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CN119306809A - 孔蛋白PorA在提高甲烷氧化菌氨态氮利用能力中的应用 - Google Patents

孔蛋白PorA在提高甲烷氧化菌氨态氮利用能力中的应用 Download PDF

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CN119306809A CN202411367723.5A CN202411367723A CN119306809A CN 119306809 A CN119306809 A CN 119306809A CN 202411367723 A CN202411367723 A CN 202411367723A CN 119306809 A CN119306809 A CN 119306809A
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Abstract

本发明公开了孔蛋白PorA在提高甲烷氧化菌氨态氮利用能力中的应用。一种孔蛋白PorA，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的孔蛋白PorA的编码基因porA，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。孔蛋白PorA在提高Methylotuvimicrobium buryatense铵态氮利用能力方面的应用。失活该孔蛋白可使甲烷氧化菌Methylotuvimicrobiumburyatense利用铵态氮生长，降低发酵培养该菌的成本，对其工业化应用有重要意义。

Description

孔蛋白PorA在提高甲烷氧化菌氨态氮利用能力中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种提高甲烷氧化菌Methylotuvimicrobiumburyatense氨态氮利用能力的方法及其应用。
背景技术
甲烷氧化菌能以甲烷为唯一碳源和能源生长，广泛分布于湿地、湖泊和海洋等环境，在地球甲烷循环中发挥重要作用。自上世纪以来，该类微生物在甲烷生物转化和甲烷污染消除方面的作用备受重视。甲烷生物转化是指利用甲烷氧化菌转化甲烷生产单细胞蛋白、可降解塑料、类胡萝卜素和四氢嘧啶等产品。甲烷污染消除是利用甲烷氧化菌消除垃圾填埋场和污水处理系统等点源排放的甲烷，减少进入大气的甲烷量。
虽然在甲烷生物转化方面有很多商业化尝试、在甲烷消除方面有不少工程化的努力，但目前在这两方面都缺乏持续的成功。究其原因，经济性是重要的限制因素之一。提高经济性的途径之一是降低甲烷氧化菌大规模培养的成本。从培养基原料角度来看，氮源形式影响发酵成本。由于甲烷氧化菌普遍对铵态氮敏感，所以通常用硝态氮作为该菌的氮源。然而，在价格方面，硝酸钾比氯化铵高出约5倍。若能用铵态氮代替硝态氮，将会降低甲烷氧化菌的培养成本。
Methylotuvimicrobium buryatense是一类具有工业应用价值的甲烷氧化菌。该类甲烷氧化菌生长速度快、嗜碱性、抗污染且耐天然气中的杂质(PNAS,2023,https://doi.org/10.1073/pnas.2310046120)。近年来，该类菌已被发展为重要的模式菌株和代谢工程改造的底盘宿主。然而，该类菌对铵态氮非常敏感，通常只能用硝态氮进行培养。若能使该类菌较好地利用铵态氮，则降低大规模培养成本，对其工业化应用有重要意义。
本发明提供了一种通过失活孔蛋白提高甲烷氧化菌Methylotuvimicrobiumburyatense氨态氮利用能力的方法及其在发酵培养中的应用。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的是甲烷氧化菌Methylotuvimicrobium buryatense对铵态氮敏感的问题，本发明提供一种通过失活孔蛋白提高其氨态氮利用能力的方法及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了如下技术方案：
第一方面，本发明公开了一种影响Methylotuvimicrobium buryatense铵态氮利用能力的孔蛋白PorA及其编码基因porA。
孔蛋白PorA，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的孔蛋白PorA的编码基因porA，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本发明公开了上述孔蛋白PorA在提高Methylotuvimicrobiumburyatense铵态氮利用能力方面的应用。
其中，所述孔蛋白PorA的失活可以提高Methylotuvimicrobium buryatense铵态氮利用能力。
其中，所述孔蛋白PorA的失活可以通过porA的基因敲除、基因突变或基因沉默实现。
孔蛋白PorA的编码基因在提高Methylotuvimicrobium buryatense铵态氮利用能力方面的应用，通过porA的基因敲除、基因突变或基因沉默实现提高Methylotuvimicrobium buryatense铵态氮利用能力。
基因敲除、基因突变或基因沉默实现孔蛋白PorA失活的物质在提高Methylotuvimicrobium buryatense铵态氮利用能力方面的应用。
综上，本发明提供了一种通过失活孔蛋白提高甲烷氧化菌Methylotuvimicrobiumburyatense氨态氮利用能力的方法及其应用。
有益效果：
本发明公开了一种影响甲烷氧化菌Methylotuvimicrobiumburyatense摄取铵离子效率的孔蛋白，失活该孔蛋白可使甲烷氧化菌Methylotuvimicrobium buryatense利用铵态氮生长，降低发酵培养该微生物的成本，对该微生物的工业化应用有重要意义。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1筛选氨氮利用能力较强的5GB1C突变体的方法。
图2菌株WT、△porA和△porA-Com以铵盐为氮源的生长能力测试。
图3PorA的3D结构模拟图。
图4菌株△porA在摇瓶中进行流加氯化铵的生长能力测试。
图5菌株△porA利用氨氮过程中有害产物积累测试。
具体实施方式
本发明首先通过转座子随机插入突变筛选能够耐受铵态氮的甲烷氧化菌Methylotuvimicrobium buryatense突变体，然后通过基因敲除和回补实验确定孔蛋白基因porA的作用。
实施例1
如图1所示，参考文献(AEM,2013.https://doi:10.1128/AEM.02478-13)方法，用携带Himar1 mariner转座子的pSC123质粒构建菌株Methylotuvimicrobium buryatense5GBC1的转座子随机插入文库。Methylotuvimicrobium buryatense 5GBC1为一株甲烷氧化菌的模式株，其来源参考文献(AEM,2015.https://doi:10.1128/AEM.03795-14)。将突变子分别点于NMS2培养基和NMS2N(NMS2+8mM NH4Cl)培养基上筛选。出发菌株只能在NMS2平板上生长而无法在NMS2N平板上生长。利用该方法筛选到一株能在NMS2N上生长的突变体，命名为5G-P。参考文献(AEM,2007,https://doi.org/10.1128/AEM.02973-06)方法，通过染色体步移方法确定了突变体5G-P中转座子插入的位置，被插入失活的基因被命名为porA。注意，通过“实施例2”的方法可以基因工程手段也可以重复获得突变体5G-P。
实施例2
为了验证porA的失活会提高菌株5GBC1利用铵态氮能力，通过基于pheSAG基因的无标记敲除系统在菌株5GBC1基础上敲除porA，获得菌株ΔporA(Frontiers inMicrobiology,2020,https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00441)。具体步骤如下:使用待删除目标区域下游约450bp片段作为正向重复(Direct Repeat，DR)序列并添加到PZ盒前(PZ盒包含tac启动子、RBSmmoX、人工合成的pheSAG以及zeo抗性基因)。然后，通过重叠PCR的方法将左右两侧同源臂(LF，RF)按LF-DR-PZ-RF的顺序进行融合，融合好的DNA片段纯化回收后，通过电转化的方式转入5GB1C的感受态细胞中(Frontiers in Microbiology,2020,https://do i.org/10.3389/fmicb.2020.00441)。通过博来霉素筛选DR和PZ表达盒成功重组到目标区域的转化子，然后再通过p-Cl-Phe对第一步筛选得到的转化子进行反向筛选，通过PCR鉴定获得无痕敲除菌株。其中片段LF通过引物LF-F(GCAGAAGAAGAACGGCAAAT)和引物LF-R(AAAAGGC GACACTTGGTTTTGAAAACGGCCTCAAA)进行扩增；片段DR通过引物DR-F(AGGCCGTTTTCAAAACCAAG TGTCGCCTTTTTAAGTA)和引物DR-R(TGTCAACAGCTCATTTCAGAGTGAGTATAAAGGGAGTATGTCG)进行扩增,片段PZ通过引物PZ-F(CTCTGAAATGAGCTGTTGACA)和引物PZ-R(TCAGTCCTGCTCCTCGGCCA C)进行扩增,片段RF通过引物RF-F(GTGGCCGAGGAGCAGGACTGACTAGAAACGAATGATCGCATC)和引物RF-R(TACGGCGTGGATGCTGCTTAT)进行扩增。
将5GB1C的基因组中的低转录位点(160485)作为porA回补的整合位点，进一步通过同源双交换的方法将porA整合于ΔporA的染色体上，获得回补菌株ΔporA-Com。具体步骤为：以菌株5GB1C总DNA为模版，扩增出回补位点的上下游同源臂CLF、CRF和包含原始启动子区域的porA基因片段CPA，以pAWP89为模板扩增出卡那霉素抗性基因片段KAN(AEM,2015,http://dx.doi.org/10.1128)，这四个片段按照CLF、CPA、KAN、CRF的顺序进行融合，回收后的片段通过电转化的方式转入菌株ΔporA的感受态细胞中。通过卡那霉素进行筛选，对目标菌株进行PCR和测序验证。其中片段CLF通过引物CLF-F(GGTGTCGATGGCATGCTCAA)和引物CLF-R(CA AGGCGAAGTTGAAGGCGC)进行扩增；片段CPA通过引物CPA-F(GCGCCTTCAACTTCGCCTTGACCGTCGT GAACCCATTCAT)和引物CPA-R(TGCTCGATGAGTTTTTCTAACTAGAAACGAATGATCGCAT)进行扩增,片段KAN通过引物KAN-F(TTAGAAAAACTCATCGAGCA)和引物KAN-R(CGCGTATAGCTTGCCGGAAG)进行扩增,片段CRF通过引物CRF-F(CTTCCGGCAAGCTATACGCGATCGATCTCCGCGATAATCT)和引物CRF-R(GTTACAGGCGTTACGTTACGTT)进行扩增。
如图2所示，菌株ΔporA在AMS2培养基(除氮源改变外培养基内其他组分同NMS2培养基，以氯化铵作为氮源)中可以利用1mM和2mM的NH4Cl生长，而出发菌株5GBC1和回补ΔporA-Com生长困难。这些结果说明失活porA可以提高菌株5GBC1利用铵态氮的能力。
通过AlphaFold 3对PorA进行结构模拟预测，如图3所示，结果显示PorA具有孔蛋白的典型特征，由排列成β-桶状的16条β链组成，被组织为三聚体。从垂直于该结构的横截面来看，通道内部呈现沙漏状，其中最窄的部分为“收缩区”，外环构成。
实施例3：失活孔蛋白编码基因porA提高Methylotuvimicrobium buryatense5GBC1利用铵态氮能力
为了验证porA基因敲除菌株ΔporA能否通过利用铵态氮获得较高的生物量，将菌株ΔporA在AMS2培养基中于30℃、180rpm在摇瓶中过夜培养，然后以1％接种至50mL AMS2液体培养基中于30℃、180rpm培养，每6小时补充0.5mM NH4Cl，每12h更换一次摇瓶中的气体。如图4所示，在持续补充NH4Cl的条件下，菌株ΔporA可以持续生长，这说明可以利用铵态氮代替硝态氮对菌株ΔporA进行发酵培养，对降低Methylotuvimicrobiumburyatense发酵培养的成本有重要意义。
实施例4：失活孔蛋白编码基因porA减少有害性产物积累
甲烷氧化菌可以将氨转化为羟胺、亚硝酸盐和氧化亚氮等有害物质，为了检测失活基因porA后这些有害物质是否会减少，将出发菌株Methylotuvimicrobium buryatense5GBC1和敲除菌株ΔporA分别置于NMS2培养中于30℃、180rpm过夜培养至指数期，然后离心收集菌体，转移至AMS2培养基中于30℃、180rpm过夜培养，检测积累的羟胺、亚硝酸盐和氧化亚氮的含量(方法参考Analytical Chemistry,1955,https://doi.org/10.1021/ac60106a054和PNAS,2016,https://doi.org/10.1073/pnas.1611051113)。如图5所示，菌株ΔporA相比出发菌株，其培养基上清中亚硝酸盐积累量降低了约60％，羟胺积累量降低了约50％，氧化亚氮积累量降低了约50％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种影响Methylotuvimicrobium buryatense铵态氮利用能力的孔蛋白PorA，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的PorA的编码基因porA，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述的PorA在提高Methylotuvimicrobium buryatense铵态氮利用能力方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，失活所述的孔蛋白PorA可以提高Methylotuvimicrobium buryatense铵态氮利用能力。
5.权利要求2所述的孔蛋白PorA的编码基因porA在提高Methylotuvimicrobiumburyatense铵态氮利用能力方面的应用，其特征在于，通过porA的基因敲除、基因突变或基因沉默实现提高Methylotuvimicrobium buryatense铵态氮利用能力。
6.基因敲除、基因突变或基因沉默实现孔蛋白PorA失活的物质在提高Methylotuvimicrobium buryatense铵态氮利用能力方面的应用。
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