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CN119301149A - 自然杀伤细胞的嵌合抗原受体及其在免疫疗法中的用途 - Google Patents

自然杀伤细胞的嵌合抗原受体及其在免疫疗法中的用途 Download PDF

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CN119301149A
CN119301149A CN202380043773.5A CN202380043773A CN119301149A CN 119301149 A CN119301149 A CN 119301149A CN 202380043773 A CN202380043773 A CN 202380043773A CN 119301149 A CN119301149 A CN 119301149A
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CN
China
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domain
cell
signaling domain
seq
car
Prior art date
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CN202380043773.5A
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李·安德鲁·博兰·斯旺森
大卫·托马斯·罗杰斯
朱黄
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Coastal Bioscience Co
Original Assignee
Coastal Bioscience Co
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Publication date
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Abstract

提供了工程化以表达具有Toll/白介素‑1(IL‑1)受体(TIR)信号转导结构域，如Toll样受体(TLR)信号转导结构域或IL‑1受体(IL‑1R)亚家族信号转导结构域的嵌合抗原受体(CAR)的自然杀伤细胞。还提供了用于制备这些自然杀伤细胞和在用于癌症的免疫疗法中使用这些自然杀伤细胞的组合物和方法。所述CAR‑NK细胞可以是CISH‑/‑iPSC‑NK细胞。

Description

自然杀伤细胞的嵌合抗原受体及其在免疫疗法中的用途
相关申请
本发明申请主张2022年3月30日提交的美国临时专利申请No.63/325,441，以及2023年1月20日提交的美国临时专利申请No.63/440,169的权益，这些专利申请的全部内容以其全部作为参考并入本文。
序列表
本发明申请包含与本发明申请一起以XML文件格式提交的计算机可读的序列表，该序列表的全部内容以其全部作为参考并入本文。与本发明申请一起提交的序列表XML文件的标题为“14735-026-228_SEQ_LISTING.xml”，于2023年3月28日创建并且大小为347,806字节。
发明领域
本发明涉及自然杀伤(NK)细胞的嵌合抗原受体(CAR)及其在免疫疗法中的用途。具体地，本发明涉及具有包括Toll/白介素-1(IL-1)受体(TIR)信号转导结构域的胞质部分的CAR。
背景技术
NK细胞是构成先天免疫系统的主要成分的细胞毒性淋巴细胞。它们由于它们不需要事先激活来杀伤靶标的初始概念而被命名为“自然杀手”。在人中，自然杀伤细胞通常表达表面标志物CD16(FCyRIII)和CD56。NK细胞通常具有细胞毒活性。内源性NK细胞提供对病毒感染细胞的快速应答，并对转化细胞应答。细胞质中的小颗粒含有穿孔素、颗粒酶和其它生物活性分子。一旦接触靶标细胞，NK细胞释放这些颗粒。穿孔素在靶标细胞的细胞膜中形成孔，颗粒酶和相关分子可以通过该孔进入并起作用以诱导靶标细胞的凋亡。
与适应性淋巴样细胞(T细胞和B细胞)和骨髓细胞(如巨噬细胞)相反，NK细胞被认为是先天性淋巴样细胞。与特异性检测由感染细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的来自病原体的肽的T细胞不同，无论MHC分子上是否存在来自病原体的肽，NK细胞都能识别应激细胞。相反，NK细胞的细胞表面上识别其它生物分子的受体控制NK细胞的激活。
可以通过已知方法，从干细胞，如诱导的多潜能干细胞制备人工NK细胞，所述方法如Zhu和Kaufman.，Methods Mol Biol.2048：107-119(2019)中所述的那些。在编码含细胞因子可诱导的SH2蛋白(CISH)的基因中具有失活突变的NK细胞是特别关心的。这些突变包括(但不限于)替换、插入和/或缺失。CISH是IL-15信号转导的重要负调节因子。如US 2021/0145883 A1中所述，CISH基因在诱导的多潜能干细胞(iPSC)中失活，随后iPSC分化为自然杀伤(NK)细胞，这导致工程化的NK细胞相对于其中CISH未失活的NK细胞具有提高的持久性和效力。CISH的失活也被认为能够在癌症疗法中增强T细胞的细胞毒性。
通过工程化NK细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)，可以将NK细胞的先天性靶向能力重定向至所选的细胞群体。嵌合抗原受体具有胞外部分，其包括设计以特异性结合靶标抗原的配体结合结构域；跨膜结构域；和包含一个或多个信号转导结构域的胞质部分。CAR的胞质部分的多种结构是已知的。第一代CAR仅含有T细胞受体ζ链的信号转导结构域，称为CD3ζ结构域。之后几代CAR引入了来自共刺激分子的结构域，特别是分化簇28(CD28)和41BB(也称为CD137)的信号转导结构域。
本领域仍需要用于工程化自然杀伤(NK)细胞的嵌合抗原受体及其用途。本发明解决了该需求。
发明内容
提供了用于工程化自然杀伤(NK)细胞的嵌合抗原受体及其用途。在一个方面，本公开提供了具有胞质部分的嵌合抗原受体(CAR)，所述胞质部分包括Toll/白介素-1(IL-1)受体(TIR)信号转导结构域。
在一个方面，本公开提供了具有胞质部分的CAR，所述胞质部分包括Toll样受体(TLR)信号转导结构域。如本文所使用的，术语“TLR信号转导结构域”是指TLR受体的TIR结构域或其功能性变体。TLR信号转导结构域可以是TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLR10信号转导结构域，优选地TLR2信号转导结构域。
因此，CAR的胞质部分可以包含具有选自SEQ ID NO：1-10的多肽序列的信号转导结构域，或其功能性变体。所述信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：1-10中的任一项具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
在另一个方面，本公开提供了具有胞质部分的CAR，所述胞质部分包括白介素-1受体(IL-1R)亚家族信号转导结构域。如本文所使用的，术语“IL-1R亚家族信号转导结构域”是指IL-1R受体亚家族成员的TIR结构域或其功能性变体。IL-1R亚家族信号转导结构域可以是IL-1R信号转导结构域或白介素18受体(IL-18R)信号转导结构域。
因此，CAR的胞质部分可以包含具有选自SEQ ID NO：11或12的多肽序列的信号转导结构域，或其功能性变体。所述信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：21-22中的任一项具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
在另一个方面，本公开提供了具有胞质部分的CAR，所述胞质部分包括TIR信号转导结构域和CD3ζ结构域(在本文中也称为“CD3-ζ”)-优选地，位于CAR的C末端的CD3ζ结构域。本文所公开的CAR还可以包含一个或多个其它信号转导结构域。在变化形式中，CAR的胞质部分可以包含2B4信号转导结构域或OX40信号转导结构域。然而，在其它变化形式中，CAR的胞质部分缺少2B4信号转导结构域，缺少OX40信号转导结构域，或缺少2B4和OX40信号转导结构域两者。
本文所公开的CAR还包含跨膜结构域。多种适合的跨膜结构域是本领域中是已知的。在变化形式中，跨膜结构域可以是CD8α链(CD8α)、CD28、CD16、NKp44、NKp46、TLR、IL-1R亚家族的跨膜结构域，或其功能性变体。跨膜结构域可以是具有多肽序列NLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFP(SEQ ID NO：41)的人工跨膜结构域(称为“aTM”)，或具有1、2、3、4、5或更多个替换的变体。
在多个实施方式中，本公开提供了工程化以表达这些CAR的自然杀伤(NK)细胞、编码这些CAR的核酸、用于将这些核酸递送至细胞的载体、包含这些核酸的干细胞、治疗性组合物、试剂盒、制造方法和治疗方法。
在一些实施方式中，本公开提供了自然杀伤细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含胞外部分、跨膜结构域和胞质部分，其中所述胞质部分包含Toll/白介素-1(IL-1)受体(TIR)信号转导结构域，胞外蛋白包含配体结合结构域。在某些实施方式中，配体结合结构域特异性结合CD19抗原、CD20抗原、Her2抗原或BCMA抗原。
另一方面，本文提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外部分、跨膜结构域和胞质部分，其中所述胞质部分包含Toll/白介素-1(IL-1)受体(TIR)信号转导结构域。在一些实施方式中，TIR信号转导结构域是Toll样受体(TLR)信号转导结构域。在一些实施方式中，TLR信号转导结构域是TLR2信号转导结构域或其功能性变体。在一些实施方式中，TLR信号转导结构域具有与SEQ ID NO：2具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％，至少90％，至少95％或100％的同一性的多肽序列。在一些实施方式中，胞质部分包含CD3ζ信号转导结构域。在一些实施方式中，胞质部分包含2B4信号转导结构域。在一些实施方式中，胞质部分缺少2B4信号转导结构域。在一些实施方式中，胞质部分以N末端至C末端的顺序基本上由2B4信号转导结构域、IL-18R信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域组成。在一些实施方式中，胞质部分以N末端至C末端的顺序基本上由2B4信号转导结构域、CD3ζ信号转导结构域和TLR2信号转导结构域组成。在一些实施方式中，胞质部分以N末端至C末端的顺序基本上由2B4信号转导结构域、TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域组成。
在一些实施方式中，胞外蛋白包含配体结合结构域。在一些实施方式中，配体结合结构域包含抗体样结构域。在一些实施方式中，配体结合结构域包含可变重链(VH)结构域和/或可变轻链(VL)结构域。在一些实施方式中，配体结合结构域包含单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，配体结合结构域特异性结合CD19抗原、CD20抗原、Her2抗原或BCMA抗原。
在一些实施方式中，(i)胞外结构域包含来源于CD19配体结合结构域、CD20配体结合结构域、BCMA结合结构域或HER2结合结构域的多肽；(ii)跨膜结构域是选自aTM、CD8α链(CD8α)、CD28、CD16、NKp44、NKp46、NKG2、DNAM1、IL-2Rβ、TLR和IL-1R亚家族的跨膜结构域；和(iii)胞质结构域包含TLR2、41BB或2B4的信号转导结构域。
在一些实施方式中，胞质结构域还包含CD3ζ的信号转导结构域。在一些实施方式中，CAR包含(i)aTM跨膜结构域、TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域；或(ii)CD28跨膜结构域、TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域。
在一些实施方式中，胞外结构域的C末端在没有接头的情况下可操作性地连接至跨膜结构域的N末端或C末端。在一些实施方式中，胞外结构域的C末端通过接头或铰链结构域可操作性地连接至跨膜结构域的N末端或C末端。
在一些实施方式中，铰链结构域是CD8a铰链。在一些实施方式中，CD8a铰链包含SEQ ID NO：158中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，跨膜结构域的N末端或C末端在使用或不使用接头的情况下可操作性地连接至胞质结构域的N末端。在一些实施方式中，跨膜结构域通过Gly-Ser接头可操作性地连接至胞质结构域。
在另一个方面，本文提供了包含编码本公开的嵌合抗原受体的核苷酸序列的多核苷酸。
在另一个方面，本文提供了包含免疫细胞的细胞群体，所述免疫细胞包含本公开的嵌合受体或本公开的多核苷酸。在一些实施方式中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，NK细胞是诱导的多潜能干细胞-来源的自然杀伤(iPSC-NK)细胞。在一些实施方式中，免疫细胞在含细胞因子可诱导的SH2的蛋白(CISH)基因中包含纯合失活突变。在一些实施方式中，免疫细胞是CISH-/-。
在另一个方面，本文提供了包含本公开的细胞群体的药物组合物。
在另一个方面，本文提供了一种杀伤靶标细胞的方法，其包括将靶标细胞群体与本公开的细胞群体或本公开的药物组合物接触，其中CAR的配体结合结构域特异性结合靶标细胞上的抗原，并且其中细胞诱导靶标细胞的特异性杀伤。
在另一个方面，本文提供了一种治疗对其有需要的受试者中癌症的方法，其包括向所述受试者施用本公开的药物组合物。
本发明的优势可以包括(但不限于)与本领域中已知的CAR相比，所公开的CAR在NK细胞或相关细胞类型中活性的升高。
通过以下描述和附图，本发明的其它方面和优势将变得显而易见。
附图说明
本专利或专利申请包含至少一副彩色附图。通过请求和支付必要的费用，专利局将提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开的拷贝。
图1A显示了编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸序列的图示，其中标记了CAR部分。包括前导序列以促进膜整合。
图1B显示了切割N末端前导序列后嵌合抗原受体(CAR)的多肽序列的图示，其中标记了CAR部分。
图2A显示了具有一般配体结合结构域和具体说明的铰链(CD8α)和信号转导结构域(TLR2和CD3ζ)的CAR的实施方式的图示。
图2B显示了具有一般配体结合结构域和具体说明的铰链(CD8α)和信号转导结构域(2B4、TLR2和CD3ζ)的CAR的实施方式的图示。
图3显示了CAR在细胞膜中的图示。
图4显示了具有具体说明的铰链(CD8α)和信号转导结构域(TLR2和CD3ζ)的CAR在细胞膜中的实施方式的图示。
图5A显示了由TIR信号转导结构域的多肽序列比对所产生的TIR信号转导结构域的最近邻域连接系统发生树。
图5B显示了由TLR信号转导结构域的多肽序列比对所产生的TLR信号转导结构域的最近邻域连接系统发生树。
图6显示了TLR1(SEQ ID NO：1)、TLR2(SEQ ID NO：2)、TLR4(SEQ ID NO：4)、TLR6(SEQ ID NO：6)和TLR10(SEQ ID NO：10)的信号转导结构域的多重序列比对。
图7显示了TLR信号转导结构域的成对序列同一性的表。
图8显示了分成CAR组分(SEQ ID NO：37、38、41、2和63)的CAR(SEQ ID NO：100)的实施方式的序列。
图9显示了单个CAR构建体在iPSC-NK细胞中的表达。流式细胞术数据柱状图显示了成熟的iPSC来源的NK细胞中的CAR表达。使用工程化至CAR的胞外部分中的HA-标签和抗HA抗体(APC)检测CAR表达。
图10显示了CAR表达数据的柱状图。显示iPSC来源的NK细胞中CAR表达频率的柱状图。虚线表示所有构建体间的平均CAR表达。
图11显示了长期杀伤测定：折线图显示了使用eSight阻抗测定，对CD19+ Raji靶标细胞的NK特异性杀伤的频率。将数据归一化至单独的靶标细胞(无NK细胞)，其由水平虚线表示。50％NK细胞杀伤表示在该时间点，培养物中的活细胞数量是未处理(无NK细胞)对照的一半。箭头指向具有TLR2信号转导结构域和CD3ζ胞质结构域(“TLR2-ζ”)的CAR的曲线。
图12显示了4hr半胱天冬氨酸酶3/7细胞毒性测定：柱状图显示了共培养4hr后CD19+ SupB15靶标细胞的NK特异性杀伤。虚线表示参考CAR(“2B4-ξ”)的特异性杀伤。箭头指向具有TLR2信号转导结构域和CD3ζ胞质结构域(“TLR2-ζ”)的CAR的曲线。
图13A显示了以三种不同顺序具有TLR2信号转导结构域、任选地2B4信号转导结构域和CD3ζ胞质结构域的CAR的实施方式的图示。
图13B显示了图13A中所示的3种构建体的长期杀伤测定：折线图显示了使用eSight阻抗测定，对CD19+ Raji靶标细胞的NK特异性杀伤的频率。
图13C显示了图13A中所示的3种构建体的4hr半胱天冬氨酸酶3/7细胞毒性测定。
图14A显示了CAR表达数据的柱状图，其显示了在CISH敲除(KO)iPSC来源的NK细胞的慢病毒转导后的CAR表达频率，如通过重组HER2所检测的。
图14B显示了图14A中所参考的CAR构建体的24小时杀伤测定：折线图显示了使用eSight阻抗测定，对HER2+靶标细胞的NK特异性杀伤的频率。
图14C显示了柱状图，其显示了HER2+靶标细胞和表达图14A中参考的CAR构建体的CISH KO iPSC来源的NK细胞共培养后，细胞因子IFN-γ和TNF-α的释放。
图14D显示了柱状图，其显示了在暴露于表达图14A中所参考的CAR构建体的CISHKO iPSC来源的NK细胞24小时后，单层中NK细胞耐受的实体瘤HER2+靶标细胞(2：1E：T)的CISH KO iPSC来源的NK杀伤。
图15A显示了表达3种不同CAR构建体的CISH KO iPSC来源的NK细胞的应激测试杀伤测定，使用eSight阻抗测定，所述构建体中的每一个包含针对HER2+靶标细胞的相同的HER2结合结构域。
图15B显示了使用eSight阻抗测定，表达相同CAR构建体和针对HER2+靶标细胞的3种不同的HER2结合结构域的CISH KO iPSC来源的NK细胞的应激测试杀伤测定。
图16A显示了显示半胱天冬氨酸酶3/7细胞毒性测定的折线图，该图显示了在与表达相同CAR构建体和3种不同的HER2结合结构域的iPSC来源的NK细胞共培养4小时后，HER2+靶标细胞的NK杀伤。
图16B显示了在NK细胞和NK细胞耐受的实体瘤靶标(2：1E：T)共培养30小时后，HER2+靶标细胞杀伤和半胱天冬氨酸酶3/7激活的代表性图。
图17显示了用未转导的iPSC来源的NK细胞(无CAR表达)和表达相同CAR构建体和3种不同的HER2结合结构域的iPSC来源的NK细胞处理18小时和36小时后的HER2+3D肿瘤球状体的代表性图。
图18显示了使用eSight阻抗测定，通过表达具有HER2结合结构域的CAR或不表达CAR(UT)的iPSC来源的NK细胞对HER2+靶标细胞的连续杀伤测定。
图19显示了用NK细胞(“UT”)和表达具有HER2结合结构域的CAR的NK细胞处理的第0天和第3天时的HER2+3D肿瘤球状体的代表性图像。
图20显示了根据本公开的三重编辑的(“TE”)iPSC细胞的图示。
图21显示了流式细胞数据的代表性柱状图，该图显示了野生型(WT)NK细胞、CISHKO iPSC来源的NK细胞和三重编辑的(“TE”)iPSC来源的NK细胞中CAR和NK标志物的表达。
图22A显示了HER2+3D肿瘤球状体中的长期杀伤测定，其显示了WT NK细胞、CISHKO iPSC来源的NK细胞和三重编辑的(“TE”)iPSC来源的NK细胞对HER2+靶标细胞的NK杀伤频率。
图22B显示了与WT NK细胞、CISH KO iPSC来源的NK细胞和三重编辑的(“TE”)iPSC来源的NK细胞共培养第0天和第3天后，HER2+3D肿瘤球状体的代表性图。
图23A和图23B显示了sIL-15与HER2-CAR构建体共表达对NK细胞杀伤HER+乳腺癌细胞系BT474的协同作用。与表达抗-CD20 CAR的细胞进行比较。图23A中显示了具有或不具有sIL-15的CAR表达，并且图23B显示了具有或不具有sIL-15时，NK细胞对BT474克隆5的杀伤。
发明的详细说明
本发明涉及自然杀伤(NK)细胞的嵌合抗原受体(CAR)及其在免疫疗法中的用途。在一些变化形式中，本发明涉及具有包括Toll/白介素-1(IL-1)受体(TIR)信号转导结构域的胞质部分的CAR。
在多个实施方式中，本公开提供了工程化以表达所公开的CAR的自然杀伤(NK)细胞、编码这些CAR的核酸、用于将这些核酸递送至细胞的载体、包含这些核酸的干细胞、治疗性组合物、试剂盒、制造方法和治疗方法。如图1A-1B所示，本公开的CAR可以是由单个多核苷酸序列所编码的单个多肽。所述CAR可以具有常规组分布置，如图1A所示。在CAR作为多肽表达后，从CAR切割前导肽，如图1B所示。
图2A和图2B中显示了CAR的说明性实施方式。CAR的胞质部分可以具有单个TIR信号转导结构域，如图2A中所示的TLR2信号转导结构域。在该实施方式中，CAR还具有CD3ζ信号转导结构域。这种CAR可以缺少其它信号转导结构域。图2B显示了具有2B4信号转导结构域的实施方式。
图3显示了CAR多肽在细胞膜中的表达。将配体结合结构域显示为单链可变结构域(scFv)，尽管可以使用其它配体结合结构域。图4显示了其中CAR的胞质部分具有单个TIR信号转导结构域(显示为TLR2信号转导结构域)和CD3ζ信号转导结构域的CAR的实施方式。
在内源性受体中，TIR信号转导结构域具有共有的功能属性。然而，它们在序列水平上是不同的。图5A显示了系统发生树以显示TIR信号转导结构域之间的序列差异及其聚类成组。图5B中仅显示了TLR信号转导结构域的类似的系统发育树。图6显示了所选的TLR信号转导结构域：TLR1、TLR2、TLR4、TLR6和TLR10的序列比对。可以使用这些比对来产生TLR信号转导结构域的功能性变体，以选择可以改变的残基和应被保留的保守残基以促进结构域的折叠和功能。
图7显示了TLR信号转导结构域的成对序列比较。除了少数例外，TLR信号转导结构域之间的序列同一性通常小于55％。例如，TLR2和TLR4信号转导结构域之间的序列同一性是41％。
图8显示了CAR的实施方式的多肽序列。在该实施方式中，CAR包含对CD19特异的配体结合结构域。然而，如以下详细描述的，可以使用其它配体结合结构域。此外，本公开考虑改变每种所示组分。如所公开的，对该实施方式进行了多种改变。
自然杀伤细胞
在一个方面，本公开提供了工程化以表达所公开的CAR的自然杀伤(NK)细胞。NK细胞可以是原代NK细胞。可以使用熟知的方法从脐带血或周围血液中分离原代NK细胞。可以使用病毒载体、非病毒载体或电穿孔将编码CAR的多核苷酸引入原代NK细胞。作为另外一种选择，NK细胞可以是诱导的多潜能干细胞(iPSC)来源的NK细胞或人胚胎干细胞(hESC)来源的NK细胞。制备iPSC-NK细胞的方法可以通过使用已知方法分化iPSC来获得。在一种变化形式中，使用拟胚体制备iPSC-NK细胞。示例性的方法提供于US 2013/0287751 A1和Zhu等人Methods Mol.Biol.2048：107-119(2019)。在另一种变化形式中，使用单细胞分化制备hESC-NK细胞，如(例如)Woll等人Blood 113：6094-6101(2009)中所述。在其它变化形式中，通过分化单个细胞制备iPSC-NK细胞。示例性的方法提供于US 2021/0024891 A1和US2016/0097035 A1。可以通过测量表面标志物表达对hESC-/iPSC-来源的NK细胞进行表型分析，所述表面标志物如CD16、NKG2D、NKp44、NKp46、TRAIL、FasL或其组合。可以评价hESC-/iPSC来源的NK细胞的杀伤活性。评价向NK细胞的分化的功能测定包括肿瘤细胞的直接溶胞活性(如K562细胞的杀伤)、半胱天冬氨酸酶-3/7流式细胞术测定、细胞毒性颗粒的免疫学测定或者细胞因子释放，或者抗肿瘤活性体内异种移植模型。参见，例如，Woll等人Blood113：6094-6101(2009)；Hermanson等人in Hematopoietic differenttiation of humanpluripotent stem cells.69-19(2015)。
在一些实施方式中，NK细胞是CD45+/CD56+双阳性的。在一些实施方式中，免疫细胞是CD45+。在一些实施方式中，免疫细胞是CD56+。在一些实施方式中，免疫细胞是CD45+、CD56+或CD45+/CD56+。制备和使用工程化细胞的其它示例性方法提供于美国专利申请公开No.US 2018/0298101 A1、US 2021/0230548 A1和US 2021/0145883 A1；和国际专利申请公开No.WO 2018/075664 A1(对应于美国专利申请No.17/481,404)和WO 2020/113029 A2(对应于美国专利申请No.17/309,408)，以上专利的公开内容以其全部作为参考并入本文。
本公开的细胞群体可以是纯化的细胞群体。如本文所使用的，含有“纯化的细胞群体”或“纯化的细胞组合物”的组合物表示所述组合物中至少30％、50％、60％，通常至少70％，并且更优选地80％、90％、95％、98％、99％或更多的细胞具有类似地鉴别的细胞表型。
所述细胞群体可以是分离的细胞群体。如本文所使用的，术语“分离的”表示基本上或本质上不含在其天然状态下通常伴随它的组分的材料。在具体的实施方式中，术语“获得的”或“来源的”与分离的同义使用。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分的解释，如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M J.Gait主编，1984)；Methods in Molecular Biology，Humana Press；Cell Biology：A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis主编，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney主编，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather andP.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle.J.B.Griffiths，and D.G.Newell主编，1993-1998)J.Wiley and Sons；Methodsin Enzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and CC.Blackwell主编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos主编，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel el al.主编，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人主编，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan e1al.主编，1991)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley and Sons，1999)；Immunobiology(C A.Janewayand P.Travers.1997)；Antibodies(P.Finch.1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.主编，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd and C.Dean主编，Oxford University Press.2000)；Using antibodies：alaboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra主编，Harwood Academic Publishers，1995)；和Cancer：Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人主编，J.B.Lippincott Company，1993)。
编码CAR的多核苷酸的引入可以通过用病毒载体，如慢病毒载体转导NK细胞或iPSC或hESC前体来实现。适合的慢病毒载体在本领域中是已知的，并且描述于(例如)Zufferey等人，(1997)；Dull等人，(1998)；US6013516A和US5994136A。在一些变化形式中，可以将非病毒载体，如脂质纳米颗粒、转染试剂或电穿孔用于将多核苷酸引入细胞。
在一个方面，本公开提供了包含如本文所描述的嵌合抗原受体和/或编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸的细胞。所述细胞可以是干细胞或祖细胞。在一些实施方式中，所述细胞是诱导的多潜能干细胞(iPSC)。在一些实施方式中，所述细胞是iPSC-来源的NK细胞。
在一些实施方式中，所述细胞在所述细胞的含细胞因子可诱导的SH2的蛋白(CISH)基因中包含纯合失活突变(例如，CISH-/-)。在一些实施方式中，所述细胞包含编码可溶性IL-15或膜结合的IL-15的基因的表达和/或过表达。
嵌合抗原受体
提供了用于工程化的自然杀伤(NK)细胞的嵌合抗原受体及其用途。在一个方面，本公开提供了具有胞质部分的嵌合抗原受体(CAR)，所述胞质部分包括Toll样/白介素-1(IL-1)受体(TIR)信号转导结构域。
Toll样受体信号转导结构域
已知NK细胞表达模式识别受体(PRR)，其识别感染细胞上的病原体相关分子模式(PAMP)，包括Toll样受体(TLR)。Noh等人(2020)J.Immunol.Res.2020：204860。
Toll/白介素-1(IL-1)受体(TIR)家族被定义为具有含有结构上同源的信号转导结构域(称为TIR结构域)的胞质部分。TIR结构域存在于Toll样受体(TLR)以及两种白介素受体，白介素-1受体(IL1R)和白介素-18受体(IL18)中，它们尽管被归类为白介素受体，但参与与TLR的那些类似的信号转导通路。因此，根据它们的胞外结构域的特异性所定义的，TIR家族被认为是两个亚家族：(i)Toll样受体(TLR)亚家族和(ii)IL-1受体(IL-1R)亚家族。
对胞外信号应答，两种TLR都可以形成二聚体受体复合物，其招募辅助蛋白。Martin等人(2002)Biochimica et Biophysica Acta 1592：265-280。人具有10种TLR，TLR1-TLR10。通过TLR的信号转导不同地取决于异源二聚化或同源二聚化。已知TLR4通过同源二聚化发出信号。TLR2信号转导是由TLR1或TLR6的异源二聚化触发的。已知与TLR4不同，TLR2不作为同源二聚体发出信号。Zhang等人(2002)FEBS Lett.532：171。
在一个方面，本公开提供了具有胞质部分的CAR，所述胞质部分包括Toll样受体(TLR)信号转导结构域。如本文所使用的，术语“TLR信号转导结构域”是指TLR受体的TIR结构域或其功能性变体。TLR信号转导结构域可以是TLR1、TLR2、TLR3、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLR10信号转导结构域，优选地TLR2信号转导结构域。
因此，CAR的胞质部分可以包含具有选自SEQ ID NO：1-10的多肽序列的信号转导结构域，或其功能性变体。所述信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：1-10中的任一项具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
当含有Toll/白介素-1(IL-1)受体(TIR)结构域的受体被激活时，TIR结构域触发保守细胞信号转导途径，通过招募包括含有TIR结构域的胞质衔接蛋白在内的胞质信号转导分子来控制细胞功能。TIR信号转导结构域通常被鉴定为包含3个保守区(例如，盒1基序：(F/Y)DA或FADFISY(SEQ ID NO：136)、盒2基序：RDXXPG(SEQ ID NO：137)或GYKLC-RD-PG(SEQ ID NO：138)和盒3基序：FW或与碱性残基相邻的保守W)负责介导Toll样受体(TLR)和信号转导组分之间的蛋白-蛋白相互作用(Slack等人，2000)。每个TIR信号转导结构域包含5个链平行β-折叠(A-至-E)和6个具有各自连接环结构的周围α-螺旋(A-至-E)(Bovijen等人，2013)。保守残基位于疏水核心中，并且大的插入和缺失可以存在于不同TIR信号转导结构域的多个环区中。例如，据信包含信号转导结构域的“BB环”区的盒2基序中的差异在TIR-TIR相互作用的特异性中起作用(Xu等人，2000；Poltorak等人，1998)。已在人中鉴别了约20种具有TIR结构域的受体，包括Toll样受体(TLR)和白介素-1受体(IL-1R)。TIR信号转导结构域的一般结构包含核心序列内的保守残基，其范围为约125至约200个氨基酸残基，然而，这些结构域之间的序列保守性可以低至仅20-30％。TIR结构域之间的外部残基变化很大，这导致静电势的差异分布和所产生的信号功能(Dunne等人2003)。TIR信号转导结构域之间的序列变化可以包括在一个或多个α-螺旋、β-折叠、环或盒基序中的插入、缺失和/或突变。
在一些实施方式中，TIR信号转导结构域是Toll样受体(TLR)信号转导结构域。人Toll样受体(TLR 1-10)是分别识别独特配体的单次跨膜蛋白，其通过TIR信号转导结构域(Xu等人，2000；Horng等人，2002；Brown等人，2006)激活胞内信号转导(Armant，M andFenton，M，2002)。TLR 1、2、4、5、6和10存在于质膜中并且识别胞外病原体相关分子模式(PAMP)。TLR 3、7、8和9位于胞内的内涵体中，其识别内化的PAMP(Akira等人，2006；Kawai，T.and Akira，S.，2007)。TLR经历了同源或异源二聚化，这起始了它们的激活(Gay，N.andGangloff，M.，2007)。信号级联之后是TLR信号转导，其经由存在于胞质信号转导结构域和TLR衔接蛋白两者中的保守的胞质TIR结构域，如骨髓分化因子88(MyD88)、MyD88衔接蛋白样蛋白(MAL/TIRAP)、TRIF相关衔接蛋白分子(TRAM/TICAM2)、含TIR结构域的衔接蛋白诱导干扰素-β(TRIF/TICAM1)和含无菌α-和犰狳基序的蛋白(SARM)(O'Neill，L.and Bowie，A.2007)。MyD88依赖性通路将MyD88信号传递至白介素-1受体相关激酶(IRAK)4的磷酸化，然后传递至IRAK1和IRAK2(Lin等人，2010)。MyD88和TRIF与激酶TRAM和MAL相互作用(Yamamoto等人，2003；Yamamoto等人，2002)。TRAM和TIRAP通路将MyD88和TRIF招募至它们各自的TLR。除TLR3之外，所有TLR均激活MyD88依赖性通路(Horng等人，2002；Kawai andAkira，2010)。TRIF依赖性通路通过下游激酶(TANK结合激酶1(TBK1)和IKKε)发出信号，以激活IRF3并随后产生1型干扰素(Yamamoto等人，2002b；Oshiumi等人，2003)。SARM通路作为TRIF依赖性Toll样受体信号转导的负调节因子起作用(Carty等人2006)。
TLR信号转导结构域可以是TLR2信号转导结构域或其功能性变体。TLR2信号转导结构域来源于Toll样受体2(TLR2)，一种在用配体刺激之前与TLR1、TLR6或TLR10相互作用的TLR(Jin等人，2007；Toshchakov，V.and Neuwald，A.，2020)。异源二聚体的形成有助于与胞内TIR结构域的相互作用以促进信号起始。TLR2经由MYD88和TRAF6起作用，从而导致转录因子NF-KB的激活、细胞因子分泌和炎症反应；并且还可以响应脂蛋白的脂质部分而促进细胞凋亡(Brightbill等人，1999；Aliprantis等人，1999)。TLR2信号转导结构域可以包含人TLR2(SEQ ID NO：26)的残基639-782(144个aa)或其功能性变体
TLR2的TIR信号转导结构域可以包含多肽序列：
或其功能性变体。在一些实施方式中，TLR2的TIR信号转导结构域由SEQ ID NO：180中所示的核苷酸序列所编码。在一些实施方式中，TLR2的TIR信号转导结构域由与SEQ ID NO：180具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核苷酸序列所编码。
TLR信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：2具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。可以保留TLR2信号转导结构域的功能性变体和/或一些或全部保守残基。功能性变体可以包括N至C末端的截断、插入和/或突变。功能性变体可以包含使用TLR2信号转导通路足以促进信号传播的多肽序列。TLR2TIR信号转导结构域的保守残基可以包含残基698-707(Toshchakov，V.and Neuwald，A.，2020)。TLR2TIR的其它保守残基可以包含P681、K709、K714、KK742-743、K751、K754、S636、R677、Y715和/或R753(Xu等人，2000；Mckelvey等人，2016；Ben-Ali等人，2011；Kang等人，2001；Bochud等人，2003；Georgel等人2009)。
TLR信号转导结构域可以是TLR8信号转导结构域或其功能性变体。TLR8信号转导结构域来源于Toll样受体8(TLR8)，它是一类作为内体、核酸传感TLR起作用的TLR，所述TLR能够经由同型相互作用在含TIR的下游衔接蛋白MYD88的招募中经历二聚化(Tanji等人，2013；Tanji等人，2015)。通过激活NF-K-B的IRAK4、IRAK1、TRAF6、TRAF3和诱导促炎细胞因子和干扰素的IRF7产生通过Mydd小体(Myddosome)的所产生的信号传播(Qin等人2006；Doyle等人2007；Zhang等人，2018)。TLR8信号转导结构域可以包含人TLR8的残基878-1022(SEQ ID NO：32)。TLR8的TIR信号转导结构域可以包含多肽序列：
或其功能性变体。在一些实施方式中，TLR8的TIR信号转导结构域由SEQ ID NO：188中所示的核苷酸序列所编码。在一些实施方式中，TLR8的TIR信号转导结构域由与SEQ ID NO：188具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核苷酸序列所编码。
TLR信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：8具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。可以保留TLR8信号转导结构域的功能性变体和/或一些或全部保守残基。功能性变体可以包括N至C末端的截断、插入和/或突变。功能性变体可以包含使用TLR8信号转导通路足以促进信号传播的多肽序列。TLR8TIR信号转导结构域的保守残基可以包含BB环的N末端一半中的保守模式，-E9E9R9D9W9xP9G9-，其中谷氨酸和色氨酸残基仍然存在；β-折叠A的C末端的D9；和/或α-螺旋C和α-螺旋D内的保守残基(Toshchakov，V.and Neuwald，A.，2020)。
在一些实施方式中，TLR信号转导结构域是TLR3信号转导结构域或其功能性变体。TLR3信号转导结构域来源于Toll样受体3(TLR3)，它是经历二聚化的核内体核酸传感TLR，其中配体结合导致与TRIF/TICAM1衔接蛋白的相互作用，从而导致激活NF-κ-B、IRF3核易位、细胞因子分泌和炎症应答(Oshiumi等人，2003)。TLR3信号转导结构域可以包含人TLR3(SEQ ID NO：27)的残基754-897或其功能性变体。TLR3的TIR信号转导结构域可以包含多肽序列：
或其功能性变体。在一些实施方式中，TLR3的TIR信号转导结构域由SEQ ID NO：183所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，TLR3的TIR信号转导结构域由与SEQ ID NO：183具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
TLR信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：3具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。可以保留TLR3信号转导结构域的功能性变体和/或一些或全部保守残基。功能性变体可以包括N至C末端的截断、插入和/或突变。功能性变体可以包含使用TLR3信号转导通路足以促进信号传播的多肽序列。TLR3TIR信号转导结构域的保守残基可以包含N759、Y858、R867和/或M870(Sakar等人，2007；Hu等人，2015；Zhang等人，2020)。
在一些实施方式中，TLR信号转导结构域是TLR7信号转导结构域或其功能性变体。TLR7信号转导结构域来源于Toll样受体7(TLR7)，它是能够应答含尿嘧啶核苷的单链RNA或鸟苷类似物的核内体受体(Davenne等人，2020；Lee等人，2003)。与激动剂的结合导致二聚化，其使得能够经由同型相互作用对含TIR的衔接蛋白MYD88进行招募(Zhang等人，2016)。Mydd小体信号转导复合物与IRAK4、IRAK1、TRAF6和TRAF3相互作用，从而产生NF-κ-B和IRF7的激活以诱导细胞因子和干扰素(zhang等人2016)。TLR7信号转导结构域可以包含人TLR7(SEQ ID NO：31)的残基889-1033(145个aa)。TLR7的TIR信号转导结构域可以包含多肽序列：
或其功能性变体。在一些实施方式中，TLR7的TIR信号转导结构域由SEQ ID NO：187所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，TLR7的TIR信号转导结构域由与SEQ ID NO：187具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
TLR信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：7具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。可以保留TLR7信号转导结构域的功能性变体和/或一些或全部保守残基。功能性变体可以包括N至C末端的截断、插入和/或突变。功能性变体可以包含使用TLR7信号转导通路足以促进信号传播的多肽序列。TLR7TIR信号转导结构域的保守残基可以包含BB环的N末端一半中>90％的保守模式，-E9E9R9D9W9xP9G9-，其中谷氨酸和色氨酸残基仍然存在；β-折叠A的C末端的D9；和/或α-螺旋C和α-螺旋D内的保守残基(Toshchakov，V.and Neuwald，A.，2020)。
TLR信号转导结构域可以是TLR4信号转导结构域或其功能性变体。TLR4信号转导结构域来源于Toll样受体4(TLR4)，它是一类经由均二聚化，经由与K96和CD14的相互作用起作用以起始对脂多糖(LPS)的应答的TLR(Tatematsu等人，2016)。TLR4与MYD88、TIRAP和TRAF6相互作用，从而导致NF-K-B的激活、细胞因子分泌和炎症反应(Medzhitov等人，1997；Arbour等人，2000；Tatematsu等人，2016)。TLR4还可以经由独立于LPS的应答起作用，其中通过游离脂肪酸和Ni(2+)引发激活，这是非保守且种特异性的(Marc等人，2010)。TLR4信号转导结构域可以包含人TLR4(SEQ ID NO：28)的残基672-815(144个aa)或其功能性变体。TLR4的TIR信号转导结构域可以包含多肽序列：
或其功能性变体。在一些实施方式中，TLR4的TIR信号转导结构域由SEQ ID NO：184所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，TLR4的TIR信号转导结构域由与SEQ ID NO：184具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
TLR信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：4具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。可以保留TLR4信号转导结构域的功能性变体和/或一些或全部保守残基。功能性变体可以包括N至C末端的截断、插入和/或突变。功能性变体可以包含使用TLR4信号转导通路足以促进信号传播的多肽序列。TLR4TIR信号转导结构域的变化形式可以包含R763H和/或Q834H(Smirnova等人，2001)。TLR4TIR信号转导结构域的保守残基可以包含α-螺旋C上的C747；WXC747XXE基序的存在；和/或BB环的P712(shirey等人2020；Poltorak等人，1998)。TLR4TIR的其它保守残基可以包含BB环和α-螺旋E之间的残基(Toshchakov等人，2011)。
TLR信号转导结构域可以是TLR1信号转导结构域或其功能性变体。TLR1信号转导结构域来源于Toll样受体1(TLR1)，它是一类与TLR2相互作用以调节由特定脂肽的存在所刺激的免疫应答的TLR(Lancioni等人，2011)。TLR1信号转导结构域可以包含人TLR1(SEQID NO：25)的残基635-776(142个aa)或其功能性变体
TLR1的TIR信号转导结构域可以包含多肽序列：
或其功能性变体。在一些实施方式中，TLR1的TIR信号转导结构域由SEQ ID NO：182所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，TLR1的TIR信号转导结构域由与SEQ ID NO：182具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
TLR信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：1具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。可以保留TLR1信号转导结构域的功能性变体和/或一些或全部保守残基。功能性变体可以包括N至C末端的截断、插入和/或突变。功能性变体可以包含使用TLR1信号转导通路足以促进信号传播的多肽序列。
TLR信号转导结构域可以是TLR5信号转导结构域或其功能性变体。TLR5信号转导结构域来源于Toll样受体5(TLR5)，它是一类已显示经由独特分子基序的识别在免疫应答中起作用的TLR(Bielaszewska等人，2018)。TLR5信号转导结构域可以包含人TLR5(SEQ IDNO：29)的残基691-836(146个aa)或其功能性变体。TLR5的TIR信号转导结构域可以包含多肽序列：
或其功能性变体。在一些实施方式中，TLR5的TIR信号转导结构域由SEQ ID NO：185所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，TLR5的TIR信号转导结构域由与SEQ ID NO：185具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
TLR信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：5具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。可以保留TLR5信号转导结构域的功能性变体和/或一些或全部保守残基。功能性变体可以包括N至C末端的截断、插入和/或突变。功能性变体可以包含使用TLR5信号转导通路足以促进信号传播的多肽序列。
TLR信号转导结构域可以是TLR6信号转导结构域或其功能性变体。TLR6信号转导结构域来源于Toll样受体6(TLR6)，它是一类已显示在经由与TLR2的相互作用在二酰化和三酰化脂肽的识别中起作用的TLR(Stewart等人，2010；Triantafilou等人，2006)。TLR6信号转导结构域可以包含人TLR6(SEQ ID NO：30)的残基640-781(142个aa)或其功能性变体。TLR6的TIR信号转导结构域可以包含多肽序列：
或其功能性变体。在一些实施方式中，TLR6的TIR信号转导结构域由SEQ ID NO：186所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，TLR6的TIR信号转导结构域由与SEQ ID NO：186具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
TLR信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：6具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。可以保留TLR6信号转导结构域的功能性变体和/或一些或全部保守残基。功能性变体可以包括N至C末端的截断、插入和/或突变。功能性变体可以包含使用TLR6信号转导通路足以促进信号传播的多肽序列。
TLR信号转导结构域可以是TLR9信号转导结构域或其功能性变体。TLR9信号转导结构域来源于Toll样受体9(TLR9)，它是一类已显示在由未甲基化的胞嘧啶核苷-磷酸酯-鸟苷(CpG)二核苷酸的存在所刺激的核苷酸传感中起作用的TLR(Takeshita等人，2001；Doyle等人，2007)。TLR9信号转导结构域可以包含人TLR9(SEQ ID NO：33)的残基868-1013(146个aa)或其功能性变体。TLR9的TIR信号转导结构域可以包含多肽序列：
或其功能性变体。在一些实施方式中，TLR9的TIR信号转导结构域由SEQ ID NO：189所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，TLR9的TIR信号转导结构域由与SEQ ID NO：189具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
TLR信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：9具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。可以保留TLR9信号转导结构域的功能性变体和/或一些或全部保守残基。功能性变体可以包括N至C末端的截断、插入和/或突变。功能性变体可以包含使用TLR9信号转导通路足以促进信号传播的多肽序列。
TLR信号转导结构域可以是TLR10信号转导结构域或其功能性变体。TLR10信号转导结构域来源于Toll样受体10(TLR10)，它是参与独特分子的检测和调节免疫应答的TLR受体家族成员。TLR10信号转导结构域可以包含人TLR10(SEQ ID NO：34)的残基632-775(144个aa)或其功能性变体。TLR10的TIR信号转导结构域可以包含多肽序列：
或其功能性变体。在一些实施方式中，TLR10的TIR信号转导结构域由SEQ ID NO：190所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，TLR10的TIR信号转导结构域由与SEQ ID NO：190具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
TLR信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：10具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。可以保留TLR10信号转导结构域的功能性变体和/或一些或全部保守残基。功能性变体可以包括N至C末端的截断、插入和/或突变。功能性变体可以包含使用TLR10信号转导通路足以促进信号传播的多肽序列。
白介素-1受体(IL-1R)亚家族信号转导结构域
在一个方面，本公开提供了具有胞质部分的CAR，所述胞质部分包括白介素-1受体(IL-1R)亚家族信号转导结构域。如本文所使用的，术语“IL-1R亚家族信号转导结构域”是指IL-1R受体亚家族成员的TIR结构域或其功能性变体。目前，在人类中，已鉴定了10种IL-1R亚家族受体(Fields等人，2019)，其中9种具有TIR结构域。IL-1R亚家族信号转导结构域可以是IL-1R信号转导结构域或白介素18受体(IL-18R)信号转导结构域。在一些实施方式中，IL-1R亚家族信号转导结构域可以是IL-1R4(IL-33R、ST2)信号转导结构域、IL-1R6(IL-36R、IL1-Rrp2)信号转导结构域、IL-1R3(IL-1RAcp)信号转导结构域、IL-1R7(IL-18Rβ、AcPl)信号转导结构域、IL-1R8(SIGGIR、TIR8)信号转导结构域、IL-1R9(IL-1RAPL1、TIGIRR-2)信号转导结构域或者IL-1R10(IL-1RAPL2)信号转导结构域。
因此，CAR的胞质部分可以包含具有选自SEQ ID NO：21或22的多肽序列的信号转导结构域，或其功能性变体。所述信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：21-22中的任一项具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
CAR的胞质部分可以包含具有选自SEQ ID NO：143、144、145、146、147、148或149的多肽序列的信号转导结构域，或其功能性变体。所述信号转导结构域可以具有与SEQ IDNO：143、144、145、146、147、148或149中的任一项具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
IL-1R亚家族信号转导结构域来源于IL-1R，IL-1R是以胞外免疫球蛋白样(Ig样)结构域和胞内Toll/白介素1R(TIR)结构域为特征的超家族。IL-1R亚家族的TIR结构域与TLR的TIR结构域共有一定程度的同源性，并且在信号转导方面起着类似的功能。IL-1R家族成员作为识别同源细胞因子并激活下游信号转导分子的异源二聚体起作用(Boraschi，D.and Tagliabue，A.，2013)。配体结合导致受体上TIR结构域的寡聚化，随后辅助蛋白和衔接蛋白分子(例如，MYD88)相互作用。与TIR结构域的异源二聚化导致下游胞质激酶(例如，IRAK)的转导和NF-kB激活，其产生了免疫应答(例如，细胞因子分泌)。
IL-1R亚家族信号转导结构域可以是IL-1R信号转导结构域或其功能性变体。IL-1R信号转导结构域来源于白介素-1受体(IL-1R)，白介素-1受体是通过结合白介素-1并与辅助蛋白(IL-1RAcp)结合形成复合物而起作用的细胞因子受体，以上所形成的复合物介导与TOLLIP、MYD88和IRAK的相互作用，从而导致MAPK信号转导和NF-κ-B的激活(Greenfeder等人，1995；Slack等人，2000)。IL-1R信号转导结构域可以包含人IL-1R(SEQ ID NO：35)的残基357-569(213个aa)或其功能性变体。IL-1R的IL-1R信号转导结构域可以包含多肽序列：
IL-1R信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：21具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。可以保留IL-1R信号转导结构域的功能性变体和/或一些或全部保守残基。功能性变体可以包括N至C末端的截断、插入和/或突变。功能性变体可以包含使用IL-1R信号转导通路足以促进信号传播的多肽序列。IL-1R信号转导结构域的保守残基可以包含D369A和/或R428A(Slack等人2000)。
IL-1R亚家族信号转导结构域可以是白介素-18受体(IL-18R)信号转导结构域。IL-18R信号转导结构域来源于白介素-18受体(IL-18R)，它是通过结合同源细胞因子、作为复合物与IL-18RAcP辅助蛋白结合并与一种或多种衔接蛋白接合以导致信号转导的起作用的细胞因子受体(Loiarro等人，2010)。IL-18R信号转导结构域可以包含人IL-18R(SEQ IDNO：36)的残基373-520(148个aa)或其功能性变体。IL-18R信号转导结构域可以包含以下多肽序列：
或其功能性变体。
IL-18R信号转导结构域可以具有与SEQ ID NO：22具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。可以保留IL-18R信号转导结构域的功能性变体和/或一些或全部保守残基。功能性变体可以包括N至C末端的截断、插入和/或突变。功能性变体可以包含使用IL-18R信号转导通路足以促进信号传播的多肽序列。IL-18R信号转导结构域的保守残基可以包含BB环内的保守序列(Ota等人，2012)。
CAR胞质部分的其它组分
在另一个方面，本公开提供了CAR，其具有包括TIR信号转导结构域和CD3ζ结构域——优选地位于CAR的C末端的CD3ζ结构域的胞质部分。本文所公开的CAR还可以包含一个或多个其它信号转导结构域。在变化形式中，CAR的胞质部分可以包含2B4信号转导结构域或OX40信号转导结构域。然而，在其它变化形式中，CAR的胞质部分缺少2B4信号转导结构域，缺少OX40信号转导结构域，或缺少2B4和OX40信号转导结构域两者。
所述胞质部分可以包含以下多肽序列：
或其功能性变体。所述胞质部分可以具有与SEQ ID NO：64具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
所述胞质部分可以包含以下多肽序列：
或其功能性变体。所述胞质部分可以具有与SEQ ID NO：65具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
所述胞质部分可以包含以下多肽序列：
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO：66)或其功能性变体。所述胞质部分可以具有与SEQ ID NO：66具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
可以在CAR中使用的其它胞质结构域提供于美国专利公开US 2017/0233454和美国专利No.10，415,017。
配体结合结构域
在一个方面，本公开提供了具有包含配体结合结构域的胞外部分的CAR。本公开的配体结合结构域可以包含基于抗体的结合剂，其经由抗原或其抗原性片段特异性结合所关心的抗原。如本文所使用的，术语“抗原”是指鉴别用于通过使用NK细胞的免疫疗法进行治疗的靶标细胞的肽、多肽、糖蛋白、聚糖、脂质、糖脂或其它生物分子。
如本文所使用的，术语“抗体”统称为免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，其包括(例如但不限于)IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其组合，以及在免疫应答期间所产生的类似分子。术语“抗原结合片段”是指特异性结合抗原的抗体的一部分。特异性结合被认为是指具有临床实用性的任何水平的特异性。特异性结合可以表示比组织中其它分子的结合常数大至少103M-1、至少104M-1或至少105M-1的结合常数。抗原结合片段可以是人工片段，如人源化或嵌合抗原结合片段。
术语“抗体样结构域”是指重组抗体片段(如sFv片段、dsFv片段、双重特异性sFv片段、双重特异性dsFv片段、F(ab)′2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)、双链抗体和三链抗体(如本领域已知的)和骆驼科动物抗体，其保留了抗原结合特性(参见，例如，美国专利No.6，015，695；6，005,079；5，874,541；5，840,526；5，800，988；和5,759，808)。抗体样结构域可以表达为融合蛋白以形成单链CAR，或者它可以通过其它已知方式与其它多肽结合，从而形成多部分CAR(multipartite CAR)。多部分CAR的说明性实例描述于(例如)国际专利公开No.PCT/US2021/05676。
抗体样结构域可以是单链可变片段(scFv)。scFv蛋白是其中抗体的轻链可变区(VL)和抗体的重链可变区(VH)作为融合多肽表达(任选地，在VH-VL或VL-VH取向中，具有插入连接，如Gly-Ser接头)的融合蛋白。scFv可以是dsFv，其链已被突变以引入二硫键来稳定所述链的结合。
当配体结合结构域是抗原样结构域时，它可以包含互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方式中，所述结合结构域包含VH和/或VL链。在一些实施方式中，所述配体结合结构域包含单多肽链。所述配体结合结构域可以是scFv。
特异性结合CD19的配体结合结构域
在一个方面，本公开提供了特异性结合CD19的嵌合抗原受体。所述配体结合结构域可以是抗CD19scFv，其包含SEQ ID NO：73所示的多肽序列，或者具有与SEQ ID NO：73具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％，至少90％，至少95％或100％的同一性的多肽序列的其功能性变体，或者从SEQ ID NO：73产生的其它scFv或VH/VL对。所述配体结合结构域可以包含根据SEQ ID NO：74的VH序列和/或根据SEQ ID NO：75的VL序列，或者具有分别与SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列的其功能性变体。
配体结合结构域(例如，scFv)可以包含表1中的CDR序列，或者具有1、2、3或更多个替换的功能性变体。
表1：抗-CD19配体结合结构域序列
在变化形式中，配体结合结构域可以包含通过已知方法从SEQ ID NO：109提取的CDR(例如，Chothia、Martin、Kabat、AHo和IMGT编号，可得自(例如)abysis.org；参见，Swindells等人J.Mol.Bio.429(3)：356-365(2017))。
在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域包含SEQ ID NO：152所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域由SEQ ID NO：152所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域包含与SEQ ID NO：152具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域由SEQ ID NO：153所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域由与SEQ ID NO：153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
特异性结合CD20的配体结合结构域
CD20是一种B细胞谱系特异性抗原，表达于大多数B细胞淋巴瘤的细胞表面上，尤其是在B细胞淋巴生成的晚期阶段。在一个方面，本公开提供了特异性结合CD20的嵌合抗原受体。所述配体结合结构域可以是抗CD20scFv，其包含SEQ ID NO：139所示的多肽序列，或者具有与SEQ ID NO：139具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％，至少90％，至少95％或100％的同一性的多肽序列的其功能性变体，或者从SEQ ID NO：139产生的其它scFv或VH/VL对。
CD20-scFv-4(SEQ ID NO：139)：
在变化形式中，配体结合结构域可以包含通过已知方法从SEQ ID N0：139提取的CDR(例如，Chothia、Martin、Kabat、AHo和IMGT编号，可得自(例如)abysis.org；参见，Swindells等人J.Mol.Bio.429(3)：356-365(2017))。在一些实施方式中，配体结合结构域可以是包含SEQ ID NO：139的抗CD20scFv。
在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域包含SEQ ID NO：156所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域由SEQ ID NO：156所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域包含与SEQ ID NO：156具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。所述配体结合结构域可以包含根据SEQ ID NO：154的VH序列和/或根据SEQ ID NO：155的VL序列，或者具有分别与SEQ ID NO：154和SEQ ID NO：155具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列的其功能性变体。
在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域由SEQ ID NO：157所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域由与SEQ ID NO：157具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
特异性结合HER2的配体结合结构域
在某些实施方式中，所述配体结合结构域可以结合癌症抗原。在具体的实施方式中，配体结合结构域可以结合与实体癌相关的抗原，例如存在于肿瘤细胞上的抗原。例如，人表皮生长因子受体2(HER2)的功能性激活已显示强烈促进致癌作用。在一个方面，本公开提供了特异性结合HER2的嵌合抗原受体。所述配体结合结构域可以是抗HER2scFv，其包含SEQ ID NO：140-142所示的多肽序列，或者具有与SEQ ID NO：140-142具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％，至少90％，至少95％或100％的同一性的多肽序列的其功能性变体，或者从SEQ ID NO：140-142产生的其它scFv或VH/VL对。配体结合结构域(例如，scFv)可以包含CDR序列，或者具有1、2、3或更多个替换的功能性变体。
在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域包含SEQ ID NO：140、141或142所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域由SEQ ID NO：140、141或142所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域包含与SEQ ID NO：140、141或142具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域由SEQ ID NO：198、199或200所示的核苷酸序列所编码。在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域由与SEQ ID NO：198、199或200具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
表2：抗-HER2配体结合结构域序列
在变化形式中，配体结合结构域可以包含通过已知方法从SEQ ID NO：140-142提取的CDR(例如，Chothia、Martin、Kabat、AHo和IMGT编号，可得自(例如)abysis.org；参见，Swindells等人J.Mol.Bio.429(3)：356-365(2017))。在一些实施方式中，配体结合结构域可以是包含SEQ ID NO：140的抗HER2scFv。在一些其它实施方式中，配体结合结构域可以是包含SEQ ID NO：141的抗HER2scFv。在一些实施方式中，配体结合结构域可以是包含SEQ IDNO：142的抗HER2scFv。
在一些实施方式中，CAR包含与SEQ ID NO：202-207具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CAR包含与SEQ ID NO：202(HER2-2-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ，无sIL15)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CAR包含与SEQ ID NO：203(HER2-2-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ-sIL15)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CAR包含与SEQ ID NO：204(HER2-3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ，无sIL15)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CAR包含与SEQ ID NO：205(HER2-3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ-sIL15)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CAR包含与SEQ ID NO：206(HER2-5-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ，无sIL15)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CAR包含与SEQ ID NO：207(HER2-5-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ-sIL15)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
特异性结合B细胞成熟抗原(BCMA)的配体结合结构域
在一些实施方式中，本文所描述的嵌合受体包含含有BCMA的配体结合结构域或其结合片段的胞外结构域。BCMA优先在成熟的B淋巴细胞中表达，并且对B细胞发育是重要的。
在一些实施方式中，如本文所描述的嵌合受体包含含有BCMA的配体结合结构域或其结合片段的胞外结构域。
在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域包含SEQ ID NO：210、212、214或216所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域由SEQ ID NO：210、212、214或216所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域包含与SEQ ID NO：210、212、214或216具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域由SEQ ID NO：209、211、213或215所示的核苷酸序列所编码。在一些实施方式中，嵌合受体的胞外结构域由与SEQ ID NO：209、211、213或215具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
信号肽
可以从编码N末端信号肽的多核苷酸序列表达嵌合抗原受体。信号肽可以指导它们的融合伴侣整合到细胞的质膜中。例如，信号肽包含序列MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQID NO：37)，或者具有1、2、3或更多个氨基酸替换的功能性变体。
跨膜域
在一个方面，本公开提供了具有跨膜部分的CAR，所述跨膜部分包括跨膜结构域。CAR可以被设计为包含与CAR的抗原结合结构域融合的跨膜结构域。在一些实施方式中，使用了与CAR中的结构域之一天然结合的跨膜结构域。在一些情况下，可以选择并通过氨基酸替换修饰所述跨膜结构域以避免这些结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合以最大程度降低与所述受体复合物的其它成员的相互作用。在一些实施方式中，跨膜结构域在使用或不使用接头的情况下可操作性地连接至胞外结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域经由如本文所描述的铰链结构域可操作性地连接至胞外结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是来源于蛋白质的天然存在的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是合成跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域包含多肽完整的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域包含多肽跨膜结构域的片段。
所述跨膜结构域可以来源于天然来源或合成来源。可以使用的跨膜区包括下列的跨膜结构域：CD28、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCRα、TCRβ或CD3ζ或其功能性变体。在变化形式中，跨膜结构域可以是下列的跨膜结构域：CD8α链(CD8α)、CD28、CD16、NKp44、NKp46、NKG2、DNAM1、IL-2Rβ、TLR、IL-1R亚家族，或其功能性变体。
表3中提供了说明性跨膜结构域。
表3：跨膜(TM)结构域
缩写 多肽序列 SEQ ID NO：
aTM NLFVASWIAVMIIFRJGMAVAIFCCFFFP 41
DNAM1TM GGTVLLLLFVISITTIIVIFL 42
CD28TM FW VLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFW V 43
IL-2Rβ IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLI 44
TLR1TM LLIVTIVATMLVLAVTVTSLC 45
TLR2TM ALVSGMCCALFLLILLTGVLC 46
TLR3TM FFMINTSILLIFIFIVLLIHF 47
TLR4TM TIIGVSVLSVLVVSVVAVLVY 48
TLR5TM FSLFIVCTVTLTLFLMTILTV 49
TLR6TM LIVTIGATMLVLAVTVTSLCI 50
TLR7TM LILFSLSISVSLFLMVMMTAS 51
TLR8TM AVILFFFTFFITTMVMLAALA 52
TLR9TM FALSLLAVALGLGVPMLHHLC 53
TLR10TM ALLIVTIVVIMLVLGLAVAFC 54
IL1RTM HMIGICVTLTVIIVCSVFIY 55
IL18R TM GMIIAVLILVAVVCLVTVCVI 56
在一些实施方式中，跨膜结构域是CD28的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是CD28跨膜结构域的片段。在一些实施方式中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO：43中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD28跨膜结构域由SEQ ID NO：43中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，CD28跨膜结构域包含与SEQ ID NO：43具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，CD28跨膜结构域由SEQ ID NO：160中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，CD28跨膜结构域由与SEQ ID NO：160具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码，。在一些实施方式中，CD28跨膜结构域由SEQ ID NO：218中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，CD28跨膜结构域由与SEQ ID NO：218具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方式中，跨膜结构域是TLR2的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是TLR2跨膜结构域的片段。在一些实施方式中，TLR2跨膜结构域包含SEQ ID NO：46中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，TLR2跨膜结构域由SEQ ID NO：46中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，TLR2跨膜结构域包含与SEQ ID NO：46具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，TLR2跨膜结构域由SEQ ID NO：161中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，TLR2跨膜结构域由与SEQ ID NO：161具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方式中，跨膜结构域是aTM结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是aTM结构域的片段。在一些实施方式中，aTM结构域包含SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：163中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，aTM结构域由SEQ ID NO：41中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，aTM结构域由SEQ ID NO：163中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，aTM结构域包含与SEQ ID NO：41具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，aTM结构域包含与SEQ ID NO：163具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，aTM结构域由SEQ ID NO：164或165所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，aTM结构域由与SEQ ID NO：164或165具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方式中，跨膜结构域是DNAM1的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域是DNAM1跨膜结构域的片段。在一些实施方式中，DNAM1跨膜结构域包含SEQ ID NO：42中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，DNAM1跨膜结构域由SEQ ID NO：42中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，DNAM1跨膜结构域包含与SEQ ID NO：42具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，DNAM1跨膜结构域由SEQ ID NO：162中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，DNAM1跨膜结构域由与SEQ ID NO：162具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
铰链结构域
在一个方面，本公开提供了具有包括铰链结构域的部分的CAR。本公开的CAR的铰链结构域可以包含胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的接头或间隔序列。本领域的技术人员将理解铰链结构域(例如，序列)是在至少一些示例中有助于灵活性的多肽节段(参见，例如，Woof等人，Nat.Rev.Immuno1.，4(2)：89-99(2004))。铰链序列可以是来源于或得自任何适合的分子的任何适合的序列。
铰链可以来源自或包括免疫球蛋白FC区的至少一部分，例如，IgG1Fc区、IgG2Fc区、IgG3Fc区、IgG4Fc区、IgE Fc区、IgM Fc区或IgA Fc区。在某些实施方式中，间臂结构域包括属于其CH2和CH3结构域的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM或IgA免疫球蛋白Fc区的至少一部分。在一些实施方式中，间臂结构域还可以包括相应免疫球蛋白铰链区的至少一部分。
在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区的一部分用作抗原结合结构域(例如scFv)和跨膜结构域之间的铰链区。与不存在间臂的情况相比，间臂可以具有提供抗原结合后提高的细胞反应性的长度。示例性铰链包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸，并且包括任何所列范围的端点之间的任何整数个氨基酸的那些。在一些实施方式中，铰链具有约12个氨基酸或更少，约119个氨基酸或更少，或者约229个氨基酸或更少。在一些实施方式中，铰链的长度为12个氨基酸或约12个氨基酸。示例性间臂包括(但不限于)Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.，19：3153、国际专利申请公开号WO2014031687、美国专利公开No.US 2014/0271635中所描述的那些。
本公开的CAR可以包含从CD4、CD8α、CD28、IgG1、IgG2、IgG4或IgD分离或来源的铰链结构域。
在一些实施方式中，铰链结构域分离自或来源于人CD8α分子。铰链结构域可以包含多肽序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：38)或具有1、2、3、4、5或更多个替换的变体。
在一些实施方式中，铰链结构域分离自或来源于人CD28分子。铰链结构域可以包含多肽序列：CTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO：39)或具有1、2、3、4、5或更多个替换的变体。铰链结构域可以包含多肽序列：LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO：217)或具有1、2、3、4、5或更多个替换的变体。
在一些实施方式中，铰链结构域分离自或来源于人IgG4分子。铰链结构域可以包含多肽序列：ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：40)或具有1、2、3、4、5或更多个替换的变体。
在一些实施方式中，铰链结构域分离自或来源于人CD8分子。铰链结构域可以包含多肽序列：TTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：158)或具有1、2、3、4、5或更多个替换的变体。
接头
在一些实施方式中，本文所描述的嵌合受体包含受体组分之间的一个或多个接头。在一些实施方式中，本文所描述的嵌合受体包含胞外结构域和跨膜结构域之间的接头。在一些实施方式中，本文所描述的嵌合受体包含跨膜结构域和胞质结构域之间的接头。在一些实施方式中，本文所描述的嵌合受体包含胞质结构域的两个或更多个胞内信号转导结构域之间的接头。
Gly-Ser接头
适合于连接多肽序列的接头是本领域技术人员已知的。示例性接头包括gly-ser多肽接头、甘氨酸-脯氨酸多肽接头和脯氨酸-丙氨酸多肽接头。在某些实施方式中，所述接头是gly-ser多肽接头，即由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。
如本文所使用的，术语“gly-ser接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性的gly-ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一些实施方式中，n＝1。在某些实施方式中，n＝2。在某些实施方式中，n＝3，即Ser(Gly4Ser)3。在一些实施方式中，n＝4，即Ser(Gly4Ser)4。在某些实施方式中，n＝5。在某些实施方式中，n＝6。在一些实施方式中，n＝7。在一些实施方式中，n＝8。在一些实施方式中，n＝9。在某些实施方式中，n＝10。另一个示例性的gly-ser多肽接头包含氨基酸序列(Gly4Ser)n。在一些实施方式中，n＝1。在某些实施方式中，n＝2。在某些实施方式中，n＝3。在一些实施方式中，n＝4。在某些实施方式中，n＝5。在某些实施方式中，n＝6。另一个示例性的gly-ser多肽接头包含氨基酸序列(Gly3Ser)n。在一些实施方式中，n＝1。在一些实施方式中，n＝2。在一些实施方式中，n＝3。在一些实施方式中，n＝4。在一些实施方式中，n＝5。在一些实施方式中，n＝6。示例性的gly-ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一些实施方式中，n＝1。在一些实施方式中，n＝2。在一些实施方式中，n＝3，即Ser(Gly4Ser)3。在一些实施方式中，n＝4，即Ser(Gly4Ser)4。在一些实施方式中，n＝5。在某些实施方式中，n＝6。在一些实施方式中，n＝7。在一些实施方式中，n＝8。在某些实施方式中，n＝9。在一些实施方式中，n＝10。另一个示例性的gly-ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在某些实施方式中，n＝1。在一些实施方式中，n＝2。在一些实施方式中，n＝3。在某些实施方式中，n＝4。在一些实施方式中，n＝5。在某些实施方式中，n＝6。另一个示例性的gly-ser多肽接头包含(Gly4Ser)n。在一些实施方式中，n＝1。在一些实施方式中，n＝2。在某些实施方式中，n＝3。在一些实施方式中，n＝4。在一些实施方式中，n＝5。在某些实施方式中，n＝6。另一个示例性的gly-ser多肽接头包含(Gly3Ser)n。在一些实施方式中，n＝1。在一些实施方式中，n＝2。在某些实施方式中，n＝3。在某些实施方式中，n＝4。在一些实施方式中，n＝5。在一些实施方式中，n＝6。
在一些实施方式中，本文所描述的嵌合受体包含如SEQ ID NO：166中所示的gly-ser接头。在一些实施方式中，所述gly-ser接头由SEQ ID NO：167所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，本文所描述的嵌合受体包含如SEQ ID NO：168中所示的gly-ser接头。在一些实施方式中，所述gly-ser接头由SEQ ID NO：169所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，本文所描述的嵌合受体包含如SEQ ID NO：170中所示的gly-ser接头。在一些实施方式中，所述gly-ser接头由SEQ ID NO：171所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，本文所描述的嵌合受体包含如SEQ ID NO：172中所示的gly-ser接头。在一些实施方式中，所述gly-ser接头由SEQ ID NO：173所示的核苷酸序列编码。
其它接头
适合于连接多肽序列以允许双顺反子表达的其它接头是本领域技术人员已知的。示例性接头包括Furin GSG-T2A。
在一些实施方式中，本文所描述的嵌合受体包含如SEQ ID NO：174中所示的gly-ser接头。在一些实施方式中，所述gly-ser接头由SEQ ID NO：175所示的核苷酸序列编码。
CAR多肽和多核苷酸序列
尽管本公开考虑了本公开的信号转导结构域以任何顺序的组合以及与任何跨膜和胞外结构域的组合，但是本公开至少提供了表4中所列的构建体。
在每种情况下，CAR多肽可以以连续顺序包含CD8铰链结构域、人工跨膜结构域(“aTM”)和一个或多个信号转导结构域和/或其它胞质结构域，如表4第一列所示。它可以具有根据第二列的多肽序列，或者与之具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的功能性变体。在变化形式中，CAR多肽包含对CD19特异的配体结合结构域。在每个表的第三列中提供了实例。在每种情况下，CAR多肽可以包含具有根据第三列的多肽序列，或者与之具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的功能性变体。第四列提供了各自相应的示例性多核苷酸序列。在一些其它变化形式中，CAR多肽包含对CD20特异的配体结合结构域。在一些其它变化形式中，CAR多肽包含对HER2特异的配体结合结构域。
共表达伴侣
在一个方面，本公开的NK CAR细胞被工程化以共表达其它蛋白质(膜结合或分泌的蛋白质)。US 2017/0073638 A1中提供了示例性的组合物和方法。
在一些变化形式中，本公开的NK细胞被工程化以表达白介素-15(IL-15)(膜结合或分泌的)。IL-15是一种在调节免疫应答中起作用的细胞因子。不受理论束缚，IL-15的表达可以改善NK细胞功能。IL-15可以包含以下多肽序列：
IL-15可以具有与SEQ ID NO：58具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。在一些实施方式中，IL-15由SEQ ID NO：208所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，IL-15由与SEQ ID NO：208具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列编码。
作为另外一种选择，IL-15可以包含以下多肽序列：
IL-15可以具有与SEQ IDNO：57具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
在一些变化形式中，本公开的NK细胞被工程化以表达白介素-18(IL-18)(膜结合或分泌的)。IL-18是一种在免疫细胞激活和应答中起作用的促炎细胞因子。不受理论束缚，IL-18的表达可以增强NK细胞增殖、成熟和细胞毒性。IL-18可以包含以下多肽序列：
IL-18可以具有与SEQ ID NO：60具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。作为另外一种选择，IL-18可以包含以下多肽序列：
IL-18可以具有与SEQ ID NO：59具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
本公开的NK细胞的共表达蛋白可以是融合蛋白。如本文所使用的，“融合蛋白”是指由至少两个基因融合所产生的表达产物。融合蛋白可以是包含两种或更多种彼此缀合的不相关的蛋白或蛋白片段的嵌合多肽。共表达的多肽可以通过自切割肽，如自切割(2A)肽，或其功能性变体与编码本公开的CAR的多肽连接。
在一些变化形式中，本公开的NK细胞被工程化以表达白介素-15/白介素-15R(IL15/IL15R)融合蛋白。白介素-15受体(IL-15R)已被证明在刺激免疫细胞增殖中起作用。不受理论束缚，IL-15/IL15R的表达可以改善NK细胞功能。IL15/IL15R融合蛋白可以包含以下多肽序列：
IL15/IL15R融合蛋白可以具有与SEQ IDNO：62具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
在一些变化形式中，本公开的NK细胞被工程化以表达白介素-18/白介素-18R(IL18/IL18R)融合蛋白。白介素-18受体(IL-18R)已被证明在免疫细胞激活和促进细胞毒活性中起作用。不受理论束缚，IL18/IL18R的表达可以增强NK细胞增殖、成熟和细胞毒性。IL18/IL18R融合蛋白可以包含以下多肽序列：
IL18/IL18R融合蛋白可以具有与SEQ ID NO：63具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
在一些变化形式中，本公开的NK细胞被工程化以表达OX40。OX40(CD134)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的成员，其在免疫细胞的信号转导和致敏中起作用。不受理论束缚，OX40的表达可以增强MAPK/ERK、NFkB和AKT途径的激活；和/或诱导增殖和细胞因子释放。OX40可以包含以下多肽序列：
OX40可以具有与SEQ ID NO：61具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
在本公开的CAR的范围内设想了本文所描述的胞外配体结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内/胞质信号转导结构域和共表达蛋白的任意组合。
多核苷酸和载体
本公开的多核苷酸可以作为分离的核酸或在载体中被递送至细胞。在一个方面，本公开提供了包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含本公开的CAR。在一些实施方式中，所述载体包含编码本公开的共表达伴侣的多核苷酸。本公开的载体中存在的其它元件还可以包含蛋白质表达所必需的可选择标志物及其它组分，如增强子、启动子和终止序列。本公开的多核苷酸可以包含用于同源介导修复的侧接左臂和右臂(arm)。所述多核苷酸可以包含可操作性连接至编码CAR的多核苷酸序列的启动子。
本公开的多核苷酸也可以用于基因编辑。例如，同源介导修复可以用于将多核苷酸插入至所期望的基因组基因座中。多核苷酸可以包括启动子及其它遗传元件，或者修复模板可以省略这些，并且作为替代依赖于宿主基因组序列进行转录。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见，例如，Sambrook等人(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的一种方法是磷酸钙转染。
将所关心的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，并且特别是反转录病毒载体已成为将基因插入到哺乳动物，例如，人细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺病毒相关病毒等。参见，例如，美国专利No.5，350，674和5,585，362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散体系，如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和脂质基系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊)。
不考虑用于将外源核酸引入到宿主细胞中的方法，为了确认所述宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以实施多种测定。这些测定包括(例如)本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如(流体)通过免疫学方式(ELISA和免疫印迹)或其它测定检测特定的肽的存在或不存在。
提供了包含CAR或其部分的多核苷酸。在本公开的范围内设想了编码本文所描述的胞外配体结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内/胞质信号转导结构域和共表达蛋白的任意组合的多核苷酸。
修饰的细胞
制备修饰的细胞(例如，干细胞、祖细胞或免疫效应细胞)的方法是本领域技术人员已知的。制备表达多肽，如本文所描述的嵌合受体或融合多肽的细胞的方法是本领域已知的。本文描述了示例性方法。
在一些实施方式中，本公开提供了表达本文所描述的嵌合抗原受体的修饰的细胞(例如，修饰的干细胞、修饰的祖细胞或修饰的免疫效应细胞)。在一些实施方式中，本公开提供了包含编码本文所描述的嵌合抗原受体的多核苷酸序列的修饰的细胞(例如，修饰的干细胞、修饰的祖细胞或修饰的免疫效应细胞)。在一些实施方式中，修饰的细胞(例如，修饰的干细胞、修饰的祖细胞或修饰的免疫效应细胞)是CISH敲除细胞。
在一些实施方式中，细胞包含本文所描述的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域和包含TLR2信号转导结构域的胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，细胞包含本文所描述的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域和包含TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域的胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，细胞包含本文所描述的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含配体结合结构域、选自下列的跨膜结构域：CD8α链(CD8α)、CD28、CD16、NKp44、NKp46、NKG2、DNAM1、IL-2Rβ、TLR、IL-1R亚家族，或其功能性变体和包含TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域的胞内信号转导结构域。
信号转导结构域
在一些实施方式中，本公开的多核苷酸包含编码本公开的信号转导结构域的序列。在一些实施方式中，所述多核苷酸编码TLR信号转导结构域。在一些实施方式中，所述多核苷酸编码IL-1R亚家族信号转导结构域。
在一些实施方式中，编码本公开的信号转导结构域的多核苷酸序列包含编码TLR2信号转导结构域的核酸序列。编码TLR2信号转导结构域的多核苷酸序列可以包含SEQ IDNO：12中所示的核酸序列。编码TLR2信号转导结构域的多核苷酸序列可以具有与SEQ IDNO：12具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码本公开的信号转导结构域的多核苷酸序列包含编码TLR8信号转导结构域的核酸序列。编码TLR8信号转导结构域的多核苷酸序列可以包含SEQ IDNO：18中所示的核酸序列。编码TLR8信号转导结构域的多核苷酸序列可以具有与SEQ IDNO：18具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码本公开的信号转导结构域的多核苷酸序列包含编码TLR3信号转导结构域的核酸序列。编码TLR3信号转导结构域的多核苷酸序列可以包含SEQ IDNO：13中所示的核酸序列。编码TLR3信号转导结构域的多核苷酸序列可以具有与SEQ IDNO：13具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码本公开的信号转导结构域的多核苷酸序列包含编码TLR7信号转导结构域的核酸序列。编码TLR7信号转导结构域的多核苷酸序列可以包含SEQ IDNO：17中所示的核酸序列。编码TLR7信号转导结构域的多核苷酸序列可以具有与SEQ IDNO：17具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码本公开的信号转导结构域的多核苷酸序列包含编码TLR4信号转导结构域的核酸序列。编码TLR4信号转导结构域的多核苷酸序列可以包含SEQ IDNO：14中所示的核酸序列。编码TLR4信号转导结构域的多核苷酸序列可以具有与SEQ IDNO：14具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码本公开的信号转导结构域的多核苷酸序列包含编码TLR1信号转导结构域的核酸序列。编码TLR1信号转导结构域的多核苷酸序列可以包含SEQ IDNO：11中所示的核酸序列。编码TLR1信号转导结构域的多核苷酸序列可以具有与SEQ IDNO：11具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码本公开的信号转导结构域的多核苷酸序列包含编码TLR5信号转导结构域的核酸序列。编码TLR5信号转导结构域的多核苷酸序列可以包含SEQ IDNO：15中所示的核酸序列。编码TLR5信号转导结构域的多核苷酸序列可以具有与SEQ IDNO：15具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码本公开的信号转导结构域的多核苷酸序列包含编码TLR6信号转导结构域的核酸序列。编码TLR6信号转导结构域的多核苷酸序列可以包含SEQ IDNO：16中所示的核酸序列。编码TLR6信号转导结构域的多核苷酸序列可以具有与SEQ IDNO：16具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码本公开的信号转导结构域的多核苷酸序列包含编码TLR9信号转导结构域的核酸序列。编码TLR9信号转导结构域的多核苷酸序列可以包含SEQ IDNO：19中所示的核酸序列。编码TLR9信号转导结构域的多核苷酸序列可以具有与SEQ IDNO：19具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码本公开的信号转导结构域的多核苷酸序列包含编码TLR10信号转导结构域的核酸序列。编码TLR10信号转导结构域的多核苷酸序列可以包含SEQ ID NO：20中所示的核酸序列。编码TLR10信号转导结构域的多核苷酸序列可以具有与SEQ ID NO：20具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码本公开的信号转导结构域的多核苷酸序列包含编码IL-1R信号转导结构域的核酸序列。编码IL-1R信号转导结构域的多核苷酸序列可以包含编码SEQ ID NO：21中所示的多肽的核酸序列。编码IL-1R信号转导结构域的多核苷酸序列可以具有编码与SEQ ID NO：21具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列的多核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码本公开的信号转导结构域的多核苷酸序列包含编码IL-18R信号转导结构域的核酸序列。编码IL-18R信号转导结构域的多核苷酸序列可以包含SEQID NO：24中所示的核酸序列。编码IL-1R信号转导结构域的多核苷酸序列可以具有与SEQID NO：24具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸序列。
表5：信号转导结构域
CAR胞质部分的其它组分
CAR的胞质部分可以进一步包含一个或多个表6中所列的结构域，或与之具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性的功能性变体。
表6：其它胞质结构域
在一些实施方式中，本文所描述的嵌合受体包含胞质结构域。在一些实施方式中，胞质结构域通过接头可操作性地连接至TIR信号转导结构域。在一些实施方式中，胞质结构域在没有接头的情况下可操作性地连接至TIR信号转导结构域。在一些实施方式中，胞质结构域的N末端可操作性地连接至TIR信号转导结构域的C末端。在一些实施方式中，胞质结构域的C末端可操作性地连接至TIR信号转导结构域的N末端。
在一些实施方式中，胞质结构域是2B4信号转导结构域。在一些实施方式中，2B4胞质结构域包含SEQ ID NO：65中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，2B4胞质结构域由SEQ ID NO：65中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，2B4胞质结构域包含与SEQ IDNO：65具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，2B4胞质结构域由SEQ ID NO：179所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，2B4胞质结构域由与SEQ ID NO：179具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方式中，胞质结构域是CD3ζ胞质结构域。在一些实施方式中，CD3ζ胞质结构域包含SEQ ID NO：64中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD3ζ胞质结构域由SEQID NO：64中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，CD3ζ胞质结构域包含与SEQ IDNO：64具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD3ζ胞质结构域由SEQ ID NO：181所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，CD3ζ胞质结构域由与SEQ ID NO：181具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方式中，胞质结构域是41BB胞质结构域。在一些实施方式中，41BB信号转导结构域包含SEQ ID NO：176所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，41BB胞质结构域由SEQ ID NO：176中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，41BB胞质结构域包含与SEQID NO：176具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，41BB胞质结构域由SEQ ID NO：177所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，41BB胞质结构域由与SEQ ID NO：177具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方式中，胞质结构域是CD28胞质结构域。在一些实施方式中，CD28胞质结构域包含SEQ ID NO：68中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，胞质结构域是CD28胞质结构域。在一些实施方式中，CD28胞质结构域包含SEQ ID NO：220中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD28胞质结构域由SEQ ID NO：68中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，CD28胞质结构域由SEQ ID NO：220中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，CD28胞质结构域包含与SEQ ID NO：68具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD28胞质结构域包含与SEQ ID NO：220具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，CD28胞质结构域由SEQ ID NO：178所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，CD28胞质结构域由SEQ ID NO：219所示的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，CD28胞质结构域由与SEQ ID NO：178具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方式中，CD28胞质结构域由与SEQ ID NO：219具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核苷酸序列编码。
共表达伴侣
可以通过共表达多种因子来提高NK细胞的活性，所述因子包括(但不限于)表7中所提供的那些。
表7：共表达伴侣
示例性嵌合抗原受体
在一些实施方式中，本文所描述的嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域和包含TLR2信号转导结构域的胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，本文所描述的嵌合抗原受体包含配体结合结构域、跨膜结构域和包含TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域的胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，本文所描述的嵌合抗原受体包含(a)配体结合结构域、(b)跨膜结构域，其选自CD8α链(CD8α)、CD28、CD16、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM1、IL-2Rβ、TLR、IL-1R亚家族，或其功能性变体和(c)包含TLR2信号转导结构域和CD3信号转导结构域的胞内信号转导结构域。示例性的非限制性实例包括(例如)本文所描述的嵌合抗原受体，其包含配体结合结构域、aTM结构域和胞内信号转导结构域，所述胞内信号转导结构域包含TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域。其它示例性嵌合抗原受体包含配体结合结构域、CD28跨膜结构域和包含TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域的胞内信号转导结构域。
试剂盒
在一个方面，本公开提供了试剂盒，其包含本公开所述的CARNK细胞或药物组合物和使用说明。
使用方法
在一个方面，本公开提供了治疗或预防对其有需要的受试者中的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用本公开的CARNK细胞或本公开的药物组合物。
在一个方面，本公开提供了杀伤靶标细胞的方法，其包括使所述靶标细胞群体与本公开的自然杀伤细胞群体接触，其中所述自然杀伤细胞的嵌合抗原受体包含特异性结合靶标细胞上的抗原的配体结合结构域，并且其中所述自然杀伤细胞诱导靶标细胞的特异性杀伤。
在一个方面，本公开提供了杀伤靶标细胞的方法，其包括使靶标细胞群体与NK细胞群体接触。
可以通过本领域中已知的测定评价细胞杀伤，其包括(但不限于)实施例中所描述的那些。
所述癌症可以由显示处被CAR或表达CAR的NK细胞特异性结合的抗原的肿瘤细胞的增殖所引起。本文所提供的CAR包括具有特异性结合CD19、CD20和/或HER2的配体结合结构域的CAR。CD19和CD20可以在B细胞淋巴瘤和白血病的多种惰性和侵袭性亚型的肿瘤细胞上表达，非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和非T急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。因此，本文所描述的CAR可以用于杀伤CD19+和/或CD20+肿瘤细胞和/或治疗患有非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和非T急性淋巴母细胞性白血病(ALL)的受试者的癌症。已在几种肿瘤类型中发现了HER2表达，其包括(但不限于)乳腺癌、食道癌、肺癌、宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌。因此，本文所描述的CAR可以用于杀伤HER2+肿瘤细胞和/或治疗患有乳腺癌、食道癌、肺癌、宫颈癌、子宫内膜癌和/或卵巢癌的受试者中的癌症。
在一个方面，本公开提供了治疗对其有需要的受试者中癌症的方法，其包括施用NK细胞群体或包含NK细胞群体的药物组合物。
术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中是可互换使用的以表示脊椎动物，如哺乳动物，例如，人。
如本文所使用的，术语“治疗”至少涵盖了患者中与疾病或病况相关的症状的改善，其中改善在广义上用于表示至少参数(例如，与所治疗的病况相关的症状)幅度的降低。照此，“治疗”还包括其中完全抑制(例如，防止发生)或停止(例如，终止)疾病、病症或病理状况或至少与之相关的症状，从而使得患者不再遭受该状况或至少表征该状况的症状的情况。
在一些实施方式中，治疗对其有需要的受试者中癌症的方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的CARNK细胞和/或药物组合物。
如本文所使用的，“治疗有效的”是指细胞或药物组合物的量足以治疗或改善或以某种方式减轻与疾病(如癌症)有关的症状。
在一些实施方式中，将本文所描述的CARNK细胞和包含它们的药物组合物用作组合疗法的一部分。在一些实施方式中，将本公开的CARNK细胞或药物组合物与肿瘤靶向抗体一起共施用至受试者。
在一些实施方式中，本公开的CARNK细胞或药物组合物相对于其中细胞未以本公开的方式工程化的细胞或药物组合物表现出提高的细胞毒性。在一些实施方式中，本公开的细胞或药物组合物相对于其中细胞未以本公开的方式工程化的等价细胞或药物组合物表现出提高的有效性。
NK细胞群体或药物组合物可以以有效杀伤靶标细胞的量和/或对于癌症治疗的治疗有效的量施用。
药物组合物
在一个方面，本公开提供了药物组合物，其包含本公开所述的CARNK细胞或细胞群体和一种或多种药物可用的赋形剂或稀释剂。
如本文所使用的，术语“药物可用的”表示联邦或州政府管理机构批准的或者美国药典、其它通常承认的药典中所列的，以及其它在动物，并且更具体地在人和/或非人哺乳动物中使用安全的制剂。
如本文所使用的，术语“药物可用的赋形剂或稀释剂”是指本公开的细胞与之一起施用的赋形剂、稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或媒介物。这类媒介物和药剂用于药学活性物质的使用在本领域中是熟知的。参见，例如，Remington，The Science andPractice of Pharmacy，第20版，(Lippincott，Williams&Wilkins 2003)。
本发明的组合物可以另外含有常规存在于药物组合物中的其它辅助组分。因此，例如，所述组合物可以含有其它、相容的药物活性材料，如(例如)止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以含有在物理配制所述组合物的多种剂量形式中有用的其它材料。
生产方法
在一个方面，本公开提供了制备NK细胞的方法，其包括提供干细胞或祖细胞，如诱导的多潜能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)，并将所述干细胞或祖细胞分化为NK细胞。干细胞或祖细胞可以在分化干细胞之前或之后被基因修饰以包含编码CAR的多核苷酸。已知的载体可以用于递送多核苷酸，其可以由细胞稳定维持和/或整合到细胞的基因组中。干细胞或祖细胞可以是CISH-/-iPSC并且可以用于产生CISH-/-iPSC-NK细胞。干细胞或祖细胞可以是可溶性IL-15或膜结合的IL-15敲入iPSC，并且可以用于产生IL-15敲入iPSC-NK细胞。在一些实施方式中，可以编辑iPSC以不表达CISH，表达可溶性IL-15或膜结合IL-15，并且表达本文所公开的任何一种或多种CAR构建体。
癌症治疗
在一些实施方式中，本公开提供了用本文所提供的嵌合受体表达细胞或其药物组合物或制剂治疗癌症的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将本文所提供的嵌合受体表达细胞、本文所描述的药物组合物或制剂施用于对其有需要的受试者。如本文所使用的，术语“施用”是指通过以下施用途径递送生物活性组合物或制剂，所述施用途径包括(但不限于)静脉内、肌内、腹膜内、皮下和肌内或其组合。该术语包括(但不限于)由医学专业人员施用和自施用。
在一些实施方式中，相对于缺少嵌合受体的细胞，表达本文所描述的嵌合受体的细胞表现出增强的抗肿瘤效力。测量体外和体内抗肿瘤效力的方法是本领域技术人员已知的，并且包括(例如)体外杀伤测定和将肿瘤植入小鼠模型。
可以通过本领域中已知的测定评价细胞杀伤，其包括(但不限于)实施例中所描述的那些。
在一些实施方式中，与缺少嵌合受体和/或融合多肽的细胞相比，表达本文所描述的嵌合受体的细胞表现出约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％或约1000％的增强的细胞杀伤。
在一些实施方式中，与缺少嵌合受体和/或融合多肽的细胞相比，表达本文所描述的嵌合受体的细胞表现出1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、90％至100％或100％至1000％之间的增强的细胞杀伤。
在一些实施方式中，与缺少嵌合受体和/或融合多肽的细胞的相比，表达本文所描述的嵌合受体的细胞表现出约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％或约1000％的增强的特异性杀伤。
在一些实施方式中，与缺少嵌合受体和/或融合多肽的细胞相比，表达本文所描述的嵌合受体的细胞表现出1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、90％至100％或10O％至1000％之间的增强的特异性杀伤。
定义
所有专利公开、专利和专利申请，包括其中的任何附图和附录，出于所有目的以其全部内容作为参考并入，其程度如同具体且单独指明每个单独的专利公开、专利或专利申请、附图或附录出于所有目的以其全部内容作为参考并入。
本说明书对任何在先出版物(或来源于它的信息)或者对任何已知事物的提及不视为并且不应视为对以下的认可或承认或者任何说明形式：在先出版物(或来源于它的信息)或者任何已知事物构成了本说明书所涉及的领域中的一般常识的一部分。
除非上下文明确规定，否则可以组合使用本发明的任何方面的所有实施方式。
除非上下文另外明确要求，否则在整个描述和权利要求中，单词“包含(comprise、comprising)”等将被视为是与排它或穷举的含义相反的包含的含义；即“包括，但不限于”的含义。
除非上下文明确规定，否则如本文所使用的单数形式的“一个”和“所述”包括复数对象。除非另外明确表示，否则如本文所使用的“和”与“或”可互换使用。使用单数或复数数字的单词还分别包括复数和单数数字。
章节标题仅是为了方便，并且考虑了来自不同章节的元素的组合。另外，当在本发明申请中使用时，单词“本文中”、“以上”和“以下”以及具有类似含意的单词应表示作为整体的本发明申请而不是本发明申请的任何具体部分。
术语“功能性变体”是指保留足以激活NK细胞的信号转导活性的结构域的同源性(通过序列或结构)。
术语“序列同一性”是指所关心的多肽或多核苷酸序列与参考序列的百分比同一性，其计算为所关心的序列与参考序列的最佳比对中精确匹配的数目除以参考序列的总长度(包括缺口)在乘以100。可以使用在www.ebi.ac.uk可获得的European Mo1ecularBiology Open Software Suite(EMBOSS)Needle程序产生序列的最佳比对，如Maderia等人Nucleic Acids Res.47(W1)：W636-W641(2019)中所述。
如本文所使用的，术语“失活突变”是指基因组序列中破坏基因功能的突变。失活突变可以在有助于基因表达的任何序列区(例如，编码或非编码区)中。实例包括(但不限于)顺式作用元件(增强子)或经受转录的序列(例如，mRNA转录本序列)。失活突变包括使基因或其编码的蛋白无功能或降低基因或其编码的蛋白的功能的突变。
实施例
现将参考以下实施例描述本公开。仅出于说明的目的提供了这些实施例，并且本公开决不应视为受限于这些实施例，而是应视为涵盖了由于本文所提供的教导内容而变得显而易见的任何和所有改变。
在不进行进一步描述的情况下，据信本领域的技术人员可以使用以上描述和以下说明性实施例制备和使用本公开所述的方法和实践所主张的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本公开的实施方式并且不应将以下工作实施例视为以任何方式对本公开的其余部分的限制。
现将描述在这些实验中所使用的材料和方法。
实施例1：嵌合抗原受体设计的筛选
本实施例描述了诱导的多潜能干细胞(iPSC)-来源的自然杀伤细胞(NK细胞)中嵌合抗原受体的设计和测试。我们构建了一个有44个新型CAR构建体的文库，所述CAR构建体含有来自不同NK细胞特异性信号转导受体的信号转导模块。然后，我们在成熟的iPSC-来源的NK细胞中开发了病毒基CAR表达规程，其产生了高CAR表达(>75％CAR+)，同时维持了高存活力(>90％)。然后，我们使用两种共培养靶标细胞杀伤测定(eSight阻抗测定和半胱天冬氨酸酶3/7杀伤测定)和两种NK细胞耐受性CD19+靶标细胞系(Raji和SupB15)筛选CAR活性。作为SEQ ID NO：100-117提供了所测试的构建体，其全部具有抗CD19scFv作为配体结合结构域。我们的筛选鉴别了7个新型CAR信号转导模块，其表现优于第二代T细胞CAR(CD28-ξ)和三个先前描述的NK细胞CAR(2B4-ξ、OX40-ξ和OX40L-ξ)。这些结果在两种功能测定和两种所测试的靶标细胞系间都是一致的，从而为我们的发现提供了支持。
所设计的CAR序列经由自切割(2A)肽C末端连接至膜结合的IL-15(mbIL-15)一用于在自然杀伤细胞中共表达。产生慢病毒颗粒并浓缩～100倍以有助于转导iPSC-来源的NK细胞所需的高病毒滴度。
通过离心将浓缩的病毒原液加载到重组人纤维连接蛋白(retronectin)涂覆的96孔板上，添加IL-2激活的iPSC-来源的NK细胞，并在存在病毒上清液的情况下离心，并在存在IL-2的情况下孵育72hr。使用工程化至CAR多肽的胞外部分的HA-标签，通过流式细胞术检测CAR表达(图9)。CAR表达在大多数CAR构建体间是均一的，其平均CAR表达为～78％(图10)。当将CAR转导的细胞与未转导的对照相比时，我们未观察到任何细胞存活力损失。
我们使用两种共培养靶标细胞杀伤测定(eSight阻抗测定和半胱天冬氨酸酶3/7杀伤测定)和两种NK细胞耐受性CD19+靶标细胞系(Raji和SupB15)筛选CAR活性。图11和图12中显示了筛选结果。我们鉴别了6个CAR构建体，其表现优于最佳对比CAR(2B4-ξ)。12个的表现优于另一对比CAR(OX40L-ξ)。除了一个外，所有所测试的CAR的表现优于第三对比CAR(OX40-ξ)。
图13A-13C中显示了比较具有和不具有2B4结构域的CAR设计的所选的数据。基于2B4的CAR已表明对于激活NK细胞有效。意外地，我们的CAR TLR2-ξ在两种测定中均优于对比2B4-ξ和我们组合了2B4和TLR2结构域的CAR设计(2B4-ξ)(图13B和图13C)。
总体而言，我们已成功在治疗相关的同种异体细胞来源中开发了CAR筛选平台，并已鉴别了NK优化的CAR，与当前的CAR解决方案相比，它能够提高NK细胞的效力。值得注意地，与先前开发的NK优化的CAR设计，即2B4(如图所示)、FCER1G、DNAM1、DAP10中所使用的含有经典NK细胞激活受体结构域的CAR相比，来自Toll样受体和IL-1R亚家族受体的胞内信号转导模块显示出增强的NK CAR活性。这些发现验证了不同的免疫细胞信号转导结构域在NK优化的CAR中的用途。
方法
慢病毒表达载体的构建和病毒包装：所有候选CAR组分的多肽序列均得自EnsembleTM数据库(Howe等人Nucleic Acids Res.2021，第49卷(1)：884-891)并使用SnapGeneTM分子生物学软件组装成完整的CAR设计。使用可公开获得的密码子优化工具(Integrated DNA TechnologiesTM)确定核酸序列。所有CAR构建体作为代表性配体结合结构域包括CD19 scFv结合剂(FMC63；SEQ ID NO：109)、mbIL-15共表达伴侣(SEQ ID NO：48)和用于CAR检测的HA-标签。合成CAR构建体并克隆至受EF-1α启动子(pCDH-EF1α-MCS-T2A-Puro；System BiosciencesTM)控制的慢病毒表达载体中，并产生maxi-preps并进行序列验证。使用以上所描述的构建体、包装质粒(Rev、gag-pol和VSVG；Cell BiolabsTM)和Lenti-XTM 293T细胞系(TakaraTM)产生慢病毒颗粒。使用PEG基浓缩溶液(TakaraTM)将病毒上清液浓缩～100倍，并使用Lenti-x GoStix PlusTM(TakaraTM)确定病毒滴度。
iPSC-NK细胞的产生：收集iPSC并转移至无血清培养基中培养并通过旋转聚集形成拟胚体。在第6天在拟胚体(EB)内一旦出现CD34+细胞，则将EB转移至NK细胞分化培养基中，所述培养基含有：Dulbecco改良的Eagle培养基/Ham F12的2：1混合物、2mM L-、1％青霉素/链霉素、25mM D-巯基乙醇、20％热失活的人血清AB、5ng/mL亚硒酸钠、50mM乙醇胺、20mg/mL抗坏血酸、白介素-3；仅对于第一周，含有干细胞因子、白介素-15、Fms样酪氨酸激酶3配体和白介素-7。将EB在这些条件下放置28天，每周更换培养基以产生NK细胞(CD45+CD56+CD33-CD3-细胞，如通过流式细胞术所确定的)。然后，收获NK细胞用于扩增。
扩增：分化后，使用表达mbIL21和4-1BB配体(CD137)的永生化白血病细胞系K562刺激NK细胞扩增。用K562-41BBL-mbIL21饲养细胞接种NK细胞，并以1：2的比例在含有100U/mL IL-2的基质细胞生长培养基(SCGM)中孵育。除去非贴壁细胞并通过流式细胞术分析以确定CD56+NK细胞的纯度。然后，用2：1的aAPC(以10000Gy辐照)比NK细胞以350000个NK细胞/mL培养基(含有RPMI 1640、2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、1％非必需氨基酸和10％标准FBS或10％人血清AB，补充有50-100U/mL IL-2)刺激这些细胞。
iPSC-NK细胞的转导：用重组人纤维连接蛋白(Takara)涂覆未处理的96孔板。将等量的浓缩慢病毒加入板中，并在32℃下以2000×g离心2hr。将iPSC-来源的NK细胞(6e4个细胞)加入至含有IL-2(50U/ml)的培养基中的每个孔中，并在32℃下以800×g离心1hr。将细胞在37℃孵育48hr。加入新鲜培养基(具有IL-2)，并将细胞孵育另外24hr。在转导后72hr使用流式细胞术确定CAR表达以检测工程化至每个CAR的胞外结构域中的HA-标签。在CAR检测的24hr内，将CAR+细胞用于功能测定。
使用eSightTM的长期靶标细胞杀伤测定：用在PBS中稀释的CD40系链试剂(AgilentTM)在4℃下涂覆RTCA E-板过夜。用PBS清洗板，将靶标细胞(CD19+靶标细胞(Raii；ATCCTM)或HER2+靶标细胞(BT474克隆5))加入至每个孔中，并使阻抗读数平衡2-4hr。将CAR+iPSC-NK细胞以指定的E：T比加入至每个孔中，并且每15min测量阻抗读数，测量24hr。通过将阻抗读数归一化至“单独的靶标细胞”对照孔来确定NK特异性杀伤，并作为靶标杀伤频率绘图。
4hr半胱天冬氨酸酶3/7细胞毒性测定：以终浓度为5μM的CellTraceTM Violet在PBS中的溶液在37℃预染色SupB15(CD19+靶标细胞)15min，然后在完全培养基中清洗。将CAR+iPSC-NK细胞以2∶1的E∶T比加入至每个孔中，最终体积为100μL。将共培养物以100×g离心1min，并在37℃下孵育3.5hr。孵育后，将半胱天冬氨酸酶-3/7Green检测试剂和SYTOXTM AADvancedTM死细胞染色溶液加入至共培养物中，并在37℃下孵育另外30min。染色后，在NovoCyte Advanteon上读取测定，并通过FlowJo软件进行分析。通过将阻抗读数归一化至“单独的靶标细胞”对照孔来确定NK特异性杀伤，并作为靶标杀伤频率绘图。
[预言性]实施例2：具有CD19结合结构域的CAR的体内功能测试
使用B细胞恶性肿瘤的CD19表达模型测试表达功能性CAR构建体(通过体外测定结果确定)的iPSC来源的NK细胞的体内效力。为了引发疾病，向10-12周大的NOD-SCID-γγ-/-(NSG)小鼠(Jackson Laboratory)静脉内注射表达荧光素酶的Raji细胞(CD19阳性)。1天后，向小鼠施用iPSC-来源的NK细胞，所述NK细胞被工程化以表达(a)无CAR(阴性对照)；(b)第二代T细胞CAR(基准对照)；或(c)NK CAR(测试组)。在实验的剩余时间内，每隔一天向受试小鼠施用IL-2。通过存活、体重减轻和肿瘤负荷的生物发光成像(每周测量)来监测疾病发展。为了评价在实验过程中存在的输注的NK细胞的数目，每周对来自周围血液的CD45+CD56+CD3-细胞进行定量。
实施例3：具有HER2结合结构域的CAR的功能测试
通过离心将包含具有HER2scFv结合剂的不同CAR的浓缩的慢病毒原液加载到涂覆了重组人纤维连接蛋白的96孔板上。加入IL-2激活的iPSC-来源的NK细胞，在存在病毒上清液的情况下离心，并在存在IL-2的情况下孵育72hr。使用工程化至CAR多肽的胞外部分的HA-标签，通过流式细胞术检测CAR表达。CAR表达在大多数CAR构建体中是均一的(图14A)。
在NK细胞耐受性HER2+靶标细胞系(BT474)上使用共培养靶标细胞杀伤测定(eSight阻抗测定)筛选CAR活性。图14B和图14D中显示了筛选结果。另外，使用ELISA对共培养上清液进行细胞因子分泌测定。图14C中显示了分泌测定结果。结果将CD8-aTM-TLR2-CD3ζ(SEQ ID NO：82)鉴别为所测试的最佳NK优化的CAR，并且在多个CAR靶标和测定中始终表现得与其它相同/更好。另外，在(1)CD8-aTM-TLR2-CD3ζ、(2)CD8-aTM-DNAM 1-LFA1-CD3ζ和(3)2B4-ζ(对于aTM-IL18R-2B4-CD3ζ较低，～100pg/ml)之间观察到类似的sIL15水平(150-200pg/m1)(数据未显示)。
类似地，具有CD19 scFv的CD8-aTM-TLR2-CD3ζ构建体在多个效应因子比靶标细胞比下表现出对Raji 2.0细胞稳健的细胞杀伤(数据未显示)。CD8-CD28TM-TLR2-CD3ζ构建体也表现出类似的活性。
然后，使用应激测试杀伤测定筛选CAR-HER2活性。简言之，使用具有三种不同CAR构建体之一的反转录病毒转导CISH KO iPSC来源的NK细胞，所述CAR构建体具有相同的HER2scFv结合结构域(HER2v3)和不同的胞内结构域。(图15A)。在第二组实验中，使用具有三种不同CAR构建体之一的反转录病毒转导CISH KO iPSC来源的NK细胞，所述CAR构建体具有相同的胞内结构域和不同的HER2scFv结合结构域(HER2v3)。(图15B)。在不添加细胞因子或sIL-15的共表达的情况下，将效应细胞CISH KO iPSC-来源的NK细胞与NK细胞耐受性HER2+靶标细胞系(BT474)以5：1的效应细胞比靶标细胞比共培养，并采用靶标细胞杀伤测定(eSight阻抗测定)来鉴别哪种CAR构建体表现出高杀伤活性。
使用具有相同HER2scFv结合结构域(HER2v3)的不同CAR构建体的结果将CD8-aTM-TLR2-CD3ζ(SEQ ID NO：82)鉴别为所测试的最佳NK优化的CAR-HER2构建体(图15A)。使用具有不同HER2scFv结合结构域的相同胞内结构域(CD8-aTM-TLR2-CD3ζ)的结果将HER2scFv变体3(V3)鉴别未所测试的最佳NK优化的CAR-HER2构建体。(图15B)。
还在半胱天冬氨酸酶3/7杀伤测定中使用NK细胞耐受性HER2+靶标细胞系(BT474)评价了具有不同HER2scFv结合结构域的CD8-aTM-TLR2-CD3ζCAR构建体的CAR活性(图16A-16B)。简言之，在表达具有相同胞内结构域和不同HER2scFv结合结构域(HER2v2、HER2v3或HER2v5)的三种不同的CAR构建体之一的CISH KO iPSC来源的NK细胞与耐受性实体瘤靶标(2：1的E：T)共培养后，测量半胱天冬氨酸酶3/7激活(图16A)。在CISH KO iPSC来源的NK细胞+/-CAR与NK细胞耐受性实体瘤靶标共培养30hr后，靶标细胞杀伤和半胱天冬氨酸酶3/7激活的代表性图像表明了在表达CAR的CISH KO iPSC来源的NK细胞的共培养后稳健的NK细胞杀伤，但在没有CAR的情况下不能。(图16B)。用Cell TrackerRed标记靶标细胞，并以绿色显像半胱天冬氨酸酶3/7激活。
然后，在3D单一肿瘤球形体中测试了表达CD8-aTM-TLR2-CD3ζCAR和三种不同HER2scFv结合结构域(HER2v2、HER2v3或HER2v5)之一的CISH KO iPSC来源的NK细胞的杀伤活性。简言之，使用球形体形成的标准规程接种和培养BT474细胞，所述BT474细胞是人HER+导管癌细胞。在球形体形成后(接种后约36小时)，将细胞与具有下列特征的CISH KO iPSC来源的NK细胞共培养：1)不表达CAR；2)表达HER2v2-CD8-aTM-TLR2-CD3ζCAR；3)表达HER2v3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζCAR；或者4)表达HER2v5-CD8-aTM-TLR2-CD3ζCAR。图17显示了处理后0、18和36小时的NK细胞耐受性实体瘤靶标球形体的代表性图像。总之，数据显示CAR-HER2NK，具体地表达HER2v3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ的NK有效地杀死HER2+靶标癌细胞。
使用用HER2v3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζζ构建体转导的iPSC-来源的NK细胞，实时进行细胞连续杀伤测定(eSight阻抗测定)。简言之，通过向靶标细胞中重复添加HER2v3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζCISH KO iPSC来源的NK细胞，观察到HER2+靶标细胞系(SKOV3)的重复杀伤和耗竭谱。如图18所示，HER2v3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζNK细胞在3轮后维持高百分比的NK细胞杀伤能力，而不具有CAR(未转导或“UT”)的NK细胞在第2轮后不再杀伤细胞。
在3D单一HER+肿瘤球形体中测试了表达her2v3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ的CISH KOiPSC来源的NK细胞的杀伤活性。在球形体形成后，将靶细胞与不同比例的1)未用CAR构建体转导的CISH KO iPSC来源的NK细胞(未转导的NK或“UT”)或2)表达HER2v3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ的CISH KO iPSC来源的NK细胞共培养。加入靶标细胞(BT474细胞)的效应细胞(未转导的CISH KO iPSC来源的NK细胞或HER2v3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζCISH KO iPSC-来源的NK细胞)的比例为5：1、2.5：1或1.25：1。在加入NK细胞后的第0天和第3天监测球形体细胞的杀伤。图19显示用表达HER2v3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ的NK处理的HER+球形体的靶标BT474细胞在第3天以浓度依赖性方式缩小并经历细胞凋亡。
为了检验sIL-15对CAR-HER2活性的影响，实施了CAR表达测定(图23A)和针对细胞系BT474克隆5的长期杀伤测定(图23B)。尽管sIL-15的表达不影响CAR表达，但与对照(无sIL15的CD20-2b4-ζ-sIL15和HER2-3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ(SEQ ID NO：204))相比，sIL-15表达(HER2-3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ-sIL15(SEQ ID NO：205))显著增加了BT474细胞的CARNK细胞杀伤。约10小时后，对于HER2-3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ-sIL15(SEQ ID NO：205)观察到约80％的NK细胞杀伤，而对于无sIL15的CD20-2b4-ζ-sIL15和HER2-3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ(SEQ ID NO：204)分别仅观察到约55％和30％的NK细胞杀伤。这些结果证实sIL-15与HER2-CAR构建体在HER+乳腺癌细胞系的NK细胞杀伤中具有协同作用。
总之，这些结果证实表达HER2-CD8-aTM-TLR2-CD3ζCAR的CISH KO iPSC来源的NK细胞对NK细胞耐受性实体瘤靶标细胞表现出稳健的活性。
实施例4.HER2-CAR CISH KO iPSC来源的NK细胞的功能测试
本实施例描述了对表达HER2scFv-CAR和可溶性IL-15的CISH KO iPSC来源的NK细胞的测试证实了对实体瘤靶标细胞系的有效杀伤。
首先，使用基因编辑方法，通过向CISH KO iPSC中引入经由自切割(2A)肽C末端连接至可溶性IL-15(sIL-15)的HER2-CAR序列来产生三重编辑(TE)的iPSC。所产生的TEiPSC：1)不表达CISH基因(CISH KO)；2)表达HER2v3-CD8-aTM-TLR2-CD3ζ(HER-CAR)且3)表达可溶性IL-15(SEQ ID NO：58)，从而使得IL-15分泌(图20)。然后，对TE iPSC进行分化以形成缺少CISH、表达HER-CAR并且表现出IL-15分泌的功能性NK细胞(TE iPSC来源的NK细胞)。
为了确定iPSC的三重编辑是否导致NK表型改变，通过流式细胞术测量TE iPSC来源的NK细胞中NK细胞标志物的表达。如图21所示，12种NK表型标志物的表达在野生型(WT)NK细胞、从仅具有CISH KO的iPSC分化的NK和从所评价的TE iPSC分化的NK之间没有显著差异。
在球形体杀伤测定中评价了TE iPSC-来源的NK细胞的功能。简言之，如本文中的实施例中所述，制备了HER2+(BT474克隆5)靶标细胞球形体。将野生型(WT)NK细胞、从仅具有CISH KO的iPSC分化的NK或从TE iPSC分化的NK中的任一种加入至HER2+球形体(10：1的E：T)中。使用eSight阻抗测定所监测的HER2+球形体的NK介导的杀伤显示TE iPSC来源的NK细胞在杀伤NK耐受性HER2+实体瘤靶标方面是有效的(图22A)。图22显示与用WT NK或CISHKO iPSC来源的NK细胞处理的球形体相比，TE iPSC来源的NK细胞处理的球形体在3天后尺寸显著减小。
总之，数据证实TE iPSC来源的NK细胞有效杀伤实体瘤靶标细胞系。
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尽管已结合其所提议的具体实施方式描述了本发明，但是将理解它能够进一步修饰，并且本发明申请旨在涵盖一般地，根据本发明的原理并且包括本发明所属领域内的已知或惯例实践内的与本公开的这些偏离所做的本发明的任何变化、使用或改变，并且可以适用于以上所述的基本特征并且在如下所附权利要求的范围内。

Claims (89)

1.一种自然杀伤细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含胞外部分、跨膜结构域和胞质部分，
其中所述胞质部分包含Toll/白介素-1(IL-1)受体(TIR)信号转导结构域。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述TIR信号转导结构域是Toll样受体(TLR)信号转导结构域。
3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述TLR信号转导结构域是TLR2信号转导结构域或其功能性变体。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的细胞，其中所述TLR信号转导结构域具有与SEQID NO：2具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
5.根据权利要求2所述的细胞，其中所述TLR信号转导结构域是TLR8信号转导结构域或其功能性变体。
6.根据权利要求2或权利要求5所述的细胞，其中所述TLR信号转导结构域具有与SEQID NO：8具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
7.根据权利要求2所述的细胞，其中所述TLR信号转导结构域是TLR3信号转导结构域或其功能性变体。
8.根据权利要求2或权利要求7所述的细胞，其中所述TLR信号转导结构域具有与SEQID NO：3具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
9.根据权利要求2所述的细胞，其中所述TLR信号转导结构域是TLR7信号转导结构域或其功能性变体。
10.根据权利要求2或权利要求9所述的细胞，其中所述TLR信号转导结构域具有与SEQID NO：7具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
11.根据权利要求2所述的细胞，其中所述TLR信号转导结构域是TLR4信号转导结构域或其功能性变体。
12.根据权利要求2或权利要求11所述的细胞，其中所述TLR信号转导结构域具有与SEQID NO：4具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
13.根据权利要求2所述的细胞，其中所述TLR信号转导结构域选自TLR1、TLR5、TLR6、TLR9或TLR10信号转导结构域或其功能性变体。
14.根据权利要求2或权利要求13所述的细胞，其中所述TLR信号转导结构域具有与SEQID NO：1、5、6、9或10中的任一项具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
15.根据权利要求1所述的细胞，其中所述TIR信号转导结构域是白介素-1受体(IL-1R)亚家族信号转导结构域。
16.根据权利要求15所述的细胞，其中所述IL-1R亚家族信号转导结构域是白介素-1受体(IL-1R)信号转导结构域或其功能性变体。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的细胞，其中所述IL-1R亚家族信号转导结构域具有与SEQ ID NO：21具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
18.根据权利要求15所述的细胞，其中所述IL-1R亚家族信号转导结构域是白介素-18受体(IL-18R)信号转导结构域或其功能性变体。
19.根据权利要求15或权利要求18所述的细胞，其中所述IL-1R亚家族信号转导结构域具有与SEQ ID NO：22具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
20.根据权利要求15所述的细胞，其中所述IL-1R亚家族信号转导结构域选自白介素-1受体4(IL-1R4)、白介素-1受体6(IL-1R6)、白介素-1受体3(IL-R3)、白介素-1受体7(IL-1R7)、白介素-1受体8(IL-R8)、白介素-1受体9(IL-1R9)或者白介素-1受体10(IL-1R10)信号转导结构域或其功能性变体。
21.根据权利要求15或权利要求20所述的细胞，其中所述IL-1R亚家族信号转导结构域具有与SEQ ID NO：143、144、145、146、147、148或149中的任一项具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的细胞，其中所述胞质部分包含CD3ζ信号转导结构域。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的细胞，其中所述胞质部分包含2B4信号转导结构域。
24.根据权利要求1至22中任一项所述的细胞，其中所述胞质部分缺少2B4信号转导结构域。
25.根据权利要求22所述的细胞，其中所述胞质部分以N末端至C末端的顺序基本由TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域组成。
26.根据权利要求22所述的细胞，其中所述胞质部分以N末端至C末端的顺序基本由2B4信号转导结构域、IL-18R信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域组成。
27.根据权利要求22所述的细胞，其中所述胞质部分以N末端至C末端的顺序基本由2B4信号转导结构域、CD3ζ信号转导结构域和TLR2信号转导结构域组成。
28.根据权利要求22所述的细胞，其中所述胞质部分以N末端至C末端的顺序基本由2B4信号转导结构域、TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域组成。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的细胞，其中所述胞外蛋白包含配体结合结构域。
30.根据权利要求29所述的细胞，其中所述配体结合结构域包含抗体样结构域。
31.根据权利要求30所述的细胞，其中所述配体结合结构域包含可变重链(VH)结构域和/或可变轻链(VL)结构域。
32.根据权利要求30所述的细胞，其中所述配体结合结构域包含单链可变片段(scFv)。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的细胞，其中所述配体结合结构域特异性结合CD19抗原。
34.根据权利要求33所述的细胞，其中所述配体结合结构域包含根据SEQ ID NO：76的CDR-H1；根据SEQ ID NO：77的CDR-H2；根据SEQ ID NO：78的CDR-H3；根据SEQ ID NO：79的CDR-L1；根据SEQ ID NO：80的CDR-L2；和/或根据SEQ ID NO：81的CDR-L3。
35.根据权利要求33所述的细胞，其中所述配体结合结构域包含根据SEQ ID NO：74的VL和/或根据SEQ ID NO：75的VL，或者具有与之具有至少55％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列的功能性变体。
36.根据权利要求33所述的细胞，其中所述配体结合结构域包含根据SEQ IDNO：73的scFv，或者具有与之具有至少55％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列的功能性变体。
37.根据权利要求29至32中任一项所述的细胞，其中所述配体结合结构域特异性结合CD20抗原。
38.根据权利要求37所述的细胞，其中所述配体结合结构域包含根据SEQ ID NO：139的scFv，或者具有与之具有至少55％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列的功能性变体。
39.根据权利要求29至32中任一项所述的细胞，其中所述配体结合结构域特异性结合HER2抗原。
40.根据权利要求39所述的细胞，其中所述配体结合结构域包含根据SEQ ID NO：140-142的scFv，或者具有与之具有至少55％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列的功能性变体。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的细胞，其中所述跨膜结构域包含具有多肽序列NLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFP(SEQ ID NO：41)的多肽，或具有1、2、3、4、5或更多个替换的变体。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的细胞，其中所述跨膜结构域是DNAM1、CD28、IL-2Rbeta、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、IL-1R或IL-18R跨膜结构域，或其功能性变体。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的细胞，其中所述CAR还包含铰链结构域，任选地其中所述铰链结构域是CD8a铰链、CD28铰链或IgG4铰链。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的细胞，其中所述细胞在所述细胞的含细胞因子可诱导的SH2的蛋白(CISH)基因中包含纯合失活突变。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的细胞，其中所述细胞是诱导的多潜能干细胞来源的自然杀伤(iPSC-NK)细胞。
46.药物组合物，其包含根据权利要求1至45中任一项所述的细胞和药物可用的溶液。
47.杀伤靶标细胞的方法，其包括使靶标细胞群体与根据权利要求1至45中任一项所述的自然杀伤细胞群体接触，
其中所述自然杀伤细胞的嵌合抗原受体包含特异性结合所述靶标细胞上的抗原的配体结合结构域，和
其中所述自然杀伤细胞诱导靶标细胞的特异性杀伤。
48.治疗对其有需要的受试者中癌症的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求46所述的药物组合物。
49.根据以上权利要求中任一项所述的自然杀伤细胞或药物组合物用于治疗癌症的用途。
50.嵌合抗原受体，其包含在以上所述的自然杀伤细胞中的任一个中。
51.多核苷酸，其包含编码包含在以上所述的自然杀伤细胞中的任一个中的嵌合抗原受体的多核苷酸序列。
52.载体，其包含根据权利要求51所述的多核苷酸。
53.干细胞或祖细胞，其包含根据权利要求51所述的多核苷酸。
54.制备自然杀伤细胞的方法，其包含提供包含根据权利要求51所述的多核苷酸的干细胞或祖细胞，并使所述干细胞或祖细胞分化成自然杀伤细胞。
55.自然杀伤细胞，其通过使包含根据权利要求51所述的多核苷酸的干细胞或祖细胞分化成自然杀伤细胞所产生。
56.根据权利要求29至32中任一项所述的细胞，其中所述配体结合结构域特异性结合CD19抗原、CD20抗原、Her2抗原或BCMA抗原。
57.嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外部分、跨膜结构域和胞质部分，其中所述胞质部分包含Toll/白介素-1(IL-1)受体(TIR)信号转导结构域。
58.根据权利要求57所述的CAR，其中所述TIR信号转导结构域是Toll样受体(TLR)信号转导结构域。
59.根据权利要求58所述的CAR，其中所述TLR信号转导结构域是TLR2信号转导结构域或其功能性变体。
60.根据权利要求58或59所述的CAR，其中所述TLR信号转导结构域具有与SEQ ID NO：2具有至少55％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的同一性的多肽序列。
61.根据权利要求57-60中任一项所述的CAR，其中所述胞质部分包含CD3ζ信号转导结构域。
62.根据权利要求57-61中任一项所述的CAR，其中所述胞质部分包含2B4信号转导结构域。
63.根据权利要求57-61中任一项所述的CAR，其中所述胞质部分缺少2B4信号转导结构域。
64.根据权利要求57-61中任一项所述的CAR，其中所述胞质部分以N末端至C末端的顺序基本由2B4信号转导结构域、IL-18R信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域组成。
65.根据权利要求57-61中任一项所述的CAR，其中所述胞质部分以N末端至C末端的顺序基本由2B4信号转导结构域、CD3ζ信号转导结构域和TLR2信号转导结构域组成。
66.根据权利要求57-61中任一项所述的CAR，其中所述胞质部分以N末端至C末端的顺序基本由2B4信号转导结构域、TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域组成。
67.根据权利要求57-66中任一项所述的CAR，其中所述胞外蛋白包含配体结合结构域。
68.根据权利要求67所述的CAR，其中所述配体结合结构域包含抗体样结构域。
69.根据权利要求67所述的CAR，其中所述配体结合结构域包含可变重链(VH)结构域和/或可变轻链(VL)结构域。
70.根据权利要求67所述的CAR，其中所述配体结合结构域包含单链可变片段(scFv)。
71.根据权利要求57-70中任一项所述的CAR，其中所述配体结合结构域特异性结合CD19抗原、CD20抗原、Her2抗原或BCMA抗原。
72.根据权利要求57所述的CAR，其中
(i)所述胞外结构域包含来源于CD19配体结合结构域、CD20配体结合结构域、BCMA结合结构域或者HER2结合结构域的多肽；
(ii)所述跨膜结构域是选自下列的跨膜结构域：aTM、CD8α链(CD8α)、CD28、CD16、NKp44、NKp46、NKG2、DNAM1、IL-2Rβ、TLR和IL-1R亚家族；且
(iii)所述胞质结构域包含TLR2、41BB或2B4的信号转导结构域。
73.根据权利要求72所述的CAR，其中所述胞质结构域还包含CD3ζ的信号转导结构域。
74.根据权利要求57所述的CAR，其包含
(i)aTM跨膜结构域、TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域；或者
(ii)CD28跨膜结构域、TLR2信号转导结构域和CD3ζ信号转导结构域。
75.根据权利要求57-74中任一项所述的CAR，其中所述胞外结构域的C末端在没有接头的情况下可操作性地连接至所述跨膜结构域的N末端或C末端。
76.根据权利要求57-74中任一项所述的CAR，其中所述胞外结构域的C末端通过接头或铰链结构域可操作性地连接至所述跨膜结构域的N末端或C末端。
77.根据权利要求76所述的CAR，其中所述铰链结构域是CD8a铰链。
78.根据权利要求77所述的CAR，其中所述CD8a铰链包含SEQ ID NO：158所示的氨基酸序列。
79.根据权利要求57-78中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域的N末端或C末端在使用或不使用接头的情况下可操作性地连接至所述胞质结构域的N末端。
80.根据权利要求79所述的CAR，其中所述跨膜结构域通过Gly-Ser接头可操作性地连接至所述胞质结构域。
81.多核苷酸，其包含编码根据权利要求57-80中任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
82.细胞群体，其包含免疫细胞，所述免疫细胞包含根据权利要求57-80中任一项所述的嵌合受体或者根据权利要求81所述的多核苷酸。
83.根据权利要求82所述的细胞群体，其中所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。
84.根据权利要求83所述的细胞群体，其中所述NK细胞是诱导的多潜能干细胞-来源的自然杀伤(iPSC-NK)细胞。
85.根据权利要求82-84中任一项所述的细胞群体，其中所述免疫细胞在含细胞因子可诱导的SH2的蛋白(CISH)基因中包含纯合失活突变。
86.根据权利要求82-84中任一项所述的细胞群体，其中所述免疫细胞是CISH-/-。
87.药物组合物，其包含根据权利要求82-86中任一项所述的细胞群体。
88.一种杀伤靶标细胞的方法，其包括将靶标细胞群体与根据权利要求82-86中任一项所述的细胞群体或者根据权利要求87所述的药物组合物接触，其中CAR的配体结合结构域特异性结合靶标细胞上的抗原，并且其中所述细胞诱导靶标细胞的特异性杀伤。
89.治疗对其有需要的受试者中癌症的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求86所述的药物组合物。
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