因片段通过柔性Linker连接得到Fel D1的序列，其中CH1和CH2基因片段均为切除信号肽后的序列；Fel D4的序列为Fel D4基因切除信号肽后的序列；并将Fel D1和Fel D4的序列通过刚性Linker连接后，与标签蛋白的基因序列共同连接于表达载体得到重组质粒，转化至原核表达菌株，经诱导表达、纯化重组蛋白，得到Fel D1与Fel D4融合蛋白。
作为本发明所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白的一种优选方案：所述表达载体包括pET-3a、pET-11a、pET-12a、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b、pET-19b、pET-20b、pET-21a、pET-22b、pET-23a、pET-24a、pET-25b、pET-26b、pET-27b、pET-28a、pET-29a、pET-30a、pET-31b、pET-32a、pET-33b、pET-34b、pET-35b、pET-37b、pET-39b、pET-40b、pET-41a、pET-42a、pET-43.1a、pET-44a、pET-45b、pET-47b、pET-48b、pET-49b、pET-50b、pET-51b、pET-52b、pETDuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1、pColaDuet-1中的一种。
作为本发明所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白的一种优选方案：所述标签蛋白包括多组氨酸（His）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、硫氧还蛋白（Trx）、链霉亲和素（SA）、多聚组氨酸（Poly-His）、小分子泛素样修饰蛋白（SUMO）、血凝素标签（HA）中的一种。
作为本发明所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白的一种优选方案：所述原核表达菌株包括BL21、cBL21、BL21 (DE3)、BL21codonplus (DE3)、BL21 Star (DE3)、B834 (DE3)、Tuner (DE3)、Rosetta (DE3)、Rosetta2 (DE3)、Arctic Express (DE3)、Origami (DE3)、Origami2 (DE3)、OrigamiB (DE3)、SHuffle T7、ER2566、OverExpressC43 (DE3)、BLR(DE3)、HMS174 (DE3)、GT115、MG1655、NovaBlue (DE3)中的一种。
作为本发明所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白的一种优选方案：所述诱导表达包括经0.5~1 mM的IPTG诱导表达。
作为本发明所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白的一种优选方案：所述纯化包括通过亲和层析法纯化重组蛋白。
作为本发明所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白的一种优选方案：所述Fel D1与FelD4融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白在免疫蛋鸡制备卵黄抗体中的应用。
优选地，所述蛋黄在猫粮中的添加量为1~10wt%。
本发明还提供所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白在制备猫粮添加剂中的应用：将所述Fel D1与Fel D4融合蛋白免疫蛋鸡得到含有卵黄抗体的蛋黄，并将所述卵黄作为猫粮添加剂添加到猫粮中。
本发明的有益效果：本发明通过原核表达的方式获得了Fel D1&Fel D4融合蛋白，融合表达的蛋白在诱导蛋白表达、纯化、浓缩和免疫等方面大大简化了操作程序，降低了经济成本。本发明提供了一种卵黄抗体的制备方法，通过Fel D1&Fel D4融合蛋白免疫蛋鸡获得的卵黄抗体可分别与Fel D1和Fel D4发生抗体-抗原发应，并且效价高于单一抗原蛋白免疫组和联合免疫组。本发明还提供了一种功能性猫粮的制备方法，将蛋黄粉以一定比例添加到猫粮中，喂食一段时间后，猫毛发和唾液中的Fel D1和Fel D4含量显著降低，并且融合蛋白Fel D1&Fel D4卵黄抗体制备的猫粮可同时抗Fel D1和Fel D4，并且阻断效果显著提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，其中：
图1为PCR扩增Fel D1（A）、Fel D4（B）和Fel D1&Fel D4（C）的DNA片段，产物大小分别为551bp（含同源臂）、553bp（含同源臂）和1095bp（含同源臂）。
图2为IPTG诱导Fel D1（A）、Fel D4（B）和Fel D1&Fel D4（C）蛋白表达。
图3为重组蛋白Fel D1、Fel D4、Fel D1+Fel D4和Fel D1&Fel D4免疫蛋鸡后卵黄抗体效价的变化。
图4为饲喂功能性猫粮后猫唾液和毛发中Fel D1、Fel D4含量的变化。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
本发明通过原核表达的方式获得了重组融合蛋白：Fel D1&Fel D4，免疫高产蛋鸡后获得的卵黄抗体可用于开发特异性阻断猫过敏原Fel D1和Fel D4的功能性猫粮。重组融合蛋白Fel D1&Fel D4免疫高产蛋鸡后获得的卵黄抗体能够用于开发特异性阻断猫过敏原Fel D1和Fel D4的功能性猫粮。
本发明一方面提供猫过敏原Fel D1、Fel D4及Fel D1&Fel D4融合蛋白表达方法，将Fel D1基因、Fel D4基因、Fel D1和Fel D4串联基因，连接于表达载体、转化至表达菌株、经诱导表达获得。其详细方法包括以下步骤：
1）利用PCR技术从猫皮肤cDNA中扩增分别获得构成Fel D1的CH1和CH2基因片段，通过重叠延伸PCR技术将CH2和CH1基因片段以柔性氨基酸Linker串联，获得Fel D1基因序列（551 bp，含同源臂）（图1 A）；通过人工合成的方式获得经密码子优化后的Fel D4基因序列（553 bp，含同源臂）（图1 B）；通过重叠延伸PCR技术将Fel D1和Fel D4以刚性Linker串联，获得Fel D1&Fel D4的串联基因序列（1095 bp，含同源臂）（图1 C）。
2）通过Xho I和Nco I快切酶将pET-28a质粒线性化。利用同源重组技术将上述FelD1、Fel D4和Fel D1&Fel D4的基因序列分别连接于线性化的pET28a载体上，获得重组质粒pET28a-Fel D1、pET28a-Fel D4和pET28a-Fel D1&Fel D4。
3）将上述重组质粒载体通过化学转化的方法分别转化至Rosetta (DE3) 表达菌株，经0.5 mM的IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导获得可溶性重组蛋白（图2）。
4）上述重组蛋白含有His标签，利用镍柱亲和层析技术纯化重组蛋白，通过SDS-PAGE凝胶分离总蛋白，考马斯亮蓝染色可视化进行纯化鉴定。
本发明还提供了一种利用上述Fel D1、Fel D4及Fel D1&Fel D4重组蛋白免疫母鸡制备卵黄抗体的方法，包括以下步骤：
上述Fel D1、Fel D4及Fel D1&Fel D4重组蛋白用无菌PBS稀释，将200 μg重组蛋白按体积比1:1与免疫佐剂混合，通过颈部皮下注射的方式免疫高产的蛋鸡，设置空白对照组（NC）、Fel D1组、Fel D4组、Fel D1+Fel D4组（Fel D1蛋白和Fel D4蛋白质按质量比1:1混合后进行联合免疫）和Fel D1&Fel D4（融合蛋白）组。
收集各组鸡蛋，采用Elisa法测定特定时间的各组卵黄抗体效价，Fel D1和Fel D4组蛋鸡分别产生了相应的卵黄抗体，Fel D1+Fel D4组和Fel D1&Fel D4组蛋白免疫母鸡后产生了同时针对Fel D1和Fel D4的卵黄抗体。Fel D1&Fel D4融合蛋白组蛋鸡产生的卵黄抗体效价显著高于单独免疫组和联合免疫组（图3）。
本发明还提供了一种上述卵黄抗体制备功能性猫粮的方法，包括以下步骤：将上述鸡蛋的蛋黄与麦芽糊精等质量混匀，低温烘干粉碎后即为蛋黄粉。
将上述蛋黄粉以5%的质量比例混入常规猫粮中即为功能性猫粮，分为空白对照组（NC组），添加抗Fel D1卵黄抗体组（Fel D1组），添加抗Fel D4卵黄抗体组（Fel D4组），添加抗Fel D1和抗Fel D4卵黄抗体组（Fel D1+Fel D4组）和添加抗Fel D1&Fel D4融合蛋白卵黄抗体组。
将上述功能性猫粮饲喂成年猫一段时间后，通过Elisa法检测猫唾液和毛发中的Fel D1、Fel D4含量，Fel D1组、Fel D4组猫唾液和毛发中相对应的Fel D1和Fel D4含量显著下降，Fel D1+Fel D4组和Fel D1&Fel D4组猫唾液和毛发中的Fel D1和Fel D4含量均降低。同时，Fel D1&Fel D4组猫唾液和毛发中的Fel D1和Fel D4含量下降最为显著（图4）。
实施例1：
猫过敏原Fel D1、Fel D4及其融合蛋白Fel D1&Fel D4表达方法：
1）重组质粒构建：
使用Trizol从猫皮肤组织中提取总RNA，反转录成cDNA后，使用CH1和CH2基因两端引物扩增相应片段。使用重叠延伸PCR技术连接CH2和CH1，获得Fel D1基因片段。从NCBI数据库中下载Fel D4基因片段信息，经密码子优化后交由上海生工生物技术公司合成。通过重叠延伸PCR 技术，连接Fel D1和Fel D4片段，获得Fe l D1&Fel D4融合片段。
使用XhoI和EcoRI两种快切酶线性化pET28a质粒，通过同源重组的方法分别连接线性化pET28a载体与Fel D1片段、Fel D4 片段、Fel D1&Fel D4融合片段。
重组Fel D1蛋白的氨基酸序列为（SEQ ID NO：2）：
重组Fel D4蛋白的氨基酸序列为（SEQ ID NO：3）：
重组Fel D1&Fel D4融合蛋白的氨基酸序列为（SEQ ID NO：1）：
2）IPTG诱导蛋白表达与蛋白纯化：
通过化学转化法分别将三种重组质粒（pET28a-Fel D1、pET28a-Fel D4、pET28a-Fel D1&Fel D4）转化至Rosetta（DE3）表达菌株中，通过卡那霉素LB固体培养基筛选转化后的阳性菌株。
在16℃下使用0.5 mM IPTG诱导重组蛋白表达24 h后，离心菌液获得细菌沉淀，用PBS重悬菌体。利用细胞超声破碎仪破碎菌体，收集细菌破碎匀浆、匀浆上清液（匀浆离心后上清部分）、匀浆沉淀（匀浆离心后沉淀部分）。在获得的蛋白样品中加入蛋白loadingbuffer (4×)，100℃煮沸10 min以配置SDS-PAGE胶蛋白样品。蛋白样品经过SDS-PAGE胶电泳分离后，用考马斯亮蓝染色液染色，观察重组蛋白的表达效果。
通过镍柱亲和层析技术纯化重组蛋白（带有His蛋白标签），流程为去离子水清洗层析柱、Lysis buffer平衡层析柱、样品过层析柱（重复1次）、再次平衡层析柱、50 mM 咪唑缓冲液冲洗层析柱（去除非特异结合的杂蛋白）、100 / 200 / 500 mM 咪唑缓冲液冲洗层析柱（洗脱目的蛋白）、去离子水冲洗层析柱、20%乙醇冲洗层析柱。所有冲洗层析柱的液体都经0.22 μM孔径的滤膜过滤。咪唑缓冲液配方为20 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，及相应物质的量浓度的咪唑，PH = 8.6。纯化的蛋白样品置于超滤管中离心浓缩。
实施例2：
用实施例1中重组蛋白免疫蛋鸡产生卵黄抗体的方法：
1）免疫蛋鸡
将实施例1中纯化浓缩后的Fel D1、Fel D4、Fel D1+Fel D4（Fel D1和Fel D4两种蛋白按照质量比1：1混合后进行联合免疫）及Fel D1&Fel D4（融合蛋白）的重组抗原蛋白用无菌PBS稀释，具体为：用无菌PBS将各组蛋白分别稀释至浓度为400 μg/mL，按照体积比1：1与免疫佐剂混合，取1mL混合液（即混合液中抗原蛋白含量为200 μg），通过颈部皮下注射的方式免疫产蛋高峰期的蛋鸡（n = 6，200-250日龄），具体免疫程序如表1所示。
表1
2）卵黄抗体效价测定
首免后收集各组第0 W、1 W、2 W、3 W、4 W、5 W、6 W、7 W鸡蛋，清洗鸡蛋表面，分离蛋清和蛋黄，采用Elisa测定各组卵黄抗体的效价。具体步骤如下：
①清洁与消毒：先使用清洁水清洗鸡蛋外壳，去除表面的污物，再用75%酒精对鸡蛋外壳进行消毒。
②卵黄分离：无菌条件下打开鸡蛋，小心地将蛋黄转移至灭菌容器中。
③卵黄稀释：用灭菌PBS按2倍比稀释蛋黄。
④抗原包被：分别将重组蛋白Fel D1、Fel D4作为抗原，用包被液稀释至10 μg/mL，按100μL/孔加入酶标板中，4℃过夜。抗原包被液为碳酸盐缓冲液（PH=9.6）。
⑤封闭：弃去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干酶标板，按每孔200 μL加入封闭液，37℃孵育2h。洗涤液为PBST（0.5%吐温-20的PBS溶液，PH=7.4），封闭液为5%脱脂奶粉溶液（溶剂为PBST）。
⑥一抗孵育：弃去封闭液，用洗涤液洗涤3次，拍干酶标板，将上述倍比稀释的蛋黄加入酶标板中，100 μL/孔，37℃孵1 h。一抗稀释液为含1%脱脂奶粉的PBS缓冲液，pH=7.4。
⑦酶标二抗孵育：弃去一抗稀释液，用洗涤液洗涤3次，拍干酶标板，加入小鼠抗鸡IgY-HRP抗体，100μL/孔，37℃孵育1 h。二抗稀释液为含1%脱脂奶粉的PBS缓冲液，pH=7.4。
⑧显色反应：弃去酶标板中的二抗液稀释液，用洗涤液洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL显色液，37℃避光孵育10 min。
⑨收集信号：每孔加入100 μL终止液，37℃避光孵育10 min。使用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光值。样品孔的OD450 nm记为P，阴性孔OD 450 nm记为N。当P/N≥2.1时，则该孔被记为阳性孔，阳性孔的最大稀释倍数被记为抗体效价。
实施例3：
用实施例2中得到的卵黄抗体制备功能性猫粮的办法：
1）蛋黄粉和功能性猫粮的制备
收集实施例2中28-49天各组鸡蛋，分离蛋清和蛋黄。将蛋黄与麦芽糊精等质量混匀，在45℃下进行低温烘干，烘干的混合物粉碎后即为蛋黄粉。将上述蛋黄粉以5%的质量比例混入常规猫粮中即为所述的功能性猫粮。
2）功能性猫粮的效果检测
将40只成年猫随机分为NC组，Fel D1组，Fel D4组，Fel D1+Fel D4和Fel D1&FelD4组（n=5），分别饲喂添加了相应卵黄抗体（蛋黄粉）的功能性猫粮。分别于第0周、第1周、第2周、第4周和第8周收集各组猫唾液和毛发，通过Elisa法检测其中Fel D1和Fel D4的含量。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种Fel D1与Fel D4融合蛋白，其特征在于：将Fel D1基因的CH1和CH2基因片段通过柔性Linker连接得到Fel D1的序列，其中CH1和CH2基因片段均为切除信号肽后的序列；Fel D4的序列为Fel D4基因切除信号肽后的序列；将Fel D1和Fel D4的序列通过刚性Linker连接后，与标签蛋白的基因序列共同连接于表达载体得到重组质粒，转化至原核表达菌株，经诱导表达、纯化重组蛋白，得到Fel D1与Fel D4融合蛋白；所述Fel D1与Fel D4融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白，其特征在于：所述表达载体包括pET-28a。
3.根据权利要求1或2所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白，其特征在于：所述标签蛋白包括多组氨酸His。
4.根据权利要求1或2所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白，其特征在于：所述原核表达菌株包括Rosetta DE3。
5.根据权利要求1或2所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白，其特征在于：所述诱导表达包括经0.5~1 mM的IPTG诱导表达。
6.根据权利要求1或2所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白，其特征在于：所述纯化包括通过亲和层析法纯化重组蛋白。
7.根据权利要求1所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白在免疫蛋鸡制备卵黄抗体中的应用。
8.根据权利要求1所述的Fel D1与Fel D4融合蛋白在制备猫粮添加剂中的应用，其特征在于：将所述Fel D1与Fel D4融合蛋白免疫蛋鸡得到含有卵黄抗体的蛋黄，并将蛋黄作为猫粮添加剂添加到猫粮中。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述蛋黄在猫粮中的添加量为1~10wt%。
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