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CN1192244A - 用于生产偶姻的方法,其适用的丙酮酸脱羧酶,以及两者的制备,和编码pdc基因的dna序列 - Google Patents

用于生产偶姻的方法,其适用的丙酮酸脱羧酶,以及两者的制备,和编码pdc基因的dna序列 Download PDF

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CN1192244A
CN1192244A CN96195936A CN96195936A CN1192244A CN 1192244 A CN1192244 A CN 1192244A CN 96195936 A CN96195936 A CN 96195936A CN 96195936 A CN96195936 A CN 96195936A CN 1192244 A CN1192244 A CN 1192244A
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CN
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codon
pdc
dna sequence
pyruvate decarboxylase
amino acid
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M·波尔
K·梅斯赫
M·R·库拉
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Forschungszentrum Juelich GmbH
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Abstract

本发明涉及一种用于从生产生物体分离而获得丙酮酸脱羧酶的方法,该丙酮酸脱羧酶具有以>95%对映异构体单位产生(R)－(－)苯基乙酰基甲醇,且(Ⅰ)/2－羟基乙基苯基甲酮的产物比率>95%的能力。另外,丙酮酸脱羧酶关于苯基乙酰基甲醇生成的比活是1U/mg。本发明的目的是,获得一种具有提高的关于(R)－(－)－苯基乙酰基甲醇形成的合成能力的丙酮酸脱羧酶。为此目的而形成的本发明的方法的特征在于:应用了一种具有来自运动发酵单胞菌的编码丙酮酸脱羧酶的基因的生产生物体,在其DNA序列的1174—1176位编码色氨酸残基的密码子TGG被编码具有减小的体积(Raumerfullung)的氨基酸残基的密码子替代。

Description

用于生产偶姻的方法，其适用的丙酮酸脱羧酶，以及 两者的制备，和编码PDC基因的DNA序列
本发明涉及一种通过在丙酮酸脱羧酶的存在下酶促转化α-酮羧酸和/或乙醛(Aldehyd)而生产偶姻，而且包括对此适用的PDC，以及它们的制备以及其编码基因。
偶姻即α-羟基酮是具有一个光学活性C-原子的化合物，在复杂的化合物的合成中起重要的作用，特别是(R)-(-)-苯基乙酰基甲醇(PAC)，对于简便的黄麻素生产具有重大意义。此处感兴趣的是R-对映异构体，在苯甲醛存在下，借助于啤酒酵母通过发酵转化丙酮酸而形成(DE-PS 548 459，1932)。
借助于酵母细胞合成PAC，其基础是大量的现有酵母中多种酶的副产物，其细胞生长在苯甲醛的存在下被抑制。
从酵母中分离的丙酮酸脱羧酶还用于PAC异构体2-羟基乙基苯基酮的大份额的转化。
焦磷酸硫胺素和Mg2+依赖PDC是广泛分布的，发现于多种植物，酵母和真菌，以及一些细菌中。它催化从丙酮酸到乙醛的非氧化性脱羧作用，在α-羟基酮形成时，作为副反应接着发生了偶姻缩合，如由图1所显而易见的。
这样的酶促转化甚至可以从位于α-酮羧酸上的醛出发而完成，甚至通过脱羧作用形成的醛，亦作为“共底物”，参与R＝R′的同聚偶姻R-CHOH-CO-R′的形成的缩合反应。
已经从运动发酵单胞菌中分离了PDC。然而有关从酵母中分离的PDC与从运动发酵单胞菌中分离的PDC在相似的条件下PAC的形成比较表明：来源于运动发酵单胞菌的合成能力明显地微弱(S.Bringer-Meyer和H.Sahm，生物催化1(1988)321-331页)。
目前令人惊讶地发现，通过对来自运动发酵单胞菌的PDC基因的有目的的基因工程改变会获得其有提高的形成PAC的合成能力，该改变的基因以与生成2-羟基乙基苯基酮相比具有高度选择性地生成PAC而见称。
开始时提及的技术的本发明的方法的基本特征在于，所使用的PDC酶，在通往其活性中心的引导底物通路上的色氨酸残基被一个空间上较小的氨基酸残基取代。
空间上较小的氨基酸涉及简单的，尤其是脂族氨基酸，如丙氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，精氨酸或组氨酸或以及丝氨酸和苏氨酸。
通过将来自于运动发酵单胞菌的PDC基因的DNA序列的1174-1176位的编码392位色氨酸的密码子TCG用公知的方式进行改变将PDC在生产生物体(例如特别是大肠杆菌)中表达，并由此分离PDC，从而获得基因工程改变的新的PDC该有目的的突变例如借助于聚合酶链式反应，使用第9页中表述的引物完成。用于该突变PDC的表达载体pBTac2从野生型酶的大肠杆菌表达载体pPDC构建。
从粗提物中收获和增溶细胞，以公知的方式通过色谱法回收突变PDC。
PDC通过本发明的改变，其关于因子4的PAC合成能力提高。这种提高是由这种有目的的改变引起的，换言之，是由取消了在通往酶的活性中心引导底物通道上的限制而引起的，因而体积庞大的底物分子进入活性中心和生成产物的离去都变得容易起来。
在获得焦磷酸硫胺素依赖性酶的情形之下，亦常见一类似的优化过程，这些酶在其通往酶活中心的引导底物通道上显示了进入限制-这种进入限制是以立体的或通过电荷影响的限制性方式：通以将编码该酶的DNA序列进行类似的改变，确切地说，通过将编码进入限制的密码子用一个用于编码取消了进入限制的氨基酸残基置换，致使该酶的合成能力极大提高。
根据本发明的出发点建立的目标，如此获得的PDC是用于为了大量的需求而进行的PAC合成，因此将获得R-(-)-对映异构体的高光学的纯度(＞＞98％)和仅伴有低百分比2-羟基-乙基苯基酮的PAC。该酶从合适的微生物体的回收和分离可以采用相对简单的方法(以酵母中常见的)。
当借助于PDC进行酶促偶姻缩合时，作为底物可使用线性和/或分支α-酮羧酸，且作为底物和/或共底物可使用芳香族，环化，长链和/或分支醛。例如在此可例举苯甲醛，环己醛，糖醛，肉桂醛，冠醛，丙酮酸，2-酮丁酸，2-酮戊酸，2-酮-4-甲基己酸，2-酮-4-甲基戊酸，2-酮-4，4-二甲基己酸，3-苯基-2-酮-丙酸。
本发明的其他优点在权利要求和下述实施方案详尽描述中展示。援引以下几幅附图：
图1：例举丙酮酸和苯甲醛作为底物和辅助底物借助于脱羧基作用主要途径和羰基连接酶(Carboligase)-副反应以生成PAC的PDC反应图解。
图2：含有来自运动发酵单胞菌的PDC的表达载体pPDC的构建图解，和
图3：通过借助于乙醇脱氢酶进行乙醛分离，使它照图1的PAC的生产最优化的图解。
实施例
1.PDC突变体PDC-N392A的生产
1.1表达载体pPDC的构建
为表达来自于运动发酵单胞菌的PDC将选用载体pBTac2(Boehringer，Mannheim)。外源基因的转录处于强的tac启动子的控制之下，该启动子是源自trp-和lac UV-启动子的杂种分子，具有其母体启动子的11倍及3倍的效率。操纵基因序列和核糖体结合区来自lacZ基因。因而转录调节通过过表达的细菌来源的lac-阻遏物完成，而且是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导的。该载体含有一个单一的限制性内切核酸酶EcoRl的识别位点，其后跟随有起始密码子ATG和紧接而来的其他限制性酶识别序列(位点)，因而该载体不仅普遍用于基因序列的表达，而且无需插入一个起始密码子。
多克隆位点紧随强核糖体RNA转录终止子(rrnB)之后，以保证转录的被控制地中止。作为用于运动发酵单胞菌(ATCC29191)PDC基因的克隆的出发材料，可指定使用载体pZY134B(G.Sprenger，Instf.生物技术2，KFA-Julich)。这个质粒含有一个3.2kb大小的来自运动发酵单胞菌的片段，带有全长的PDC基因，包括非编码区(图2)。为了在表达载体中编码序列的连接成为可能，必要时，在起始密码子的5′方向引入一个新的限制性酶识别序列。该载体的Shine-Dalgarno序列的起始密码子的最适距离保证了该基因连接到pBTac 2-载体的EcoRI位点上。一种便利简单的修饰DNA序列的方法是对其进行聚合酶链式反应(PCR)。将DNA双链进行多轮热变性和通过热稳定DNA聚合酶进行多轮酶促合成，使确定的DNA片段的指数扩增成为可能。产物的大小和一致性取决于合成的出发点(引物)。该引物含有出发序列的一种修饰，比如突变，缺失或添加残基(插入)，因此在合成的片段中，这种修饰也是现有的。
借助于这种方法，可在PDC基因的起始密码子的5′方向引入必需的EcoRI限制性位点，这时，寡核苷酸合成连接在该酶的识别序列的与基因互补的引物的5末端上。因为一些内切核酸酶对于限制性末端稳定序列表现出强烈减低的活性，在EcoRI一位点的上游添加几个其他的碱基。
用于PCR的多数Taq聚合酶不具有3′-5′-外切核酸酶活性(proof-reading)。其合成序列因此为统计学上的错误率所累。甚至通过选择合适的反应条件使之仅有1/100,000的极其微弱的概率，为保障合成的完美性，决定了测序任一片段的必要性。因而为了扩增选择的不是PDC基因的完整的编码区，而是一较小的片段(890bp)从5′末端至一个单一性限制性位点(EcoRV)。
PCR产物可用相应的限制内切酶EcoRI和E.coRV消化。
PDC基因的缺少的第二个部分通过从质粒pIY134B用ECoRV和BamHI限制性酶切而获得，这时如此获得片段(1.2kb)含有在PDC-基因3末端的大约350bp的非翻译序列。两个片段通过制备性琼脂糖凝胶电泳分开，分离与用EcoRI和BamHI线性化，分离的pBTac2(4.6kb)连接。该克隆即在Ecoli JM109中继续进行，该菌株是lac阻遏物过表达菌株。1.2分子生物学操作
为获得通过于392位色氨酸/丙氨酸突变的PDC，首先将野生型酶现有的密码子TGG(色氧酸)转变为GCG(丙氨酸)(来源于运动发酵单孢菌的丙酮酸脱羧酶基因的1174-1176位的改变)。有目标的突变的实施借助于Ho等人描述的聚合酶链式反应方法而完成(S.N.Ho，H.D.Hunt.R.M.Horton，J.K.Pullen，L.R.Pease，基因77(1989)51页)。
作为起点，可采用在E.coli表达载体pPDC中的来自于运动发酵单胞菌的PDC基因(见图2)。按标准方法完成DNA分离(J.Sambroch，E.F.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆(1989)冷泉港实验室出版社)。
质粒pPDC用作合成两个重叠单一片段的模板。引物(按照附录的引物序列)以0.2-0.4nM的浓度使用。反应借助于Taq聚合酶(Biomaster，koln)在生产商推荐的连同1.5mM MgCl2和一般是0.2mM核苷酸反应缓冲液中，于″Robo-Cycler″(Stratgene)中，以下述温度程序进行：2.5分钟，94℃变性，随后是30轮循环：94℃变性1.5分钟，于48℃退火1.2分钟，72℃延伸2分钟，随后于72℃，10分钟以完成该反应。退火温度在48℃和56℃之间变动，这视所采用引物的理论熔点而定。寡核苷酸的熔点按下式计算：
         Tm＝2×(A+T)+3×(C+G)
片段通过电泳分开并分离，用乙醇沉淀浓缩，再次溶于Tris·HCl·10mM，pH7.4缓冲液中。
在第二种组合的PCR中，使用大约50-100ng的重叠片段以用作模板。其他的反应条件与第一轮反应一致。退以温度的选择用生成片段的重叠区的熔点校定。用突变片段在表达载体pPDC中替代野生型DNA的其他操作(限制性酶切，分离，连接)接标准方法完成(J.Sambrock，E.F，Fritsch，T.Maniatis，分子克隆(1989)冷泉港实验室出版社)。所用引物的序列编号将PDC序列的5’核苷酸定为1。s＝有义as＝反义突变碱基下面划线用于合成5’-单个片段的引物
·  PDC867s
    CTACTCCACCACTGGTTGGACG
·  PDC1186as
    GAGGATTGAAGGAGAGTCACC用于合成3’-单个片段的引物
·  PDC1159s
    GAAACCGGTGACTCTGCGTTCAATGC
·  PBTAC453as
    ATCTTCTCTCATCCGCCAAACA(该引物与紧邻PDC序列之后的3’末端的载体序列互补)用于合成融合片段的引物
·  PDC867s
    CTACTCCACCACTGGTTGGAGG
·  PBTAC453as
    ATCTTCTCTATCCGCCAAACA(该引物与紧邻PDC序列之后的3’末端的载体序列互补)ATGAGTTATA  CTGTCGGTAC  CTATTTAGCG  GAGCGGCTTG  TCCAGATTGGTCTCAAGCAT  CACTTCGCAG  TCGCGGGCGA  CTACAACCTC  GTCCTTCTTGACAACCTGCT  TTTGAACAAA  AACATGGAGC  AGGTTTATTG  CTGTAACGAACTGAACTGCG  GTTTCAGTGC  AGAAGGTTAT  GCTCGTGCCA  AAGGCGCAGCAGCAGCCGTC  GTTACCTACA  GCGTTGGTGC  GCTTTCCGCA  TTTGATGCTATCGGTGGCGC  CTATGCAGAA  AACCTTCCGG  TTATCCTGAT  CTCCGGTGCTCCGAACAACA  ACGACCACGC  TGCTGGTCAT  GTGTTGCATC  ACGCTCTTGGCAAAACCGAC  TATCACTATC  AGTTGGAAAT  GGCCAAGAAC  ATCACGGCCGCCGCTGAAGC  GATTTACACC  CCGGAAGAAG  CTCCGGCTAA  AATCGATCACGTGATCAAAA  CTGCTCTTCG  CGAGAAGAAG  CCGGTTTATC  TCGAAATCGCTTGCAACATT  GCTTCCATGC  CCTGCGCCGC  TCCTGGACCG  GCAAGTGCATTGTTCAATGA  CGAAGCCAGC  GACGAAGCAT  CCTTGAATGC  AGCGGTTGACGAAACCCTGA  AATTCATCGC  CAACCGCGAC  AAAGTTGCCG  TCCTCGTCGGCAGCAAGCTG  CGCGCTGCTG  GTGCTGAAGA  AGCTGCTGTT  AAATTCACCGACGCTTTGGG  CGGTGCAGTG  GCTACTATGG  CTGCTGCCAA  GAGCTTCTTCCCAGAAGAAA  ATGCCAATTA  CATTGGTACC  TCATGGGGCG  AAGTCAGCTATCCGGGCGTT  GAAAAGACGA  TGAAAGAAGC  CGATGCGGTT  ATCGCTCTGGCTCCTGTCTT  CAACGACTAC  TCCACCACTG  GTTGGACGGA  TATCCCTGATCCTAAGAAAC  TGGTTCTCGC  TGAACCGCGT  TCTGTCGTTG  TCAACGGCATTCGCTTCCCC  AGCGTTCATC  TGAAAGACTA  TCTGACCCGT  TTGGCTCAGAAAGTTTCCAA  GAAAACCGGT  TCTTTGGACT  TCTTCAAATC  CCTCAATGCAGGTGAACTGA  AGAAAGCCGC  TCCGGCTGAT  CCGAGTGCTC  CGTTGGTCAACGCAGAAATC  GCCCGTCAGG  TCGAAGCTCT  TCTGACCCCG  AACACGACGGTTATTGCTGA  AACCGGTGAC  TCTTGGTTCA  ATGCTCAGCG  CATGAAGCTCCCGAACGGTG  CTCGCGTTGA  ATATGAAATG  CAGTGGGGTC  ACATTGGTTGGTCCGTTCCT  GCCGCCTTCG  GTTATGCCGT  CGGTGCTCCG  GAACGTCGCAACATCCTCAT  GGTTGGTGAT  GGTTCCTTCC  AGCTGACGGC  TCAGGAAGTTGCTCAGATGG  TTCGCCTGAA  ACTGCCGGTT  ATCATCTTCT  TGATCAATAACTATGGTTAC  ACCATCGAAG  TTATGATCCA  TGATGGTCCG  TACAACAACATCAAGAACTG  GGATTATGCC  GGTCTGATGG  AAGTGTTCAA  CGGTAACGGTGGTTATGACA  GCGGTGCTGC  TAAAGGCCTG  AAGGCTAAAA  CCGGTGGCGAACTGGCAGAA  GCTATCAAGG  TTGCTCTGGC  AAACACCGAC  GGCCCAACCCTGATCGAATG  CTTCATCGGT  CGTGAAGACT  GCACTGAAGA  ATTGGTCAAATGGGGTAAGC  GCGTTGCTGC  CGCCAACAGC  CGTAAGCCTG  TTAACAAGCTCCTCTAG1.2表达和纯化
通过在E.coli细胞中表达修饰的DNA将获得本发明的酶(PDC-W392A)。突变酶(突变体)PDC-W392A按下述步骤进行实验，从细胞提取物中纯化：
载有突变体PDC-W392A的表达质粒的大肠杆菌细胞在含有用于选择的100ng/ml的氨苄青霉素的LB培养基中发酵。该培养基用处于稳定长期的预培养物以1∶50的比例接种，于37℃，220rpm温孵。
当OD600为0.6时，通过加入1mM IPTG而诱导表达。在这种条件下，PDC-突变体在E.coli中过表达20％可溶性蛋白质。
为产生足够的酶量，该表达如上所述在8升罐中进行。将pH值调至7.0，将通风量调至10l/h。搅拌速度为200rpm。为避免过快的泡沫形成按需要加入丙二醇。细胞在表达3小时之后，通过gekuhlte持续离心而收获。
增溶通过用玻璃珠研磨而完成。对此将制备在50mM，pH6.5Mes/KOH缓冲液(含有5mM MgCl2和0.1mM)ThDP中的30％细胞悬液，并加入两倍体积的玻璃珠。取决于待处理的体积，增溶在Eppendorf管内在Retsch-Muhle或在Disintegrator S(最大体积80ml)中冰浴(eisgekuhlen)进行。研磨超过10分钟时收率最大。离心悬液，用缓冲液洗玻璃珠。过滤合并的离心液(1um)。如下进行PDC突变体的纯化柱层析：
1.阴离子交换层析
应用Fa.Pharmacia的FPLC设备，将粗提物(大约110ml，约1.0-1.5g蛋白质)以3ml/mn速度上Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)(2.6×9.5cm)柱。通过设置在10mM Mes/KOH，pH6.5，2mM MgCl2，0.1mM ThDP中的NaCl(梯度(0-200mM)，在100mM NaCl时洗脱酶。含有目的蛋白质的级分通过活性试验(见下文)而确定。
2.疏水相互作用层析
通过加入1体积的饱和硫酸铵溶液，将合并的级分施加50％饱和的硫酸铵含量。疏水互相作用层析在丁基-琼脂糖(Pharmacia)(5×8cm柱)上进行，洗脱速度是2ml/mn。在上样之前柱材料预先用在50mMMes/KOH，2mM MgCl2，0.1mM ThDP中的40％硫酸铵平衡。用同样的、具有下降硫铵酸铵梯度(40-0％)的缓冲液，在24％时洗脱该酶。目标级分进一步借助于活性测试鉴定和合并。
3.通过Sephadex G25而脱盐，将缓冲液转换(Umpnffern)为50mMMes/KOH，2mM MgCl2，0.1mM ThDP。流出速度为20ml/mn。随即进行冷冻干燥。1.3活性测试(脱羧基反应)
酶活性的测试将通过偶联酶促试验完成，在此通过来源于酵母的辅助酶乙醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1)监测可光度测量的NADH-氧化。反应混合物中含有16.9mM丙酮酸，0.18M NADH和10UADH，以上物质溶于50mM Mes/KOH，pH6.5，20mM MgSO4，1.5mMThDP。PDC的一个酶单位相应于在30℃1分钟内催化/n/mel底物转化的酶量。酶活如下计算
                  ΔE/mn×V
       C(U/ml)＝             ×5
                  ε×d×v
      ε(NADH)＝6.31×mMol-1×cm-1
             V＝总体积
             v＝样品体积
d＝比色杯层厚度(Schichtdicke der Kuvette)(1cm)
          ΔE/min＝每分钟消光减少
             f＝样品稀释系数
2.PDC-W392A在PAC合成中的应用
可以从作为底物的α-酮羧酸例如乙醛，和作为共底物的另一种醛出发，借助于PDC或PDC突变体，获得手性偶姻。例如下列应用中所提及的：从丙酮酸和苯甲醛出发，进行PAC合成
反应混合物中含有溶于Mes/KOH-缓冲液，50mM pH6.5，20mM MgSO4，1.5mM ThDP中的40mM丙酮酸，70mM苯甲醛和10U/ml PDC-W392A。反应在37℃进行1小时，用HDLC检测生成的PAC(6.2mM)。从乙醛和苯甲醛出发，进行PAC合成PAC合成混合物中含有替代丙酮酸的40mM乙醛。其余的则如上述进行。1小时后生成3.7mM PAC.。在偶联3酶体系中，用PDC-W302A进行PAC合成
按照图3进行酶促转换。来自于酵母的乙醇脱氢酶(ADH)的使得乙醛的持续清除和因而部分失活PDC-W392A成为可能。来自于Candida boidinii的甲酸盐脱氢酶(Formiat-dehydrogenase)(FDH)(E.C.1.2.1.2)用于再生NADH。酶促PAC合成在20mlMes/KOH缓冲液，50mM，pH6.5，20mM MgSO4，1.5mM THDP中进行。
混合物中含有
1.3U/ml PDC-W392A，2U/ml ADH，2.5U/ml FDH。丙酮酸起始浓度校定为70mM。该混合物还含有2mM NADH和200mM甲酸盐。120分钟后，补加0.7ml 2.1M丙酮酸溶液和0.125ml 8M甲酸钠溶液。
用甲酸滴定由酶促转化引起的pH升高。7小时后获得6.8mMPAC。酶促反应产物的处理和分析
反应产物的拆分借助于制备型反相HPLC完成。用C8-MOSHypersil-Saule，250×4.6mM作稳定相。洗脱在isokratisch条件下，用冰乙酸/乙腈0.5％/12.5％(v/v)，流速为1.5ml/分。在该条件下洗脱时间是：PAC，4.77分，2-羟基乙基苯基甲酮，5.41分。作为R-(-)PAC的获得的对映异构体的配置(Zuo dnung)借助于按照PAC产生的标准进行极性测量而完成。
借助于性气相色谱测定PAC异构件含量＞＞98％。

Claims (13)

1.一种用于获得一种用于以＞95％对映异构体单位产生(R)-(-)苯基乙酰基甲醇(I)，且(I)/2-羟基乙基苯基甲醇的产物比率＞95％的丙酮酸脱羧酶(PDC)的方法，这种丙酮酸脱羧酶具有关于苯基乙酰基甲醇生成的比活＞1U/mg，通过从生产生物体中分离而获得，其特征在于：应用了一种具有来自运动发酵单胞菌的编码丙酮酸脱羧酶的基因的生产生物体，在其DNA序列的1174-1176位编码色氨酸残基的密码子TGG被编码具有减小的体积(Raumerfullung)的氨基酸残基的密码子替代。
2.权利要求1的方法，其特征在于，密码子TGG被编码一个简单氨基酸残基的密码子替代。
3.权利要求2的方法，其特征在于，密码子TGG被编码一个脂族氨基酸残基的密码子替代。
4.权利要求3的方法，其特征在于，密码子TGG被编码丙氨酸残基的密码子替代。
5.一种丙酮酸脱羧酶，能够在苯甲醛存在时将丙酮酸转化成具有＞95％对映异构体单位的(R)-(-)苯基乙酰基甲醇，且(I)/2-羟基乙基苯基甲酮的产物比率＞95％，该酶关于产物形成的比活＞1U/mg，可以按照权利要求1至3获得，在其392位的色氨酸残基被尺寸较小的氨基酸残基替代。
6.权利要求5的丙酮酸脱羧酶，其特征在于：在392位的色氨酸残基被丙氨酸残基替代。
7.用于在PDC存在时通过酶促偶姻缩合α-酮羧酸和/或乙醛而酶促生成偶姻的方法，其特征在于，作为PDC应用权利要求5或6的酶。
8.权利要求7的方法，其特征在于：出自α-酮羧酸的偶姻缩合，在同时借助于乙醇脱氢酶和NADH而还原过量的、由脱羧基而形成的乙醛的情况下进行。
9.权利要求8的方法，其特征在于：当转化时形成的NAD，在原位通过甲酸盐脱氢酶再生成NADH。
10.在通往活性中心的引导底物通路上具有进入限制的硫胺素焦磷酸盐依赖性酶的基因的DNA序列，其特征在于：在编码进入限制的密码子的位置上引入了一个编码清除了进入限制的氨基酸残基的密码子。
11.权利要求10的DNA序列，其特征在于，来自于运动发酵单胞菌的PDC基因的DNA序列在其1174-1176位上具有编码较小尺寸的氨基酸残基的密码子。
12.权利要求11的DNA序列，其特征在于，在其1174-1176位具有编码脂族氨基酸残基的密码子。
13.权利要求12的DNA序列，其特征在于：在其1174-1176位具有编码丙氨酸残基的密码子。
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