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CN119257034A - 一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法 - Google Patents

一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法 Download PDF

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CN119257034A
CN119257034A CN202411645907.3A CN202411645907A CN119257034A CN 119257034 A CN119257034 A CN 119257034A CN 202411645907 A CN202411645907 A CN 202411645907A CN 119257034 A CN119257034 A CN 119257034A
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hong kong
heavy metal
acute toxicity
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oyster
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栗志民
蔡思灿
张方琪
吴汉亮
黄东明
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Guangdong Ocean University
Original Assignee
Guangdong Ocean University
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Abstract

本发明公开了一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法，选取香港牡蛎作为研究对象，通过急性毒性实验评估重金属铜对其生存与抗氧化酶活性的影响。确定香港牡蛎对铜离子的LC50为65.32mg/L，SC为0.65mg/L。使用确定的半致死浓度进行胁迫处理，随实验时间的的延长，对香港牡蛎不同组织的抗氧化指标均产生显著影响。香港牡蛎的肝胰腺中CAT、鳃组织中的T‑SOD和GST、生殖腺中的GPX，在其相应的组织中的表现出特异性，该发现可作为Cu2+含量生态监测的重要依据。本试验结果可为香港牡蛎的健康养殖提供参考。

Description

一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响 研究方法
技术领域
本发明涉及水产养殖研究技术领域，更具体的说是涉及一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法。
背景技术
香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)，又称香港巨牡蛎，俗称白耗，隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、翼形亚纲(Pterimorpjia)、珍珠贝目(Pterioida)、牡蛎科(Ostreidae)、巨蛎属(Crassostrea)，通常生长在低潮线附近及入海口。香港牡蛎在我国已有两千多年的养殖历史，具有肉质鲜美，营养价值丰富的特点，被称为“海中牛奶”，属于高蛋白、低脂肪、低胆固醇且富含锌、硒等微量元素的经济种类，受到了市场的青睐以及科技工作者的关注，有研究表明，2018年全国香港牡蛎的年产量为180万t，占全国牡蛎年产量的34.7％，仅次于福建牡蛎。
近些年来，随着工业生产过程中，有色金属冶炼、煤炭燃烧和电子垃圾处理等产生的重金属通过地表径流等方式大量输入近海以及养殖过程中，饲料的投放、鱼药的施用等养殖行为不当，近海水质受到了严重的污染。研究表明，在食物链和食物网的流动过程中，重金属含量随着营养级的升高而逐渐下降。大多数双壳贝类以滤食为主，对重金属的富集水平都相对较高，而一旦达到阈值会导致贝类的生理响应加强，造成组织损伤和血细胞活性下降，最终影响其存活。据调查，目前近海的重金属污染以Hg、Cu为主，而养殖区的重金属污染则以Cu、Zn为主。因此，不少学者围绕重金属Cu对养殖贝类的影响展开研究，与对照组相比，单一重金属离子Cu2+致死的泥蚶(Tegillarca granosa)具有明显的特异性死亡症状：Cu2+致死的泥蚶成体表现为鳃糜烂。应用PI染色的流式细胞术测定血细胞活性的变化，结果显示胁迫6h后，10-3M Cu2+导致血细胞的死亡率显著，且与Hg2+、Cd2+、Zn2+比较发现，Cu2+对杂色鲍血细胞的毒性最小。采用静态急性毒性实验方法研究重金属Cu2+和海水酸化对菲律宾蛤仔的联合影响，结果表明Cu胁迫显著降低了蛤仔的耗氧率和滤水率(P<0.05)，随胁迫时间的延长，蛤仔心率显著下降(P<0.05)。
水质理化指标是影响香港牡蛎健康生长的重要因素。研究表明，温度、盐度、溶解氧、pH等都会影响香港牡蛎的健康状况。而重金属Cu2+胁迫对香港牡蛎影响的研究尚未见报道，鉴于铜元素可能对牡蛎造成的潜在毒性影响，进行深入的毒性研究和严格的检测工作显得尤为迫切，这不仅关系到食品安全，也直接影响到公众健康和生态环境的可持续性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法，具体采用如下技术方案：
一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法，包括以下步骤：
步骤一：挑选规格一致的香港牡蛎清净后暂养4d备用；
步骤二：急性毒性实验
设置不同浓度的含Cu(NO3)·2.5H2O的养殖海水，然后将香港牡蛎分别置于其中进行饲养，每隔24h等浓度换水一次，及时清除死亡的香港牡蛎并且记录存活率，持续饲养4d，计算香港牡蛎在重金属铜胁迫4d后的半致死浓度和安全浓度；
步骤三：胁迫实验
根据步骤二中急性毒性实验结果，选定4d LC50为胁迫浓度对香港牡蛎进行胁迫，设置多个水平组且每组养殖数量相同，分别在胁迫0h、24h、48h、72h、96h后随机选取同等数量的香港牡蛎，无菌条件下对其外套膜、鳃、生殖腺和肝胰腺进行取样，然后进行抗氧化酶活性的测定。
优选的，步骤一中香港牡蛎壳高为140.15±2.56mm、壳长为71.28+±1.89mm。
优选的，步骤一中暂养期间盐度18.75±0.67‰、水温25±0.5℃，每天投喂湛江等鞭金藻两次，每次投喂量1×104cell/mL，每日进行一次100％换水，期间持续充气。
优选的，步骤一中暂养水与步骤二中养殖海水相同，均符合一类海水标准，步骤二中设置40.00mg/L、56.62mg/L、79.98mg/L、113.24mg/L和160.00mg/L五个浓度的含Cu(NO3)·2.5H2O的养殖海水，每组3个平行。
优选的，步骤二中以养殖海水作为对照组，实验期间不投饵，其余培养条件与暂养期一致，每3h检查香港牡蛎的存活情况。
优选的，步骤二采用SPSS27.0软件中的Probit过程，构建概率单位-药物质量浓度对数直线回归方程，通过该方程，分别得到24h、48h、72h、96h的半致死浓度(LC50)，再利用安全浓度的计算公式MPC＝96hLC50/100，求出安全浓度(SC)。
优选的，步骤三以养殖海水作为对照组，设置至少3个水平组。
优选的，步骤三中所述抗氧化酶为CAT、T-SOD、GSH-PX和GSH-ST。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法，具有如下有益效果：
本发明以香港牡蛎为对象，探讨了铜的急性毒性以及对抗氧化酶活性的影响。研究发现，香港牡蛎对铜离子的96h LC50为65.32mg/L，安全浓度为0.65mg/L。在铜胁迫下，香港牡蛎的肝胰腺中CAT、鳃组织中的T-SOD和GST、生殖腺中的GPX均在不同的组织中抗氧化应激水平中存在特异性，该发现可作为Cu2+含量生态监测的重要依据。本试验结果可为香港牡蛎的健康养殖提供参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为铜胁迫下香港牡蛎不同组织CAT活力变化图；
图2为铜胁迫下香港牡蛎不同组织T-SOD活力变化图；
图3为铜胁迫下香港牡蛎不同组织GPX活力变化图；
图4为铜胁迫下香港牡蛎不同组织GST活力变化图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
实施中的实验海水为广东海洋大学水产学院东海岛养殖实验基地海水，经沉淀、砂滤处理。水质分析结果显示：重金属：Cd为0.04μg/L、Pb为0.3μg/L、Cu为0.89μg/L、Zn为7.23μg/L，符合一类海水标准。实验选用分析纯的重金属污染物Cu(NO3)·2.5H2O制备质量浓度为30mg/mL的母液。实验前，用海水按所需浓度进行稀释，并进行现配现用。
步骤一：实验用香港牡蛎于2023年4月购自湛江沿海养殖场，随机挑选500个健康个体，壳高为(140.15±2.56)mm、壳长为(71.28+±1.89)mm，运输取回牡蛎后，去除表面附着生物，并放置于500L塑料桶内暂养4天，暂养期间，盐度(18.75±0.67)‰、水温(25±0.5)℃，每日投喂湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)两次，每次投喂量1×104cell/mL，每日进行一次100％换水，期间持续充气；
步骤二：使用Cu(NO3)·2.5H2O分析纯配置实验所用溶液，根据预实验结果(铜离子浓度为40.00mg/L时香港牡蛎出现死亡，160.00mg/L时香港牡蛎全部死亡)确定药物质量浓度范围，采用等对数间距法，设置5个质量浓度梯度：40.00mg/L、56.62mg/L、79.98mg/L、113.24mg/L和160.00mg/L的实验组，以正常海水对照组。试验在55cm×45cm×30cm方形塑料箱中进行，每个浓度梯度设置3个平行组，每个塑料箱放入30只牡蛎。实验期间不投饵，每隔24h更换与实验组Cu2+浓度一致的海水，其余培养条件与暂养期一致。实验期间，每3h检查香港牡蛎的存活情况，若发现有香港牡蛎开壳，且针刺外套膜无收缩，确定为死亡，将其清除。实验持续4d，每24h记录一次存活率；利用SPSS27.0软件中的Probit过程，构建概率单位-药物质量浓度对数直线回归方程，通过该方程，分别得到24h、48h、72h、96h的半致死浓度(LC50)，再利用公式MPC＝96hLC50/100[12]，求出安全浓度(SC)，最后，进行单因素方差分析(ANOVA)和Duncan法多重比较分析，所有图表均使用Excel 2021绘制；
结果如表1所示：
如表1所示，在一定时间内，随着Cu2+胁迫浓度的增加，香港牡蛎的死亡率逐渐升高。在40.00mg/L Cu2+胁迫72h时香港牡蛎开始出现死亡，平均死亡率为4.44％，160.00mg/LCu2+胁迫96h时全部死亡。对照组死亡率在72h、96h与实验组40.00mg/L Cu2+死亡率存在显著差异(P<0.05)，对照组死亡率在96h内均与与实验组56.62mg/L、79.98mg/L、113.24mg/L和160.00mg/L Cu2+死亡率之间均存在显著差异(P<0.05)。Cu2+对香港牡蛎胁迫24h、48h、72h和96h时的LC50均随着胁迫时间的延长，呈现逐渐降低的趋势，24时最高，96h时最低，LC50依次为230.13mg/L、116.01mg/L、84.33mg/L、65.32mg/L，SC为0.65mg/L。
步骤三：根据步骤二的急性毒性实验结果，选定96h LC50为胁迫浓度对香港牡蛎进行胁迫，即：实验设置对照组和处理组，处理组的浓度设定96h时的半致死浓度65.32mg/L作为胁迫浓度，以正常海水为对照组，实验在55cm×45cm×30cm方形塑料箱中进行，分别于0h、24h、48h、72h、96h随机从每个组取出3个香港牡蛎，用于测定其免疫指标，实验设置3个重复；
免疫指标测定具体为：依次解剖出香港牡蛎的外套膜、鳃、生殖腺和肝胰腺，取组织约500mg与0.86％生理盐水按质量：体积为1：9混合，匀浆机制成10％的组织匀浆，4℃下2500r离心10min，取上清液4℃保存；
其中，酶活性测定具体为：
使用南京建成生化试剂公司生产的试剂盒测定CAT、T-SOD、GSH-PX、GSH-ST，所有操作均参照南京建成公司提供的试剂盒说明书进行，测定原理如下，
CAT：钼酸铵可终止CAT分解H2O2的反应，并与剩余的H2O2作用产生一种淡黄色的络合物，将每毫克组织蛋白每秒钟分解1μmol的H2O2的量定义为一个CAT活力单位，在405nm处测定其变化量并计算CAT的活力。
SOD：WST-1可以与超氧阴离子(O2-)反应，形成水溶性的甲臜染料，SOD抑制该反应过程，将本反应体系中SOD抑制率达50％时所对应的酶量定义为一个SOD活力单位，在450nm处对WST-1的产物进行比色并计算T-SOD的活力。
GSH-PX：还原型谷胱甘肽和二硫代二硝基苯甲酸作用可以生成稳定的5-硫代二硝基苯甲酸阴离子且产物表现为黄色。在412nm处测量其吸光度，计算出还原型谷胱甘肽的量。
GSH-ST：GST催化GSH与1-氯-2,4-二硝基苯反应。一定反应时间内，通过检测溶液中反应物浓度的高低来计算GST酶活力。
结果如附图1-4所示。
图1为铜胁迫下不同组织CAT活力变化，图1显示，在Cu2+胁迫96h内，随实验时间的的延长，对香港牡蛎CAT产生显著影响，其鳃、生殖腺的CAT均呈现先上升后下降的趋势，其外套膜、肝胰腺的CAT呈现上升的趋势。外套膜、鳃、生殖腺、肝脏处理组在胁迫24h、48h、72h、96h时，均与对照组之间存在显著差异(P<0.05)。重金属Cu2+胁迫对不同组织CAT的影响存在显著差异(P<0.05)，敏感程度呈现出肝胰腺>鳃>生殖腺>外套膜，且在96内的最大值，分别为0.545U/mg prot、0.557U/mg prot、0.636U/mg prot、0.615U/mg prot。
图2为铜胁迫下不同组织T-SOD活力变化图。图2显示，在Cu2+胁迫96h内，随实验时间的的延长，对香港牡蛎T-SOD产生显著影响，其外套膜的T-SOD呈现先下降后上升的趋势，其鳃的T-SOD呈现先上升后下降的趋势，其生殖腺、肝胰腺的T-SOD呈现先下降再上升后下降的趋势。外套膜、鳃、生殖腺、肝脏处理组在胁迫24h、48h、72h、96h时，均与对照组之间存在显著差异(P<0.05)。重金属Cu2+胁迫对不同组织T-SOD的影响存在显著差异(P<0.05)，敏感程度呈现出鳃>生殖腺>肝胰腺>外套膜的抗氧化水平，其在96内的最大值，分别为0.740U/mg prot、0.806U/mg prot、0.770U/mg prot、0.785U/mg prot。
图3为铜胁迫下不同组织GPX活力变化图。图3显示，在Cu2+胁迫96h内，随实验时间的的延长，对香港牡蛎GPX产生显著影响，其生殖腺、外套膜、肝胰腺的GPX均呈现先上升后下降的趋势，其鳃组织的GPX呈现波浪状变化。外套膜、鳃、生殖腺、肝脏处理组在胁迫24h、48h、72h、96h时，均与对照组之间存在显著差异(P<0.05)。重金属Cu2+胁迫对不同组织GPX的影响存在显著差异(P<0.05)，其敏感程度呈现出生殖腺>外套膜>鳃>肝胰腺，其在96内的最大值，分别为0.420U/mg prot、0.275U/mg prot、0.217U/mg prot、0.349U/mg prot。
图4为铜胁迫下不同组织GST活力变化。图4显示，在Cu2+胁迫96h内，随实验时间的的延长，对香港牡蛎GST产生显著影响，其外套膜、肝胰腺的GST均呈现先上升后下降的趋势，其鳃的GST呈现先下降再上升后下降的趋势，其生殖腺呈现先下降后上升的趋势。外套膜、鳃、生殖腺、肝脏处理组在胁迫24h、48h、72h、96h时，均与对照组之间存在显著差异(P<0.05)。重金属Cu2+胁迫对不同组织GST的影响存在显著差异(P<0.05)，其敏感程度呈现出鳃>外套膜>肝胰腺>生殖腺，其在96内的最大值，分别为0.271U/mg prot、0.294U/mg prot、0.211U/mg prot、0.406U/mg prot。
上述研究结果表明，在c(Cu2+)＝65.32mg/L的急性胁迫下，随着实验时间的延长，香港牡蛎的鳃、生殖腺的CAT均呈现先上升后下降的趋势，外套膜、肝胰腺的CAT呈现上升的趋势，该结果与实验毒物的浓度、种类以及胁迫时间有关。肝胰腺是香港牡蛎的主要解毒和代谢功能器官，是重金属Cu2+进入其体内的主要富集部位。结果表明，香港牡蛎CAT对Cu2+的敏感程度，呈现出肝胰腺>鳃>生殖腺>外套膜的规律。当Cu2+进入肝胰脏组织时，催化CAT产生大量活性氧自由基团，对于其一直处在较高水平而未下降，是组织细胞受到轻度破坏时，因受到污染物胁迫而不断产生新CAT维持氧化还原体系平衡，这是机体自身正常的应激反应。
在Cu2+浓度为65.32mg/L的急性胁迫下，随着实验时间的延长，香港牡蛎外套膜的T-SOD呈现先下降后上升的趋势，鳃的T-SOD呈现先上升后下降的趋势，其生殖腺、肝胰腺的T-SOD呈现先下降再上升后下降的趋势，该结果与实验毒物的浓度、不同组织有关。鳃组织是软体动物的呼吸器官，鳃的损坏将对其呼吸作用产生重要影响，造成体内离子失衡，最终导致生物体死亡。结果表明，香港牡蛎T-SOD对Cu2+的敏感程度，呈现鳃>生殖腺>肝胰腺>外套膜的规律，是Cu2+胁迫72h内，Cu/Zn-SOD基因高表达可有效消除过多的氧自由基，降低和阻止细胞损伤，SOD呈上升趋势，72h后，鳃组织受到氧化损伤，抑制SOD的活性，SOD呈下降趋势。
Cu2+浓度为65.32mg/L的急性胁迫下，随着实验时间的延长，香港牡蛎外套膜、肝胰腺的GPX均呈现先上升后下降的趋势，生殖腺的GPX呈现先上升再下降后上升的趋势，鳃的GPX呈现波浪状变化，且不同组织中的敏感程度呈现出生殖腺>外套膜>鳃>肝胰腺的规律。当机体受到重金属胁迫时，生殖腺会积累大量的ROS，因此生殖腺中的GPX活力上升，直到生殖腺组织受到氧化损伤，生殖功能出现障碍，GPX活力开始下降。
香港牡蛎GST对Cu2+的敏感程度，呈现出鳃>外套膜>肝胰腺>生殖腺的规律。原因在于由于活性氧增多，造成组织损伤，导致外套膜GST敏感程度较为强烈。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：挑选规格一致的香港牡蛎清净后暂养4d备用；
步骤二：急性毒性实验
设置不同浓度的含Cu(NO3)·2.5H2O的养殖海水，然后将香港牡蛎分别置于其中进行饲养，每隔24h等浓度换水一次，及时清除死亡的香港牡蛎并且记录存活率，持续饲养4d，计算香港牡蛎在重金属铜胁迫4d后的半致死浓度和安全浓度；
步骤三：胁迫实验
根据步骤二中急性毒性实验结果，选定4d LC50为胁迫浓度对香港牡蛎进行胁迫，设置多个水平组且每组养殖数量相同，分别在胁迫0h、24h、48h、72h、96h后随机选取同等数量的香港牡蛎，无菌条件下对其外套膜、鳃、生殖腺和肝胰腺进行取样，然后进行抗氧化酶活性的测定。
2.根据权利要求1所述的一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法，其特征在于，步骤一中香港牡蛎壳高为140.15±2.56mm、壳长为71.28+±1.89mm。
3.根据权利要求1所述的一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法，其特征在于，步骤一中暂养期间盐度18.75±0.67‰、水温25±0.5℃，每天投喂湛江等鞭金藻两次，每次投喂量1×104cell/mL，每日进行一次100％换水，期间持续充气。
4.根据权利要求1所述的一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法，其特征在于，步骤一中暂养水与步骤二中养殖海水相同，均符合一类海水标准，步骤二中设置40.00mg/L、56.62mg/L、79.98mg/L、113.24mg/L和160.00mg/L五个浓度的含Cu(NO3)·2.5H2O的养殖海水，每组3个平行。
5.根据权利要求1所述的一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法，其特征在于，步骤二中以养殖海水作为对照组，实验期间不投饵，其余培养条件与暂养期一致，每3h检查香港牡蛎的存活情况。
6.根据权利要求1所述的一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法，其特征在于，步骤二采用SPSS27.0软件中的Probit过程，构建概率单位-药物质量浓度对数直线回归方程，通过该方程，分别得到24h、48h、72h、96h的半致死浓度LC50，再利用安全浓度的计算公式MPC＝96hLC50/100，求出安全浓度SC。
7.根据权利要求1所述的一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法，其特征在于，步骤三以养殖海水作为对照组，设置至少3个水平组。
8.根据权利要求1所述的一种重金属铜对香港牡蛎的急性毒性和抗氧化酶活性的影响研究方法，其特征在于，步骤三中所述抗氧化酶为CAT、T-SOD、GSH-PX和GSH-ST。
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