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CN119306837A - 一种抗cd276的纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种抗cd276的纳米抗体及其应用 Download PDF

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CN119306837A CN202411434598.5A CN202411434598A CN119306837A CN 119306837 A CN119306837 A CN 119306837A CN 202411434598 A CN202411434598 A CN 202411434598A CN 119306837 A CN119306837 A CN 119306837A
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Abstract

本发明涉及一种抗CD276的纳米抗体，所述抗CD276的纳米抗体包括互补决定区CDR和框架区FR；其中，所述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1‑CDR3；所述框架区FR包括框架区FR1‑FR5。本发明提供的抗人CD276纳米抗体具有与CD276抗原免疫反应特性，且特异性好、亲和力高，可应用于制备CD276检测试剂或抗肿瘤药物等，本发明提供的抗人CD276纳米抗体可以作为CAR的抗原识别结构域进而进行CAR‑T细胞的构建，其对表达CD276抗原的多种肿瘤细胞系具有显著杀伤作用；本发明提供的抗人CD276纳米抗体可以用于检测肿瘤组织中CD276的表达。

Description

一种抗CD276的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物基因领域，特别是涉及一种抗CD276的纳米抗体及其应用。
背景技术
CD276(Recombinant cluster of differentiation 276)，又称B7-H3，是I型跨膜糖蛋白，分子量为45-66kDa，其与B7-H1(PD-L1)有相似的分子结构，是B7-CD28家族重要的免疫检查点分子。CD276主要以膜蛋白和可溶形式存在，其中，可溶形式由膜蛋白经金属蛋白酶剪切而来。此外，在外泌体和其他胞外小泡中也发现了CD276蛋白。CD276在免疫系统中可能发挥共刺激和共抑制的双重作用：一方面，其具有对CD4+和CD8+T细胞的共刺激作用，作为一种共刺激分子，CD276信号诱导细胞免疫，促进细胞因子IFN-γ、IL-8、TNF-α等的分泌，增强CD8+T细胞的细胞毒作用；另一方面，其可以抑制Treg细胞，从而使肿瘤逃逸免疫反应，其机制可能与T细胞表面受体调节基因转录的NFAT、NFκB和AP-1因子三个主要信号通路相关。已有大量研究证实CD276在多种类型的癌症中广泛表达，其与肿瘤不良预后的相关性也被确认。目前CD276抗体的临床应用研究主要有针对肿瘤的抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugates，ADC)、抗体介导的细胞毒(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)药物、双特异性及三特异性抗体、嵌合抗原受体T细胞(chimericantigen receptor T，CAR-T)治疗等。
重链抗体是1989年于骆驼科动物体内发现的一类缺失轻链和重链恒定区1(constant domain of heavy chain，CH1)的一类新型抗体。纳米抗体克隆自重链抗体的重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody，VHH)，晶体直径仅2.5nm，分子量12-15kDa，是目前已知的分子量最小的抗体。纳米抗体与传统抗体相比优势在于：1、纳米抗体具有更长的第三抗原互补决定区，维持了与正常双链抗体相似的抗原结合能力且能够更好地和抗原表位结合。2、纳米抗体内部普遍存在环间二硫键，在高温和更高浓度的有机溶剂中稳定性更强。3、纳米抗体的第二骨架区含有四个保守的亲水性氨基酸突变，导致其具有亲水性，不易发生聚集，影响抗原识别。4、纳米抗体体积小，能够更好地渗透致密的肿瘤组织，应用于实体瘤治疗。5、纳米抗体只有重链可变区，在多个纳米抗体联合使用时，不会发生重链和轻链的交叉反应，影响抗体治疗效果。6、纳米抗体来自骆驼科，与人源抗体相似度极高，免疫原性低，在治疗时不会产生中和抗体。
目前市面上报道的针对CD276的抗体绝大部分都是由重链可变区(variabledomain of heavy chain of heavy chain antibody，VHH)和轻链可变区组成的单链抗体(single chain fragment variable，scFv)。scFv抗体大小几乎是VHH抗体的两倍，并且在scFv中，FR2中的四个残基形成疏水界面，这个疏水区虽然促进了VH-VL的连接，但是降低了scFv的溶解度，导致它们有很高的聚集倾向，相比VHH抗体，scFv抗体不容易溶解，可能影响对抗原的识别。scFv的另一个重大缺点是它们大部分来源于啮齿类动物，因为杂交瘤技术只在小鼠和大鼠身上得到很好的发展。小鼠VL和VH与人类相应区域的序列同源性分别只有53％和51％，而VHH抗体与人类VH(VH3基因家族)显示出很高的序列相似性，约75-90％的同源性，因此VHH抗体的人性化程度更高，免疫原性更低。鼠源scFv抗体即使在人源化之后，其可变区仍能引起抗独特型反应，不利于免疫治疗。
综上所述，亟需研发一种新的技术方案，以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
基于纳米抗体的优势，本发明成功构建了人CD276胞外段蛋白免疫的羊驼噬菌体抗体库，并从中筛选出了2条新的抗CD276的纳米抗体的VHH序列。我们实验发现该纳米抗体既可以做细胞流式又可以做组织的免疫组化来检测人CD276抗原，因此具有检测CD276抗原的应用前景；同时，该纳米抗体序列可制备成嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)，并可以有效地杀伤CD276阳性的肿瘤细胞，因此具有应用于靶向CD276阳性细胞的免疫治疗方面的前景。
本发明所涉及的术语“嵌合抗原受体”，是指一种人造受体，经过基因工程改造，赋予免疫细胞(如T淋巴细胞)靶向特定抗原的新能力。这些受体是嵌合的，因为它们将抗体中特异性识别抗原的结构域和T细胞激活功能域结合到一个受体中。
本发明所涉及的术语“重链CDR”，即，重链的互补决定区，是指抗体重链可变区的核心保守结构，是决定抗体结合抗原的关键区域，包括CDR1、CDR2和CDR3。
本发明所涉及的术语“框架区FR”，是VHH抗体中除CDR区外的序列。
本发明的一个目的在于，提供一种抗CD276的纳米抗体，所述抗CD276的纳米抗体包括互补决定区CDR和框架区FR；
其中，
所述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1-CDR3；
所述互补决定区CDR1-CDR3分别如氨基酸序列1-3所示；
所述氨基酸序列1-3如SEQ ID No.1-SEQ ID No.3所示。
进一步地，所述框架区FR包括框架区FR1-FR5；
其中，
所述框架区FR1-FR5分别如氨基酸序列4-8所示；
所述氨基酸序列4-8如SEQ ID No.4-SEQ ID No.8所示。
进一步地，所述抗CD276的纳米抗体的氨基酸序列为CD276-VHH1或CD276-VHH2；所述CD276-VHH1和CD276-VHH2如SEQ ID No.9-SEQ ID No.10所示。
进一步地，所述抗CD276的纳米抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其组合。
本发明的另一个目的在于，提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述抗CD276的纳米抗体。
进一步地，所述核酸分子包括核酸序列SEQ ID No.11或SEQ ID No.12。
本发明的另一个目的在于，提供一种载体，所述载体包括上述抗CD276的纳米抗体。
进一步地，所述载体选自DNA分子、mRNA分子或细胞。
本发明的另一个目的在于，提供所述载体在抗原检测、吸附抗原试剂和免疫治疗中的应用。
进一步地，所述抗原检测为CD276抗原检测。
进一步地，所述免疫治疗为针对CD276阳性细胞免疫治疗。
噬菌体展示技术是最常用的纳米抗体生产方法，通过基因工程从天然、免疫或合成抗体库中获取cDNA。将该DNA插入到噬菌体外壳蛋白的合适位置，与外壳蛋白形成融合蛋白一同表达到噬菌体表面，然后筛选能与抗原结合的蛋白。采用免疫抗体库筛选抗体，特异性高且更容易获得高亲和力抗体。
因此，本发明基于发明人团队构建的人CD276蛋白胞外段免疫的羊驼噬菌体抗体展示库筛选抗CD276的纳米抗体，可较好地应用于针对CD276阳性肿瘤细胞的免疫治疗。
本发明发现了两条全新的抗人CD276纳米抗体序列，该序列与其他纳米抗体序列完全不同，其可用于CD276抗原的识别、CD276阳性细胞的内吞、CAR-T细胞的构建和对CD276阳性细胞的杀伤。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种抗CD276的纳米抗体，所述抗CD276的纳米抗体包括重链CDR1-CDR3。本发明首先表达纯化CD276胞外段多肽，并使其具有免疫原性，然后将CD276胞外段多肽偶联在酶标板上，展示该蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选CD276胞外段免疫的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了CD276特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株；我们的前期实验发现本发明方法筛选得到的CD276纳米抗体具有与CD276抗原免疫反应的特性，且特异性好、亲和力高，可应用于制备CD276检测试剂或抗肿瘤药物等，例如本发明提供的抗人CD276纳米抗体可以作为CAR的抗原识别结构域进而进行CAR-T细胞的构建，其对表达CD276抗原的多种肿瘤细胞系具有显著杀伤作用；本发明提供的抗人CD276纳米抗体可被CD276表达阳性的细胞内吞；另外，本发明提供的抗人CD276纳米抗体可以用于检测肿瘤组织中CD276的表达。
附图说明
图1示出了VHH片段扩增的PCR凝胶电泳结果；
其中，
图1(a)示出了第一轮PCR产物跑胶结果；
图1(b)示出了第二轮PCR产物跑胶结果。
图2示出了文库插入率检测结果。
图3示出了抗体序列比对结果。
图4示出了phage-ELISA验证结果；
其中，
图4(a)示出了第一板96孔板中ELISA显色阳性的克隆在酶标仪450nm处的读值，NC代表阴性对照，1-10代表10个不同的克隆；
图4(b)示出了第二板96孔板中ELISA显色阳性的克隆在酶标仪450nm处的读值，NC代表阴性对照，1-10代表10个不同的克隆。
图5示出了阳性克隆噬菌体上清液的流式结果；
其中，
图5(a)分别示出了CD276-VHH1与HepG2、Hela和Raji细胞的流式结果；
图5(b)分别示出了CD276-VHH2与HepG2、Hela和Raji细胞的流式结果。
图6示出了构建PMIGV-CD276-VHH1-mIgGFc和PMIGV-CD276-VHH2-mIgGFc载体质粒示意图；
其中，
图6(a)示出了构建PMIGV-CD276-VHH1-mIgGFc载体质粒示意图；
图6(b)示出了构建PMIGV-CD276-VHH2-mIgGFc载体质粒示意图。
图7示出了测试例1载体构建的核酸电泳图；
其中，
图7(a)示出了第一次PCR的核酸电泳图；
图7(b)示出了第二次PCR的核酸电泳图。
图8示出了载体测序比对结果；
其中，
图8(a)示出了PMIGV-CD8 signal peptide-CD276-VHH1-mIgGFc载体测序比对结果；
图8(b)示出了PMIGV-CD8 signal peptide-CD276-VHH2-mIgGFc载体测序比对结果。
图9示出了酶切验证质粒结果；
其中，
图9(a)示出了图8(a)中CD276-VHH1的表达载体的XhoI和EcoRI双酶切验证结果；
图9(b)示出了图8(b)中CD276-VHH2的表达载体的XhoI和EcoRI双酶切验证结果。
图10示出了Western blot验证CD276-VHH1-mIgGFc蛋白和CD276-VHH2-mIgGFc蛋白的表达和浓缩；
其中，
图10(a)示出了CD276-VHH1-mIgGFc蛋白未浓缩(1X)和浓缩后(10X)的表达情况；
图10(b)示出了CD276-VHH2-mIgGFc蛋白未浓缩(1X)和浓缩后(10X)的表达情况。
图11示出了流式细胞术验证肿瘤细胞中CD276的表达；
其中，
图11(a)示出了CD276在Raji细胞中的表达；
图11(b)示出了CD276在293T细胞中的表达；
图11(c)示出了CD276在Hela细胞中的表达；
图11(d)示出了CD276在HepG2细胞中的表达；
图11(e)示出了CD276在KYSE270细胞中的表达；
图11(f)示出了CD276在KYSE30细胞中的表达。
图12示出了CD276阳性肿瘤细胞的荧光强度；
其中，
图12(a)示出了HepG2、KYSE270、KYSE30、Hela和Raji几种肿瘤细胞中CD276的表达强度；
图12(b)示出了HepG2、KYSE270、KYSE30、Hela和Raji几种肿瘤细胞中CD276的平均表达荧光强度。
图13示出了CD276纳米抗体与CD276阳性细胞系的结合情况；
其中，
图13(a)分别示出了CD276-VHH1、CD276-VHH2与Raji细胞系的结合情况；
图13(b)分别示出了CD276-VHH1、CD276-VHH2与HepG2细胞系的结合情况；
图13(c)分别示出了CD276-VHH1、CD276-VHH2与Hela细胞系的结合情况；
图13(d)分别示出了CD276-VHH1、CD276-VHH2与KYSE270细胞系的结合情况；
图13(e)分别示出了CD276-VHH1、CD276-VHH2与KYSE30细胞系的结合情况。
图14示出了流式细胞术检测CD276-VHH1-mIgGFc和CD276-VHH2-mIgGFc在不同浓度梯度下与Hela细胞的结合效果；
其中，
图14(a)示出了Hela分别单独与CD276-VHH1和CD276-VHH2一抗、二抗、商业化抗体的结合；
图14(b)示出了分别以200μl、50μl、10μl和2μl体积的CD276-VHH1融合蛋白做一抗时的检测效果；
图14(c)示出了分别以200μl、50μl、10μl和2μl体积的CD276-VHH2融合蛋白做一抗时的检测效果。
图15示出了CAR慢病毒载体质粒示意图；
其中，
图15(a)示出了pEF-CD276-VHH1-CAR慢病毒载体质粒示意图；
图15(b)示出了pEF-CD276-VHH2-CAR慢病毒载体质粒示意图。
图16示出了测试例2载体构建电泳图。
图17示出了质粒测序比对图；
其中，
图17(a)示出了pEF-CD276-VHH1-CAR质粒测序比对图；
图17(b)示出了pEF-CD276-VHH2-CAR质粒测序比对图。
图18示出了CAR慢病毒滴度测定结果；
其中，
图18(a)示出了流式细胞术对CD276-VHH1-CAR慢病毒滴度的测定；
图18(b)示出了流式细胞术对CD276-VHH2-CAR慢病毒滴度的测定。
图19示出了PBMC中淋巴细胞核CD3+T细胞磁珠分选效率；
其中，
图19(a)示出了分选前PBMC中CD3+T细胞的比例；
图19(b)示出了经过CD3/CD28磁珠分选后PBMC中CD3+T细胞的比例。
图20示出了慢病毒感染后CAR-T细胞的阳性率；
其中，
图20(a)示出了CD276-VHH1组慢病毒感染后CAR-T细胞的阳性率；
图20(b)示出了CD276-VHH2组慢病毒感染后CAR-T细胞的阳性率。
图21示出了CD276-VHH1-CAR-T细胞和CD276-VHH2-CAR-T细胞在不同效靶比下对五种肿瘤细胞的杀伤作用；
其中，
图21(a)示出了对Raji细胞的杀伤作用；
图21(b)示出了对HepG2细胞的杀伤作用；
图21(c)示出了对KYSE30细胞的杀伤作用；
图21(d)示出了对Hela细胞的杀伤作用；
图21(e)示出了对KYSE270细胞的杀伤作用。
图22示出了CAR-T细胞杀伤过程中IFN-γ的分泌；
其中，
图22(a)示出了CAR-T对Raji细胞杀伤过程中IFN-γ的分泌；
图22(b)示出了CAR-T对HepG2细胞杀伤过程中IFN-γ的分泌；
图22(c)示出了CAR-T对KYSE30细胞杀伤过程中IFN-γ的分泌；
图22(d)示出了CAR-T对Hela细胞杀伤过程中IFN-γ的分泌；
图22(e)示出了CAR-T对KYSE270细胞杀伤过程中IFN-γ的分泌；
图22(f)示出了IFN-γ的ELISA检测标准曲线。
图23示出了Raji细胞CD276-VHH1/VHH2内吞(50μg)结果；
其中，
图23(a)示出了Raji细胞CD276-VHH1内吞(50μg)结果；
图23(b)示出了Raji细胞CD276-VHH2内吞(50μg)结果。
图24示出了Hela细胞CD276-VHH1/VHH2内吞(50μg)结果；
其中，
图24(a)示出了Hela细胞CD276-VHH1内吞(50μg)结果；
图24(b)示出了Hela细胞CD276-VHH2内吞(50μg)结果。
图25示出了HCT116细胞CD276-VHH1/VHH2内吞(50μg)结果；
其中，
图25(a)示出了HCT116细胞CD276-VHH1内吞(50μg)结果；
图25(b)示出了HCT116细胞CD276-VHH2内吞(50μg)结果。
图26示出了商业化CD276抗体(Proteintech Cat No:66481-1-Ig)与食管癌组织的结合情况；可作为阳性对照。
图27示出了CD276-VHH1与食管癌的结合情况。
图28示出了CD276-VHH2与食管癌的结合情况。
图29示出了纳米抗体与食管癌组织的结合情况的阴性对照。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，列举如下实施例。实施例中所出现的原料、反应和后处理手段，除非特别声明，均为市面上常见原料，以及本领域技术人员所熟知的技术手段。
实施例
一种抗CD276的纳米抗体，所述抗CD276的纳米抗体包括互补决定区CDR和框架区FR；
其中，
所述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1-CDR3；
所述互补决定区CDR1-CDR3分别如氨基酸序列1-3所示；
所述氨基酸序列1-3如SEQ ID No.1-SEQ ID No.3所示；
所述框架区FR包括框架区FR1-FR5；
所述框架区FR1-FR5分别如氨基酸序列4-8所示；
所述氨基酸序列4-8如SEQ ID No.4-SEQ ID No.8所示；
所述抗CD276的纳米抗体的氨基酸序列为CD276-VHH1或CD276-VHH2；
所述CD276-VHH1和CD276-VHH2如SEQ ID No.9-SEQ ID No.10所示。
一种编码上述抗CD276的纳米抗体的核酸分子，包括核酸序列SEQ ID No.11或SEQID No.12。
上述抗CD276的纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：
S1、噬菌体文库的构建
从羊驼PBMC中进行RNA的提取，使用诺维赞RNA反转录试剂盒(HiScriptⅡQSelect RT SuperMix for qPCR R232)进行RNA反转录，反应液配制体系和RNA反转录配制体系分别如表1和表2所示。
表1反应液配制体系
试剂 使用量
Oligo dT Primer(50μM) 1μl
dNTP Mix 1μl
总RNA 5μg
ddH2O 最高10μl
表2RNA反转录配制体系
试剂 使用量
反应液 10μl
5×PrimeScript II Buffer 4μl
RNase Inhibitor 0.5μl
PrimeScript II RTase 1μl
ddH2O 最高20μl
以cDNA为模板，使用诺维赞生物科技公司的2*Phanta Max Master Mix通过PCR扩增VHH第一轮，PCR扩增VHH反应体系如表3所示。
表3PCR扩增VHH反应体系
试剂 使用量
2*Phanta Max Master Mix 10μl
Primer1 0.4μl
Primer2 0.4μl
cDNA 0.6μl
ddH2O 最高20μl
反应结束后，取20μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并在600bp大小处进行胶回收纯化得到VHH产物，PCR凝胶电泳结果如图1所示。
图1示出了VHH片段扩增的PCR凝胶电泳结果；
其中，
图1(a)示出了第一轮PCR产物跑胶结果，M(Marker)为诺唯赞DL5000 DNA Marker，条带分别是5k、3k、2k、1.5k、1k、750bp、500bp、250bp、100bp；
图1(b)示出了第二轮PCR产物跑胶结果，Marker同图1(a)。
通过Goldengate连接VHH和噬菌体载体，反应体系如表4所示。
表4VHH和噬菌粒载体连接体系
将连接产物进行电转化，电压：2477V；时间：4.6ms；库容：1.1x108 cfu。使用载体上引物检测文库阳性率并测序，文库插入率检测结果如图2所示。
图2示出了文库插入率检测结果；结果显示文库插入率为100％。
从菌落PCR检测的阳性克隆中随机挑选数个克隆送测序，将测序结果中轻链抗体片段翻译成氨基酸序列后进行序列比对，检测细菌文库中序列多样性，抗体序列比对结果如图3所示。
图3示出了抗体序列比对结果；结果显示，这些序列不同，且是羊驼抗体重链可变区序列。
S2、噬菌体抗体库制备和纳米抗体的淘选
使用辅助噬菌体对甘油菌进行扩增并检测滴度得到噬菌体抗体库。使用免疫管包被抗原并用PBST封闭，加入1×1012的噬菌体进行淘洗，使用pH2.0的Gly-Hcl和pH9.5的Tris-Hcl中和作为洗脱液。筛选淘洗的步骤重复三次，三轮扩增和淘选的噬菌体滴度测定如表5所示。通过上述操作，使噬菌体抗体库得到富集。
表5淘选和扩增结果
S3、纳米抗体的验证
将第三轮淘选下的噬菌体侵染TG1后挑单克隆进行phage-ELISA验证，验证结果如图4所示。将ELISA阳性的噬菌体上清与表达CD276的肿瘤细胞孵育进行流式检测，流式检测结果如图5所示。
将流式阳性样本进行测序、并与羊驼序列比对，最终得到CD276-VHH1、CD276-VHH2两条纳米抗体序列，其氨基酸序列如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示。
图4示出了phage-ELISA验证结果；
其中，
图4(a)示出了第一板96孔板中ELISA显色阳性的克隆在酶标仪450nm处的读值，NC代表阴性对照，1-10代表10个不同的克隆；
图4(b)示出了第二板96孔板中ELISA显色阳性的克隆在酶标仪450nm处的读值，NC代表阴性对照，1-10代表10个不同的克隆。
结果显示，经过三轮富集，筛选到了ELISA阳性的噬菌体克隆。
图5示出了阳性克隆噬菌体上清液的流式结果；
其中，
图5(a)分别示出了CD276-VHH1与HepG2、Hela和Raji细胞的流式结果；
图5(b)分别示出了CD276-VHH2与HepG2、Hela和Raji细胞的流式结果。
结果显示，筛选到的两个阳性克隆噬菌体可以与CD276表达阳性的肿瘤细胞特异结合，而不与阴性细胞结合。
测试例1(作为流式抗体检测CD276阳性肿瘤细胞系)
测试方法：
载体质粒构建：将实施例通过筛选得到的CD276-VHH1、CD276-VHH2纳米抗体序列进行基因合成，并通过PCR扩增，获取足量的DNA片段，载体质粒的构建情况如图6所示。
载体构建：通过凝胶电泳分离目的条带后，将编码各个纳米抗体的DNA片段分别构建至含有mouse-IgG-Fc(mIgGFc)片段的真核表达载体上，载体构建的核酸电泳结果如图7所示，载体构建完成后的测序结果如图8所示。
酶切验证：用Xho1和EcoR1双酶切验证大提质粒，酶切后做核酸电泳检测，结果如图9所示，得到目标重组质粒。将目标质粒通过PEI转染法瞬转进293T细胞中进行表达，48h后收集上清进行浓缩和初步纯化即得到重组抗CD276的纳米抗体。
Western blot验证：将重组抗CD276的纳米抗体浓缩纯化后进行Western blot的验证，验证结果如图10所示。
CD276表达验证：选取CD276阳性细胞系，用商业化抗体对其CD276的表达进行验证，验证结果如图11-12所示。
纳米抗体与CD276阳性细胞系的结合检测：将得到的重组抗CD276的纳米抗体作为流式一抗，偶联FITC-anti-mouse-IgG的第二抗体，与表达CD276的肿瘤细胞共孵，上机检测重组抗CD276的纳米抗体与CD276阳性细胞系的结合情况，结果如图13所示。
纳米抗体对表达CD276的肿瘤细胞的结合能力检测：选用Hela细胞检测在不同浓度梯度下，CD276-VHH1和CD276-VHH2纳米抗体对表达CD276的肿瘤细胞的结合能力，结果如图14所示。
图6示出了构建PMIGV-CD276-VHH1-mIgGFc和PMIGV-CD276-VHH2-mIgGFc载体质粒示意图；
其中，
图6(a)示出了构建PMIGV-CD276-VHH1-mIgGFc载体质粒示意图；
图6(b)示出了构建PMIGV-CD276-VHH2-mIgGFc载体质粒示意图。
图7示出了测试例1载体构建的核酸电泳图；
其中，
图7(a)示出了第一次PCR的核酸电泳图；
图7(b)示出了第二次PCR的核酸电泳图。
结果表明，成功PCR出了条带大小正确的CD276-VHH1和CD276-VHH2片段。
图8示出了载体测序比对结果；
其中，
图8(a)示出了PMIGV-CD8 signal peptide-CD276-VHH1-mIgGFc载体测序比对结果；
图8(b)示出了PMIGV-CD8 signal peptide-CD276-VHH2-mIgGFc载体测序比对结果。
结果表明，构建的载体序列正确。
图9示出了酶切验证质粒结果；
其中，
图9(a)示出了图8(a)中CD276-VHH1的表达载体的XhoI和EcoRI双酶切验证结果；
图9(b)示出了图8(b)中CD276-VHH2的表达载体的XhoI和EcoRI双酶切验证结果。
结果表明，构建的载体结构正确。
图10示出了Western blot验证CD276-VHH1-mIgGFc蛋白和CD276-VHH2-mIgGFc蛋白的表达和浓缩；
其中，
图10(a)示出了CD276-VHH1-mIgGFc蛋白未浓缩(1X)和浓缩后(10X)的表达情况；
图10(b)示出了CD276-VHH2-mIgGFc蛋白未浓缩(1X)和浓缩后(10X)的表达情况。
结果表明，成功表达并浓缩了CD276-VHH1-mIgGFc蛋白和CD276-VHH2-mIgGFc蛋白。
图11示出了流式细胞术验证肿瘤细胞中CD276的表达；
其中，
图11(a)示出了CD276在Raji细胞中的表达；
图11(b)示出了CD276在293T细胞中的表达；
图11(c)示出了CD276在Hela细胞中的表达；
图11(d)示出了CD276在HepG2细胞中的表达；
图11(e)示出了CD276在KYSE270细胞中的表达；
图11(f)示出了CD276在KYSE30细胞中的表达。
结果表明，CD276在Hela、HepG2、KYSE270和KYSE30肿瘤细胞中表达。
图12示出了CD276阳性肿瘤细胞的荧光强度；
其中，
图12(a)示出了HepG2、KYSE270、KYSE30、Hela和Raji几种肿瘤细胞中CD276的表达强度；
图12(b)示出了HepG2、KYSE270、KYSE30、Hela和Raji几种肿瘤细胞中CD276的平均表达荧光强度(mean florescence intensity，MFI)。
结果表明，CD276在所示的肿瘤细胞中表达强弱有差别。
图13示出了CD276纳米抗体与CD276阳性细胞系的结合情况；
其中，
图13(a)分别示出了CD276-VHH1、CD276-VHH2与Raji细胞系的结合情况；
图13(b)分别示出了CD276-VHH1、CD276-VHH2与HepG2细胞系的结合情况；
图13(c)分别示出了CD276-VHH1、CD276-VHH2与Hela细胞系的结合情况；
图13(d)分别示出了CD276-VHH1、CD276-VHH2与KYSE270细胞系的结合情况；
图13(e)分别示出了CD276-VHH1、CD276-VHH2与KYSE30细胞系的结合情况。
结果表明，本发明筛选到的两个纳米抗体CD276-VHH1、CD276-VHH2可以用于流式检测细胞中CD276的表达。
图14示出了流式细胞术检测CD276-VHH1-mIgGFc和CD276-VHH2-mIgGFc在不同浓度梯度下与Hela细胞的结合效果；
其中，
图14(a)示出了Hela分别单独与CD276-VHH1和CD276-VHH2一抗、二抗、商业化抗体的结合；
图14(b)示出了分别以200μl、50μl、10μl和2μl体积的CD276-VHH1融合蛋白做一抗时的检测效果；
图14(c)示出了分别以200μl、50μl、10μl和2μl体积的CD276-VHH2融合蛋白做一抗时的检测效果。
结果表明，本发明筛选到的两个纳米抗体与Hela细胞的结合率会随着所用抗体量的变化而变化。
由上述结果可知，实施例所制备的CD276-VHH1、CD276-VHH2两种抗CD276的纳米抗体序列均能与CD276阳性的肿瘤细胞系识别，因此本发明可用作于流式抗体的生产用于CD276阳性肿瘤细胞系的识别。
测试例2(作为CAR上的抗原识别结构域参与CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤)
测试方法：
载体构建：将测试例1的抗CD276的纳米抗体的基因片段通过PCR进行扩增，获取足量的DNA片段，通过凝胶电泳分离目的条带后，将编码各个纳米抗体的DNA片段分别构建至含有CAR结构的真核表达载体中，载体构建示意图如图15所示，核酸电泳结果如图16所示。
质粒提取：通过连接、转化、提取质粒即可得到目标质粒，测序结果如图17所示。
滴度测定：通过第三代慢病毒包装体系进行病毒包装和生产，病毒生产后进行滴度测定，结果如图18所示。
CAR-T细胞对CD276肿瘤细胞系的杀伤检测：从人外周血中分离PBMC，从其中分离和激活人CD3+T细胞，分选后的CD3+T细胞比例如图19所示。使用慢病毒感染人CD3+T细胞制备CAR-T细胞，使用制备的CD276-mIgGFc胞外段蛋白检测CAR-T细胞的阳性率，阳性率结果如图20所示。根据CAR-T细胞的阳性率设计实验方案进行CD276肿瘤细胞系的杀伤，本发明共杀伤了五种细胞系，分别是CD276阳性细胞系Hela、HepG2、KYSE30、KYSE270和CD276阴性细胞系Raji。将CAR-T细胞与肿瘤细胞分别以0.5:1、1:1、2:1、4:1、8:1的比例进行孵育，24h后通过Elisa检测LDH的分泌进而判断杀伤结果，结果如图21所示。此外还进行了IFN-γ分泌的检测，结果如图22所示。
图15示出了CAR慢病毒载体质粒示意图；
其中，
图15(a)示出了pEF-CD276-VHH1-CAR慢病毒载体质粒示意图；
图15(b)示出了pEF-CD276-VHH2-CAR慢病毒载体质粒示意图。
图16示出了测试例2载体构建电泳图；结果表明，酶切及PCR出了条带大小正确的DNA片段。
图17示出了质粒测序比对图；
其中，
图17(a)示出了pEF-CD276-VHH1-CAR质粒测序比对图；
图17(b)示出了pEF-CD276-VHH2-CAR质粒测序比对图。
结果表明，成功构建了序列正确的质粒。
图18示出了CAR慢病毒滴度测定结果；
其中，
图18(a)示出了流式细胞术对CD276-VHH1-CAR慢病毒滴度的测定；
图18(b)示出了流式细胞术对CD276-VHH2-CAR慢病毒滴度的测定。
结果表明，慢病毒CD276-VHH1-CAR的滴度为2.6×105IU/mL；CD276-VHH2-CAR的滴度为1.07×106IU/mL；可以用于后续T细胞的感染。
图19示出了PBMC中淋巴细胞核CD3+T细胞磁珠分选效率；
其中，
图19(a)示出了分选前PBMC中CD3+T细胞的比例；
图19(b)示出了经过CD3/CD28磁珠分选后PBMC中CD3+T细胞的比例。
结果表明，分选前CD3+T细胞的比例为76.2％，磁珠分选后CD3+T细胞的比例为99.9％，成功分选出了CD3+T细胞。
图20示出了慢病毒感染后CAR-T细胞的阳性率；
其中，
图20(a)示出了CD276-VHH1组慢病毒感染后CAR-T细胞的阳性率；
图20(b)示出了CD276-VHH2组慢病毒感染后CAR-T细胞的阳性率。
结果表明，成功培养了表达CD276-VHH1及CD276-VHH2 CAR的T细胞。
图21示出了CD276-VHH1-CAR-T细胞和CD276-VHH2-CAR-T细胞在不同效靶比下对五种肿瘤细胞的杀伤作用；
其中，
图21(a)示出了对Raji细胞的杀伤作用；
图21(b)示出了对HepG2细胞的杀伤作用；
图21(c)示出了对KYSE30细胞的杀伤作用；
图21(d)示出了对Hela细胞的杀伤作用；
图21(e)示出了对KYSE270细胞的杀伤作用。
结果表明，本发明筛选到的两个纳米抗体序列构建的CAR-T细胞对CD276阳性肿瘤细胞有杀伤能力。
图22示出了CAR-T细胞杀伤过程中IFN-γ的分泌；
其中，
图22(a)示出了CAR-T对Raji细胞杀伤过程中IFN-γ的分泌；
图22(b)示出了CAR-T对HepG2细胞杀伤过程中IFN-γ的分泌；
图22(c)示出了CAR-T对KYSE30细胞杀伤过程中IFN-γ的分泌；
图22(d)示出了CAR-T对Hela细胞杀伤过程中IFN-γ的分泌；
图22(e)示出了CAR-T对KYSE270细胞杀伤过程中IFN-γ的分泌；
图22(f)示出了IFN-γ的ELISA检测标准曲线。
结果表明，CAR-T细胞在对阳性肿瘤细胞杀伤时分泌了大量的IFN-γ，且分泌的量与杀伤效果成正比。
由上述测试结果可知，本发明的CD276-VHH1、CD276-VHH2两条纳米抗体均可以作为CAR的抗原识别结构域对肿瘤细胞产生杀伤作用。
测试例3(纳米抗体会被CD276阳性细胞内吞，可用于ADC等药物的制备)
测试方法：
细胞准备：准备CD276阳性细胞：Hela、HCT116；CD276阴性细胞：Raji细胞。每种细胞收1-5×105个至1.5ml EP管中，每种细胞收集6支。
抗体准备：VHH-mIgGFc蛋白每种约500μl。
抗体孵育方案：收集细胞至EP管中，离心去上清。加入对应蛋白25μl，4℃孵育30min。PBS终止孵育，洗去未结合抗体，加入500μl 4℃预冷或37℃预热的完全培养基重悬细胞，分别在4℃、37℃孵育4h/6h均检测一次。PBS清洗后加入抗小鼠的荧光二抗，4℃孵育30min。PBS终止孵育并清洗后上流式细胞仪进行检测。Raji细胞、Hela细胞、HCT116细胞蛋白内吞结果分别如图23-25所示；CD276-VHH1和CD276-VHH2在不同细胞中的内化比例如图表6所示。
表6CD276-VHH1和CD276-VHH2在不同细胞中的内化比例
图23示出了Raji细胞CD276-VHH1/VHH2内吞(50μg)结果；
其中，
图23(a)示出了Raji细胞CD276-VHH1内吞(50μg)结果；
图23(b)示出了Raji细胞CD276-VHH2内吞(50μg)结果。
结果表明，不表达CD276的Raji细胞对CD276-VHH1及CD276-VHH2抗体的内吞较少。
图24示出了Hela细胞CD276-VHH1/VHH2内吞(50μg)结果；
其中，
图24(a)示出了Hela细胞CD276-VHH1内吞(50μg)结果；
图24(b)示出了Hela细胞CD276-VHH2内吞(50μg)结果。
结果表明，表达CD276的Hela细胞对CD276-VHH1及CD276-VHH2抗体有较多的内吞。
图25示出了HCT116细胞CD276-VHH1/VHH2内吞(50μg)结果；
其中，
图25(a)示出了HCT116细胞CD276-VHH1内吞(50μg)结果；
图25(b)示出了HCT116细胞CD276-VHH2内吞(50μg)结果。
结果表明，表达CD276的HCT116细胞对CD276-VHH1及CD276-VHH2抗体有较多的内吞。
由上述测试结果可知，本发明的CD276-VHH1、CD276-VHH2两条纳米抗体均可以被CD276阳性细胞内吞，可用于生产ADC等需要进入细胞发挥作用的药物。
测试例4(纳米抗体与食管癌组织的识别与结合)
测试方法：
石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ10min-环保型脱蜡液Ⅱ10min-环保型脱蜡液Ⅲ10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-蒸馏水洗。
抗原修复：修复条件如表7所示。修复过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。修复完成后，自然冷却。将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
画圈血清封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，滴加BSA(一抗是山羊来源用10％驴血清封闭，一抗其它来源的用3％ BSA封闭)，封闭30min。
加一抗：滴加配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。
加二抗：玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。加对应的二抗，避光室温孵育50min。
DAPI复染细胞核：玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。加DAPI染液，避光室温孵育10min。
淬灭组织自发荧光：玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上洗涤3次，每次5min。加自发荧光淬灭剂B液5min，流水冲洗10min。
封片：抗荧光淬灭封片剂封片。
采集图像：DAPI激发波长330-380nm，发射波长420nm；488激发波长465-495nm，发射波长515-555nm；CY3激发波长510-560nm，发射波长590nm；CY5激发波长608-648nm，发射波长672-712nm。
结果判读：DAPI通道细胞核为蓝色，488通道阳性为绿色，结果如图26-29所示。
表7抗原修复条件
图26示出了商业化CD276抗体(Proteintech Cat No:66481-1-Ig)与食管癌组织的结合情况；可作为阳性对照。
图27示出了CD276-VHH1与食管癌的结合情况。
图28示出了CD276-VHH2与食管癌的结合情况。
图29示出了纳米抗体与食管癌组织的结合情况的阴性对照。
上述结果表明，本发明筛选到的CD276-VHH1及CD276-VHH2纳米抗体可用于免疫组化检测人的食管癌组织中CD276的表达。
综合测试例1-4的结果，可以明显看出，本发明提供的抗人CD276纳米抗体可以与CD276抗原结合，能够灵敏地检测CD276抗原分子；可以作为CAR的抗原识别结构域进而进行CAR-T细胞的构建，对表达CD276抗原的多种肿瘤细胞系具有显著杀伤作用；并可以用于制备ADC等需要进入CD276阳性细胞发挥作用的药物。因此可应用于恶性肿瘤的诊断与治疗，具有极好的市场推广前景。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.一种抗CD276的纳米抗体，其特征在于，所述抗CD276的纳米抗体包括互补决定区CDR和框架区FR；
其中，
所述互补决定区CDR包括互补决定区CDR1-CDR3；
所述互补决定区CDR1-CDR3分别如氨基酸序列1-3所示；
所述氨基酸序列1-3如SEQ ID No.1-SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述抗CD276的纳米抗体，其特征在于，所述框架区FR包括框架区FR1-FR5；
其中，
所述框架区FR1-FR5分别如氨基酸序列4-8所示；
所述氨基酸序列4-8如SEQ ID No.4-SEQ ID No.8所示。
3.根据权利要求1所述抗CD276的纳米抗体，其特征在于，所述抗CD276的纳米抗体的氨基酸序列为CD276-VHH1或CD276-VHH2；
所述CD276-VHH1和CD276-VHH2如SEQ ID No.9-SEQ ID No.10所示。
4.根据权利要求1所述抗CD276的纳米抗体，其特征在于，所述抗CD276的纳米抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其组合。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-4任一项所述抗CD276的纳米抗体。
6.根据权利要求5所述核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括核酸序列SEQ IDNo.11或SEQ ID No.12。
7.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求1-4任一项所述抗CD276的纳米抗体。
8.根据权利要求7所述载体，其特征在于，所述载体选自DNA分子、mRNA分子或细胞。
9.权利要求7-8任一项所述载体在抗原检测、吸附抗原试剂和免疫治疗中的应用。
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