CN119300813A - 用于治疗冠状动脉钙化(cac)的维生素k2 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高剂量维生素K2，特别是甲萘醌‑7(MK‑7)，用于治疗冠状动脉钙化(CAC)评分≥400(例如在治疗开始时)的高风险受试者的冠心病，其中治疗导致冠状动脉中的钙化进展减缓。

Description

用于治疗冠状动脉钙化(CAC)的维生素K2

技术领域

本发明涉及新颖且令人惊讶的观察结果，即补充维生素K2降低严重冠状动脉钙化患者的冠状动脉钙化(CAC)的进一步进展。

背景技术

冠状动脉钙化(CAC)和CAC进展是急性心肌梗塞(AMI)和心血管死亡的有力预测指标。甲萘醌-7(MK-7)是一种维生素K2，是参与抑制动脉钙化的蛋白质羧化的辅助因子，并被认为可以降低主动脉瓣狭窄患者中主动脉瓣钙化(AVC)的进展速度。

此外，缺血性心脏病引起的死亡人数在男性和女性中分别占19％和20％，因此预防至关重要。缺血性心脏病通常不为人知，直到出现心肌梗塞的症状。然而，亚临床冠状动脉疾病很容易通过非造影心脏CT扫描为冠状动脉钙化(CAC)检测出来。CAC随着年龄而增加，并且男性的CAC评分高于女性。在没有CAC的人群中，未来患心血管疾病(CVD)的风险非常低，但随着CAC评分增加，缺血性心脏病的风险也会增加。因此，为了预防CVD，识别和治疗患有严重CAC的个体很重要。

血管钙化是一个缓慢进展的过程，是由促进和抑制血管壁钙沉积的机制之间的不平衡引起的，而维生素K依赖性蛋白质在这种抑制中起着至关重要的作用。最常见的K维生素是叶绿醌(维生素K1)，因为它对于激活几种凝血因子至关重要。甲萘醌(维生素K2)是另一种非常重要的维生素K种类。维生素K2被认为是与抑制动脉钙化相关的蛋白质(即基质-Gla蛋白(MGP))的γ-羧化所必需的。如果没有这些活化的蛋白质，细胞钙吸收的平衡以及骨骼和血管中的矿化过程就会受损。

维生素K2通过与乳糜微粒相关的淋巴进入循环，乳糜微粒直达肝脏。肝外分布通过LDL颗粒促进，其中长链甲萘醌的存在高于短链甲萘醌。所有表达LDL受体的组织都将成为维生素K2，尤其是长链甲萘醌，如MK-7的靶标(Schurgers,L.J.和C.Vermeer(2002)以及Shearer,M.J.和P.Newman(2008))。

体内有20种已知的维生素K依赖性蛋白质(VKDP)，其中维生素K2作为辅助因子通过羧化过程激活这些蛋白质(Simes,D.C.,et al.(2020))。基质Gla蛋白(MGP)在血管平滑肌细胞中表达，是血管钙化的强效抑制剂。基质Gla蛋白如何发挥作用的关键在于其羧基。基质Gla必须羧化才能正常发挥作用，维生素K2与γ-谷氨酰羧化酶一起作为这种酶促反应的辅助因子。在维生素K2存在的情况下，基质Gla蛋白会发生羧化，这意味着它被“开启”以排斥钙渗透。维生素K2不足会导致基质Gla羧化不足或“关闭”，这意味着它不能抑制钙渗透到软组织中。体内维生素K2状态的一种常用生物标志物是去磷酸化未羧化MGP(dp-ucMGP)。这种生物标志物是MGP的非活化形式，其水平高反映了维生素K2状态低，反之亦然。

几种VKDP具有抗炎功能，如蛋白质C、蛋白质S、Gas 6和GRP(Simes,D.C.,et al.(2020))。此外，还有数据显示了维生素K2的独立于γ-谷氨酰羧化酶的抗炎调节作用。通过使用人类单核细胞衍生的巨噬细胞，Pan及其同事发现，当细胞用维生素K2(甲萘醌-7)预处理时，细胞因子释放(TNF-α、IL-1α、IL-1β)受到抑制，科学家能够显示剂量反应关系(Pan,M.H.,et al.(2016))。其他研究组(Ohsaki,Y.,et al.(2006)和Reddi,K.,et al.(1995))发现IL-6也具有相似的抑制作用。促炎细胞因子的释放主要通过NF-kB信号通路调节，而维生素K被证明可以抑制NF-kB释放IkB，从而允许其进入细胞核(Ohsaki,Y.,et al.(2010),Ozaki,I.,et al.(2009),Xia,J.,et al.(2012))。

他汀类药物因其降脂作用和预防心血管事件而得到广泛使用。2015年，提出了一个有争议的假设，即他汀类药物的作用不仅抑制胆固醇的合成，而且通过抑制HMG-CoA还原酶也抑制了异戊烯中间体的水平，从而也抑制了体内维生素K1向K2的转化(Okuyama,H.,etal.(2015))。由于维生素K2对指向肝外组织的LDL颗粒具有更高的偏好，因此使用他汀类药物可能导致肝外维生素K缺乏，从而导致不同组织中VKDP的激活减少。一项横断面临床试验研究了他汀类药物的使用、CAC以及VKDP激活水平之间的联系。作者发现他汀类药物使用者的CAC评分更高，他们没有发现MGP的羧化状态有任何差异，然而，他们发现他汀类药物使用者的VKDP骨钙素的非羧化形式的水平明显更高(Zhelyazkova-Savova,M.D.,et al.(2021))。

目前，尚无关于补充维生素K2的建议。此外，众所周知，西方世界的维生素K2每日摄入量不足以满足完全活化MGP的要求。此外，尚无关于维生素K1或维生素K2毒性的记录，世界卫生组织也没有设定维生素K摄入量的公差上限。

最近的AVADEC试验研究了高剂量维生素K2补充剂对主动脉瓣钙化进展的影响，该试验发表于Diederichsen ACP et al.(2022)。该出版物披露了对主动脉瓣钙化评分超过300个任意单位的男性受试者的治疗。然而，在该研究中，主动脉瓣钙化进展并未显著减少。

EP1728507 A1在对大鼠的研究中披露，维生素K的高摄入可去除已经受到预先存在的钙化影响的血管中的钙化沉淀物。

EP2558084 B1在对大鼠的研究中公开了一种包含维生素K成分和烟酰胺成分的药物组合物，用于预防或治疗伴随骨外钙化的疾病。

WO19021232 A1涉及一种组合物，包含K族维生素或其类似物和衍生物、无机镁盐和铁(III)氧化物、复合物或盐、药物或食品级赋形剂、添加剂和/或共配方，用于在体外实验中治疗血管钙化的预防或治疗方法(实验模型由从大鼠主动脉中取出的钙化血管平滑肌细胞组成)。

WO19191773 A1公开了给哺乳动物施用维生素K，包括维生素K2，以快速逆转血管的钙化。WO19191773 A1进一步公开了对肾移植患者进行的临床研究，以便研究维生素K2补充剂对动脉硬化的有效性和安全性。

EP1728507 B1公开了使用维生素K2(例如与维生素D结合)来逆转大鼠模型中的血管钙化。

Geleijnse J.M.et al.(2004年)披露了饮食中甲萘醌对55岁及以上、基线时无心肌梗塞病史的男性和女性的主动脉钙化和冠心病(CHD)的影响。

Shea M.K.et al.(2009)披露了维生素K1(叶绿醌)补充剂对60-80岁之间老年男性和女性CAC进展的影响，这些男性和女性在基线时没有已知的冠心病(无症状)，并得出结论，维生素K1补充在与推荐量的钙和维生素D一起服用时，可以降低无症状老年男性和女性现有CAC的进展。

上述现有技术文献均未公开或建议对患有严重CAC(定义为CAC评分≥400，即患急性心肌梗塞(AMI)风险较高的患者)的受试者(例如人类患者)施用或补充维生素K2。

因此，为患有严重CAC(定义为CAC评分≥400)的患者亚组提供一种降低冠状动脉钙化进一步进展的治疗方法将是有利的。

发明内容

先前一项基于人群的研究(Diederichsen A.C.P.et al.(2012))对丹麦人群中CAC评分超过400的患病率进行了研究，结果表明2％的50岁男性的CAC评分超过400，而60岁男性中上升至14％。1％的50岁女性的CAC评分超过400，而60岁女性中上升至4％。此外，在随机选择的65-74岁丹麦男性和女性中，发现37.8％的男性和11.3％的女性的CAC评分>400(Kvist T.V.等人(2017))。

本发明就是在这种背景下构思出来的，它基于一个令人惊讶的观察结果：与安慰剂相比，补充维生素K2降低了患有严重CAC(定义为CAC评分≥400)的受试者(例如人类受试者)的CAC进展。具体而言，高剂量补充维生素K2和维生素D降低了患有严重CAC(定义为CAC评分≥400)的受试者(例如人类受试者)的CAC进展。

因此，本发明的一个目的涉及治疗该特定亚组的受试者(例如患者)，该亚组受试者定义为通过心脏CT扫描和通过使用所谓Agatston方法或类似的用于测定CAC的方法测定CAC评分≥400。

在第一方面，本发明提供维生素K2用于预防或治疗冠状动脉钙化(CAC)评分≥400的受试者的冠心病。

本发明还涉及维生素K2用于预防或治疗CAC评分≥400的受试者的冠心病，通过向所述受试者施用每天100μg-100mg维生素K2，优选每天200μg-50mg维生素K2，优选每天360μg-10mg维生素K2，优选每天360μg-5mg维生素K2，优选每天360-1440μg维生素K2、优选每天500-1000μg维生素K2、更优选每天720μg维生素K2，优选其中维生素K2与维生素D组合施用，优选每天1-50μg维生素D，每天10-50μg维生素D、优选每天25μg维生素D，例如其中预防或治疗导致冠状动脉的钙化进展减缓。

在另一方面，本发明提供维生素K2用于减缓冠状动脉钙化的进展。

在又一方面，本发明提供了维生素K2用于减缓冠状动脉中的钙化进展，其中，减缓冠状动脉的钙化进展是通过心脏CT扫描确和使用Agatston方法或类似的测定CAC的方法，测定的CAC评分降低至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8.9％。

在另一方面，本发明提供维生素K2用于减缓冠状动脉中钙化的进展，其中冠状动脉中钙化进展的减缓是干预组中钙化斑块(mm³)的进展降低至少1％、至少3％、至少9％、至少12％和至少12.7％。

在另一方面，本发明提供维生素K2用于减缓冠状动脉中钙化的进展，其中冠状动脉中钙化进展的减缓是干预组中非钙化斑块(mm³)进展减少至少1％、至少3％、至少5％、至少7％和至少8％。

在另一方面，本发明提供了维生素K2用于降低通过CAC评分衡量的冠状动脉中的钙化，通过心脏CT扫描和通过使用Agatston方法或类似的测定CAC的方法测定的CAC评分，与基线相比降低至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少4.8％。

在另一方面，本发明提供维生素K2用于降低冠状动脉中的总斑块体积，与基线相比降低至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13.1％。

在另一方面，本发明提供治疗CAC评分≥400的受试者的冠心病的方法，其中该方法涉及向所述受试者施用维生素K2。

本发明的另一方面涉及预防或治疗CAC评分≥400的受试者的冠状动脉钙化的方法，其中该方法涉及向所述受试者施用维生素K2。

本发明可涉及一种治疗CAC评分≥400的受试者的冠状动脉钙化的方法，通过向所述受试者施用每天100μg-100mg维生素K2、优选每天200μg-50mg维生素K2、优选每天360μg-10mg维生素K2、优选每天360μg-5mg维生素K2、优选每天360-1440μg维生素K2、优选每天500-1000μg维生素K2、优选每天720μg维生素K2，优选与维生素D组合施用，优选每天1-50μg维生素D，优选每天10-50μg维生素D，优选每天25μg维生素D。

另一方面涉及维生素K2在制造用于预防或治疗冠状动脉钙化(CAC)评分≥400的受试者的冠心病的药物中的用途。

另一方面涉及一种组件试剂盒，包含：

(A)维生素K2，和

(B)维生素D；

用于预防或治疗冠状动脉钙化(CAC)评分≥400的受试者的冠心病。

附图简要说明

图1显示了干预组和安慰剂组所有受试者(整个队列)从基线到24个月随访的CAC进展(203AU vs.254AU，p＝0.089)。

图2显示基线CAC评分<400AU的亚组的CAC进展。在基线CAC评分<400AU的受试者中，进展没有差异(77AU vs.81AU，p＝0.849)

图3显示了基线CAC评分≥400AU的亚组中CAC的进展。在基线CAC评分≥400AU的受试者中，24个月随访时CAC评分进展减缓(288AU vs.380AU，p＝0.047)。

图4显示了该队列中的斑块组成。具体而言，图4显示了分为两个亚组的总斑块组成：“钙化斑块负荷”和“非钙化斑块负荷”。后者进一步被描述为“低衰减斑块负荷”。(更多细节参见表3)

图5显示了经过24个月的维生素K2(Delta片剂，720μg/天)补充治疗，并辅以推荐日剂量的维生素D(25μg/天)(口服片剂)，安慰剂组的dp-ucMGP平均增加36.95pmol/L，而干预组为-229,4pmol/L(P<0.0001)。

图6a-c显示了经过24个月的维生素K2(Delta片剂，720μg/天)补充治疗，并辅以推荐日剂量的维生素D(25μg/天)(口服片剂形式)，在基线时，服用他汀类药物的患者与未服用他汀类药物的患者在dp-ucMGP的羧化状态方面没有差异(图6a)。在安慰剂组中，补充期间服用他汀类药物的患者与未服用他汀类药物的患者在dp-ucMGP的羧化状态方面没有差异(图6b)。在干预组中，未服用他汀类药物的患者的dp-ucMGP平均降低为-203.2pmol/L，而他汀类药物组为-239.8pmol/L(图6c)。

图7显示了经过24个月的维生素K2(Delta片剂，720μg/天)补充治疗，并辅以推荐日剂量的维生素D(25μg/天)(口服片剂)，安慰剂组非钙化斑块体积进展为46mm³，而干预组为-6mm³(p＝0.172)。安慰剂组钙化斑块体积进展为20mm³，而干预组为2mm³(p＝0.179)。安慰剂组总斑块体积进展为66mm³，而干预组为-4mm³(p＝0.146)。

图8a-b显示了在对整个人群进行24个月的维生素K2(Delta片剂，720μg/天)补充治疗，并辅以推荐日剂量的维生素D(25μg/天)(口服片剂)，从基线到24个月，安慰剂组132人中有7人CAC评分降低，而干预组143人中有13人CAC评分降低(p＝0.2533)(图8a)。在CAC评分≥400的患者中，从基线到24个月，安慰剂组76人中有3人CAC评分降低，而干预组85人中有10人CAC评分降低(p＝0.0858)(图8b)。

图9显示了经过24个月的维生素K2补充治疗(Delta片剂，720μg/天)，并辅以推荐日剂量的维生素D(25μg/天)(口服片剂)，许多患者的总斑块体积从基线到24个月有所降低。安慰剂组98人中有23人的总斑块体积降低，而干预组109人中有34人降低。

下面将更详细地描述本发明。

发明内容

在进一步详细讨论本发明之前，首先定义以下术语和约定

Agatston方法：本文中使用的CT图像中CAC评分量化系统为Agatston方法，该方法使用密度高于130HU(亨斯菲尔德尺度)的病变的加权总和，将钙化面积乘以与最大斑块衰减相关的因子：130-199HU，因子1；200-299HU，因子2；300-399HU，因子3；≥400HU，因子4(参见例如Neves PO et al.(2017)，其通过引用并入本文)。Agatston方法在本领域中是众所周知的。

CAC评分：本文使用的CAC是指“冠状动脉钙化”。要确定CAC评分，必须进行非造影CT扫描。CAC评分反映心脏动脉壁中的钙含量。该测试使用一种特殊类型的成像测试，称为心脏计算机断层扫描(CT)。该扫描会产生多张图片以检查是否存在钙，如果存在，则检查有多少。钙评分是根据CT扫描中观察到的斑块量(通过Agatston方法量化)计算得出的(另见Neves PO et al.(2017))。CAC评分在本领域中是众所周知的。

维生素K2：本文所用的维生素K2是指维生素K₂同源物中的任一种，甲萘醌-4(MK-4)、甲萘醌-5(MK-5)、甲萘醌-6(MK-6)、甲萘醌-7(MK-7)、甲萘醌-8(MK-8)、甲萘醌-9(MK-9)、甲萘醌-10(MK-10)、甲萘醌-11(MK-11)、甲萘醌-12(MK-12)或甲萘醌-13(MK-13)，或它们的组合。它们的侧链中异戊二烯基单元的数量n不同，范围从4到13，因此维生素K₂由多种形式组成。它以后缀(-n)表示，例如MK-7含有七个异戊二烯基单元。

维生素K2也指维生素K2的前药。合适的前药描述于例如WO2013/128037中。

冠心病在本文中可称为缺血性心脏病或冠状动脉疾病。

发明实施方式

本发明的一个实施方式涉及维生素K2用于预防或治疗冠心病，或一种用于预防或治疗受试者的冠心病的方法，受试者通过心脏CT扫描和使用Agatston方法或类似的用于测定CAC的方法，测定的冠状动脉钙化(CAC)评分≥400。通常，本文所述的预防或治疗可减缓冠状动脉中的钙化进展。

在本发明的实施方式和某些方面中，当提到CAC评分≥400时，通常是指在治疗开始时CAC评分≥400。如实施例中所讨论的，有益效果可见于在初始就表现出高CAC水平的受试者中。

维生素K2(例如MK-7)可以每天100μg-100mg维生素K2的剂量施用于受试者，优选每天200μg-50mg维生素K2，优选每天360μg-10mg维生素K2，优选每天360μg-5mg维生素K2，优选每天360-1440μg维生素K2，优选每天500-1000μg维生素K2，最优选每天720μg维生素K2。维生素K2的其他合适剂量包括每天至少100μg维生素K2，优选每天至少360μg维生素K2，例如每天至少500μg维生素K2。

因此，本发明的另一个实施方式涉及维生素K2用于预防或治疗冠状动脉钙化(CAC)评分≥400(例如，在治疗开始时)的受试者的冠心病的方法，所述受试者通过心脏CT扫描和使用Agatston方法或类似的测定CAC的方法测定，其中，所述受试者每天施用100μg-100mg维生素K2，优选每天200μg-50mg维生素K2，优选每天360μg-10mg维生素K2，优选每天360μg-5mg维生素K2，优选每天360-1440μg维生素K2，优选每天500-1000μg维生素K2，最优选每天720μg维生素K2。维生素K2的其他合适剂量包括每天至少100μg维生素K2，优选每天至少360μg维生素K2，例如每天至少500μg维生素K2。

本发明的另一个实施方式涉及维生素K2用于治疗受试者的冠心病，或一种治疗受试者的冠心病的方法，所述受试者通过心脏CT扫描和使用Agatston方法或类似的测定CAC的方法，测定的冠状动脉钙化(CAC)评分

≥400(例如在治疗开始时)，其中所述受试者每天施用100μg-100mg维生素K2，优选每天200μg-50mg维生素K2，优选每天360μg-10mg维生素K2，优选每天360μg-5mg维生素K2，优选每天360-1440μg维生素K2，优选每天500-1000μg维生素K2，最优选每天720μg维生素K2，与维生素D联合施用，优选每天1-50μg维生素D，优选每天10-50μg维生素D，优选每天25μg维生素D，优选地其中所述治疗导致冠状动脉中的钙化进展减缓。

本发明的另一个实施方式涉及维生素K2用于预防或治疗冠状动脉钙化(CAC)评分≥400的受试者的冠心病，通过心脏CT扫描和使用Agatston方法或类似方法测定CAC，其中受试者的去磷酸化未羧化基质Gla蛋白(dp-ucMGP)的血液浓度为433至2179pmol/L、433至500pmol/L、475至600pmol/L、550至700pmol/L、650至800pmol/L、750至900pmol/L、850至1000pmol/L、950至1250pmol/L、1200至1750pmol/L、1700至2000pmol/L、以及1950至2179pmol/L。

本发明的另一个实施方式涉及维生素K2用于预防或治疗冠状动脉钙化(CAC)评分≥400的受试者的冠心病，通过心脏CT扫描和使用Agatston方法或类似方法测定CAC，其中受试者的去磷酸化未羧化基质Gla蛋白(dp-ucMGP)的血液浓度为433至2179pmol/L、400至2000pmol/L，优选425至1500pmol/L，优选450至1250pmol/L，优选475至1000pmol/L，更优选500至900pmol/L。

在另一方面，本发明提供维生素K2用于减缓冠状动脉的钙化进展。

在又一方面，本发明提供维生素K2用于减缓冠状动脉的钙化进展，其中减缓冠状动脉钙化进展是指通过心脏CT扫描和使用Agatston方法或类似的测定CAC的方法，测定的CAC评分降低至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8.9％。

在又一方面，本发明提供了维生素K2用于减缓冠状动脉的钙化进展，其中减缓冠状动脉的钙化进展是指干预组中钙化斑块(mm³)的进展降低至少1％、至少3％、至少9％、至少12％和至少12.7％。

在另一方面，本发明提供维生素K2用于减缓冠状动脉钙化的进展，其中减缓冠状动脉钙化的进展是指干预组中非钙化斑块(mm³)的进展降低至少1％、至少3％、至少5％、至少7％和至少8％。

在另一方面，本发明提供维生素K2用于降低通过CAC评分衡量的冠状动脉中的钙化，通过心脏CT扫描及通过使用Agatston方法或类似的测定CAC的方法，测定的CAC评分以与基线相比降低至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少4.8％。

在另一方面，本发明提供维生素K2用于使冠状动脉中的总斑块体积与基线相比降低至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13.1％。

本发明的另一个实施方式涉及一种预防或治疗具有CAC评分≥400的受试者的冠心病的方法，所述CAC评分是通过心脏CT扫描和使用Agatston方法或类似的CAC测定方法测定，其中所述方法包括向所述受试者施用维生素K2。

本发明的另一个实施方式涉及一种预防或治疗CAC评分≥400的受试者的冠心病的方法，所述评分通过心脏CT扫描和使用Agatston方法或类似的CAC测定方法来测定，其中所述方法涉及向所述受试者施用维生素K2，其中维生素K2的施用剂量为每天100μg-100mg维生素K2，优选每天200μg-50mg维生素K2，优选每天360μg-10mg维生素K2，优选每天360μg-5mg维生素K2，优选每天360-1440μg维生素K2，优选每天500-1000μg，更优选每天720μg维生素K2。

本发明的另一个实施方式涉及一种预防或治疗CAC评分≥400的受试者的冠心病的方法，所述评分通过心脏CT扫描和使用Agatston方法或类似的CAC测定方法来测定，其中所述方法包括向所述受试者施用维生素K2，其中维生素K2的施用剂量为每天720μg维生素K2。其中维生素K2与维生素D组合施用，优选每天1-50μg维生素D，优选每天10-50μg维生素D，优选每天25μg维生素D。

本发明的另一个实施方式涉及一种预防或治疗CAC评分≥400的受试者的冠心病的方法，所述评分通过心脏CT扫描和使用Agatston方法或类似的CAC测定方法测定，其中所述方法包括向所述受试者施用维生素K2，其中维生素K2的施用剂量为每天720μg维生素K2。其中维生素K2与每日25μg维生素D组合施用，其中维生素K2选自维生素K2同源物，甲萘醌-4(MK-4)、甲萘醌-5(MK-5)、甲萘醌-6(MK-6)、甲萘醌-7(MK-7)、甲萘醌-8(MK-8)、甲萘醌-9(MK-9)、甲萘醌-10(MK-10)、甲萘醌-11(MK-11)、甲萘醌-12(MK-12)或甲萘醌-13(MK-13)中的任一种，或其组合。

本发明的另一个实施方式涉及一种预防或治疗CAC评分≥400的受试者的冠心病的方法，所述评分通过心脏CT扫描和使用Agatston方法或类似的CAC测定方法来测定，其中所述方法包括向所述受试者施用维生素K2，其中维生素K2的施用剂量为每天720μg维生素K2。其中维生素K2与每天25μg维生素D组合施用。其中维生素K2是甲萘醌-7(MK-7)。

本发明的另一个实施方式涉及一种预防或治疗CAC评分≥400的受试者的冠心病的方法，所述评分通过心脏CT扫描和使用Agatston方法或类似的CAC测定方法测定，其中所述方法包括向所述受试者施用维生素K2，其中维生素K2的施用剂量为每天720μg维生素K2。其中维生素K2与每天25μg维生素D组合施用。其中维生素K2为甲萘醌-7(MK-7)，其中维生素K2以注射或口服制剂施用。

本发明的另一个实施方式涉及一种减缓受试者冠状动脉钙化进展的方法，通过向所述受试者施用维生素K2，优选每天以甲萘醌-7(MK-7)形式施用720μg维生素K2。

本发明的另一个实施方式涉及一种降低受试者的冠状动脉中总的非钙化斑块体积的方法，通过向所述受试者施用维生素K2，优选每天以甲萘醌-7(MK-7)的形式施用720μg维生素K2。

本发明的另一个实施方式涉及一种降低受试者体内去磷酸化未羧化基质Gla蛋白(dp-ucMGP)血液浓度的方法，通过向所述受试者施用维生素K2，优选每天以甲萘醌-7(MK-7)的形式施用720μg维生素K2。

本发明的另一个实施方式涉及一种降低心血管事件(例如，心肌梗塞、血运重建和死亡)的方法，该方法适用于未发生过心肌梗塞、未进行过经皮冠状动脉介入治疗或冠状动脉搭桥手术的受试者，通过向所述受试者施用维生素K2，优选每天以甲萘醌-7(MK-7)的形式施用720μg维生素K2。

根据本发明施用的维生素K2可为任意维生素K2同源物，甲萘醌-4(MK-4)、甲萘醌-5(MK-5)、甲萘醌-6(MK-6)、甲萘醌-7(MK-7)、甲萘醌-8(MK-8)、甲萘醌-9(MK-9)、甲萘醌-10(MK-10)、甲萘醌-11(MK-11)、甲萘醌-12(MK-12)或甲萘醌-13(MK-13)，或其组合，优选甲萘醌-7(MK-7)。

本发明实施例中所施用的维生素D可以是维生素D1、维生素D2、维生素D3、维生素D4或维生素D5中的任一种，或它们的组合。维生素D的施用剂量通常为每天1-50μg，优选每天10-50μg，更优选每天25μg。其他适合的维生素D施用范围包括每天至少1μg维生素D，优选每天至少5μg维生素D，优选每天至少10μg维生素D。

维生素K2(以及可选的维生素D)可以作为药学上可接受的组合物施用，例如含有至少一种赋形剂。维生素K2还可以以微胶囊产品的形式施用，例如WO2015/169816中所述。

根据本发明的另一个实施方式，维生素K2源和/或维生素D源均可作为注射或口服制剂施用于受试者(例如患者)。优选维生素K2和维生素D的口服给药/制剂。

如果同时施用维生素K2和维生素D，则可以同时、单独或顺序施用。这适用于本发明的所有实施方式/方面，无论是使用的化合物、使用的试剂盒、方法、用途等。

本发明的化合物或组合可用于任何动物受试者，特别是哺乳动物，更具体地说，可用于人类或作为疾病模型的动物(例如小鼠、猴等)，优选人类。因此，优选地，受试者是人类受试者。

本发明还提供了包含维生素K2和维生素D的组合产品，用于预防或治疗冠状动脉钙化(CAC)评分≥400(例如在治疗开始时)的受试者的冠心病。

本发明还提供了一种组件试剂盒(例如多组件药物试剂盒)，包括

(A)维生素K2和

(B)维生素D；

用于预防或治疗冠状动脉钙化(CAC)评分≥400(例如在治疗开始时)的受试者的冠心病，例如其中治疗导致冠状动脉中的钙化进展减缓。例如，试剂盒的两个部分((A)和(B))可以是单独的口服制剂或单独的注射制剂。

根据本发明的又一实施方式，施用本发明所述剂量的维生素K2和/或维生素D的总时间为0.1-15年，优选0.5-10年，更优选1-5年，最优选2年。其他合适的时间包括至少0.1年，例如至少0.5年，例如至少1年，例如至少2年。

应当注意，在本发明的一个方面中描述的实施例和特征也适用于本发明的其他方面。

本申请中引用的所有专利和非专利参考文献均以引用的方式全文并入本文。

现在将在以下非限制性实施例中进一步详细描述本发明。

实施例

实施例1(所谓AVADEC试验的未发表子研究)

本发明基于所谓的AVADEC试验的子研究。在该子研究中，发明者检查了基线时无冠心病(无心肌梗塞和/或血运重建)的参与者的CAC进展情况。

评估了整个组和两个预先指定的亚组(低风险：CAC评分<400AU和高风险：基线时CAC≥400AU)中的CAC变化。

304名参与者(男性，平均年龄71岁)，无冠心病史，主动脉瓣钙化评分≥300，随机(1:1)接受维生素K2(Delta片剂，720μg/天)治疗，辅以推荐日剂量维生素D(25μg/天)，口服片剂或安慰剂治疗(无活性治疗)为期两年。Delta片剂是一种MK-7片剂配方。排除标准是接受维生素K拮抗剂治疗或凝血障碍。

在基线(0个月)、12个月和24个月的随访时进行非造影CT扫描。在基线(0个月)和24个月时进行造影CT扫描。使用成熟的软件测量CAC评分并以AU表示。在造影CT扫描中，使用Autoplaque进行定量冠状动脉斑块组成评估。有关更多详细信息，请参见实施例2。

除心血管疾病家族易感性外，干预组和安慰剂组在所有传统心血管风险因素方面均相似(14.4％vs.6.7％，p＝0.046)。发明者发现，从基线(0个月)到24个月的随访中，干预组和安慰剂组的CAC均有所进展(203AU vs.254AU，p＝0.089)(参见图1-3)。

基线(0个月)时CAC评分<400AU的患者进展情况相同(77AU vs.81AU，p＝0.846)。在CAC评分≥400的患者中，干预组的CAC进展明显较低(288AU vs.380AU，p＝0.047)。然而，对180名参与者的对比CT扫描的初步分析显示，非钙化斑块体积进展没有差异(10mm³vs.37mm³，p＝0.276)。此外，接受维生素K2和D的参与者的事件数量(全因死亡、心肌梗塞和冠状动脉血运重建)明显较低(1.9％vs.6.7％，p＝0.048)。

表1a.基线时患者特征(0个月)

表1b.基线(0个月)CAC评分的特征

基线	N	最小(AU)	最大(AU)	均值(AU)	中位数(AU)
						所有人群	304	0	6269	1034	641.5
安慰剂组	149	0	5687	1031	654.7
						干预组	155	0	6269	1037	636.4

表2.CAC评分进展。0至24个月期间CAC评分平均变化

表2a.整个组

安慰剂组的CAC评分增加了253.95，而维生素K2+D组的CAC评分增加了202.68。

表2b.基线CAC评分低于400的亚组

安慰剂组CAC评分增加了80.71，而维生素K2+D组增加了77.12，两组无显著差异。

表2c.基线CAC评分≥400的亚组.

安慰剂组的CAC评分增加了379.95，而维生素K2+D组的CAC评分增加了288.07。这相当于干预组的CAC评分进展显著降低了91.88。

表3.整个队列的斑块组成分析

表3中的分析未按CAC评分<400与CAC评分≥400进行划分。有关详细信息，请参见图4。

实施例2(通过多层计算机断层扫描确定CAC评分)

心脏CT扫描使用专用心脏CT扫描仪进行。根据常规临床护理进行标准非造影和造影扫描。

为了评估CAC评分，使用以下CT设置：120kV管电压，以及QRS复合波后300ms的前瞻性扫描。对比扫描期间的扫描方案取决于当地CT扫描仪和患者心率。对于心率稳定在每分钟60次(bpm)以上的患者，口服或静脉注射β受体阻滞剂，直到心率合适(如果可能低于60)，并使用前瞻性门控方案。对于尽管使用β受体阻滞剂进行预处理心率仍>70bpm或心律不齐的患者，在QRS复合波后200-400ms进行前瞻性扫描。

此外，在扫描前舌下注射硝酸盐。使用双头动力注射器以6.0mL/s的速度将50-80mL造影剂注入肘前静脉，然后注入60mL静脉生理盐水(6.0mL/s)。数据采集参数取决于本地CT扫描仪，但切片准直将低于0.6mm，机架旋转时间尽可能快，管电压为70或120kV(取决于患者的体重)。

所有扫描结果均送至核心实验室奥登塞大学医院进行分析。CAC评分采用Agatston方法测量，即汇总冠状动脉中的所有钙化点。

将根据美国心脏协会16段模型的分类，分析冠状动脉树，是否存在冠状动脉疾病(CAD)及其严重程度。冠状动脉斑块定义为冠状动脉腔内或附近的可见结构，可与血管腔和周围心包组织清晰区分。所有直径≥2mm且有斑块的冠状动脉段都将使用半自动化软件进行分析。扫描结果由经验丰富的心脏病专家进行分析。

实施例3(通过dp-ucMGP测量维生素K2状态)

就全部人群而言，dp-ucMGP的羧化状态范围为387pmol/L(最小值)至2179pmol/L(最大值)，平均值为773pmol/L，中位数为732pmol/L。在安慰剂组中，dp-ucMGP范围为387pmol/L(最小值)至1323pmol/L(最大值)，平均值为763pmol/L，中位数为718pmol/L。在干预组中，dp-ucMGP范围为456pmol/L(最小值)至2179pmol/L(最大值)，平均值为783pmol/L，中位数为736pmol/L。

对于CAC评分≥400的患者，dp-ucMGP的羧化状态范围为433pmol/L(min)至2179pmol/L(max)，平均值为789pmol/L，中位数为746pmol/L。在安慰剂组中，dp-ucMGP范围为433pmol/L(min)至1323pmol/L(max)，平均值为769pmol/L，中位数为728pmol/L。在干预组中，dp-ucMGP范围为456pmol/L(min)至2179pmol/L(max)，平均值为808pmol/L，中位数为751pmol/L。

表4

经过24个月的补充，安慰剂组的dp-ucMGP具有平均36.95pmol/L的增加，而干预组为-229,4pmol/L(P<0.0001)，(见图5)。

表5

实施例4(他汀类药物的使用)

在研究治疗与亚组相互作用的分层分析中，接受他汀类药物治疗的参与者的CAC评分进展通过干预显著降低(p＝0.048)。

表6

在基线时，服用他汀类药物的患者与未服用他汀类药物的患者在dp-ucMGP羧化状态方面没有差异(图6a)。在安慰剂组中，补充期间服用他汀类药物的患者与未服用他汀类药物的患者在dp-ucMGP羧化状态方面没有差异(图6b)。在干预组中，未服用他汀类药物的患者dp-ucMGP平均降低为-203.2pmol/L，而他汀类药物组为-239.8pmol/L(图6c)。

表7

实施例5(斑块体积和组成)

通过增强CT测量了整个队列的斑块体积和组成。只有良好和优秀的图像(在基线和24个月时)才被纳入分析。安慰剂组非钙化斑块体积进展为46mm³，而干预组为-6mm³(p＝0.172)。安慰剂组钙化斑块体积进展为20mm³，而干预组为2mm³(p＝0.179)。安慰剂组总斑块体积进展为66mm³，而干预组为-4mm³(p＝0.146)(见图7)。

表8基线时总斑块体积

表9基线时钙化斑块体积

表10基线时非钙化斑块体积

表11

实施例6(CAC评分和总斑块体积降低)

进行了分类分析，统计了从基线到24个月CAC评分降低的患者数量。对于整个人群，安慰剂组132人中有7人CAC评分降低，而干预组143人中有13人CAC评分降低(p＝0.2533)。在CAC评分≥400的患者中，安慰剂组76人中有3人CAC评分降低，而干预组85人中有10人CAC评分降低(p＝0.0858)(见图8a-b)。

此外，还进行了分类分析，统计了从基线到24个月总斑块体积降低的患者数量(所有图像质量)。安慰剂组98人中有23人的总斑块体积降低，而干预组109人中有34人的总斑块体积降低(p＝0.2753)(见图9)。

实施例7(心血管事件发生率)

随访期间共有13名参与者发生临床安全事件。安慰剂组中事件发生率(心肌梗塞、血管重建和全因死亡的综合事件发生率)为10人(6.7％)，而维生素K2和D组为3人(1.9％)(p＝0.048)。

表12

参考文献：

Diederichsen A.C.P.et al.(2012):(DanRisk study)“Discrepancy betweencoronary arterycalcium score and HeartScore inmiddle-aged Danes:the DanRiskstudy”,(Eur J Prev Cardiol.2012Jun；19(3):558-64)

Diederichsen A.C.P.et al.(2022):“Vitamin K2 and D in Patients WithAortic Valve Calcification:A Randomized Double-Blinded Clinical Trial”,Circulation.25April 2022；145:1387-1397.

Geleijnse J.M.et al.(2004):”Dietary intake of menaquinone isassociated with reduced risk of coronary heart disease:The Rotterdam study”,American Society for Nutritional Sciences:3100-3105.

Kvist T.V.et al.(2017):(DANCAVAS pilot study),“The DanCavas PilotStudy of Multifaceted Screening for SubclinicalCardiovascular Disease in Menand Women Aged 65-74Years”,Eur J Vasc Endovasc Surg(2017)53,123-131.

Ohsaki,Y.,et al.,Vitamin K suppresses the lipopolysaccharide-inducedexpression of inflammatory cytokines in cultured macrophage-like cells viathe inhibition of the activation of nuclear factor kappaB through therepression ofIKKalpha/beta phosphorylation.J Nutr Biochem,2010.21(11):p.1120-6.

Okuyama,H.,et al.,Statins stimulate atherosclerosis and heartfailure:pharmacological mechanisms.Expert Rev Clin Pharmacol,2015.8(2):p.189-99.

Ozaki,I.,et al.,Menatetrenone,a vitamin K2 analogue,inhibitshepatocellular carcinoma cell growth by suppressing cyclin D1 expressionthrough inhibition of nuclear factor kappaB activation.Clin Cancer Res,2007.13(7):p.2236-45.

Pan,M.H.,et al.,Inhibition of TNF-alpha,IL-1alpha,and IL-1beta byPretreatment of Human Monocyte-Derived Macrophages with Menaquinone-7 andCell Activation with TLR Agonists In Vitro.J Med Food,2016.19(7):p.663-9.

Schurgers,L.J.and C.Vermeer,Differential lipoprotein transportpathways of K-vitamins in healthy subjects.Biochim Biophys Acta,2002.1570(1):p.27-32.

Shea M.K.et al.(2009):“Vitamin K supplementation and progression ofcoronary artery calcium in older men and women”,Am J Clin Nutr 2009；89:1799-1807.

Shearer,M.J.and P.Newman,Metabolism and cell biology of vitaminK.Thromb Haemost,2008.100(4):p.530-47.

Simes,D.C.,et al.,Vitamin K as a Diet Supplement with Impact in HumanHealth:Current Evidence in Age-Related Diseases.Nutrients,2020.12(1).

Xia,J.,et al.,The role of PKC isoforms in the inhibition ofNF-kappaBactivation by vitamin K2 in human hepatocellular carcinoma cells.J NutrBiochem,2012.23(12):p.1668-75.

Zhelyazkova-Savova,M.D.,et al.,Statins,vascular calcification,andvitamin K-dependent proteins:Is there a relation？Kaohsiung J Med Sci,2021.37(7):p.624-631.

Claims (16)

1.维生素K2用于预防或治疗冠状动脉钙化(CAC)评分为≥400的受试者的冠心病，所述受试者经心脏CT扫描确定和通过使用Agatston法或类似方法确定CAC。

2.维生素K2用于预防或治疗受试者的冠心病，所述受试者的去磷酸化未羧化基质Gla蛋白(dp-ucMGP)的血液浓度为433至2179pmol/L。

3.根据权利要求2所述的维生素K2，其中去磷酸化未羧化基质Gla蛋白(dp-ucMGP)的血液浓度为433至500pmol/L、475至600pmol/L、550至700pmol/L、650至800pmol/L、750至900pmol/L、850至1000pmol/L、950至1250pmol/L、1200至1750pmol/L、1700至2000pmol/L和1950至2179pmol/L。

4.根据权利要求2所述的维生素K2，其中去磷酸化未羧化基质Gla蛋白(dp-ucMGP)的血液浓度为400至2000pmol/L，优选425至1500pmol/L，优选450至1250pmol/L，优选475至1000pmol/L，更优选500至900pmol/L。

5.维生素K2用于预防或治疗正在接受他汀类药物治疗的受试者的冠心病。

6.根据权利要求1-5任一项所述用途的维生素K2，所述受试者每天施用100μg-100mg，优选每天200μg-50mg维生素K2，优选每天360μg-10mg维生素K2，优选每天360μg-5mg维生素K2，优选每天360-1440μg维生素K2，优选每天500-1000μg，更优选每天720μg维生素K2。

7.根据权利要求1-6任一项所述用途的维生素K2，其中维生素K2与维生素D组合施用，优选每天1-50μg维生素D，更优选每天10-50μg维生素D，最优选每天25μg维生素D。

8.根据权利要求1-7任一项所述用途的维生素K2，其中维生素K2选自维生素K2同源物，甲萘醌-4(MK-4)、甲萘醌-5(MK-5)、甲萘醌-6(MK-6)、甲萘醌-7(MK-7)、甲萘醌-8(MK-8)、甲萘醌-9(MK-9)、甲萘醌-10(MK-10)、甲萘醌-11(MK-11)、甲萘醌-12(MK-12)或甲萘醌-13(MK-13)中的任一种，或其组合。

9.根据权利要求1-8任一项所述用途的维生素K2，其中所述与维生素K2组合施用的维生素D选自维生素D1、维生素D2、维生素D3、维生素D4或维生素D5中的任一种，或其组合。

10.根据权利要求1-9任一项所述用途的维生素K2，其中维生素K2作为注射或口服制剂施用。

11.维生素K2用于减缓冠状动脉中的钙化进展。

12.根据权利要求11所述用途的维生素K2，其中所述冠状动脉中的钙化进展的减缓是指通过心脏CT扫描和使用Agatston法或类似的CAC测定方法测定的CAC评分降低至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8.9％。

13.根据权利要求11所述用途的维生素K2，其中所述冠状动脉中的钙化进展的减缓是指干预组中钙化斑块(mm³)的进展降低至少1％、至少3％、至少9％、至少12％、和至少12.7％。

14.根据权利要求11所述用途的维生素K2，其中所述冠状动脉的钙化进展的减缓是干预组中非钙化斑块(mm³)的进展降低至少1％、至少3％、至少5％、至少7％和至少8％。

15.维生素K2用于降低冠状动脉的钙化，其通过心脏CT扫描和使用Agatston法或类似的CAC测定方法测定的CAC评分与基线相比至少减少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少4.8％。

16.维生素K2用于使冠状动脉中的总斑块体积，与基线相比降低了至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13.1％。