CN119303113A

CN119303113A - Nedd4l基因在制备治疗血管内皮细胞增生性相关疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN119303113A
Application number: CN202411227160.XA
Authority: CN
Inventors: 秦岩; 刘雨萌; 赵明慧; 史建红; 李靖华; 王馨悦; 王婷婷; 吴飞翔; 张岚; 郑立双
Original assignee: AFFILIATED HOSPITAL OF HEBEI UNIVERSITY
Current assignee: AFFILIATED HOSPITAL OF HEBEI UNIVERSITY
Priority date: 2024-09-03
Filing date: 2024-09-03
Publication date: 2025-01-14

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了NEDD4L基因在制备治疗血管内皮细胞增生性相关疾病药物中的应用。本发明提供了NEDD4L基因在制备治疗血管内皮细胞增生性相关疾病药物中的应用，其中所述NEDD4L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述NEDD4L基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。首次发现过表达NEDD4L基因可抑制血管内皮细胞的增殖、下调血管内皮细胞的侵袭能力、降低血管内皮细胞的迁移率以及诱导内皮细胞的自噬，基于此，本发明将NEDD4L基因用于制备治疗血管内皮细胞增生性相关疾病药物中，以期为血管内皮细胞增生性疾病的治疗提供新的策略。

Description

NEDD4L基因在制备治疗血管内皮细胞增生性相关疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了NEDD4L基因在制备治疗血管内皮细胞增生性相关疾病药物中的应用。

背景技术

血管内皮细胞增生性疾病是指涉及到血管内皮细胞异常增生的一类疾病。血管内皮细胞（VEC）具有维持血管张力、血管生成、止血等重要功能，同时也是血管健康的重要守护者，它对维持血管的健康和功能至关重要。血管内皮细胞功能失调可能表现为内皮细胞异常增殖、内皮依赖性血管舒张障碍、氧化应激增强、慢性炎症、白细胞粘附、血管通透性的增加、内皮细胞衰老、代谢异常和内皮细胞间质转化等，这些功能障碍与多种血管疾病有关，如动脉粥样硬化、高血压、糖尿病以及感染性疾病等。

血管内皮细胞异常增殖是一个受多因子复杂调控的过程，其过程主要受到由血管内皮细胞异质性、血流剪切力、内皮细胞分泌的活性物质、血管内皮生长因子等共同构成的局部微环境的影响。在血管内皮细胞增生性疾病的进展过程中，一个关键环节是血管内皮细胞功能发生了变化，导致促增殖基因转录激活，促凋亡基因沉默，并最终导致akt等增殖信号通路的活化及细胞迁移进程的启动，所以血管内皮细胞的异常增殖和迁移与动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等血管内皮细胞增生性疾病密切相关，如何有效抑制血管内皮异常增殖和迁移已经成为治疗这些疾病的重要策略。

目前常规治疗血管内皮细胞增生性疾病的方法主要有药物治疗、手术治疗、介入治疗、激光治疗等，药物治疗主要集中于控制疾病的症状和减缓疾病进展。例如，使用降压药物控制高血压、降糖药物控制糖尿病等。但药物治疗基本无法根治疾病，且可能伴随药物副作用。手术治疗虽然可以直接切除病变组织，但存在出血多、外观效果差、易复发等不足。介入治疗和激光治疗存在对正常组织可能造成损伤的风险，所以寻找新的抑制血管内皮细胞增殖和迁移的分子或蛋白成为目前临床亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术中常规治疗血管内皮细胞增生性疾病的方法中的不足，本发明旨在提供一种具有抑制血管内皮细胞增殖、迁移和侵袭作用以及诱导细胞自噬的基因药物，进而提供了NEDD4L基因在制备治疗血管内皮细胞增生性相关疾病药物中的应用，以期为血管内皮细胞增生性疾病开辟新的治疗策略。

为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

第一方面，本发明提供了NEDD4L基因在制备治疗血管内皮细胞增生性相关疾病药物中的应用。

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现NEDD4L基因可作为治疗血管内皮细胞增生性疾病的靶点，NEDD4L基因过表达后可以抑制血管内皮细胞增殖、迁移和侵袭以及诱导细胞自噬，因此可将其用于血管内皮细胞异常增生引起的相关疾病。应用NEDD4L基因制备治疗血管内皮细胞增生性相关疾病药物可克服现有相关药物中副作用大、手术出血多等不足，在现有常规治疗的基础上提供了一种新的治疗思路，为治疗血管内皮细胞增生性疾病治疗开辟新的方向。

作为对上述应用的第一种限定，所述NEDD4L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

NCBI数据库中NEDD4L基因有7个不同的转录本，而对于有多个转录本的基因，其不同转录本所编码的氨基酸序列不同，导致蛋白的结构域差异，可能会造成最终蛋白发挥不同的生理学作用。本发明创造性地发现，包括源于E3 ubiquitin-protein ligase NEDD4-like isoform 2（NM_001144964.1）的CDS区601-3165位核苷酸的序列，在本发明实验范围内，具有抑制血管内皮细胞增殖、迁移和侵袭以及诱导细胞自噬的作用。

作为对上述应用的第二种限定，所述NEDD4L基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

作为对上述应用的第三种限定，所述血管内皮细胞增生性相关疾病包括动脉粥样硬化、高血压、糖尿病或血管瘤。

第二方面，本发明提供了一种治疗血管内皮细胞增生性相关疾病的药物，所述治疗血管内皮细胞增生性相关疾病的药物中包含NEDD4L基因过表达载体。

第三方面，本发明提供了上述治疗血管内皮细胞增生性相关疾病的药物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤一、将NEDD4L基因克隆至腺病毒相关病毒后得含NEDD4L基因的腺病毒相关病毒；

步骤二、将所述含NEDD4L基因的腺病毒相关病毒转化至大肠杆菌，得重组质粒；

步骤三、将所述重组质粒转染人内皮细胞后扩大培养，纯化、浓缩得含NEDD4L基因的腺病毒浓缩液，即为所述NEDD4L基因过表达载体。

作为对上述制备方法的第一种限定，步骤一中，所述腺病毒相关病毒包括腺病毒、慢病毒或腺相关病毒中的至少一种；

其中，腺病毒包括ADV4等；慢病毒包括LV5等，腺相关病毒包括AAV-GP-1及AAV-GP-12N等。本发明以ADV4为例进行说明。

作为对上述制备方法的第二种限定，步骤三中，将所述人内皮细胞包括人脐静脉内皮细胞、人胚肾细胞或人平滑肌细胞等；

步骤三中，所述扩大培养前，还包括对所述重组质粒进行高纯度无内毒素抽提。

作为对上述制备方法的第三种限定，在所述人内皮细胞中对所述含NEDD4L基因的腺病毒浓缩液的病毒滴度进行测定。

第四方面，本发明提供了上述治疗血管内皮细胞增生性相关疾病的药物的应用，将所述药物注射于机体至少72h；进一步地，所述注射包括显微注射的方式。

本发明提供了NEDD4L基因在制备治疗血管内皮细胞增生性相关疾病药物中的应用，首次发现过表达NEDD4L基因可抑制血管内皮细胞的增殖、下调血管内皮细胞的侵袭能力、降低血管内皮细胞的迁移率以及诱导内皮细胞的自噬。因此，本发明提供的治疗血管内皮细胞增生性相关疾病的药物在上述抑制血管内皮细胞的增殖、侵袭能力和迁移以及诱导内皮细胞的自噬四方面发挥治疗作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1-1~图1-3为本发明实施例1中重组质粒基因的部分测序检测图谱；

图2为本发明实施例2中NEDD4L基因过表达载体感染血管内皮细胞后的细胞形态图；

图3为本发明实施例2中血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其mNRA表达情况；

图4为本发明实施例2中血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其NEDD4L蛋白的表达情况；

图5为本发明实施例2中血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其细胞增殖实验检测结果；

图6为本发明实施例2中血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其细胞凋亡实验检测结果；

图7为本发明实施例2中血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其细胞克隆实验检测结果；

图8为本发明实施例2中血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其细胞Transwell实验检测结果；

图9为本发明实施例2中血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其细胞划痕实验检测结果；

图10为本发明实施例2中血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其细胞免疫印迹检测结果；

图11为本发明实施例2中血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后感染mRFP-GFP-LC3病毒，其细胞自噬情况；其中，图11a为感染 mRFP-GFP-LC3病毒后显微镜成像图，图11b为自噬阳性点/细胞数占比量化图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例1

本实施例提供了一种NEDD4L基因过表达载体的制备，具体方法如下：

一、目的基因片段的获得

1.oligo设计，NEDD4L基因上下游引物加上EcoRI和BamHI及保护碱基，用于载体的亚克隆，oligo序列如下表表1所示。

表1

依据表1中的序列，委托苏州吉玛基因股份有限公司合成上述引物。

2.将上述oligo溶解成50µM；

3.用合成的引物，以NEDD4L基因为模板进行PCR反应，PCR体系如下表表2所示。

表2

上述PCR时，循环条件如下表表3所示。

表3

4.PCR反应完成后，利用Agarose 电泳并切胶回收基因片段，得目的基因片段，即人NEDD4L基因（本发明中记为NEDD4L基因）。

二、NEDD4L基因克隆至载体绵羊腺病毒4型（ADV4）

1.用EcoRI和BamHI 对上述获得的NEDD4L基因片段进行酶切，37℃ 酶切2小时，酶切体系如下表表4所示。

表4

其中，表4中NEDD4L基因的浓度为50µM。

2.用EcoRI和BamHI 对载体ADV4进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下表表5所示。

表5

其中，所述表5中ADV4载体的浓度为50µM。

3.电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切片段NEDD4L基因和载体ADV4。

4.用T4 DNA ligase连接酶切得到的NEDD4L基因片段和线性化的载体ADV4，22℃连接2小时得连接产物，连接体系如下表表6所示。

表6

5.参考《分子克隆实验指南第二版》第55页，制备大肠杆菌感受态细胞；

6.向装有大肠杆菌感受态细胞的离心管中加入上述连接产物10μL ，轻柔混匀内容物，在冰中放置30分钟；将离心管放到预加温到 42℃的水浴锅中放好的试管架上，放置90 秒，不摇动离心管。快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3分钟。向每支离心管加入800μL LB培养基(不含抗生素)，然后将离心管转移到37℃、250rpm的摇床中培育45分钟，使细菌复苏。

7.取200μL培育后的细胞均匀涂布于含50µg/ml Ampicillin的LB平板上。待平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时。从平板上挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定，挑选出阳性克隆。

8.从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5ml (含50µg/mlAmpicillin) LB 培养基的试管中，置于摇床中以37℃，250rpm条件下培养16小时。

9.将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒(天根生化，DP104-02)抽提质粒，得重组质粒。

三、重组质粒测序验证及获得

取200μL阳性克隆对应的菌液送测序，将测序结果与目的基因序列进行比对，核对无误后，将对应的阳性克隆菌株即为重组菌株；

将重组菌株在LB培养基中扩大培养，质粒抽提，得到足够量的重组质粒。

其中，NEDD4L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；NEDD4L基因编码的蛋白（记为NEDD4L蛋白）的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；重组质粒基因的部分测序检测图谱如图1-1~1-3所示。

通过NCBI数据库可知NEDD4L基因具有7个不同的转录本，本发明NEDD4L基因的核苷酸序列中包括来源于E3 ubiquitin-protein ligase NEDD4-like isoform 2（NM_001144964.1）的CDS区601-3165位核苷酸的序列，对于有多个转录本的基因，其不同转录本所编码的氨基酸序列不同，导致蛋白的结构域差异，可能会造成最终蛋白发挥不同的生理学作用。

本发明中选取的NEDD4L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，SEQ ID NO:1具体为：

atggcgaccgggctcggggagccggtctatggactttccgaagacgagggagagtcccgtattctcagagtaaaagttgtttctggaattgatctcgccaaaaaggacatctttggagccagtgatccgtatgtgaaactttcattgtacgtagcggatgagaatagagaacttgctttggtccagacaaaaacaattaaaaagacactgaacccaaaatggaatgaagaattttatttcagggtaaacccatctaatcacagactcctatttgaagtatttgacgaaaatagactgacacgagacgacttcctgggccaggtggacgtgccccttagtcaccttccgacagaagatccaaccatggagcgaccctatacatttaaggactttctcctcagaccaagaagtcataagtctcgagttaagggatttttgcgattgaaaatggcctatatgccaaaaaatggaggtcaagatgaagaaaacagtgaccagagggatgacatggagcatggatgggaagttgttgactcaaatgactcggcttctcagcaccaagaggaacttcctcctcctcctctgcctcccgggtgggaagaaaaagtggacaatttaggccgaacttactatgtcaaccacaacaaccggaccactcagtggcacagaccaagcctgatggacgtgtcctcggagtcggacaataacatcagacagatcaaccaggaggcagcacaccggcgcttccgctcccgcaggcacatcagcgaagacttggagcccgagccctcggagggcggggatgtccccgagccttgggagaccatttcagaggaagtgaatatcgctggagactctctcggtctggctctgcccccaccaccggcctccccaggatctcggaccagccctcaggagctgtcagaggaactaagcagaaggcttcagatcactccagactccaatggggaacagttcagctctttgattcaaagagaaccctcctcaaggttgaggtcatgcagtgtcaccgacgcagttgcagaacagggccatctaccaccgcccagtgccccagctgggagagcgcgttcatcaactgtcacgggtggtgaggaaccaacgccatcagtggcctatgtacataccacgccgggtctgccttcaggctgggaagaaagaaaagatgctaaggggcgcacatactatgtcaatcataacaatcgaaccacaacttggactcgacctatcatgcagcttgcagaagatggtgcgtccggatcagccacaaacagtaacaaccatctaatcgagcctcagatccgccggcctcgtagcctcagctcgccaacagtaactttatctgccccgctggagggtgccaaggactcacccgtacgtcgggctgtgaaagacaccctttccaacccacagtccccacagccatcaccttacaactcccccaaaccacaacacaaagtcacacagagcttcttgccacccggctgggaaatgaggatagcgccaaacggccggcccttcttcattgatcataacacaaagactacaacctgggaagatccacgtttgaaatttccagtacatatgcggtcaaagacatctttaaaccccaatgaccttggcccccttcctcctggctgggaagaaagaattcacttggatggccgaacgttttatattgatcataatagcaaaattactcagtgggaagacccaagactgcagaacccagctattactggtccggctgtcccttactccagagaatttaagcagaaatatgactacttcaggaagaaattaaagaaacctgctgatatccccaataggtttgaaatgaaacttcacagaaataacatatttgaagagtcctatcggagaattatgtccgtgaaaagaccagatgtcctaaaagctagactgtggattgagtttgaatcagagaaaggtcttgactatgggggtgtggccagagaatggttcttcttactgtccaaagagatgttcaacccctactacggcctctttgagtactctgccacggacaactacacccttcagatcaaccctaattcaggcctctgtaatgaggatcatttgtcctacttcacttttattggaagagttgctggtctggccgtatttcatgggaagctcttagatggtttcttcattagaccattttacaagatgatgttgggaaagcagataaccctgaatgacatggaatctgtggatagtgaatattacaactctttgaaatggatcctggagaatgaccctactgagctggacctcatgttctgcatagacgaagaaaactttggacagacatatcaagtggatttgaagcccaatgggtcagaaataatggtcacaaatgaaaacaaaagggaatatatcgacttagtcatccagtggagatttgtgaacagggtccagaagcagatgaacgccttcttggagggattcacagaactacttcctattgatttgattaaaatttttgatgaaaatgagctggagttgctcatgtgcggcctcggtgatgtggatgtgaatgactggagacagcattctatttacaagaacggctactgcccaaaccaccccgtcattcagtggttctggaaggctgtgctactcatggacgccgaaaagcgtatccggttactgcagtttgtcacagggacatcgcgagtacctatgaatggatttgccgaactttatggttccaatggtcctcagctgtttacaatagagcaatggggcagtcctgagaaactgcccagagctcacacatgctttaatcgccttgacttacctccatatgaaacctttgaagatttacgagagaaacttctcatggccgtggaaaatgctcaaggatttgaaggggtggattaa。

SEQ ID NO:2具体为：

MATGLGEPVYGLSEDEGESRILRVKVVSGIDLAKKDIFGASDPYVKLSLYVADENRELALVQTKTIKKTLNPKWNEEFYFRVNPSNHRLLFEVFDENRLTRDDFLGQVDVPLSHLPTEDPTMERPYTFKDFLLRPRSHKSRVKGFLRLKMAYMPKNGGQDEENSDQRDDMEHGWEVVDSNDSASQHQEELPPPPLPPGWEEKVDNLGRTYYVNHNNRTTQWHRPSLMDVSSESDNNIRQINQEAAHRRFRSRRHISEDLEPEPSEGGDVPEPWETISEEVNIAGDSLGLALPPPPASPGSRTSPQELSEELSRRLQITPDSNGEQFSSLIQREPSSRLRSCSVTDAVAEQGHLPPPSAPAGRARSSTVTGGEEPTPSVAYVHTTPGLPSGWEERKDAKGRTYYVNHNNRTTTWTRPIMQLAEDGASGSATNSNNHLIEPQIRRPRSLSSPTVTLSAPLEGAKDSPVRRAVKDTLSNPQSPQPSPYNSPKPQHKVTQSFLPPGWEMRIAPNGRPFFIDHNTKTTTWEDPRLKFPVHMRSKTSLNPNDLGPLPPGWEERIHLDGRTFYIDHNSKITQWEDPRLQNPAITGPAVPYSREFKQKYDYFRKKLKKPADIPNRFEMKLHRNNIFEESYRRIMSVKRPDVLKARLWIEFESEKGLDYGGVAREWFFLLSKEMFNPYYGLFEYSATDNYTLQINPNSGLCNEDHLSYFTFIGRVAGLAVFHGKLLDGFFIRPFYKMMLGKQITLNDMESVDSEYYNSLKWILENDPTELDLMFCIDEENFGQTYQVDLKPNGSEIMVTNENKREYIDLVIQWRFVNRVQKQMNAFLEGFTELLPIDLIKIFDENELELLMCGLGDVDVNDWRQHSIYKNGYCPNHPVIQWFWKAVLLMDAEKRIRLLQFVTGTSRVPMNGFAELYGSNGPQLFTIEQWGSPEKLPRAHTCFNRLDLPPYETFEDLREKLLMAVENAQGFEGVD。

四、NEDD4L基因过表达载体的获得

上述重组质粒进行高纯度无内毒素抽提后转染293A细胞，转3染6小时后更换为ECM完全培养基，培养7-15天，每3天左右补充一次新鲜培养基，然后收集细胞和上清液置于离心管中，冻融三次，4000rpm离心10分钟，取上清即为腺病毒液初代原液。连续三代扩增，收集病毒，对其纯化和浓缩后得到高滴度的含NEDD4L基因的腺病毒浓缩液，即得所述NEDD4L基因过表达载体。进一步地，将其在293A细胞中测定并标定病毒滴度。经测定，本发明所得NEDD4L基因过表达载体中病毒滴度为10⁸~10¹⁰PFU/mL。

实施例2

本实施例考察了NEDD4L蛋白对血管内皮细胞增殖、凋亡、克隆、迁移、侵袭能力的作用。具体内容如下：

一、病毒感染细胞。实验设计NEDD4L过表达组（即实施例1中制备的NEDD4L基因过表达载体，病毒滴度为1×10¹⁰PFU/mL）、阴性对照组（不感染病毒）、正常对照组（感染不含NEDD4L基因的ADV4）。试验前一天分别接种3×10⁶~5×10⁶个目的细胞/孔[本实施例中选取的目的细胞以人气静脉内皮细胞（HUVEC细胞）为例进行说明]于6孔培养板中，所加培养基为ECM培养基、体积为2mL。进行病毒感染时细胞的融合度为60%~80%。吸去细胞上清，加入所需的培养基2mL，每组三个复孔。准备3个无菌的EP管，吸取3μL的1×10¹⁰PFU/ml的病毒（预先从-80℃取出，迅速融化，4℃低温操作）加入培养液中混匀。把细胞放回培养箱37℃孵育。直至24小时后更换为新鲜培养基。感染72小时后，观察细胞状态和荧光表达情况。

NEDD4L基因过表达载体感染血管内皮细胞（人脐静脉内皮细胞）后的细胞形态图如图2所示。由图2可知，感染后细胞状态无显著差异，90%以上的内皮细胞中有NEDD4L-GFP蛋白的表达。

二、NEDD4L基因过表达载体对血管内皮细胞mRNA的影响

提取本实施例第一部分中感染后的细胞的总RNA，通过Real-time PCR 检测目的基因的表达情况来评估感染效率。将内皮细胞用胰酶消化完毕后，离心收集细胞沉淀，用20μL PBS充分重悬细胞沉淀。加入150 μL Solution R1漩涡混匀30s裂解细胞，将EP管放入4℃离心机中，13000 rpm离心30s，吸取上清到新的EP管中；加入500 μL Solution R2上下颠倒混合均匀，倒入吸附柱中。4℃离心机13000 rpm 离心30s，倒掉废液；向吸附柱中加入500μL RNA Washing Buffer，4℃离心机13000 rpm离心15s。重复此步骤一次；将吸附柱重新放回离心机，4℃离心机13000 rpm空离心1min，将残留的乙醇彻底甩干；将吸附柱芯放入到1.5 mLNuclease Free 收集管中，向吸附柱芯中加入20 μL Nuclease Free H₂O，室温放置1min；4℃离心机13,000 rpm离心1min，洗脱液即为提取的RNA，测量RNA的浓度和纯度后进行RNA逆转录反应和荧光定量PCR进行扩增，按照如下体系进行：

1.RNA热变性

RNA热变性按照下表表7所述的反应体系进行。

表7

反应条件为42℃条件下反应2min。

2.RNA的逆转录反应

RNA的逆转录反应按照下表表8所述的反应体系进行。

表8

RNA的逆转录反应条件为37℃ 15min、85℃ 5sec。

3.荧光定量PCR反应检测NEDD4L基因的表达情况

NEDD4L和β-actin的引物序列如下表表9所示。

表9

本部分荧光定量PCR反应体系如下表表10所示。

表10

荧光定量时，反应条件为预变形：95℃ 30 sec；循环反应：95℃ 10 sec，60℃ 30sec，20个循环。根据2^{- ∆∆ Ct}计算NEDD4L在内皮细胞中的相对表达量。

血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其mNRA表达情况如图3所示。图3中，Normal：正常细胞组，Control：阴性对照组，OE-NEDD4L：NEDD4L过表达组。由图3可知，较正常组和对照组相比，NEDD4L过表达组中NEDD4L的mRNA表达水平约上调22倍。

三、NEDD4L基因过表达载体对血管内皮细胞NEDD4L蛋白表达的影响

提取本实施例一部分中感染后的内皮细胞总蛋白，进行Western blot检测NEDD4L基因的表达水平。将内皮细胞用胰酶消化完毕后，离心收集细胞沉淀；向沉淀中加入冷的裂解缓冲液100 μL（PMSF:RIPA 1:100）;将细胞悬液漩涡混匀30s，五分钟一次，共六次；4℃离心机13,000 rpm离心3min，取上清于新离心管中；使用BCA法测定蛋白浓度；加入5×loading buffer 25 μL；金属浴85℃ 5min，-20℃保存。取等量蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒压120V 90min；电泳完毕，取出凝胶进行转膜，PVDF膜用之前，用甲醇泡2min，恒流320mA 120min；转膜完毕，取出PVDF膜，置于5%脱脂奶粉中室温封闭60min；取出PVDF膜洗膜，五分钟洗六次；进行一抗、二抗结合反应（其中一抗是NEDD4L兔抗人的单克隆抗体，可以与目的蛋白进行特异性结合，二抗是HRP标记的羊抗兔的抗体，可以与一抗特异性结合，最终在ECL发光液（含有过氧化物试剂和鲁米诺增强剂等）的作用下显示出条带）；最后将发光胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其NEDD4L蛋白的表达情况如图4所示。图4中，Normal：正常细胞组，Control：阴性对照组，OE-NEDD4L：NEDD4L过表达组。

本发明中设定病毒感染时间为72h，感染结束后通过荧光观察了病毒感染的细胞状态和感染效率，确定细胞状态稳定且感染效率达90%以上，进行后续实验。由于腺病毒过表达载体转染后无法整合到基因组中建立稳转细胞系，所以细胞感染的效率对于后续结果的影响至关重要，本发明在确保感染效率的前提下，由图4可知，较正常组和对照组相比，NEDD4L过表达组在内皮细胞中NEDD4L蛋白的表达水平显著升高，约提高6.15倍。

四、CCK8法检测NEDD4L基因过表达载体对内皮细胞增殖影响

参照本实施例第一部分，设NEDD4L过表达组、阴性对照组和正常对照组。腺病毒感染后的对数期细胞按照3000 cell/well铺96孔板，每组6个重复，于第0d，1d，第2d，第3d，培养终止前3h每孔加入10 μL CCK8试剂，3h后使用酶标仪在波长450 nm检测OD值，数据统计分析细胞的增殖抑制率并绘制曲线图。

血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其细胞增殖实验检测结果如图5所示。图5中，Normal：正常细胞组，Control：阴性对照组，OE-NEDD4L：NEDD4L过表达组。

由图5可知，较正常组和对照组相比，NEDD4L过表达组内皮细胞生长受到明显抑制，细胞抑制率达80%。

五、NEDD4L基因过表达载体对内皮细胞凋亡的影响

参照本实施例第一部分，设NEDD4L过表达组、阴性对照组和正常对照组。将腺病毒感染后的对数期细胞1×10⁵个/孔铺6孔板，24h后收集细胞于5ml离心管中，每组设3个复孔。条件为细胞数量≧5×10⁶/处理。离心，4℃预冷、PBS洗1次后离心，1×binding buffer洗涤细胞沉淀一次，离心，收集细胞后加入200 μL 1×binding buffer重悬细胞。加入10 μL Annexin V-APC染色，室温避光10-15min。FACS流式细胞仪检测、数据分析、绘图。

血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其细胞凋亡实验检测结果如图6所示。图6中，阴性对照组、正常细胞组和NEDD4L过表达组的细胞凋亡率依次为5.517％±1.231％、5.723％±0.586％和31.760％±1.603％。可知，NEDD4L过表达组中内皮细胞凋亡率明显高于阴性对照组及正常细胞组，NEDD4L过表达组凋亡率约为阴性对照组及正常细胞组的6倍左右。

六、克隆形成法检测NEDD4L基因过表达载体对内皮细胞增殖能力的影响

参照本实施例第一部分，设NEDD4L过表达组、阴性对照组和正常对照组。病毒感染细胞后取对数期细胞铺6孔板，每孔加入400~1000个细胞，每孔设3个复孔。细胞继续培养至10d~14d或绝大多数单个克隆细胞数大于50为止。实验终止前荧光显微镜对克隆进行拍照，PBS洗一次。每孔加入1mL 4％多聚甲醛，固定细胞30min~60min PBS洗一次。每孔加入GIEMSA染液500 μL，染细胞20min。ddH₂O洗涤细胞，晾干，数码相机拍照，克隆技术，绘制图表。

血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其细胞克隆实验检测结果如图7所示。图7中，阴性对照组、正常细胞组和NEDD4L过表达组中细胞克隆数量依次为66.33±11.37、72.33±7.506和21.33±3.22。由此可知，NEDD4L过表达组中内皮细胞克隆数量明显低于阴性对照组及正常细胞组。

七、 Transwell迁移实验检测NEDD4L基因过表达载体对内皮细胞侵袭能力的影响

参照本实施例第一部分，设NEDD4L过表达组、阴性对照组和正常对照组。细胞无血清培养基培养24h后收集细胞，调整浓度为1×10⁶个，每Boyden小室(孔径8μm)上室加入ECM完全培养基混匀的200μL 10⁵个细胞，Boyden小室下室加入500μL的含血清完全培养基培养8h；去除下室培养基，氯化钠-酒精固定10min，苏木紫染色10min，吸弃上室培养基，棉签擦掉上室面细胞，倒置显微镜计数拍照，200×光镜选择8个视野计数，取其平均值。

血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其细胞Transwell实验检测结果如图8所示。Transwell迁移实验，其中，Normal：正常细胞组，Control：阴性对照组，OE-NEDD4L：NEDD4L过表达组。由图8结果可知，显示NEDD4L过表达组内皮细胞跨膜迁移细胞数量明显降低，跨膜迁移细胞较阴性对照组及正常细胞组，侵袭细胞数降低约3倍以上。

八、细胞划痕实验检测NEDD4L基因过表达载体对内皮细胞迁移能力的影响

参照本实施例第一部分，设NEDD4L过表达组、阴性对照组和正常对照组。将NEDD4L基因过表达腺病毒进行感染后的人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中，3个复孔/组，过夜培养后；待细胞汇合度达到90%时，使用100ul的移液器枪头在正中央位置划一条直线；利用PBS将脱落的细胞冲洗掉，24h后，在倒置显微镜下进行拍照和统计。

血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其细胞划痕实验检测结果如图9所示。图9中，Normal：正常细胞组，Control：阴性对照组，OE-NEDD4L：NEDD4L过表达组。由图9结果可知，NEDD4L过表达组较阴性对照组及正常细胞组相比迁移面积显著降低，说明NEDD4L过表达组能够有效的抑制内皮细胞的迁移能力。

九、免疫印迹和mRFP-GFP-LC3病毒感染实验检测NEDD4L基因过表达载体对内皮细胞自噬能力的影响

参照本实施例第一部分，设NEDD4L过表达组、阴性对照组和正常对照组。将NEDD4L基因过表达载体进行感染的人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中，3个复孔/组，24h后收集细胞沉淀提取蛋白，进行自噬相关蛋白免疫印迹检测；待细胞汇合度达到90%时，使用mRFP-GFP-LC3病毒，24h后，在倒置显微镜下进行拍照和统计。

血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后，其自噬相关蛋白免疫印迹检测结果如图10所示。血管内皮细胞经NEDD4L基因过表达载体诱导后感染 mRFP-GFP-LC3病毒，其细胞自噬情况如图11所示；其中，图11a为感染 mRFP-GFP-LC3病毒后显微镜成像图，图11b为自噬阳性点/细胞数占比量化图。在图10或图11中，Normal：正常细胞组，Control：阴性对照组，OE-NEDD4L：NEDD4L过表达组。

由图10中，NEDD4L过表达组能够有效地诱导自噬相关蛋白ATG5和Beclin1的表达。由图11可知，经mRFP-GFP-LC3病毒感染实验后，NEDD4L过表达组较阴性对照组及正常细胞组红色斑点代表的自噬溶酶体和黄色斑点代表的自噬体显著增加，出现明显的自噬和自噬流。

在本发明实验范围内，发现诱导NEDD4L基因的表达可以诱导内皮细胞自噬的发生，由于细胞自噬是细胞成分降解和回收利用的基础，是细胞维持稳态的主要形式，细胞自噬的发生受生理环境和条件等多重因素的影响。在不同的生理环境下NEDD4L基因可能发挥不同的作用。

实施例3

鉴于NEDD4L基因过表达载体可以抑制血管内皮细胞增殖、迁移和侵袭以及诱导细胞自噬，因此可将其开发成治疗血管内皮细胞增生性疾病的药物。

在制备的治疗血管内皮细胞增生性疾病的药物中，可以包括一定剂量的于NEDD4L基因过表达载体或包含NEDD4L基因过表达的表达产物，还可包括药学上可接受的在提货辅料。制备的治疗血管内皮细胞增生性疾病的药物的剂型无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.NEDD4L基因在制备治疗血管内皮细胞增生性相关疾病药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NEDD4L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述NEDD4L基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.如权利要求1~3任一项所述的应用，其特征在于，所述血管内皮细胞增生性相关疾病包括动脉粥样硬化、高血压、糖尿病或血管瘤。

5.一种治疗血管内皮细胞增生性相关疾病的药物，其特征在于，所述药物中包含NEDD4L基因过表达载体。

6.如权利要求5所述的治疗血管内皮细胞增生性相关疾病的药物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤三、将所述重组质粒转染人内皮细胞后扩大培养，纯化、浓缩得所述NEDD4L基因过表达载体。

7.如权利要求6所述的治疗血管内皮细胞增生性相关疾病的药物的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述腺病毒相关病毒包括腺病毒、慢病毒或腺相关病毒中的至少一种。

8.如权利要求6所述的治疗血管内皮细胞增生性相关疾病的药物的制备方法，其特征在于，步骤三中，将所述人内皮细胞包括人脐静脉内皮细胞、人胚肾细胞或人平滑肌细胞；和/或

9.如权利要求6所述的治疗血管内皮细胞增生性相关疾病的药物的制备方法，其特征在于，步骤三中，在所述人内皮细胞中对所述NEDD4L基因过表达载体中的病毒滴度进行测定。

10.如权利要求5所述的治疗血管内皮细胞增生性相关疾病的药物的应用，其特征在于，将所述药物注射于机体至少72h。