CN119306826B - 抗白介素-6抗体、检测白介素-6的试剂和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗白介素‑6的抗体或检测白介素‑6的试剂和试剂盒，涉及抗体领域。本发明公开的抗白介素‑6抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区，该抗体为白介素‑6的检测提供了重要的原料来源，且具有良好的亲和力或活性。

Description

抗白介素-6抗体、检测白介素-6的试剂和试剂盒

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗白介素-6抗体、检测白介素-6的试剂和试剂盒。

背景技术

白介素6(interleukin 6，IL-6)，全称白细胞介素6，是一种功能广泛的多效性细胞因子，属于白细胞介素的一种。可由纤维母细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞以及多种瘤细胞产生。IL-6具有如调节多种细胞的生长与分化、免疫应答等，参与包括细菌感染、新生儿败血症、呼吸系统衰竭、系统性红斑狼疮、肠炎、心血管疾病、类风湿性关节炎等各种急性和慢性炎症疾病过程，在例如急性炎症反应、自身免疫性疾病和肿瘤形成中起作用。IL-6的异常和过度分泌可能导致严重的炎症反应，包括全身炎症反应综合征和细胞因子释放综合征。

临床上在内外伤、外科手术、感染等急性炎症反应过程中，IL-6会快速升高。IL-6与降钙素原(PCT)联合使用可更高效的鉴别细菌及病毒感染，因此可用于指导抗生素的合理使用、减少抗生素滥用情况。另外，IL-6可用于早期识别脓毒症及治疗效果监测、术后感染的监控、新生儿脓毒症辅助诊断、避免PCT漏诊社区获得性肺炎(CAP)等局灶性细菌感染，减少漏诊等。因此，检测IL-6对于早期诊断、判断预后、指导用药、研究发病机制等都有非常重要的意义。

目前，IL-6的检测方法主要有胶体金免疫层析法及荧光免疫层析法，其都是基于抗体和抗原的特异性反应，同时利用标记物质(如胶体金、荧光)对被检测信号进行放大和显示的一种免疫学检测方法。类似的免疫学检测方法还有生化免疫比浊法、放射免疫法、化学发光法等。上述免疫学检测方法都需要针对于IL-6的抗体。

因此，本领域对于有良好性能的抗白介素-6抗体存在着强烈的需求。

发明内容

本申请提供一种抗体或其抗原结合片段，为白介素-6的检测提供重要的原料来源，且有良好的活性或亲和力。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:17、18任一重链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:19的轻链可变区的三个互补决定区。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括如下互补决定区：

HCDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；

HCDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；

HCDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；和

LCDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或由其组成。

为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17、18任一所示；所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。

为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，包括重链和/或轻链，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20、21任一所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。

为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括上述的抗体或其抗原结合片段。

为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其抗原结合片段或上述的抗体偶联物。

为了实现上述目的，根据本发明的第七个方面，提供了一种检测白介素-6的方法，包括：a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使上述的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物，或者试剂或试剂盒与待检测样品中的白介素-6接触形成免疫复合物；和b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述抗原的存在。

为了实现上述目的，根据本发明的第八个方面，提供了一种核酸，所述核酸编码上述的抗体或其抗原结合片段。

为了实现上述目的，根据本发明的第九个方面，提供了一种载体，所述载体包括上述的核酸。

为了实现上述目的，根据本发明的第十个方面，提供了细胞，所述细胞包括上述的核酸、载体或表达上述的抗体或其抗原结合片段。

为了实现上述目的，根据本发明的第十一个方面，提供了一种制备上述抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养上述的细胞。

为了实现上述目的，根据本发明的第十二个方面，提供了一种上述的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物、试剂或试剂盒在制备检测白介素-6产品中的用途。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为Anti-IL-6 12D9Rmb1～Anti-IL-6 12D9 Rmb2的还原性SDS-PAGE的结果。

具体实施方式

第一方面，本发明实施例提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:17、18任一重链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:19的轻链可变区的三个互补决定区。

需要说明的是，HCDR1、HCDR2和HCDR3为与第一方面所述的抗体或其抗原结合片段中所限定的同一条重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3一致的氨基酸序列，LCDR1、LCDR2和LCDR3为与第一方面所述的抗体或其抗原结合片段中所限定的同一条轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3一致的氨基酸序列。

例如所述HCDR1、HCDR2、HCDR3为与SEQ ID NO:17所示重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3一致的氨基酸序列；所述LCDR1、LCDR2、LCDR3为与SEQ ID NO:19所示轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3一致的氨基酸序列。

在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。

在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。

在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。

CDR的定义方法是本领域公知的，CDR定义方法包括：Kabat定义、Chothia定义、IMGT定义、Contact定义和AbM定义。如本文所述，“Kabat定义”是指Kabat等，U.S.Dept.ofHealth and Human Services，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所述的定义系统。“Chothia定义”参见Chothia等，J Mol Biol 196：901-917(1987)。还有其他CDR定义方法可能不严格遵循上述方案之一，但仍会与Kabat定义的CDR区的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或残基组的预测或实验结果可能会缩短或延长它们。示例性的定义的CDR列于下表1中,不同文献中的定义略有不同。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。需要说明的是，不限于表1中的其他方法定义的CDR也属于本公开的保护范围。

表1：CDR定义¹

¹表1中所有CDR定义的编号是依据Kabat编号系统(参见下文)，重链上的氨基酸编号用“H+数字”表示，轻链上的氨基酸编号用“L+数字”表示。本领域普通技术人员可以明确地将该Kabat编号系统对应到任何可变区序列，而不依赖于序列本身之外的任何实验数据。如本文所述，“Kabat编号”是指Kabat等，U.S.Dept.of Health and HumanServices，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)所述的编号系统。

²如表1中使用的“AbM”具有小写“b”，是指通过Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。

³如果H35A和H35B都不存在时，那么CDR-H1结束在35位；如果只有H35A存在时，那么CDR-H1结束在35A位；如果H35A和H35B同时存在，那么CDR-H1结束在35B位。

⁴如果H35A和H35B都不存在时，那么CDR-H1结束在32位；如果只有H35A存在时，那么CDR-H1结束在33位；如果H35A和H35B同时存在，那么CDR-H1结束在34位。

⁵如果H35A和H35B都不存在时，那么CDR-H1结束在33位；如果只有H35A存在时，那么CDR-H1结束在34位；如果H35A和H35B都存在时，那么CDR-H1结束在35位。

根据本发明的实施例，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2或LCDR3由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact任意一种系统或多种系统组合定义。

在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由Kabat系统定义。

在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由Chothia系统定义。

在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由IMGT系统定义。

在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由AbM系统定义。

在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由Contact系统定义。

在本发明的一些可选实施例中，所述HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact系统组合定义。

根据本发明的实施例，所述Kabat、Chothia、AbM或IMGT系统定义的HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2或LCDR3的氨基酸序列对应的Kabat编号位置如下：

根据本发明的实施例，所述HCDRs和LCDRs由Kabat系统定义。

第二方面，本发明实施例提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括如下互补决定区：

HCDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或由其组成；

HCDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或由其组成；

HCDR3，其包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR1，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或由其组成；

LCDR2，其包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或由其组成；和

LCDR3，其包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或由其组成。

在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。

在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。

在可选的实施方式中，第一方面或第二方面所述抗体或其抗原结合片段还具有HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的至少之一；

所述HFR1包括/如SEQ ID NO:7或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述HFR2包括/如SEQ ID NO:8或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述HFR3包括/如SEQ ID NO:9或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述HFR4包括/如SEQ ID NO:10或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述LFR1包括/如SEQ ID NO:11或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述LFR2包括/如SEQ ID NO:12或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述LFR3包括/如SEQ ID NO:13或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述LFR4包括/如SEQ ID NO:14或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。

需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其抗原结合片段的各框架区氨基酸序列可以与上述对应框架区(SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13或14)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在可选的实施方式中，所述HFR1包括/如SEQ ID NO:7或23所示的氨基酸序列。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以KD＜4.97×10^-9M的亲和力结合白介素-6。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以KD≤10^-9M、KD≤10^-10M、KD≤10^-11M、KD≤10^-12M或KD≤10^-13M的亲和力结合白介素-6。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以KD≤3.06×10^-10M的亲和力结合白介素-6。

抗体亲和力(KD)测定方法有很多种，根据检测原理可分为热力学检测方法、动力学检测方法和动态平衡检测方法。其中，热力学检测方法常见如等温滴定量热法(ITC)；动力学检测方法常见如表面等离子共振(SPR)及生物膜光干涉法(BLI)；动态平衡检测方法常见如酶联免疫吸附(ELISA)等。

在可选的实施方式中，KD的测定采用动力学检测方法；可选为，表面等离子共振，例如通过使用诸如系统的生物传感器系统。

第三方面，本发明实施例提供一种抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17、18任一所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。

在可选的实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段还包含恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG、IgA、IgM、IgE、IgD任意一种的重链恒定区或多种恒定区区段的组合。

在可选的实施方式中，所述重链恒定区包括IgG的CH1、IgG的铰链区、IgM的CH2、IgM的CH3和/或IgM的CH4。

在可选的实施方式中，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

在可选的实施方式中，所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。

在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为小鼠。

在可选的实施方式中，所述重链恒定区序列(CH)如SEQ ID NO:15所示，所述轻链恒定区(CL)序列如SEQ ID NO:16所示。

需要说明的是，在其他的实施例中，所述恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ IDNO:15或16)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在可选的实施方式中，所述抗原结合片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

上述抗体的抗原结合片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的抗原结合片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的抗原结合片段。

上述抗体的抗原结合片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

第四方面，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，包括重链和/或轻链，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20、21任一所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。

第五方面，本发明提供一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括上述的抗体或其抗原结合片段。

在可选的实施方式中，上述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的生物素或生物素衍生物。

在可选的实施方式中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的标记物。

在可选的实施方式中，上述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。

在可选的实施方式中，所述标记物包括但不限于荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。

在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

在可选的实施方式中，所述胶体金属为胶体金。

在可选的实施方式中，上述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的固相载体。

在可选的实施方式中，所述固相载体选自微球、板和膜。

在可选的实施方式中，所述固相载体包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。

第六方面，本发明提供一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其抗原结合片段或上述的抗体偶联物。

如前所述，本发明一些实施方式或实施例中的抗体或其抗原结合片段能够有效与白介素-6进行结合，因此，包含所述白介素-6抗体或其抗原结合片段的试剂或试剂盒能够有效的对白介素-6进行定性或定量检测。应用本发明提供的试剂或试剂盒，例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用白介素-6和其抗体特异性结合性能的检测。如前所述，本发明一些实施方式或实施例中的抗体或其抗原结合片段具有与白介素-6更高的结合活性或亲和力，因此包含所述抗体或其抗原结合片段的试剂或试剂盒具有更高的检测灵敏度或特异性。

第七方面，本发明提供一种检测白介素-6的方法，包括：a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使上述的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物，试剂或试剂盒与待检测样品中的白介素-6接触形成免疫复合物；和b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述抗原的存在。

在可选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其抗原结合片段结合。

在可选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与白介素-6结合。

第八方面，本发明提供一种编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

第九方面，本发明提供含有上述核酸分子的载体。

第十方面，本发明提供含有上述载体的细胞。

第十一方面，本发明提供一种制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：培养如上所述的细胞。

第十二方面，本发明提供上述抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物或上述的试剂或试剂盒在制备检测白介素-6的产品中的用途。

在本发明公开了抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体或其抗原结合片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其抗原结合片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其抗原结合片段，其均属于本发明的保护范围。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1Anti-IL-6 12D9单克隆抗体的制备

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。分泌Anti-IL-6 12D9单克隆抗体的杂交瘤细胞株为本实验室制备的杂交瘤细胞株，复苏备用。

(1)抗体基因制备

从分泌Anti-IL-6 12D9单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆，各4个克隆送基因测序公司进行测序。

(2)Anti-IL-6 12D9抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在kabat抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为321bp，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为372bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

(3)重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.70kb的Light Chain基因片段和1.40kb的Heavy Chain基因片段。

Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

2.重组抗体生产

提前复苏HEK293细胞，传代培养到200ml体系，使细胞密度达到3～5×10⁶cells/ml细胞密度达到挑选抗体浓度及细胞，细胞活力>95％；离心清洗细胞，用培养基复溶，同时将细胞密度调整到2.9×10⁶cells/ml洗细胞，用培养基复溶，同时，作为细胞稀释液。用培养基分别配制质粒DNA和转染试剂稀释液。将转染试剂稀释液加入到质粒DNA稀释液中，混匀后室温静置放置15min；将该混合物在1min内缓慢加入细胞稀释液中，混匀后取样计数，记录并观察细胞转染后的活力，并将其放置于35℃恒温培养箱中培养，转速120rmp，CO2含量8％，13天后离心收样。将离心上清用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取6ug层纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。

所得抗体命名为Anti-IL-6 12D9Rmb1,对Anti-IL-6 12D9Rmb1进行突变，得到突变抗体，命名为Anti-IL-6 12D9Rmb2

Anti-IL-6 12D9Rmb1抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:20和22所示；

Anti-IL-6 12D9Rmb2抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:21和22所示。

实施例2抗体的性能检测

1.亲和力分析

提前稀释纯化抗体，同时对白介素-6抗原(来自菲鹏生物)进行梯度稀释；利用已提前耦联羊抗鼠IgG的CM5芯片，在Biacore 8K+设备上测试抗原抗体的结合解离曲线，仪器自动拟合获得亲和力常数、结合速率、解离速率。(KD表示平衡解离常数即亲和力常数；ka表示结合速率；kd表示解离速率)

表2亲和力数据

样品名称	KD	ka	kd
				对照	4.97E-09	3.65E+05	1.81E-03
Anti-IL-6 12D9Rmb1	2.96E-10	1.71E+06	5.06E-04
				Anti-IL-6 12D9Rmb2	3.06E-10	2.22E+06	6.79E-04

。

2.活性鉴定

包被液(主要成分NaHCO3)稀释白介素-6抗原(来自菲鹏生物)至1ug/ml，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份Na2HPO4+Nacl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的纯化抗体和对照抗体，100uL/孔，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100uL，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值.

备注：A液(主要成份柠檬酸+醋酸钠+乙酰苯胺+过氧化脲)；B液(主要成份柠檬酸+EDTA·2Na+TMB+浓HCL)；终止液(EDTA·2Na+浓H2SO4)

表3活性数据

浓度(ng/ml)	250.00	125.00	62.50	31.25	15.63	0.00
							对照	1.421	0.803	0.528	0.302	0.119	0.021
Anti-IL-6 12D9Rmb1	1.993	1.467	1.010	0.598	0.404	0.026
							Anti-IL-6 12D9Rmb2	1.977	1.433	1.022	0.588	0.428	0.024

3.稳定性考核

将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述抗体稳定。下表4为抗体Anti-IL-6 12D9Rmb1考核21天的酶免活性检测OD结果。

表4稳定性数据

样品浓度(ng/ml)	125.00	62.50	0.00
				4℃，21天样品	1.446	1.033	0.022
-80℃，21天样品	1.422	1.025	0.023
				37℃，21天样品	1.473	1.042	0.024

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本申请涉及的部分氨基酸序列如表5所示：

Claims (29)

1.一种抗白介素-6抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段具有氨基酸序列SEQ ID NO:17、18任一重链可变区的三个互补决定区和具有氨基酸序列SEQ ID NO:19的轻链可变区的三个互补决定区，所述可变区的互补决定区由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact任意一种系统或多种系统组合定义。

2.一种抗白介素-6抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括如下互补决定区：

HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；和

LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

3.根据权利求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还具有HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4中的至少之一。

4.根据权利求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，

所述HFR1包括SEQ ID NO:7或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述HFR2包括SEQ ID NO:8或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述HFR3包括SEQ ID NO:9或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述HFR4包括SEQ ID NO:10或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述LFR1包括SEQ ID NO:11或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述LFR2包括SEQ ID NO:12或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述LFR3包括SEQ ID NO:13或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列；

所述LFR4包括SEQ ID NO:14或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。

5.根据权利求1至2、4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段以KD＜4.97×10^-9M的亲和力结合白介素-6。

6.一种抗白介素-6抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:17、18任一所示；所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。

7.根据权利要求1至2、4至6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包含恒定区。

8.根据权利求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区。

9.根据权利求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链恒定区选自IgG、IgA、IgM、IgE、IgD任意一种的重链恒定区或多种恒定区区段的组合。

10.根据权利求8所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链恒定区包括IgG的CH1、IgG的铰链区、IgM的CH2、IgM的CH3和/或IgM的CH4。

11.根据权利求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。

12.根据权利求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为小鼠。

13.根据权利求8所述的抗的体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:15所示或与其具有至少80％同一性；所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:16所示或与其具有至少80％同一性。

14.根据权利求1至2、4至6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

15.一种抗白介素-6抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:20、21任一所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。

16.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物包括权利要求1至14任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求15所述的抗体。

17.根据权利求16所述的抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的生物素或生物素衍生物。

18.根据权利求16所述的抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的标记物。

19.根据权利求18所述的抗体偶联物，其特征在于，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

20.根据权利求16所述的抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的固相载体。

21.根据权利求16所述的抗体偶联物，其特征在于，所述固相载体选自微球、板和膜。

22.一种试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1至14任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求15所述的抗体或权利要求16至21任一项所述的抗体偶联物。

23.权利要求1至14任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求15所述的抗体、权利要求16至21任一项所述的抗体偶联物，或者权利要求22所述的试剂或试剂盒在制备检测白介素-6产品中的用途，其特征在于，包括：

a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使权利要求1至14任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求15所述的抗体、权利要求16至21任一项所述的抗体偶联物，或者权利要求22所述的试剂或试剂盒与待检测样品中的白介素-6接触形成免疫复合物；和

b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示测试样品中所述抗原的存在。

24.根据权利求23所述的用途，其特征在于，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其抗原结合片段结合。

25.根据权利求23所述的用途，其特征在于，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与白介素-6结合。

26.一种核酸，其特征在于，其编码权利要求1至14任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求15所述的抗体。

27.一种载体，其特征在于，其含有权利要求26所述的核酸。

28.一种细胞，其特征在于，其含有权利要求26所述的核酸或权利要求27所述的载体。

29.一种制备权利要求1至14任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求15所述的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求28所述的细胞。