CN119409807B

CN119409807B - 抗乙型流感病毒单克隆抗体制备方法及应用

Info

Publication number: CN119409807B
Application number: CN202411654749.8A
Authority: CN
Inventors: 李桂林; 崔亚敏; 彭亚杰; 王素娟; 董艳娜; 田晓平; 赵巧辉; 付光宇; 杨增利
Original assignee: Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Current assignee: Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Priority date: 2024-11-19
Filing date: 2024-11-19
Publication date: 2025-10-10
Anticipated expiration: 2044-11-19
Also published as: CN119409807A

Abstract

本发明涉及抗体技术领域，特别涉及抗乙型流感病毒单克隆抗体制备及应用。本发明提供了抗体及其应用、核酸分子、表达载体、基因工程生物材料、质控品及其制备方法、试剂及试剂盒。所述抗FluB单克隆抗体作为质控品和校准品，与FluB病毒HA基因的Victoria和Yamagata系重组抗原能够发生显著的酶联免疫反应，且37℃加速稳定性实验结果显示其满足试剂盒使用需求，制备方法简单，适于大量生产。

Description

抗乙型流感病毒单克隆抗体制备方法及应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，特别涉及抗乙型流感（FluB）单克隆抗体制备及应用。

背景技术

流感病毒依据内部核蛋白（NP）与基质蛋白（MP）的抗原性差异，可被分为甲型（A）、乙型（B）和丙型（C）三个型。A型流感病毒引发的症状是最严重的，B型流感病毒并不严重，但仍能引起爆发，而C型流感病毒通常是导致轻微症状，D型流感病毒是新发现的，很多问题还在研究中。A、B和C型流感病毒在总体结构上非常相似。病毒颗粒直径为80～120纳米，通常为大致球形，但可能出现丝状形式。

流感病毒B属于正粘病毒科和流感病毒B属。它具有由大约14,648个核苷酸组成，分为8个不同的片段，编码大约11个蛋白质。FluB病毒表面的HA蛋白呈三聚体结构，其基因片段包括HA1和HA2两部分，HA1位于三聚体的头部，呈球形结构，含有受体结合位点，是流感病毒的主要的抗原区域，该区域的氨基酸变异将导致流感病毒的抗原性改变，从而引起乙型流感的爆发与流行。HA2位点三聚体的基部，呈柄状结构，含有融合肽，可介导病毒包膜与宿主包膜的融合，一些针对HA2的单抗能够通过抑制流感病毒的膜融合，从而起到中和病毒的效果。

根据抗原性和基因特征的不同，乙型流感分为Victoria和Yamagata两大谱系。两谱系HA1基因编码氨基酸差异（V系340个AA，Y系338-339个AA。Y系缺乏163位AA及部分毒株的166位AA。且推测10年来HA1上的4个抗原决定簇（A区：116-137；B区141-150；C区：162-167；D区：194-202）共17个AA发生改变。V系和Y系平均差异率为5.4%-10.2%，两谱系的氨基酸差异和组间遗传距离随时间推移有逐步增大的趋势。

相较于甲型流感病毒，针对乙型流感病毒的单克隆抗体报道相对较少，且大多是通过杂交瘤技术获取的鼠源抗体序列，而多数试剂盒中质控品和校准品在使用时候需要与抗人IgM的二抗结合，故需要人源的Fc与之结合。由此可见，噬菌体全人源抗体库筛选的天然人源抗体具有先天优势，比鼠源抗体后期进行嵌合表达构建效率更高。

乙流病毒有可能导致流感病毒肺炎。对免疫力低下、年龄较大或有严重基础病的患者而言，感染肺炎的可能性更大。因此，乙型流感病毒检测具有重要的临床意义。而在体外诊断领域，大多使用的为阳性病人血浆，存在难收集、不易放大等诸多问题。通过体外方法制备抗FluB单克隆抗体作为质控品和校准品用于试剂盒检测是非常迫切的。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了抗FluB全人源单克隆抗体制备及应用，该单抗作为质控品和校准品与FluB病毒HA基因的Victoria和Yamagata系重组抗原能够发生显著的酶联免疫反应，且其37℃加速稳定性满足试剂盒使用需求，制备方法简单，适于大量生产。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了抗体，包括单链抗体，其重链可变区具有：

（1）、如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列；或

（2）、如（1）所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与（1）的相同或相似；或

（3）、与如（1）或（2）所示的氨基酸序列至少有95%同源性的氨基酸序列；

其轻链可变区具有：

（4）、如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列；或

（5）、如（4）所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与（4）的相同或相似；或

（6）、与如（4）或（5）所示的氨基酸序列至少有95%同源性的氨基酸序列；

所述多个为2个至5个。

在本发明的一些具体实施方案中，上述抗体包括抗体1或抗体2；

所述抗体1的重链可变区具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列；

所述抗体2的重链可变区具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，上述抗体为单链抗体。

本发明还提供了编码上述抗体的核酸分子。

在本发明的一些具体实施方案中，上述核酸分子具有：

（7）、如SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列；或

（8）、如（7）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与（7）的相同或相似；或

（9）、与如（7）或（8）所示的核苷酸序列至少有90%同源性的核苷酸序列；

所述多个为2个至30个。

在本发明的一些具体实施方案中，上述核酸分子具有如SEQ ID NO: 3、SEQ IDNO: 4所示的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，上述核酸分子具有SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

本发明还提供了表达载体，包括上述核酸分子。

在本发明的一些具体实施方案中，上述表达载体的骨架包括噬菌体载体骨架、慢病毒载体骨架、原核生物载体骨架或真核生物载体骨架。

本发明还提供了基因工程生物材料，包括噬菌体、细菌、真菌、植物细胞或动物细胞，具有上述表达载体。

本发明还提供了以下任一项在制备标准物质中的应用：

i）、上述抗体；

ii）、上述核酸分子；

iii）、上述表达载体；

iv）、上述基因工程生物材料。

在本发明的一些具体实施方案中，上述应用的标准物质为流感检测标准物质。

本发明还提供了标准物质，包括上述抗体，以及可接受的辅料或助剂。

在本发明的一些具体实施方案中，上述标准物质为流感检测标准物质。

本发明还提供了试剂或试剂盒，其包括以下任一项：

i）、上述抗体；

ii）、上述核酸分子；

iii）、上述表达载体；

iv）、上述基因工程生物材料；

v）、上述标准物质。

在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂或试剂盒为流感检测试剂或试剂盒。

本发明还提供了标准物质的制备方法，其基于以下任一项制备：

a）、上述核酸分子；

b）、上述表达载体；

c）、上述基因工程生物材料。

在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法包括：

A）、表达上述核酸分子，获得抗体，与可接受的辅料或助剂混合，获得标准物质；

B）、表达上述表达载体，获得抗体，与可接受的辅料或助剂混合，获得标准物质；

C）、培养上述基因工程生物材料，获得抗体，与可接受的辅料或助剂混合，获得标准物质。

本发明的抗FluB全人源单克隆抗体制备及应用有如下效果：

本发明提供的抗FluB全人源IgM单克隆抗体FH105和FH128，纯度均＞90%，瞬时表达量分别为200 mg/L和150 mg/L，且IgM多聚体占比＞90%，经鉴定，FH105效价更高，利用该单抗可作为阳性质控品，其效价、稳定性均满足使用需求，为临床诊疗提供可靠依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示提取外周血淋巴细胞提取RNA琼脂糖凝胶电泳图；

图2示VL和VH基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图3示scFv基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4示SDS-PAGE和HPLC分析图；A中的2示FH105 IgM非还原，A中的1示还原型条带（经还原剂/DTT处理）；B中的3示FH128 IgM非还原，B中的4还原型条带（经还原剂/DTT处理）；C示SEC-HPLC图，其中，蓝色峰为Marker，从左往右大小依次是1340 KDa、670 KDa、300KDa、150 KDa、45 KDa、17 KDa、1 KDa；浅绿色峰和红色峰分别对应FH105 IgM和FH128 IgM的HPLC峰图。

具体实施方式

本发明公开了抗FluB全人源单克隆抗体制备及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

抗FluB全人源IgM单克隆抗体FH105和FH128，其重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO: 1和SEQ ID NO: 5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 6所示。

本发明所述的抗FluB全人源单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为均人IgM亚型，所述轻链恒定区均为Kappa型。

本发明还提供了编码所述的抗FluB全人源单克隆抗体的DNA分子。

其中，所述的DNA分子包括编码所述重链可变区的序列如SEQ ID NO: 3、SEQ IDNO: 7所示或与SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7互补的核苷酸；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 8所示或与SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 8互补的核苷酸序列。

本发明还提供一种表达载体，含有编码所述的抗FluB全人源IgM单克隆抗体的DNA分子。

一些具体实施例中，本发明所述表达载体的骨架载体为pCMV3。

本发明还提供一种重组宿主，含有所述的表达载体。在一些具体实施例中，所述宿主细胞为Expi CHO细胞。

本发明还提供一种抗FluB全人源IgM单克隆抗体的制备方法，包括：

（1）、构建含有上述DNA分子的表达载体；

（2）、将步骤（1）所述的表达载体转化宿主细胞；

（3）、培养步骤（2）所得的宿主细胞；

（4）、分离纯化获得所述单克隆抗体。

本发明还提供了所述的抗FluB全人源IgM单克隆抗体在体外诊断试剂中的应用。

本发明还提供一种阻断剂包括所述的抗FluB全人源IgM单克隆抗体和可接受的助剂。

本发明涉及的序列如下：

FH105重链可变区氨基酸序列：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASRGTSSSNAISWVRQTPGHGLEWMGRIIPVLAIENYAQKFEGRITITADKSTSTAYMELTSLTSEDTAVYYCARERGTHLSKADAFDLWGQGTKVTVSS（SEQ ID NO: 1）

FH105轻链可变区氨基酸序列：

NIQMTQSPSSLSASVGDRVTVTCRASQTISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPLTFGPGTKVDIK（SEQ ID NO: 2）

FH105重链可变区核苷酸序列：

CAGGTTCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTAGAGGCACCTCCAGTAGCAATGCTATCAGCTGGGTGCGCCAGACCCCTGGCCATGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTGTCCTTGCCATAGAAAACTACGCACAGAAGTTCGAGGGCAGAATCACCATCACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGTTGACCAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAGAGCGTGGGACTCACTTAAGTAAGGCTGATGCTTTTGATCTATGGGGCCAAGGGACAAAGGTCACCGTCTCCTCA（SEQID NO: 3）

FH105轻链可变区核苷酸序列：

AACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCGTCACTTGCCGGGCAAGTCAGACCATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCTGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCACAGTGGCGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGAAGATTTTGCGACTTACTACTGTCAGCAGAGTTACAATACCCCCCTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA（SEQ ID NO: 4）

FH128重链可变区氨基酸序列：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGNFYNSGITNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYNCARVGQWPGDHWFDPWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 5）

FH128轻链可变区氨基酸序列：

NIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIRSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSPITFGQGTRLEIK（SEQ ID NO: 6）

FH128重链可变区核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTACAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGAATTTCTATAACAGTGGGATCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTCAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATAACTGTGCGAGAGTAGGGCAGTGGCCGGGAGACCACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA（SEQ ID NO:7）

FH128轻链可变区核苷酸序列：

AACATCCAGTTGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGAAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCTACTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCTCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA（SEQ ID NO: 8）

如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：引物合成与基因获取

用人外周血淋巴细胞分离液（Solarbio，北京）从呼吸道病人抗凝血液中分离淋巴细胞，用RNA提取试剂盒（生工，上海）提取总细胞RNA（电泳结果见图1），以Oligo-dT引物，提取的RNA为模版采用NEB公司的第一链合成试剂盒（ProtoScript^® First Strand cDNASynthesis Kit.Cat No.E6300S）逆转录生成cDNA，以其为模板分别扩增scFv重链轻链基因片段。使用的引物库序列如下：

重链上游引物如下：

VHF1：CAGGTBCAGCTGGTRCAGTC（SEQ ID NO: 9）；

VHF2：CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG（SEQ ID NO: 10）；

VHF3：CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG（SEQ ID NO: 11）；

VHF4：CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG（SEQ ID NO: 12）；

VHF5：CAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC（SEQ ID NO: 13）；

VHF6：CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG（SEQ ID NO: 14）；

VHF7：CAGGTCCAGCTKGTGCARTC（SEQ ID NO: 15）；

VHF8：CAGGTCCAGCTGGTGCAGTC（SEQ ID NO: 16）；

VHF9：CAGGTACAGCTGGTGGAGTC（SEQ ID NO: 17）；

重链下游引物：

VHR1：TGAGGAGACGGTGACCTTTG（SEQ ID NO: 18）；

VHR2：TGAGGAGACGGTGACCAGGG（SEQ ID NO: 19）；

VHR3：TGAAGAGACGGTGACCATTG（SEQ ID NO: 20）；

VHR4：TGAGGAGACGGTGACCAGGG（SEQ ID NO: 21）；

VHR5：TGAGGAGACGGTGACCGTGG（SEQ ID NO: 22）；

轻链kappa亚型上游引物：

Kappa1F：GACATCCAGATGACCCAGTCTCC（SEQ ID NO: 23）；

Kappa2F：GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC（SEQ ID NO: 24）；

Kappa3F：GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC（SEQ ID NO: 25）；

Kappa4F：GACATCGTGATGACCCAGTCTCC（SEQ ID NO: 26）；

Kappa5F：GAAACGACACTCACGCAGTCTCC（SEQ ID NO: 27）；

Kappa6F：GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC（SEQ ID NO: 28）；

轻链kappa亚型下游引物：

KappaR1：TTTGATATCCACTTTGGTCC（SEQ ID NO: 29）；

KappaR2：TTTGATCTCCACCTTGGTCC（SEQ ID NO: 30）；

KappaR3：TTTGATTTCCAGCTTGGTCC（SEQ ID NO: 31）；

KappaR4：TTTAATCTCCAGTCGTGTCC（SEQ ID NO: 32）；

KappaR5：TAGGACGGTCAGCTTGGTCC（SEQ ID NO: 33）。

PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃再延伸10 min。以切胶纯化后轻重链可变区分别连接T载体后送测，获取轻重链可变区序列。而后，通过SfiⅠ酶切位点，采用OverLap PCR技术将两者拼接成scFv基因片段。轻链、重链及scFv基因片段的PCR产物均经1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示：重轻链可变区大小在350 bp左右，拼接后scFv片段大小约750 bp（如图2和图3所示）。

实施例2：scFv噬菌体文库构建

将scFv基因片段经SfiⅠ酶切位点与噬菌体载体pComb3XSS进行连接，连接产物电转至E. coli TG1感受态细胞中，加入2×YT-AG培养基（含有2%葡萄糖，100 μg/mL AMP），37℃振荡培养1 h；取10 µL菌液，接种至2×YT-AG培养基培养过夜；观察噬菌斑形成情况，并计算抗体库滴度：

抗体库滴度（PFU／mL）=稀释度×噬菌斑数目（PFU）／铺板用菌液体积（mL）。

随机挑取10-20个阳性菌落送生工科技有限公司测序，进行菌落PCR鉴定，分析抗体库多样性。剩余菌液加入辅助噬菌体-M13K07，37℃静置孵育30 min后离心收集菌体，加入100 mL 2×YT培养基（含1 μM IPTG、100 μg/mL AMP）重悬，30℃摇床培养过夜；离心收集上清，加入四分之一体积的20% PEG/2.5 M NaCl，冰浴50分钟沉降噬菌体，离心收集沉淀，用PBS重悬沉淀获得噬菌体抗体库。

实施例3：人源抗FluB病毒噬菌体抗体库的富集筛选

将FluB Victoria和Yamagata系重组抗原按照1:1比例混合后以10 µg/mL的浓度包被免疫管，4℃过夜，用5%脱脂奶于37℃封闭2 h；PBST洗涤2次后加入1 mL实施例2制备的scFv噬菌体文库，室温震荡孵育2 h后用PBST洗10次，加入1 mL三乙胺解离缓冲液（100mM），室温孵育10 min，用1 M Tris-HCl（pH=6.4）中进行中和及加入50 mL对数生长期的TG1菌液，37℃静置孵育30 min后，取10 µL涂2×YT / GA，平板37℃培养过夜检测产出量。剩余菌液进行扩大培养，至菌液A600约为0.5加入辅助噬菌体M13K07，后续过程与实施例2一致，重复以上筛选过程4轮，富集与FluB抗原结合的噬菌体。

实施例4：阳性噬菌体克隆的诱导表达

随机挑选4轮富集后的单菌落于96深孔板中，共挑选6板，每孔添加400 μL 2×YT/ GA培养基（2%葡萄糖，50 μg/mL Amp），37℃培养过夜。次日取5 μL过夜培养的菌液转接至含有100 μL培养基的96孔板中进行活化，37℃培养2-3 h，OD值为2左右时，每孔加入20 μL2×YT+辅助噬菌体（MOI=5）混合液37℃静置孵育30 min。摇床培养1.5 h后每孔补加300 μL2×YT-AK（100 μg/mL Amp，50 μg/mL Kan+）过夜培养16-18 h。次日，离心取上清用于检测。

实施例5：噬菌体单克隆ELISA检测

将V系和Y系抗原分别包被于酶标板上，4℃过夜；封闭液Casein封闭液封闭37℃，2h，甩干备用，加入单克隆噬菌体，37℃温浴30 min后，PBST洗液清洗6次后，甩干，加入HRP-M13，37℃温浴30 min，PBST洗液清洗5次后甩干显色15 min后加入2 M H₂SO₄终止反应，酶标仪检测450 nm处吸光度值。将反应性强的2个克隆送测序。

实施例6：可变区基因的核酸序列分析及全长IgM抗体构建

抗体1-FH105：其重链可变区具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。

抗体2-FH128：其重链可变区具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。

以选取的2个阳性单克隆为模板，利用PCR技术分别扩增可变区基因序列通过HindIII/XbaI构建至实验室载体IgM-PCMV3及LC-PCMV3中（含恒定区序列）。重组后的质粒转入感受态DH5α细胞后，挑选阳性克隆测序并进行质粒提取。

实施例7：全长IgM抗体表达

转染前一天调整Expi CHO细胞密度至3×10⁶ cells/mL到4×10⁶ cells/mL，转染当天，用ExpiCHO-S expression medium将细胞稀释到6×10⁶ cells/mL。提取的质粒按照ExpiFectamine CHO转染试剂说明书，稀释质粒DNA和脂质体，以1 μg: 5 μL比例转染细胞，FH105和FH128抗体质粒包含轻重链质粒和J链质粒，其中HC:LC:J=1:1:1。24 h后添加24%CHO补料，0.6%增强剂，培养至细胞活力降至70%-75%左右收获上清。

实施例8：人源抗FluB病毒全长IgM抗体的纯化

将FH105和FH128抗体收获的上清经0.45 μm滤膜过滤，依次使用超纯水和缓冲液（0.02 M PBS，pH 7.4）平衡装有Protein L填料的层析柱，将过滤后的抗体上清上样、再次平衡，最后使用解离缓冲液（0.1 M 柠檬酸钠pH 2.3）洗脱目的蛋白抗体，收集解离峰，使用分光光度计NanoDrop One来检测蛋白含量并通过SDS-PAGE、SEC-HPLC检测蛋白表达水平。

结果显示：FH105和FH128抗体经纯化后，表达量分别为200 mg/L和150 mg/L，重链分子量大小均约为65 KD左右，轻链分子量大小为25 KD左右，与预期相符；图4的HPLC检测结果显示：抗体纯度达到98%以上（150 KDa左右）。HPLC结果显示目的抗体大多为聚体形式存在；存在少部分单体形式（大小在200 kDa左右）。

实施例9：人源抗FluB病毒全长IgM抗体的ELISA检测

用乙流病毒IgM试剂盒按照说明书进行检测，根据试剂盒判断标准：S/CO值≥10AU/mL即为阳性。本实验所制备的FH105 IgM和FH128 IgM人源抗体检测结果如表1所示，FH105 IgM和FH128 IgM检测浓度平均值分别为27015和25227，反应性强，均满足作为阳性质控品反应性要求。随后将FH105 IgM和FH128 IgM抗体效价（S/CO）调整至低、中、高三个水平（靶值分别为3±1，7±1，13±1），冻干后，考核复溶后37℃热加速7天，14天效价变幅，稳定性数据见表2，变幅均在10%以内，均满足试剂使用需求。由于FH105 IgM抗体反应性高于FH128 IgM抗体7%，因此优选FH105。

表1：FH105 IgM和FH128 IgM抗体反应性检测结果

表2：FH105 IgM和FH128 IgM抗体37℃加速稳定性考核结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.抗体，其特征在于：

I）其重链可变区具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列；或

II）其重链可变区具有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单链抗体。

3.编码权利要求1或2所述抗体的核酸分子。

4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：

I）具有SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列；或

II）具有SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列。

5.表达载体，其特征在于，包括权利要求3或4所述的核酸分子。

6.基因工程生物材料，包括噬菌体、细菌、真菌或动物细胞，其特征在于，包括权利要求5所述的表达载体。

7.以下任一项在制备标准物质中的应用：

i）、权利要求1或2所述抗体；

ii）、权利要求3或4所述的核酸分子；

iii）、权利要求5所述的表达载体；

iv）、权利要求6所述的基因工程生物材料；

所述标准物质包括质控品和标准品。

8.标准物质，包括质控品或标准品，其特征在于，包括权利要求1或2所述抗体，以及可接受的辅料或助剂。

9.试剂或试剂盒，其特征在于，包括以下任一项：

i）、权利要求1或2所述抗体；

ii）、权利要求3或4所述的核酸分子；

iii）、权利要求5所述的表达载体；

iv）、权利要求6所述的基因工程生物材料；

v）、权利要求8所述的标准物质。

10.标准物质的制备方法，其特征在于，基于以下任一项制备：

a）、权利要求3或4所述的核酸分子；

b）、权利要求5所述的表达载体；

c）、权利要求6所述的基因工程生物材料。