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CN119258206A - 一种靶向鼻咽癌的纳米火车载药系统及其制备方法与应用 - Google Patents

一种靶向鼻咽癌的纳米火车载药系统及其制备方法与应用 Download PDF

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CN119258206A
CN119258206A CN202411409030.8A CN202411409030A CN119258206A CN 119258206 A CN119258206 A CN 119258206A CN 202411409030 A CN202411409030 A CN 202411409030A CN 119258206 A CN119258206 A CN 119258206A
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CN
China
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cells
ntr
dox
aptamer
nanotrain
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Application number
CN202411409030.8A
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任彩萍
姚超艳
李一韩
刘卫东
王磊
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Central South University
Original Assignee
Central South University
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Publication date
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Abstract

本发明提供了一种靶向鼻咽癌的纳米火车载药系统，属于纳米材料和生物医学工程领域，利用核酸适配体S3的靶向特异性，偶联“纳米火车”装载化疗药物阿霉素，制备一种核酸适配体S3修饰的“纳米火车”载药纳米粒用于NPC细胞及组织的靶向杀伤，核酸适配体修饰的“纳米火车”在显著提高药物的负载量和提高对鼻咽癌靶向性的同时，能减少对正常组织及细胞的毒副作用；此外，制备核酸适配体S3和NK细胞和联用的S3‑NK细胞，这种联合策略充分利用了核酸适配体的靶向特性和NK细胞的免疫活性，形成了一个协同作用的治疗平台，显著提升了对鼻咽癌细胞的靶向递送和治疗效果，展现出广阔的临床应用前景。

Description

一种靶向鼻咽癌的纳米火车载药系统及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米材料和生物医学工程领域，具体涉及一种靶向鼻咽癌的纳米火车载药系统及其制备方法与应用。
背景技术
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种具有独特地域特色的恶性肿瘤，尤其在我国南方高发。NPC恶性程度高，对放疗高度敏感，临床上对早期NPC患者常采取单纯放射治疗，但NPC在早期往往缺乏明显的症状，许多患者在确诊时已进入中晚期，错过了最佳的治疗时机。单独放疗的5年生存率仅为35-52％，联合化疗虽然可以提高治疗效果，但同时也带来了严重的毒副作用。随着医学研究的进展，免疫治疗作为一种新兴的治疗手段，已经在多种癌症治疗中显示出巨大的潜力，包括NPC。NK细胞介导的免疫治疗与放疗和靶向治疗的联合使用越来越广泛，在达到更好的治疗效果的同时减少其毒副作用。因此，为了提高鼻咽癌治疗的精确性和有效性，筛选对鼻咽癌特异分子标志物的探针，并利用该特异性探针制作靶向性药物及靶向性NK细胞，靶向性药物能够将药物精确地递送到癌细胞，减少对正常细胞的损害，同时靶向性NK细胞也能更有效地靶向识别并清除肿瘤，达到“一石二鸟”的目的，提高靶向治疗效果的同时降低其毒副作用，为鼻咽癌患者提供了一种全新的治疗选择。
核酸适配体(aptamer)，也被称为“化学抗体”，是一种通过指数富集的配体结合过程(SELEX，Systematic Evolution ofLigands by Exponential enrichment)技术从大量核酸库中筛选出来的单链寡核苷酸。这些适配体能够高度特异性地识别并结合其目标分子，包括蛋白质、小分子化合物、甚至细胞和组织。与传统的抗体相比，核酸适配体具有许多优势，例如体积小、生物相容性好、稳定性高、生产成本低、易于化学修饰等。在作为靶向基团时，核酸适配体由于体积较小，产生的位阻很少，从而增强了和靶点的结合能力，在靶向治疗方面展现出了巨大潜力。
阿霉素(doxorubicin，DOX)是一种广泛用于多种癌症治疗的化疗药物，包括NPC。虽然DOX常规化疗在一定程度上能改善疗效，但在治疗过程中常伴随骨髓抑制和心脏毒性等毒副作用，严重限制了其在NPC中的应用和治疗效果。因此，将核酸适配体偶联到装载阿霉素的纳米载药系统即“纳米火车”上，该药物递送系统利用核酸适配体的高度特异性和亲和力，能够精准识别并靶向肿瘤细胞表面的特定标志物。装载有阿霉素的“纳米火车”在适配体的引导下，能够高效地将药物递送到肿瘤部位，从而在提高治疗效果的同时，显著降低对正常细胞和组织的毒副作用。然而，肿瘤微环境复杂多变，单一化疗的治疗效果是有限的，联合免疫治疗是非常有必要的，既可以提供直接的杀瘤作用，又可以识别和清除逃逸的癌细胞，实现长期监控和防止复发。
以NK细胞为基础的免疫疗法展现出了巨大的潜力，NK细胞杀伤肿瘤细胞不需要抗原呈递，也无需事先增敏或克隆扩增，通过释放穿孔素诱导靶细胞死亡，激活细胞信号通路触发细胞凋亡。NK细胞的这些固有特性展示出其在过继性肿瘤免疫治疗中的巨大应用价值。然而，由于NK细胞缺少细胞特异性受体，选择性较差，这限制了它在临床上的应用。通过糖代谢标记和点击反应在NK细胞表面修饰适配体S3，这种适配体修饰的NK细胞能够更精确地识别肿瘤细胞表面的特定标志物，从而显著提高NK细胞对肿瘤的靶向性。通过这种方式，NK细胞的免疫杀伤能力得到了显著增强，同时减少了对正常细胞的损害，降低了毒副作用。
总之，利用核酸适配体的靶向特异性，偶联“纳米火车”装载化疗药物DOX，联合NK细胞过继免疫治疗策略，在提高靶向治疗效果的同时降低毒副作用，具有广阔的临床应用前景。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种靶向鼻咽癌的纳米火车载药系统及其制备方法与应用，提出了一种基于特异靶向NPC细胞的核酸适配体S3修饰的“纳米火车”载药系统和工程化的NK细胞产品联合治疗鼻咽癌的制备方法与应用，该联合系统通过核酸适配体分别与“纳米火车”以及NK细胞相结合，核酸适配体修饰的“纳米火车”在显著提高药物的负载量的同时能减少对正常组织及细胞的毒副作用，核酸适配体修饰的NK细胞在达到靶向免疫治疗效果的同时能减少CAR-NK容易引起插入突变的风险，二者联合可实现对NPC更精准的靶向，显著提高NPC的治疗效果，因此，利用核酸适配体的靶向特异性，偶联“纳米火车”与NK细胞联合实现对鼻咽癌细胞的靶向递送和治疗。
为达到上述目的，本方案首先提供了一种靶向鼻咽癌的纳米火车载药系统，包括核酸适配体纳米火车载药纳米粒和工程化NK细胞，所述核酸适配体纳米火车载药纳米粒包括核酸适配体S3、DNA纳米火车和阿霉素，所述DNA纳米火车是由DNA单体M1和M2在核酸适配体触发探针trigger的作用下碱基互补配对发生杂交链式反应自组装形成的长双链结构；所述DNA纳米火车装载阿霉素后被核酸适配体S3修饰；所述工程化NK细胞为核酸适配体S3修饰的NK细胞；
所述核酸适配体S3的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述DNA单体M1的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述DNA单体M2的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述核酸适配体触发探针trigger的序列如SEQ ID NO.4所示。
基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种纳米火车载药系统的制备方法，包括以下步骤：
S1、DNA纳米火车的制备：在核酸适配体S3的5′末端修饰核酸适配体触发探针trigger得到嵌合体S3-trigger，将其引入DNA单体M1和M2的混合物中，通过碱基互补配对原则发生杂交链式反应自组装，形成DNA纳米火车S3-NTr；
S2、核酸适配体纳米火车载药纳米粒的制备：将阿霉素与S1步骤制得的DNA纳米火车S3-NTr以摩尔比50:1的比例混合于含Mg2+的杜氏磷酸盐缓冲液中，室温放置，阿霉素即载入到S3-NTr的载药位点中，得到S3-NTr-DOX；
S3、叠氮修饰的NK92细胞的制备：向NK92细胞中加入N-叠氮乙酰基甘露糖胺-四酰基化，与NK92细胞共孵育，之后收集细胞用PBS洗涤得到叠氮修饰的NK92细胞；
S4、工程化NK细胞的制备：将S3制得的叠氮修饰的NK92细胞与FAM标记、DBCO修饰的S3适配体在添加1％胎牛血清的PBS缓冲液中孵育，之后采用PBS缓冲液洗涤；
所述DBCO修饰的S3适配体的序列如SEQ ID NO.5所示。
作为优选，所述步骤S1中嵌合体S3-trigger与DNA单体M1和M2的混合物浓度比为1:10。
作为优选，所述步骤S2中室温放置的时间为2h。
作为优选，所述步骤S3中孵育时间为24h。
作为优选，所述步骤S4中孵育的温度为37℃，时间为2h。
基于一个总的发明构思，本方案还提供了一种纳米火车载药系统在制备靶向治疗鼻咽癌药物中的应用。
作为优选，所述纳米火车载药系统为任何药学上认可的制剂。
作为优选，所述纳米火车载药系统的给药顺序为：先给药工程化NK细胞，4h后再给药核酸适配体纳米火车载药纳米粒S3-NTr-DOX。
本方案治疗的机理如下：
该联合系统通过核酸适配体分别与“纳米火车”以及NK细胞相结合，核酸适配体修饰的“纳米火车”在显著提高药物的负载量的同时能减少对正常组织及细胞的毒副作用，核酸适配体修饰的NK细胞在达到靶向免疫治疗效果的同时能减少CAR-NK容易引起插入突变的风险，二者联合可实现对NPC更精准的靶向，显著提高NPC的治疗效果，因此，利用核酸适配体的靶向特异性，偶联“纳米火车”与NK细胞联合实现对鼻咽癌细胞的靶向递送和治疗。
核酸适配体纳米火车载药纳米粒包括核酸适配体S3、DNA纳米火车和抗肿瘤药物DOX。核酸适配体S3通过碱基互补配对连接在纳米火车的一端，作为靶向分子识别鼻咽癌细胞表面的CD109蛋白；纳米火车由DNA单体M1和M2在核酸适配体触发探针(S3-trigger)的作用下自组装而成，形成长双链结构，该结构内部含有大量可装载药物的位点。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本方案提供了特异性识别NPC细胞的核酸适配体S3修饰的“纳米火车”载药系统(S3-NTr-DOX)，该系统能特异性地识别并结合NPC细胞表面的CD109分子，实现抗肿瘤药物DOX的高效靶向递送。相较于游离DOX，S3-NTr-DOX显著增强了DOX对NPC细胞的杀伤效果，同时在NPC肿瘤球中也表现出良好的靶向杀伤性，为NPC的靶向治疗提供了新的有效手段。
(2)阿霉素是一种广泛应用于多种癌症治疗的化疗药物，尽管常规使用阿霉素进行化疗能够在一定程度上改善治疗效果，但由于其无靶向性，其杀伤作用仍会波及正常细胞和组织。本发明通过将阿霉素装载到能特异性识别NPC细胞的核酸适配体S3修饰的“纳米火车”上，该系统在实现高效靶向治疗的同时，显著降低了阿霉素对正常组织和细胞的毒性作用。体内外实验均证明，S3-NTr-DOX治疗组对正常组织的毒性低或无毒性，生物安全性良好，有望减轻患者在化疗过程中的毒副作用，提高患者的生活质量。
(3)本发明提供的靶向NPC细胞的载药系统，制备方法简单，载药效率高，通过对其作用机制的深入探索，为抗肿瘤药物的特应性靶向递送和NPC的个性化治疗提供了新的思路和策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实验例1中核酸适配体纳米火车(S3-NTr)的制备，a为核酸适配体纳米火车S3-Ntr反应规程图，b为通过琼脂糖凝胶电泳验证S3-NTr的合成，c为DNase处理S3-NTr的琼脂糖凝胶电泳图，d为用Defined K-SFM和1640溶液对S3-NTr样品进行琼脂糖凝胶电泳分析结果；
图2为实验例2中S3-NTr的靶向性考察，a为FITC荧光标记的S3-NTr与NPC细胞系6-10B、SUNE-1、HK-1、5-8F、C666-1的结合情况，b为FITC标记的S3-NTr对5-8F、C666-1的染色情况，c为S3-NTr对于5-8F和C666-1形成的肿瘤球的识别效应荧光成像；
图3为实验例3中S3-NTr-DOX的体外杀伤作用，a为5-8F和C666-1流式细胞仪检测结果，b为CCK-8实验检测用PBS、DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX分别处理NP69、5-8F和C666-1后的细胞活力实验结果，c为PBS、DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX四个组，分别在加药0h和48h计数每个孔中球体的个数实验结果，d为加药处理48h后，DOX组和S3-NTr-DOX组细胞存活情况；
图4为实验例4中S3-NTr-DOX对NPC细胞凋亡影响，a为PBS、DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX分别处理后对5-8F细胞凋亡的影响，b为PBS、DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX分别处理后对C666-1细胞凋亡的影响；
图5为实验例5中S3-NTr-DOX的体内杀伤作用，a为PBS、DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX四组裸鼠瘤体体积变化，b为PBS、DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX四组裸鼠瘤体最终大小及重量，c为PBS对照组，DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX处理组免疫组化检测结果；
图6实验例6中S3-NTr及S3-NTr-DOX的生物安全性，a为PBS、NTr和S3-NTr三组裸鼠体重变化图，b为PBS、DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX四组裸鼠体重变化，c为裸鼠体内的各脏器器官组织形态学照片；
图7为实验例7中NK细胞与S3的联用及其对鼻咽癌细胞的靶向性，a为S3适配体在NK细胞表面标记免疫荧光图，b为S3-NK细胞与鼻咽上皮细胞NP69和NPC细胞5-8F、C666-1共孵育检测其靶向性，c为用CCK8法评估S3-NTr-DOX、NK细胞、S3-NK细胞、S3-NTr-DOX联合NK细胞、S3-NTr-DOX联合S3-NK细胞对5-8F细胞的杀伤活性；
图8为实验例7中S3-NTr-DOX联合S3-NK细胞的给药示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实验例1
制备DNA纳米火车S3-Ntr并考察其稳定性
在核酸适配体S3的5′末端修饰了DNA触发探针(trigger)，将嵌合体S3-trigger引入DNA单体M1和M2的混合物中，通过碱基互补配对原则发生杂交链式反应自组装，形成核酸适配体纳米火车S3-Ntr，其反应规程如图1a所示。
通过琼脂糖凝胶电泳验证S3-NTr的合成，其结果如图1b所示，凝胶泳道中单独的M1、单独的M2、M1和M2混合、单独的trigger均未发生反应，而在S3-trigger的作用下M1、M2发生杂交反应，形成了长短不一的杂交产物，即表明S3-NTr的合成。并经过验证发现，S3-trigger与M1/M2的最适浓度比为1:10。
(2)验证S3-NTr的稳定性
使用浓度为1U/mL的脱氧核糖核酸内切酶(deoxyribonuclease I，DNase)来处理S3-NTr0.5h后，用琼脂糖凝胶电泳检测S3-NTr的结构完整性。DNase处理结果如图1c所示，与未处理的样品相比，加样口的样品量没有明显的减少，这说明S3-NTr有很好的抗酶消化作用。
此外，用DefinedK-SFM和含10％FBS的1640溶液对S3-NTr孵育0-64h，分别取不同时间点的样品进行琼脂糖凝胶电泳分析，处理结果如图1d所示，64h后，S3-NTr的量依旧没有明显的减少，说明S3-NTr在血清或无血清溶液中均可以较长时间地保持结构的稳定性。
总的来说，S3-NTr的稳定性相对较高，在高浓度酶和复杂溶液中仍可以保持结构的完整，进一步说明S3-NTr可以用于生物复杂体系。
核酸适配体S3的序列为：
5′–ATCCAGAGTGACGCAGCATCTGAGAATAGTGGTTTGCTGTATGGTG
GGCGTTGAAAGAGGGGTGGACACGGTGGCTTAGT–3′(SEQ ID NO.1)
DNA单体M1的序列为：
5′–CGTCGTGCAGCAGCAGCAGCAGCAACGGCTTGCTGCTGCTGCTGCTGC–3′(SEQ ID NO.2)
DNA单体M2的序列为：
5′–TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGGCAGCAGCAGCAGCAGCAAGCCGT–3′(SEQ ID NO.3)
DNA触发探针trigger的序列为：
5′–TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGTTT–3′(SEQ ID NO.4)
S3-trigger序列为:
5′–TGCTGCTGCTGCTGCTGCACGACGTTTATCCAGAGTGACGCAGCAT
CTGAGAATAGTGGTTTGCTGTATGGTGGGCGTTGAAAGAGGGGTGGACACGGTGG CTTAGT–3′
实验例2
考察S3-NTr的靶向性
(1)S3-NTr对NPC细胞的靶向性
用流式细胞术检测带有FITC荧光标记的S3-NTr与NPC细胞系6-10B、SUNE-1、HK-1、5-8F、C666-1的结合情况，以正常鼻咽上皮细胞系NP69作阴性对照。结果如图2a显示，与对照相比，NPC细胞系荧光结合峰均发生改变，向右侧移动，即S3-NTr能够特异性识别NPC细胞。
利用荧光显微镜进一步观察FITC标记的S3-NTr对5-8F、C666-1的染色情况。如图2b显示，S3-NTr能够与5-8F和C666-1结合发出荧光，主要分布在细胞膜和胞质，而对照Lib-NTr不能结合，说明了S3-NTr对鼻咽癌细胞具有良好的识别性。
(2)S3-NTr对NPC细胞中的肿瘤干细胞的靶向性
在低吸附性6孔板中加入游离的5-8F细胞和C666-1细胞，通过无血清干细胞培养基培养，形成自由漂浮的肿瘤球。在6-8天观察到非贴壁球体，酶解成单个细胞传代。通过荧光成像(图2c)，证明了对于5-8F和C666-1形成的肿瘤球来说，S3-NTr表现出良好的识别效应，表明其在杀伤肿瘤球方面也有巨大潜力。
实验例3
制备核酸适配体纳米火车载药纳米粒S3-NTr-DOX并考察其体外杀伤作用
(1)制备S3-NTr-DOX
DOX和S3-NTr以摩尔比50:1的比例混合于含5mM Mg2+的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)中，室温放置2h，DOX即载入到S3-NTr的载药位点中，得到S3-NTr-DOX。
(2)DOX在NPC细胞中的摄取
S3-NTr-DOX被细胞摄入后，药物会随着核酸酶等作用下缓慢释放。在触发探针上连接一段随机序列，设置NTr-DOX处理组，探究纳米载药系统的药物缓释作用。流式细胞仪检测结果如图3a所示，在5-8F和C666-1细胞系中，与PBS组阴性对照相比，DOX、NTr-DOX和S3-NTr-DOX组的荧光结合峰在4h、8h时均发生右移。在4h时，NTr-DOX组和S3-NTr-DOX组中DOX的荧光强度均没有DOX组强，而在8h时，NTr-DOX和S3-NTr-DOX组中DOX荧光强度逐渐增强，证明了该纳米结构的有效性。此外，在任意时刻，S3-NTr-DOX组中DOX荧光强度都比NTr-DOX组强，证明了S3-NTr的药物靶向性。在NP69中，任意时刻S3-NTr-DOX组中DOX的荧光强度最低，证明S3-NTr-DOX对正常鼻咽上皮细胞不识别。
(3)S3-NTr-DOX对细胞增殖的影响
采用CCK-8实验检测DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX分别处理对NP69、5-8F和C666-1细胞活力的影响。实验分组为PBS组、游离DOX组、NTr-DOX组、S3-NTr-DOX组，DOX的半数抑制浓度分别为：IC50(NP69)＝1382.0nM，IC50(5-8F)＝515.1nM，IC50(C666-1)＝475.6nM，用对应细胞的IC50与细胞孵育0d、1d、2d、3d、4d、5d，在对应的时间点去除培养基，并加入CCK8溶液，使用酶标仪测量每个组在450nm处的吸光度值(OD)，计算处理细胞的存活率。图3b结果显示，在NP69中，与PBS处理组相比，DOX和NTr-DOX处理组能明显抑制NP69的细胞活力，NTr-DOX组也说明了纳米火车能被细胞摄取，而用S3-NTr-DOX处理后的NP69，细胞活力与第一天相比略有下降，但与DOX和NTr-DOX相比，其增殖抑制作用不明显。在5-8F和C666-1中，S3-NTr-DOX的杀伤效果最明显。上述结果说明S3-NTr-DOX对NPC细胞表现出良好的靶向识别性，且能显著抑制NPC细胞增殖。
(4)S3-NTr-DOX对肿瘤球的杀伤作用
利用5-8F细胞培养肿瘤球到一定大小后，检测S3-NTr-DOX对肿瘤球的杀伤作用。分为PBS、DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX四个组，分别在加药0h和48h计数每个孔中球体的个数。图3c显示加药处理48h后，DOX组和S3-NTr-DOX组中明显漂浮着被杀死的死细胞，说明其对肿瘤球具有良好的杀伤效果。计数结果如图3d所示，DOX组和S3-NTr-DOX组对肿瘤球有明显的杀伤效果。
实验例4
考察S3-NTr-DOX对NPC细胞凋亡影响
使用AnnexinV-PE/7-AAD试剂盒双染色法用流式细胞仪检测细胞凋亡，Q1、Q2、Q3、Q4区分别代表坏死、晚期凋亡和早期凋亡、存活细胞区域。结果如图4所示，5-8F、C666-1细胞中，与PBS对照组相比，细胞凋亡率显著提高，其中S3-NTr-DOX组细胞凋亡率最高。且与NTr-DOX组相比，S3-NTr-DOX组抑制细胞存活的能力更强，说明在同样载药系统里，S3-NTr-DOX更能靶向NPC细胞。
实验例5
考察S3-NTr-DOX的体内杀伤作用
(1)S3-NTr-DOX体内抗肿瘤活性评价
将裸鼠分为四组，分别为PBS对照组、DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX，每隔三天给一次药，每次200μL，DOX浓度均为2mg/kg，共计十次。图5a显示，与PBS对照组相比，DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX处理组的裸鼠瘤体体积在药物作用下均增长缓慢，但S3-NTr-DOX处理组抑制效果最明显。图5b显示30天后裸鼠瘤体最终大小及重量，与PBS对照组相比，DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX处理组的裸鼠瘤体大小均减小，但S3-NTr-DOX处理组的裸鼠瘤体最小，表明S3-NTr-DOX能够有效抑制裸鼠体内肿瘤的生长。
(2)免疫组化检测
将瘤体使用石蜡包埋并切片，通过免疫组化实验检测肿瘤组织中Ki67的表达。如图5c所示，与PBS对照组相比，DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX处理组与增殖密切相关的分子Ki67的表达均低于对照组，且S3-NTr-DOX处理组Ki67的表达最低。
实验例6
考察S3-NTr及S3-NTr-DOX的生物安全性
(1)S3-NTr在动物体内的毒性
在裸鼠体内每隔3天注射PBS、NTr和S3-NTr溶液，每次200μL，并每隔3天称量一次体重。注射10次后，脱颈处死裸鼠。三组裸鼠体重变化如图6a所示，与对照组相比，NTr和S3-NTr对裸鼠体重并无明显影响，说明这种纳米载体不影响裸鼠的生长。
(2)S3-NTr-DOX在动物体内的毒性
将裸鼠分为四组，每隔三天给一次药，每次200μL，DOX浓度均为2mg/kg，共计十次，期间对各组小鼠进行体重称量，如图6b所示，PBS处理组的裸鼠体重持续增长，而DOX、NTr-DOX、S3-NTr-DOX处理组的裸鼠体重均有下降，表明裸鼠均有受到化疗药DOX影响。而与DOX处理组相比，NTr-DOX、S3-NTr-DOX处理组的裸鼠体重变化幅度小，说明纳米火车结构能有效减轻化疗药物的毒副作用。
(3)S3-NTr-DOX对裸鼠各器官组织形态的影响
通过比较裸鼠体内的各脏器器官组织形态学照片检验S3-NTr-DOX的生物安全性。如图6c所示，组织学评价结果显示，与未给药组相比，S3-NTr-DOX治疗组裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和脑的病理形态均正常，但是游离DOX治疗组中多个组织出现明显的组织形态学改变，说明纳米火车对正常组织的低毒或无毒性，生物安全性良好。
实验例7
考察工程化NK细胞与S3的联用及其对鼻咽癌细胞的靶向性
(1)工程化NK细胞的制备
向NK92细胞中加入50μM N-叠氮乙酰基甘露糖胺-四酰基化(Ac4ManNAz)，与NK92细胞共孵育24h后，用PBS洗涤3次，即制得叠氮标记的NK92细胞。将叠氮标记的NK92细胞与FAM标记、DBCO修饰的S3适配体在添加1％胎牛血清的PBS缓冲液中37℃孵育2h，之后用PBS缓冲液洗涤3次即可得到S3-NK。
FAM标记的DBCO-S3适配体序列为:
5′–DBCO-(C6)-ATCCAGAGTGACGCAGCATCTGAGAATAGTGGTTTGC
TGTATGGTGGGCGTTGAAAGAGGGGTGGACACGGTGGCTTAGT-(C6)-FAM–3′
DBCO-S3适配体序列为:
5′–DBCO-(C6)-ATCCAGAGTGACGCAGCATCTGAGAATAGTGGTTTG
CTGTATGGTGGGCGTTGAAAGAGGGGTGGACACGGTGGCTTAGT–3′(SEQ ID NO.5)
(2)S3及S3-NK对鼻咽癌细胞的靶向性
将FAM荧光标记在DBCO-S3(DBCO-S3-FAM)的核酸适配体发出荧光，免疫荧光实验结果如图7a所示，NK细胞表面检测到荧光，且24h内均有稳定荧光信号。表明S3适配体在NK细胞表面成功标记。S3-NK细胞与鼻咽上皮细胞NP69和NPC细胞5-8F、C666-1共孵育检测其靶向性，实验结果如图7b所示，S3能够靶向识别NPC细胞而不识别NP69细胞，表明S3对NPC细胞具有靶向性。
(3)S3-NTr-DOX联合S3-NK细胞对鼻咽癌细胞的特异性杀伤作用
实验分为S3-NTr-DOX组、NK细胞组、S3-NK细胞组、NK细胞先加入4h后再加入S3-NTr-DOX的联合治疗组、S3-NK细胞先加入4h后再加入S3-NTr-DOX的联合治疗组，将各组分别与5-8F细胞孵育(其中S3-NTr-DOX的浓度设计为515.1nM，NK细胞与靶细胞的孵育比例为10:1)，采用CCK8法评估联合处理组对5-8F细胞的杀伤活性。如图7c所示，Control组5-8F细胞正常存活，S3-NTr-DOX、NK细胞、S3-NK细胞、S3-NTr-DOX联合NK细胞、S3-NTr-DOX联合S3-NK细胞处理组5-8F细胞存活率均下降，而与S3-NTr-DOX、NK细胞、S3-NK细胞处理组相比，联合处理组(S3-NTr-DOX联合NK细胞、S3-NTr-DOX联合S3-NK细胞)5-8F细胞存活率下降趋势更明显，其中S3-NTr-DOX联合S3-NK细胞处理组5-8F细胞存活率下降幅度和趋势最为明显。说明S3-NTr-DOX联合S3-NK细胞对鼻咽癌细胞的特异性杀伤作用最强。
S3-NTr-DOX联合S3-NK细胞的给药示意图如图8所示。
以上所述仅是本发明专利的优选实施方式，本发明专利的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明专利的技术构思前提下所得到的改进和变换也应视为本发明专利的保护范围。

Claims (9)

1.一种靶向鼻咽癌的纳米火车载药系统，其特征在于，包括核酸适配体纳米火车载药纳米粒和工程化NK细胞，所述核酸适配体纳米火车载药纳米粒包括核酸适配体S3、DNA纳米火车和阿霉素，所述DNA纳米火车由DNA单体M1和M2在核酸适配体触发探针trigger的作用下碱基互补配对发生杂交链式反应自组装形成的长双链结构；所述DNA纳米火车装载阿霉素后被核酸适配体S3修饰；所述工程化NK细胞为核酸适配体S3修饰的NK细胞；
所述核酸适配体S3的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述DNA单体M1的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述DNA单体M2的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述核酸适配体触发探针trigger的序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种如权利要求1所述的纳米火车载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、DNA纳米火车的制备：在核酸适配体S3的5′末端修饰核酸适配体触发探针trigger得到嵌合体S3-trigger，将其引入DNA单体M1和M2的混合物中，通过碱基互补配对原则发生杂交链式反应自组装，形成DNA纳米火车S3-NTr；
S2、核酸适配体纳米火车载药纳米粒的制备：将阿霉素与S1步骤制得的DNA纳米火车S3-NTr以摩尔比50:1的比例混合于含Mg2+的杜氏磷酸盐缓冲液中，室温放置，阿霉素即载入到S3-NTr的载药位点中，得到S3-NTr-DOX；
S3、叠氮修饰的NK92细胞的制备：向NK92细胞中加入N-叠氮乙酰基甘露糖胺-四酰基化，与NK92细胞共孵育，之后收集细胞用PBS洗涤得到叠氮修饰的NK92细胞；
S4、工程化NK细胞的制备：将S3制得的叠氮修饰的NK92细胞与FAM标记、DBCO修饰的S3适配体在添加1％胎牛血清的PBS缓冲液中孵育，之后采用PBS缓冲液洗涤；所述DBCO修饰的S3适配体的序列如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中嵌合体S3-trigger与DNA单体M1和M2的混合物浓度比为1:10。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中室温放置的时间为2h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中孵育时间为24h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中孵育的温度为37℃，时间为2h。
7.一种如权利要求1所述的载药体系或如权利要求2-6任一项所述的制备方法制得的纳米火车载药系统在制备靶向治疗鼻咽癌药物中的应用。
8.根据权利要求7的应用，其特征在于，所述纳米火车载药系统为任何药学上认可的制剂。
9.根据权利要求7的应用，其特征在于，所述纳米火车载药系统的给药顺序为：先给药工程化NK细胞，4h后再给药核酸适配体纳米火车载药纳米粒S3-NTr-DOX。
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