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CN119224296A - 用于改进测定的化合物、组合物和方法 - Google Patents

用于改进测定的化合物、组合物和方法 Download PDF

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CN119224296A
CN119224296A CN202411394209.0A CN202411394209A CN119224296A CN 119224296 A CN119224296 A CN 119224296A CN 202411394209 A CN202411394209 A CN 202411394209A CN 119224296 A CN119224296 A CN 119224296A
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CN
China
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nucleic acid
solid support
acid sequence
sequence
molecular recognition
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Application number
CN202411394209.0A
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English (en)
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W·H·亨利
E·A·德索夫
J·M·拉姆齐
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University of North Carolina at Chapel Hill
Original Assignee
University of North Carolina at Chapel Hill
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Publication date
Application filed by University of North Carolina at Chapel Hill filed Critical University of North Carolina at Chapel Hill
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Abstract

本发明涉及用于改进测定的化合物、组合物和方法。提供用于改进测定比如多重PCR测定(例如多重免疫PCR测定)的化合物、组合物、试剂盒、系统、装置和方法。根据本发明的一些实施方案，可提供固体支持物(例如珠粒)。所述固体支持物可包含编码剂(例如染料)、核酸序列(例如寡核苷酸和/或引物)和分子识别元件(例如抗体)。根据本发明的一些实施方案，可提供检测试剂。所述检测试剂可包含分子识别元件(例如抗体)和核酸标签。在一些实施方案中，所述固体支持物的核酸序列的至少一部分和所述检测试剂的核酸标签的至少一部分配置成参与核酸扩增过程。固体支持物和检测试剂可结合于同一靶标，从而形成试剂对。

Description

用于改进测定的化合物、组合物和方法
本申请是申请日为2019年9月24日，申请号为201980036497.3，发明名称为“用于改进测定的化合物、组合物和方法”的发明专利申请的分案申请。
联邦支持的声明
本发明在美国国防部(United States Department of Defense)(DARPA)授予的批准号HR0011-12-2-0001的政府支持下完成。
技术领域
本发明涉及用于改进测定比如多重免疫PCR测定的化合物、组合物和方法。
背景技术
靶标分子(比如蛋白)的免疫测定一般地依赖于成对的分子识别元件(比如抗体或适体)来首先捕获并然后标记靶标分子使得可对其进行量化。一般地，捕获抗体结合于固体支持物，比如微孔板的壁或微珠的表面。样品与抗体包被的表面一起温育以捕获靶标分子。在去除样品基质的洗涤步骤之后，将捕获的靶标分子用检测识别元件(比如抗体或适体)标记，该元件可直接缀合于报告分子(标签)或连接试剂(比如生物素)，其允许随后偶联于标签。或者，检测识别元件可用第二抗体进行检测，第二抗体又通过标签来检测。标签可包括可通过直接观察或通过化学或生化测定检测的纳米颗粒、染料、酶或核酸(NA)。
在不需要高灵敏度的应用中，标签可为金纳米颗粒(在侧流式测定中受欢迎)或者可直接检测的荧光染料。Luminex Corp.已将一种使用直接标记的受欢迎的免疫测定商业化。在该测定中，编码的微珠组用于进行多重免疫测定。通过用独特的染料组合对珠粒进行染色对每个珠粒组进行编码。然后用不同的亲和试剂(例如抗体、抗原等)将每个珠粒组功能化。珠粒可混合在一起以形成多重珠粒库。在测定期间，将珠粒与样品一起温育以如果存在靶标的话则捕获靶标分子。洗涤珠粒并然后与检测抗体一起温育，该检测抗体用报告染料标记或生物素化，使得其随后可用链霉亲和素缀合的报告染料标记。流式细胞术或荧光显微术用于确定编码染料(以鉴定珠粒类型)的组合和每种珠粒的测定信号(即来自报告染料的信号)两者。通过将每种珠粒类型的平均测得测定信号与标准曲线进行比较，确定样品中靶标分子的浓度。在该方法中，根据连接于检测抗体的荧光团的数量或其生物素化的程度，用大约1-5个荧光团标记捕获的靶标分子。
酶联免疫吸附测定(ELISA)为一种众所周知的免疫测定，其使用信号放大来提高测定灵敏度。ELISA使用亲和试剂对来捕获靶标分子并用酶(比如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖醛酸苷酶或半乳糖苷酶)来标记靶标分子。然后使用酶以浓度依赖性方式将底物转化为可检测的产物，使得可测定靶标分子的浓度(图1)。该方法通常比直接标记方法更加灵敏，因为一种酶标记可将许多底物分子快速转化为可检测的产物分子。
在ELISA中，捕获抗体结合于固相，比如微孔板的表面，并使用读出器(比如荧光板读出器)测量模拟信号。可在空间上进行多重复用，其中样品在含有不同的捕获抗体并向其添加不同的检测抗体的微孔板的不同孔之间分流。也可进行单锅多重复用，但每种靶标需要不同的酶和底物对，这增加一般地不实用的额外复杂性。或者，捕获抗体可连接于微珠或磁性微珠以更易于处理或改进工作流程(图1)。
除ELISA之外，还可使用免疫PCR(iPCR)量化蛋白和其他分子。该方法以与ELISA类似的方式使用亲和试剂，但与ELISA不同，检测试剂(例如抗体)不是用酶而是用核酸(NA)标签进行标记。NA标签可共价连接于抗体(形成缀合物)或通过相互作用比如生物素-链霉亲和素键来连接。标签通常通过定量PCR(qPCR)进行扩增以测定靶标分子的浓度。与ELISA类似，可使用包被有捕获抗体的微孔板以模拟信号形式进行iPCR。免疫复合物可保持完整，或者可在进行PCR之前分离以释放NA标签。可使用数字PCR以液滴或微孔阵列形式检测释放的标签，从而获得更高精确度的量化。可通过在单重反应之间分流样品，或通过在单个反应中使用具有不同颜色探针组的多个独特标签序列来实现多重复用。
与ELISA类似，也可使用结合于珠粒的捕获抗体进行iPCR(图2)。用单独的捕获抗体将不同编码的珠粒组功能化，使得可从光学信号(例如来自连接于或嵌入在珠粒中的不同浓度的多种染料的荧光)解码结合于每个珠粒的捕获抗体的身份。可将不同组的珠粒混合在一起以形成珠粒文库或测定小组，其可量化单个样品中的多种分析物(图3)。
在典型的基于珠粒的iPCR测定中，将珠粒与样品一起温育以捕获靶标分子，洗涤以去除样品基质，并然后用检测抗体进行标记(图4)。如果检测抗体共价连接于核酸标签(即检测抗体-NA缀合物或“检测缀合物”)，则免疫复合物为完整的。然而，如果检测抗体为生物素化的，则将珠粒连续地与链霉亲和素和生物素化的NA标签一起温育。定量PCR用于测定NA标签的数量，从而测定初始样品的浓度。多重测定比单重测定更加复杂，因为每种靶标分子均需要不同的捕获和检测抗体对。
如同上述数字ELISA一样，在数字iPCR测定中，将珠粒加载到单个反应孔中以将PCR反应彼此分开。大多数孔仅含有一个珠粒和少量含有扩增标签序列的引物的PCR主混合物。PCR扩增在例如用不混溶的油密封孔之后进行。通过检查光学特性(比如在一个或多个波长下的荧光强度)来确定珠粒的身份。可通过几种方法来鉴定PCR阳性珠粒，比如测量双链DNA(dsDNA)-插入染料或水解探针(例如TaqMan探针)的荧光信号。
在低靶标分子浓度下，大多数珠粒将具有零或一个检测缀合物，并且PCR阳性珠粒的百分比(即数字信号)可与Poisson统计一起用于确定每珠粒的平均检测缀合物数目，从而确定样品中靶标分子的浓度。在高靶标浓度下，大多数珠粒可能具有多于一个检测缀合物，并因此可使用模拟信号(例如实时PCR或对靶标分子整体的另一定量测量)确定每个珠粒上的检测缀合物数目。组合数字和模拟PCR信号提供很大的动态范围(在某些条件下高达约1010)，同时在低靶标浓度下仍保持数字PCR的精确定量能力。
在以上详述的所有免疫测定中，必须针对每种靶标分子优化检测亲和试剂(例如抗体)的浓度。例如，如果检测抗体浓度太低，则测定将具有差的灵敏度，因为捕获的靶标分子将无法有效标记。增加检测抗体浓度提高灵敏度，因为更多捕获的靶标分子被标记，但这也可能会增加测定的背景信号。背景信号的增加通常由检测试剂与微孔或微珠表面的非特异性结合(NSB)、与捕获抗体的相互作用或基于珠粒的免疫测定中与珠粒编码染料的相互作用引起。不幸的是，无法区分源自正确形成的免疫复合物(图5，复合物A)的阳性信号与非特异性相互作用(比如捕获抗体和检测抗体(图5，复合物B)、捕获抗体和NA标签(图5，复合物C)或NA标签和珠粒表面(图5，复合物D)之间的相互作用)。应该注意的是，检测抗体缀合物的抗体部分也可与珠粒表面相互作用(图5，复合物E)，并且NSB可在检测抗体与样品基质中可能已特异性或非特异性地结合了珠粒或捕获抗体的其他蛋白之间发生。
当单重测定被合并成多重小组(通常需要重新优化检测抗体浓度和其他测定参数)时，上述NSB相互作用变得更加严重。NSB在多重测定中增加的主要原因是随着向测定中添加更多靶标分子，总的检测抗体浓度也增加，这一般地会增加由于NSB观察到的信号。另外，抗体和脱靶分子之间的交叉反应性在多重测定形式中可能成为更大的问题。有多种形式的交叉反应会影响测定信号。例如，抗原可结合错误的(脱靶)捕获抗体，并然后被其自身的检测抗体检测到，这将导致假阳性信号。在类似的实例中，抗原可结合错误的(脱靶)捕获抗体，但不能被检测抗体检测到。在这种情况下，错误捕获的抗原可阻断(即竞争性地抑制)真正的靶标的结合以及随后的检测，从而导致假阴性信号。
尽管有时可对较低灵敏度、直接标记测定或批量模拟测定降低由于交叉反应性和NSB产生的信号，但对于单分子测定而言这是一个重大得多的问题，因为甚至每珠粒的单一NSB事件对数字化测定的性能也可能有害。高灵敏度的多重测定一般地限于约5-10种不同的靶标，因为NSB和检测化学物质之间的交叉反应性显著降低信噪比并提高检测限。
除以上强调的问题之外，多重PCR还经常遭受序列外扩增以及引物和探针组之间的竞争的困扰。为了在更高的多重复用水平上实现高度灵敏的iPCR测定，需要另一种方法。
发明内容
本发明的方面涉及用于改进测定比如多重PCR测定(例如多重免疫PCR测定)的化合物、组合物、试剂盒、系统、装置和方法。
本发明的一个方面涉及一种试剂盒，其包含：(i)固体支持物(例如珠粒)，其中固体支持物包含：编码剂(例如染料)；第一核酸序列(例如寡核苷酸和/或引物)；和第一分子识别元件(例如抗体)；和(ii)检测试剂，其包含第二分子识别元件(例如抗体)和第二核酸序列，其中第一核酸序列的至少一部分和第二核酸序列的至少一部分配置成参与核酸扩增过程。在一些实施方案中，固体支持物和检测试剂分开储存。在一些实施方案中，固体支持物和检测试剂存在于相同的组合物中和/或一起储存和/或提供。
本发明的另一方面涉及一种固体支持物(例如珠粒)，其包含：编码剂(例如染料)；核酸序列；和分子识别元件(例如抗体)。
本发明的另一方面涉及多种固体支持物，其包括：(i)第一多个固体支持物，并且第一多个固体支持物中的每个固体支持物包含：提供第一编码信号的第一编码剂(例如染料)；第一核酸序列；和第一分子识别元件(例如抗体)；和(ii)第二多个固体支持物，并且第二多个固体支持物中的每个固体支持物包含：提供第二编码信号的第二编码剂(例如染料)；第二核酸序列；和第二分子识别元件(例如抗体)，其中第一编码信号不同于第二编码信号，第一核酸序列不同于第二核酸序列，和第一分子识别元件不同于第二分子识别元件。
本发明的另一方面涉及多种检测试剂，其包括：(i)第一多种检测试剂，并且第一多种检测试剂中的每种检测试剂包含第一分子识别元件(例如抗体)和第一核酸序列；和(ii)第二多种检测试剂，并且第二多种检测试剂中的每种检测试剂包含第二分子识别元件(例如抗体)和第二核酸序列；其中第一和第二核酸序列各自包含第一部分和第二部分；和其中用于第一核酸序列的第一部分的核酸序列不同于用于第二核酸序列的第一部分的核酸序列。在一些实施方案中，用于第一和第二核酸序列的第二部分的核酸序列为相同的。
本发明的另一方面涉及检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：合并本文所述的固体支持物和包含靶标的样品以形成包含靶标结合的固体支持物的第一组合物；任选地洗涤靶标结合的固体支持物(例如用水溶液)；合并检测试剂和靶标结合的固体支持物以形成包含固体支持物、靶标和检测试剂的复合物，其中检测试剂包含第二分子识别元件和第二核酸序列并且第一核酸序列的至少一部分和第二核酸序列的至少一部分配置成参与核酸扩增过程；任选地洗涤复合物(例如用水溶液)；任选地合并扩增剂(例如反向引物、ssDNA夹板(splint)和连接酶等)和复合物；任选地从固体支持物释放核酸序列；和扩增第二核酸序列的至少一部分，从而检测样品中的靶标。
本发明的另一方面涉及提高测定的特异性和/或减少测定的背景信号的方法，所述方法包括：提供本文所述的固体支持物或本文所述的多种固体支持物；和在存在所述固体支持物或多种固体支持物的情况下进行测定，从而提高测定的特异性和/或减少测定的背景信号。
注意的是，关于一个实施方案描述的本发明的方面可并入不同的实施方案中，尽管没有相对于其进行具体描述。就是说，可以任何方式和/或组合来组合所有实施方案和/或任何实施方案的特征。申请人保留更改任何初始提交的权利要求和/或相应地提交任何新权利要求的权利，包括能够修改任何初始提交的权利要求以从属于和/或并入任何其他一项或多项权利要求的任何特征的权利，尽管最初并未以该方式要求保护。在以下阐述的说明书中详细解释本发明的这些和其他目的和/或方面。通过阅读附图和随后优选实施方案的详述，本领域的普通技术人员将意识到本发明的其他特征、优点和细节，这种描述仅为对本发明的说明。
附图说明
图1为用于ELISA的由实例亲和试剂对形成的复合物的示意图。
图2为用于iPCR的由实例亲和试剂对形成的复合物的示意图。
图3为用单独的捕获抗体功能化的3个不同的编码珠粒组的示意图并且每个珠粒组对应于不同的检测抗体。
图4为基于珠粒的iPCR测定中的实例方法步骤的示意图。
图5为可在免疫测定中提供真阳性或假阳性的相互作用的示意图。
图6为根据本发明的一些实施方案形成的实例复合物的示意图。
图7为通过用独特的染料或染料组合编码每组制备的珠粒组的示意图，并且根据本发明的一些实施方案，用于每组的相应检测试剂包括不同的核酸标签。
图8为根据本发明的一些实施方案正确形成的实例复合物(即珠粒上的捕获抗体结合于适当的靶标，并且相应的检测试剂也结合于靶标)(这导致荧光信号)和错误形成的复合物(即珠粒上的捕获抗体结合于不是珠粒的相应检测试剂的检测试剂)(这不会产生荧光信号)的示意图。
图9A为显示在单重测定中针对不同靶标提供的阳性珠粒的百分比的图表。
图9B为显示在多重测定中针对不同目标提供的阳性珠粒的百分比的图表。
图9C为显示分别在图9A和9B图中指涉的单重测定和多重测定的背景信号的图表。
图10为根据本发明的一些实施方案制备固体支持物的方法的示意图。
图11为结合于来自不同珠粒组的代表性珠粒的编码染料的荧光强度曲线图。
图12提供将常规iPCR珠粒的阳性珠粒的百分比与根据本发明的一些实施方案制备的阳性珠粒的百分比进行比较的图表。iPCR dAb缀合物用于所有测定，PCR主混合物中包含1组引物。
图13提供将常规iPCR检测试剂缀合物的活性与根据本发明的一些实施方案制备的检测试剂的活性进行比较的图表。iPCR珠粒用于所有测定，PCR主混合物中包含1组引物。
图14提供将使用常规iPCR系统在基线单重测定中用于各种靶标的阳性珠粒的百分比与使用本发明一些实施方案的系统用于相同靶标的阳性珠粒的百分比进行比较的图表。
图15提供显示在三重iPCR测定中对于每种珠粒类型获得的信号的图表和比较不同测定条件的图表。
图16提供显示根据本发明的一些实施方案在三重测定中针对每种珠粒类型获得的信号的图表和比较不同测定条件的图表。
图17提供图15的三重iPCR测定的比较图表和图16的本发明一些实施方案的三重测定的比较图表。
具体实施方式
现参考其中显示本发明实施方案的附图在下文更全面地描述本发明。然而，本发明可以许多不同的形式来实施，并且不应解释为限于本文阐述的实施方案；相反提供这些实施方案使得本公开将是完全和完整的，并且将本发明的范围充分地传达给本领域的技术人员。
本文在本发明的描述中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明。如在本发明的描述和所附权利要求中使用的单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指明。
除非另外定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。将进一步理解的是，术语比如在常用词典中定义的那些术语，应解释为具有与其在本申请和相关技术的上下文中的含义一致的含义，并且除非本文明确如此定义，否则不应以理想化或过于正式的意义解释。本文在本发明的描述中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明。本文提及的所有公开、专利申请、专利和其他参考文献通过参考以其全部结合。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。
此外，本文使用的“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关所列条目的任何和所有可能的组合，以及当以备选方式(“或”)解释时没有组合。
除非上下文另外表明，否则特别地旨在可以任何组合使用本文描述的发明的各种特征。此外，本发明还考虑在本发明的一些实施方案中可排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。举例说明，如果说明书指出复合物包含组分A、B和C，则特别地旨在可省略和放弃A、B或C中的任何一种或其组合。
本文使用的过渡短语“基本上由…组成”(和语法变体)应解释为涵盖所列举的材料或步骤“以及不实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的那些”。参见In reHerz,537F.2d 549,551-52,190U.S.P.Q.461,463(CCPA 1976)(原文中强调)；另请参见MPEP§2111.03。因此，本文使用的术语“基本上由…组成”不应解释为等同于“包含”。
还应理解，本文使用的术语“实例”、“示例性的”及其语法变体旨在是指本文讨论的非限制性实例和/或变体实施方案，并且不旨在表示与一个或多个其他实施方案相比较优选本文讨论的一个或多个实施方案。
本文使用的术语“约”在指涉可测量值比如量或浓度等时，意指涵盖指定值的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或者甚至±0.1％的变化以及指定值。例如，“约X”(其中X为可测量值)意指包括X以及X的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或者甚至±0.1％的变化。本文提供的可测量值的范围可包括其中的任何其他范围和/或单个值。
本文使用的术语“增加”、“增多”、“增大”、“增长”、“增强”和类似术语表示指定参数升高至少约2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。
本文使用的术语“减少”、“减小”、“降低”、“缩小”、“抑制”和类似术语是指指定参数下降至少约2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。
将理解的是，当元件被称为“在另一元件上”、“接合”于另一元件、“连接”于另一元件、与另一元件“偶联”、“接触”另一元件等时，其可直接在另一元件上、接合于另一元件、连接于另一元件、与另一元件偶联或接触另一元件，或者也可存在中间元件。相比之下，当元件被称为例如“直接在另一元件上”、“直接接合”于另一元件、“直接连接”于另一元件、与另一元件“直接偶联”或“直接接触”另一元件时，则不存在中间元件。本领域的技术人员还将意识到，指涉“邻近”另一特征设置的结构或特征可具有与邻近特征重叠或构成其基础的部分。
为了便于描述，本文中可使用空间相对术语，比如“在…下面”、“在…之下”、“低于”、“在…之上”、“上面的”等，以描述一个元件或特征与如图所示的另一元件或特征的关系。将理解的是，除附图中描绘的定位之外，空间相对术语还旨在涵盖装置在使用或操作中的不同定位。例如，如果附图中的装置被倒置，则描述为在其他元件或特征的“下面”或“下方”的元件将定位为在其他元件或特征“之上”。因此，示例性的术语“在…下面”可涵盖“在…之上”和“在…下面”两者定位。装置可以其他方式定位(旋转90度或其他定位)，并据此解释本文使用的空间相对描述词。类似地，除非另外具体指明，否则术语“向上”、“向下”、“垂直”、“水平”等本文中仅出于解释的目的来使用。
将理解的是，尽管本文中可使用术语“第一”、“第二”等来描述各种元件，但是这些元件不应受到这些术语的限制。这些术语仅用于区分一个元件与另一个元件。因此，以下讨论的“第一”元件也可称为“第二”元件而不背离本发明的教导。除非另外具体指明，否则操作(或步骤)的顺序不限于权利要求或附图中呈现的顺序。
本文使用的术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”是指线性或分支、单链或双链的RNA或DNA或其杂合体。该术语还涵盖RNA/DNA杂合体。在一些实施方案中，RNA和/或DNA可包含化学修饰的碱基，比如自然界中通常未发现的那些碱基，并且化学修饰的碱基可提高测定(例如PCR反应)的特异性和/或减少其他RNA和/或DNA之间的非特异性结合。当合成产生dsRNA时，不太常见的碱基(比如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等)可用于反义、dsRNA和核酶配对。例如，已显示含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸以高亲和力结合RNA，并且为有效的基因表达反义抑制剂。还可进行其他修饰，比如对磷酸二酯主链或RNA的核糖基中的2'-羟基的修饰。
本文使用的术语“核苷酸序列”和“核酸序列”可互换使用，并且是指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸从核酸分子的5'至3'末端的序列，并且包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段或部分、基因组DNA、合成(例如化学合成)的DNA、质粒DNA、mRNA和反义RNA，其任何一个均可为单链和/或双链的。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”本文中也可互换使用，是指核苷酸的杂聚物。本文提供的核酸分子和/或核苷酸序列以从左到至右的5'至3'方向呈现，并使用标准编码表示，该标准编码表示如美国序列规则37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(World Intellectual PropertyOrganization)(WIPO)标准ST.25中阐述的核苷酸字符。本文使用的“5'区域”是指多核苷酸中最接近5'末端的区域。因此，例如，多核苷酸5'区域中的元件可位于从位于多核苷酸5'末端的第一核苷酸到位于多核苷酸中途的核苷酸的任何位置。本文使用的“3'区域”是指多核苷酸中最接近3'末端的区域。因此，例如，多核苷酸3'区域中的元件可位于从位于多核苷酸3'末端的第一核苷酸到位于多核苷酸中途的核苷酸的任何位置。
本文使用的术语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对的天然结合。例如，序列“A-G-T”(5'至3')结合于互补序列“T-C-A”(3'至5')。两个单链分子之间的互补性可为“部分的”，其中仅某些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，其可为完全的。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。
本文使用的“互补”可意指与比较核苷酸序列具有100％互补性，或者其可意指小于100％的互补性(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等互补性)。
本发明核酸序列的一“部分”或“区段”应理解为意指相对于参考核酸序列长度减少(例如减少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250或更多个核苷酸)的核酸序列，并且其包含与参考核酸序列相同或几乎相同(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续核苷酸的核酸序列。本发明的这种核酸部分可在适当情况下包含在其作为组成部分的较大多核苷酸的任何部分中。
本发明氨基酸序列的“片段”应理解为意指相对于参考氨基酸序列长度减少(例如减少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250或更多个氨基酸)的氨基酸序列，并且其包含与参考氨基酸序列相同或几乎相同(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续氨基酸的氨基酸序列。本发明的这种氨基酸片段可在适当情况下包含在其作为组成部分的较大蛋白或肽中。
本文使用的“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在整个组分例如核苷酸或氨基酸的比对窗口中不变的程度。“同一性”可通过已知方法易于计算，所述方法包括(但不限于)如下描述的那些方法：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,编辑)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics andGenome Projects(Smith,D.W.,编辑)Academic Press,New York(1993)；ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编辑)HumanaPress,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,编辑)Academic Press(1987)；和Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,编辑)Stockton Press,New York(1991)。
本文使用的术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指当两个序列最佳比对时，与测试(“受试”)多核苷酸分子(或其互补链)相比较，参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分比。在一些实施方案中，“同一性百分比”可指氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。
本文使用的在两个核酸分子、核苷酸序列或蛋白序列的上下文中的短语“基本上相同”或“基本同一性”是指当针对最大对应性进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查测量的，具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和/或100％核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或更多个序列或子序列。在本发明的一些实施方案中，基本同一性存在于本发明核苷酸序列的连续核苷酸的区域中，该区域长度为约4个核苷酸-约30个核苷酸、约5个核苷酸-约20个核苷酸、约16个核苷酸-约30个核苷酸、约18个核苷酸-约25个核苷酸、约30个核苷酸-约40个核苷酸、约50个核苷酸-约60个核苷酸、约70个核苷酸-约80个核苷酸、约90个核苷酸-约100个核苷酸或更多个核苷酸及其中的任何范围，直至序列的全长。在一些实施方案中，核苷酸序列可在至少约5、10、15、20或25个连续核苷酸上基本上相同。在一些实施方案中，核苷酸序列可在至少约5个连续核苷酸上基本上相同。在一些实施方案中，基本上相同的核苷酸或蛋白序列执行与其基本上相同的核苷酸或蛋白序列基本上相同的功能。
为了进行序列比较，一般地将一个序列用作测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比对比较窗口的序列的最佳比对为本领域技术人员众所周知的，并且可通过工具比如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的搜索相似性方法来进行，并且任选地通过这些算法的计算机化实施(比如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，可作为Wisconsin(Accelrys Inc.,SanDiego,CA)的一部分获得)来进行。测试序列和参考序列的比对节段的“同一性分数”为两个比对序列所共有的相同组分的数目除以参考序列节段中组分的总数，即整个参考序列或参考序列的较小定义部分。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可为与全长多核苷酸序列或其一部分或与较长多核苷酸序列的比较。为了本发明的目的，“同一性百分比”也可使用用于翻译的核苷酸序列的BLASTX版本2.0和用于多核苷酸序列的BLASTN版本2.0来确定。
当两个核苷酸序列在严格条件下彼此杂交时，两个序列也可被认为是基本上互补的。在一些代表性的实施方案中，被认为基本上互补的两个核苷酸序列在高度严格条件下彼此杂交。
在核酸杂交实验比如Southern和Northern杂交的上下文中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”为序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。有关核酸杂交的广泛指南参见Tijssen Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes第一部分第2章“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”，Elsevier,New York(1993)。通常，将高度严格的杂交和洗涤条件选择为比特定序列在规定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。
Tm为50％的靶标序列杂交于完全匹配的探针的温度(在规定的离子强度和pH下)。选择非常严格的条件以等于特定探针的Tm。在Southern或Northern印迹中，在过滤器上具有多于100个互补残基的互补核苷酸序列进行杂交的严格杂交条件的一个实例为50％甲酰胺和1mg肝素在42℃下进行杂交过夜。高度严格洗涤条件的一个实例为0.15M NaCl在72℃下约0.15分钟。严格洗涤条件的一个实例为0.2x盐水-枸橼酸钠(SSC)洗涤在65℃下15分钟(有关SSC缓冲液的描述参见下文的Sambrook)。通常，在高度严格洗涤之前先进行低严格洗涤以去除背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双链体，中度严格洗涤的一个实例为1x SSC在45℃下15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双链体，低严格洗涤的一个实例为4-6x SSC在40℃下15分钟。对于短探针(例如约10-50个核苷酸)，严格条件一般地涉及盐浓度小于约1.0M Na离子，在pH 7.0-8.3时一般地为约0.01-1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且温度一般地为至少约30℃。加入去稳定剂比如甲酰胺也可获得严格条件。通常，为在特定杂交测定中对不相关探针观察到的信噪比的2x(或更高)信噪比表明检测到特异性杂交。
以下为可用于克隆与本发明的参考核苷酸序列基本上相同的同源核苷酸序列的杂交/洗涤条件组的实例。在一个实施方案中，参考核苷酸序列在50℃下于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交于“测试”核苷酸序列，并在50℃下以2XSSC、0.1％SDS洗涤。在另一个实施方案中，参考核苷酸序列在50℃下于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交于“测试”核苷酸序列，并在50℃下以1XSSC、0.1％ SDS洗涤，或者在50℃下于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交于“测试”核苷酸序列，并在50℃下以0.5X SSC、0.1％ SDS洗涤。在仍然其他的实施方案中，参考核苷酸序列在50℃下于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交于“测试”核苷酸序列，并在50℃下以0.1X SSC、0.1％ SDS洗涤，或者在50℃下于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA中杂交于“测试”核苷酸序列，并在65℃下以0.1X SSC、0.1％ SDS洗涤。
本文使用的术语“靶标”是指可存在于样品中的任何目标分析物。实例靶标包括(但不限于)合成或天然的化学和/或生物大分子、纳米颗粒、小分子化合物、DNA、核酸/多核酸、肽、蛋白和/或类似物。靶标可为一种或多种分析物分子。在一些实施方案中，靶标可存在于样品中，任选地其中样品获自来源(例如受试者、供水、食物供应等)。靶标和/或样品可包括一种或多种极性代谢物，比如氨基酸和/或荷电分子、肽和/或蛋白。靶标和/或样品可包含从生物流体、组织、血液、血清、尿液、细胞生长培养基、裂解细胞、饮料和/或食物等中提取的一种或多种化学和/或生物化合物。在一些实施方案中，靶标可来自和/或存在于环境样品比如水、空气和/或土壤样品中。在一些实施方案中，靶标可来自和/或存在于法医样品中。在一些实施方案中，靶标和/或样品可包括合并的样品，其包含两种或更多种样品的混合物。
本文使用的“接触(contact)”、“接触(contacting)”、“接触(contacted)”及其语法变体是指将两种或更多种组分置于一起或足够接近，使得在合适的条件下可进行期望的反应(例如结合、转录控制、基因组编辑、切口、裂解和/或扩增核酸)。
本发明的实施方案可解决和/或减少测定(例如多重iPCR测定)中的一个或多个问题，比如背景信号问题，比如由非特异性结合(NSB)引起的那些问题和/或抗体交叉反应性问题。本发明的实施方案可包括和/或利用独特核酸标签的组合并提供基于固体支持物(例如珠粒)的递送以形成空间多重PCR反应，其可避免与单一反应、多重PCR相关的常见复杂化。
根据本发明的一些实施方案提供固体支持物。本文使用的术语“固体支持物”包括一种或多种物体，比如微珠、芯片、板、载玻片、销、板孔、珠粒、微球、纳米颗粒、微孔或可用于提供核酸序列和分子识别元件和/或可偶联于编码剂(比如荧光化合物、化学发光化合物、放射性元件和/或酶)和/或动态元件或用编码剂和/或动态元件标记的其他构件。核酸序列、分子识别元件、编码剂和/或动态元件可直接或间接地连接于或嵌入(部分或完全地)在固体支持物内，比如通过共价连接、非共价连接和/或物理合并。在一些实施方案中，固体支持物可为固体表面上的印刷阵列。在一些实施方案中，固体支持物可为微球。在一些实施方案中，固体支持物可为固体表面，其上接触样品比如化学和/或生物组分(例如组织样品)与并且固体支持物(任选地包含一种或多种编码剂)上的分子识别元件可连接于样品的一部分和/或其中的靶标。分子识别元件可包含或可为抗体或其片段、适体、DNA杂交探针、寡核苷酸、肽、蛋白和/或其组合。在一些实施方案中，固体支持物可包含不稳定的试剂和/或支持物键合，其各自可允许组分(例如核酸序列)从固体支持物上裂解。
在一些实施方案中，可将一种或多种编码剂连接于固体支持物(例如珠粒或微球)以提供编码的固体支持物(例如编码的珠粒或编码的微球)。在一些实施方案中，可将一种或多种编码剂连接于分子识别元件(例如抗体)以提供编码的分子识别元件(例如编码的抗体)，识别元件可连接于固体支持物，从而提供编码的固体支持物。在一些实施方案中，编码的分子识别元件可连接于颗粒，比如纳米颗粒。在一些实施方案中，本发明的方法可包括将一种或多种编码剂和/或编码的分子识别元件提供或结合到固体支持物上。在一些实施方案中，固体支持物和/或编码的固体支持物为如国际公开号WO 2017/112025中所述的，其内容通过参考以其全部结合至本文中。
本文使用的术语“珠粒(bead)”或“珠粒(beads)”是指固相构件，比如颗粒、微粒或微球，一般地为磁性微球，其可为多孔的、表面多孔的或无孔材料，比如聚合物、塑料、玻璃、二氧化硅、金属或半金属氧化物(包括(但不限于)氧化铝、氧化钛、氧化锆或其他氧化物)、量子点、金属颗粒和/或可适合于在反应孔中使用的类似物。在一些实施方案中，可提供包含多个珠粒(例如微球)的多重复用珠粒组，所述多个珠粒被独特地编码以区分一个珠粒群与另一珠粒群。
在一些实施方案中，固体支持物为珠粒，比如磁性或超顺磁性珠粒。在一些实施方案中，固体支持物不为磁性或超顺磁性珠粒。在一些实施方案中，固体支持物为多孔的和/或具有增加其表面积的涂层的珠粒。在一些实施方案中，固体支持物为通过产生微米颗粒和/或纳米颗粒的聚集体而制成的珠粒，任选地将一些或全部微米颗粒和/或纳米颗粒功能化使得其可用于携带试剂比如捕获亲和试剂、引物、探针、阻断剂、聚合酶、逆转录酶和/或其他酶。
在一些实施方案中，固体支持物(例如珠粒)包含编码剂(例如染料)、核酸序列和分子识别元件(例如抗体)。在一些实施方案中，编码剂直接或间接地连接于或至少部分地嵌入在固体支持物内。在一些实施方案中，固体支持物的核酸序列和/或分子识别元件包含编码剂。分子识别元件可包含或可为抗体或其片段、适体、修饰的适体、DNA杂交探针、寡核苷酸、肽、蛋白、碳水化合物和/或其组合。
本文使用的术语“编码剂”是指与(例如施加于、连接于、结合于、配混、用于制造或产生等)固体支持物和/或固体支持物的材料和/或与固体支持物接触的材料缔合的一种或多种试剂(例如化学品、蛋白等)，其为相应的固体支持物(可为其全部或一部分)提供和/或产生编码信号。在一些实施方案中，一种或多种编码剂提供和/或产生可检测的编码信号，其允许区别固体支持物(例如珠粒)群或亚群。例如，在一些实施方案中，一种或多种编码剂可为一种或多种编码剂缔合(例如连接)的单个固体支持物(例如珠粒)提供和/或产生可检测的编码信号和/或一种或多种编码剂可为一种或多种编码剂连接的固体支持物的特定部分(例如包含一种或多种编码剂的分子识别元件结合的固体支持物的部分)提供和/或产生可检测的编码信号。
编码信号可由与固体支持物缔合的一种或多种编码剂和/或由固体支持物本身和/或与固体支持物缔合的材料(例如化合物)提供和/或产生。在一些实施方案中，编码信号可为固体支持物的大小和/或形状。在一些实施方案中，编码信号为由与(例如施加于、连接于、结合于、配混、用于制造或产生等)固体支持物缔合的一种或多种编码剂(例如化学品、蛋白等)和/或由固体支持物产生的信号(例如光学和/或电信号)。可检测的编码信号可为光学和/或以电子方式可检测的，其可用人眼视觉感知和/或以电子方式读取、检测和/或获得。可检测的编码信号可包括一般地处于或高于定义的阈值的强度、颜色(例如色调、颜色强度和/或色值)、颜色和强度和/或大小、形状的变化和/或放射性。在一些实施方案中，可检测的编码信号包括发光强度，其可包括荧光、磷光和/或化学发光强度。
相应固体支持物(可为其全部或一部分)的编码信号可为可检测的(例如可以光学、电子、电化学、静电、磁性等检测)或可为不可检测的。在一些实施方案中，相应固体支持物(可为其全部或一部分)的编码信号可以变化。例如，相应固体支持物的编码信号可从可检测到不可检测、从不可检测到可检测、从较大值到较低值(例如从较大的信号幅度、荧光强度值、直径等)和/或从较低值到较大值变化。相应固体支持物的编码信号的变化可随着时间的推移发生和/或可由于与固体支持物相关的至少一种化学和/或物理变化而发生。在一些实施方案中，固体基底的编码信号可以变化和/或可通过其中存在固体支持物的环境的变化(例如在其中固体支持物和/或编码剂与之接触的溶液的变化)来提供和/或产生。例如，固体支持物的编码信号可以变化和/或可通过磁性行为、pH、光散射、物理尺寸(增大或减小)、形状、折射率、溶解度、吸光度和/或发射强度或最大波长偏移、电导率、介电常数、粘度和同位素衰变引起的无线电发射以及上述的组合的变化来提供和/或产生。
术语“解码”是指相应样品(包括例如固体支持物的样品和/或包含多种编码的分子识别元件的样品)的不同群至少部分地基于来自编码的固体支持物和/或编码的分子识别元件的编码信号的(一般地为电子/程序)识别。一个或多个编码信号的检测和/或识别可允许对样品进行解码，以确定特定固体支持物群的身份和/或检测靶标。
本文使用的“动态元件”是指响应定义的事件而提供或表现出物理和/或化学变化的化学和/或生物化合物。与在不同(例如较早)时间点处的编码信号相比较，物理和/或化学变化可在一个时间点处修改相应固体支持物(可为其全部或一部分)的编码信号，并且可为可检测的(例如光学和/或电可检测的)。“动态元件”可包括编码剂(例如染料、蛋白等)和/或固体支持物(例如微球)。物理和/或化学变化可为影响固体支持物的物理和/或化学变化(例如变化可为固体支持物的电荷和/或颜色的变化和/或可为固体支持物的大小和/或形状的变化)。因此，动态元件可为固体支持物和/或与固体支持物连接和/或缔合的化合物。在一些实施方案中，物理和/或化学变化为影响与固体支持物缔合的编码剂的物理和/或化学变化(例如变化可为使编码剂结合于固体支持物的接头的稳定性、编码剂的溶剂可及性和/或猝灭剂的存在和/或不存在方面的变化)。因此，动态元件可为编码剂和/或连接于编码剂和/或与编码剂缔合的化合物(例如猝灭剂)。物理和/或化学变化可为可逆或不可逆的。在一些实施方案中，动态元件可为编码剂。在一些实施方案中，动态元件和/或编码剂为如国际公开第WO 2017/112025号中所述的，其内容通过参考以其全部结合至本文中。
固体支持物的编码可通过本领域技术人员已知的任何方法来实现(例如使用颜色、荧光色、大小、形状、变化的性质(比如热不稳定或光不稳定的染料)和/或其任何组合)。在一些实施方案中，固体支持物可包含与固体支持物共价或非共价连接的编码剂。在一些实施方案中，比如经由溶剂溶胀和截留将染料嵌入在固体支持物(例如珠粒)中。
在一些实施方案中，固体支持物包含一个或多个可以相同或不同的接头。一个或多个接头可将分子识别元件和/或核酸序列连接和/或结合(例如共价或非共价地)于固体支持物。例如，接头可用于将一种或多种分子识别元件连接或结合于固体支持物和/或相同或不同的接头可用于将一个或多个核酸序列连接或结合于固体支持物。本文使用的“接头”是指可用于将一个组件(例如固体支持物)连接或结合于另一组件(例如分子识别元件)的任何分子、部分和/或官能团。实例接头包括(但不限于)化学部分和/或化合物，比如胺(例如胺衍生物、异氰酸酯、异硫氰酸酯、碘乙酰胺、叠氮化物等)、酸(例如酸衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、酰肼等)、醛、磺酰氯、磺酰肼、环氧化物、羟基、硫醇基和/或马来酰亚胺和/或生物分子(比如蛋白、肽、DNA和/或RNA)。在一些实施方案中，接头是作为特异性结合对的构件的生物分子。“特异性结合对”和“配体-受体结合对”本文中可互换使用，并且是指两个不同的分子，其中一个分子在分子的表面上或腔内具有特异性地吸引或结合于另一分子的特定空间或极性组构，导致两个分子彼此具有亲和力的区域。特异性结合对的构件可称为配体和受体(抗配体)。术语配体和受体旨在涵盖整个配体或受体或其足以在配体和受体之间发生结合的部分。配体-受体结合对的实例包括(但不限于)激素和激素受体，例如表皮生长因子和表皮生长因子受体、肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子受体以及干扰素和干扰素受体；亲和素和生物素或抗生物素；抗体和抗原对；酶和底物；药物和药物受体；细胞表面抗原和凝集素；两条互补的核酸链；核酸链和互补寡核苷酸；白介素和白介素受体；和刺激因子及其受体，比如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和GMCSF受体以及巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和MCSF受体。可用于连接两个组件的其他示例性接头和/或化学物质包括(但不限于)可光裂解生物素、在固体支持物和识别元件之间提供共价键的接头、亲和素、可从Integrated DNA Technologies,Inc.市售获得的AcryditeTM、腺苷酸化、叠氮化物(NHS酯)、地高辛(NHS酯)、胆固醇-TEG、可从Integrated DNA Technologies Inc.市售获得的I-LinkerTM、可从Integrated DNA Technologies,Inc.市售获得的Uni-LinkTM AminoModifier、5'己炔基、5-辛二炔基dU、生物素dT、生物素-TEG(Biotin-TEG)、双重生物素(Dual Biotin)、脱硫生物素-TEG(Desthiobiotin-TEG)、巯基改性剂C3 S-S、二硫醇和/或巯基改性剂C6 SS。
可使用任何合适的偶联化学将分子识别元件和/或核酸序列结合于固体支持物。在一些实施方案中，接头、分子识别元件和/或核酸序列包括不稳定的化学键，其可用于使分子识别元件或其一部分与固体支持物分开和/或使核酸序列或其一部分与固体支持物分开。不稳定的化学键可使用多种技术裂解，包括(但不限于)使用热、光和/或化学品来裂解不稳定的化学键。例如，可施加热能以破坏或裂解不稳定的化学键，或者可施加光以破坏不稳定的化学键(例如可光裂解的键)。可通过与热表面的传导接触、溶液的焦耳加热、与固体支持物相邻的基底的电阻加热、暴露于电磁辐射和/或电磁感应来实现热加热。在一些实施方案中，可使用电离辐射、化学剂、酶、电化学过程、pH的变化和/或其他合适的裂解操作来裂解不稳定的化学键。例如，pH变化可由在包含固体支持物的区域的表面发生的电化学反应引起，或者条件的变化可直接或间接地由本身可通过物理变化比如热、光、电化学过程、pH变化等而活化的引发剂试剂的活化引起。在一些实施方案中，可在PCR测定和/或反应之前和/或期间进行不稳定化学键的裂解。在一些实施方案中，裂解不稳定的化学键以使核酸序列与固体支持物分开，使得可发生和/或引发PCR。在一些实施方案中，直至从其所连接的固体支持物释放出核酸序列(例如正向引物和/或反向引物)才发生PCR反应。在一些实施方案中，当核酸序列连接于固体支持物时可发生PCR反应。在一些实施方案中，可使用如美国专利号9617589中所述的化合物、组合物和/或方法将组件(例如分子识别元件和/或核酸序列)连接于固体支持物，所述专利的内容通过参考以其全部结合至本文中。
在一些实施方案中，分子识别元件(例如抗体)和/或核酸序列(例如引物或寡核苷酸)经由可光裂解或热不稳定的键连接于固体支持物。例如，在一些实施方案中，可光裂解的生物素用于将分子识别元件和/或核酸序列连接于固体支持物。在一些实施方案中，一种或多种连接化学物质用于将分子识别元件和/或核酸序列连接于固体支持物，比如(但不限于)利用对抗体具有亲和力的分子比如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L等的那些。
在一些实施方案中，核酸序列(例如正向引物)可通过共价键连接于固体支持物，尤其是如果水解探针或TaqMan探针用于检测化学时，因为即使dsDNA扩增子连接于珠粒仍可检测到来自水解探针的染料。
在一些实施方案中，固体支持物包含多种接头和/或包被有一种或多种接头。例如，固体支持物可包含结合于和/或包被在固体支持物的至少一部分表面上的链霉亲和素，并且一种或多种生物素化的分子识别元件和/或一种或多种生物素化的核酸序列可经链霉亲和素和生物素的结合而结合于固体支持物。在一些实施方案中，固体支持物(例如珠粒)包含每固体支持物约3.5amol的链霉亲和素，并且每个链霉亲和素结合约1、2、3或4个生物素化的分子。在一些实施方案中，存在于固体支持物上的分子识别元件分子与核酸序列分子的比率为约4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3或1:4(分子识别元件:核酸序列)。
固体支持物可包含量为约1、10、50、100、200、300、400、500或600个分子(即分子识别元件和/或核酸序列)-约1000、5000、10000、50000、100000、250000、500000、1000000、10000000、25000000、50000000、60000000个或更多个分子的分子识别元件和/或核酸序列。在一些实施方案中，固体支持物包含量为约10、30、50、75或100ymol-约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15fmol的分子识别元件和/或核酸序列。在一些实施方案中，固体支持物包含量为约0.1、0.3、0.5、0.75、1、2、3、4或5zmol-约1、5、10、15、20、25、30、35或40amol的分子识别元件和/或核酸序列。在一些实施方案中，固体支持物包含和/或结合量为约1amol，量在约1zmol-约100amol范围内，或量在约100ymol-约10fmol范围内的分子识别元件。在一些实施方案中，固体支持物包含和/或结合量为约3amol，量在约0.3zmol-约30amol范围内或量在约30ymol-约3fmol范围内的核酸序列(例如引物和/或单链寡核苷酸)。
固体支持物可提供给测定和/或反应孔以约1nM-约1mM范围内的量存在的分子识别元件和/或以约300pM或者1或3nM-约300μM或3mM范围内的量存在的核酸序列。在一些实施方案中，固体支持物可提供给测定和/或反应孔以约1μM-约100nM范围内的量存在的核酸序列(例如引物)。分子识别元件和/或核酸序列的浓度可为固体支持物上存在的和/或从固体支持物释放的量。在一些实施方案中，通过固体支持物在测定和/或反应孔中提供的分子识别元件和/或核酸序列的浓度可足以执行或进行扩增过程(例如PCR)和/或检测靶标。
在一些实施方案中，核酸序列可任选地经接头连接和/或结合于固体支持物，并且可具有约5、10、20或25个核苷酸-约30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸的长度。在一些实施方案中，核酸序列包含至少5个核苷酸-约500个核苷酸(例如5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、21、22、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸)。在一些实施方案中，核酸序列为寡核苷酸。在一些实施方案中，核酸序列为引物(例如正向引物或反向引物)，其可例如用作PCR测定中的引物、用作杂交测定和/或微阵列中的探针。可用于本发明的引物包括(但不限于)用于扩增和/或检测的那些引物。在一些实施方案中，核酸序列包含约15个核苷酸-约50个核苷酸或约20个核苷酸-约25个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的固体支持物包含至少一种正向引物和/或至少一种反向引物。在一些实施方案中，本发明的固体支持物包含正向引物而不包含反向引物。在一些实施方案中，本发明的固体支持物包含正向引物和反向引物。
在一些实施方案中，可将引物吸收到固体支持物(例如水凝胶珠粒)中，使得引物主要在固体支持物内部而不暴露在固体支持物的外部(其中可结合分子识别元件(例如捕获抗体))。示例性的水凝胶珠粒包括(但不限于)琼脂糖珠粒(例如Sepharose珠粒)。
存在于固体支持物上的引物可与防止杂交的化学物类(比如某些核酸序列(任选地带有修饰的碱基)，其解链温度高于检测试剂温育的温度但低于进行PCR的退火温度)缔合。或者或另外，可使用肽、蛋白、RNA序列、聚合物和/或其他试剂来减少与固体支持物上的引物的非特异性结合和/或不需要的杂交。
在一些实施方案中，固体支持物包含衍生自一种或多种修饰的碱基比如可得自Firebird和其他来源的那些的自回避引物。在一些实施方案中，自回避分子识别系统(SAMRS)为正向引物和检测试剂的核酸标签，而反向引物为正常DNA。
本发明固体支持物上的正向引物和/或反向引物和/或本发明的检测试剂可配置成在适当的时间结合某些组件。例如，在一些实施方案中，由于NA标签为单链的并且引物结合位点直至第一个PCR循环之后才存在，所以防止引物(例如正向引物)与检测试剂的核酸标签结合直至第一个PCR循环之后。在一些实施方案中，可设计正向引物和反向引物，使得其在较低的温度下(例如在与检测试剂一起温育期间)不可用于碱基对，但在较高的温度下(例如在过量检测试剂被洗去之后的时间)变为可用。在一些实施方案中，本发明固体支持物上的正向引物和/或反向引物可为双链的(例如经双链体或发夹结构)，并且在PCR的变性步骤后引物变为单链。可设计引物使得双链结构(例如双链体或发夹)在PCR退火温度下不会显著形成，因为其可抑制PCR。在一些实施方案中，本发明固体支持物上的正向引物和/或反向引物可在酶促裂解之后变为可用。例如，引物可为双链体的一部分，并且竞争链(引物的反向互补物)含有可裂解的键。竞争链降解成较小的部分可显著降低解链温度，使得其在PCR期间不会竞争。对于可裂解的键，可使用以下非排他性实例：可光裂解的键、可被内切核酸酶或其他酶作用的特别掺入的核苷酸或可被RNA酶作用的RNA。在一些实施方案中，裂解提供具有可延伸的3'末端的引物。
在一些实施方案中，本发明的检测试剂可被保护和/或设计为最小化与固体支持物上的引物的杂交。例如，可使用与以上讨论的那些类似的技术(例如dsDNA双链体、发夹结构)，使得反向引物结合位点已经碱基配对。
根据一些实施方案提供多种固体支持物，其包括第一多个固体支持物和第二多个固体支持物。第一多个固体支持物中的每个固体支持物包含：提供第一编码信号的第一编码剂(例如染料)；第一核酸序列；和第一分子识别元件(例如抗体)，和第二多个固体支持物中的每个固体支持物包含：提供第二编码信号的第二编码剂(例如染料)；第二核酸序列；和第二分子识别元件(例如抗体)。由于第一编码信号不同于第二编码信号，第一核酸序列不同于第二核酸序列和/或第一分子识别元件不同于第二分子识别元件，所以第一多个固体支持物中的固体支持物区分和/或区别于第二多个固体支持物中的固体支持物。
根据一些实施方案提供一种检测试剂，其包含分子识别元件(例如抗体)和核酸序列。检测试剂的核酸序列在本文中也称为“核酸标签”或“标签”。检测试剂可结合于靶标的第一部分，和本发明的固体支持物可结合于靶标的第二部分。以这种方式，检测试剂具有相应的固体支持物，因为其经靶标与固体支持物配对。用于本发明检测试剂的核酸标签具有配置成参与核酸扩增过程的部分，该核酸序列的一部分连接(例如结合)于用于检测试剂的相应固体支持物。在一些实施方案中，本发明的检测试剂为包含核酸标签的检测抗体。
检测试剂的核酸标签可包含约20、30、40、50或60个核苷酸-约70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280或300个核苷酸。在一些实施方案中，核酸标签包含发夹环。
在一些实施方案中，核酸标签的至少一部分与用于检测试剂的相应固体支持物的核酸序列的至少一部分基本上相同。在一些实施方案中，核酸标签中的至少约5个或更多个(例如6、7、8、9、10、15、20个或更多个)连续核苷酸与用于检测试剂的相应固体支持物的核酸序列中的至少约5个或更多个(例如6、7、8、9、10、15、20个或更多个)连续核苷酸基本上相同。在一些实施方案中，核酸标签的5'区域中的序列与固体支持物的核酸分子中的序列基本上相同。在一些实施方案中，核酸标签的5'区域中的序列与用于检测试剂的相应固体支持物的核酸序列基本上相同和/或核酸标签的3'区域中的序列与可任选地存在于PCR主混合物中的反向引物互补。在一些实施方案中，对应于两个或更多个不同固体支持物组的两种或更多种检测试剂在核酸标签的3'区域中包含基本上相同的序列，并且该序列可与反向引物互补。
现参考图6，显示本发明实施方案的示例性复合物，该复合物包含编码的固体支持物、靶标和检测试剂。编码的固体支持物为用正向引物和结合于靶标的抗体(例如捕获抗体)功能化的编码的珠粒。图6所示的检测试剂为包含核酸序列的抗体，并且该抗体结合于靶标，从而形成本发明的复合物。因此，捕获的靶标用含有独特核酸序列的检测抗体标记，并且通过相应编码的珠粒的正向引物(任选地当正向引物从珠粒中释放出来时)和在PCR主混合物中提供的反向引物，扩增核酸序列的至少一部分(即核酸标签)。然后可通过荧光信号(例如来自dsDNA插入染料)检测PCR产物。
对应于一个或多个固体支持物组中的固体支持物的检测试剂各自包含相同的核酸标签。对于对应于不同固体支持物的检测试剂，核酸标签是不同的。再次参考图6，检测试剂的核酸标签在5'区域中包含配置成参与用正向引物的至少一部分进行的核酸扩增过程的序列。另外，核酸标签在3'区域中包含与反向引物互补的序列，并且该核酸序列也存在于对应于不同固体支持物的不同检测试剂中(并且因此为其所共有)，如图7所示。因此，核酸标签可通过两种引物扩增：独特的正向引物和共有的反向引物。独特的正向引物可与核酸标签的5'区域中的序列基本上相同。反向引物可与所有核酸标签的3'区域中的序列互补，并且可添加到PCR主混合物中。
在一些实施方案中，固体支持物的核酸序列和/或检测试剂的核酸标签包含单链DNA。在一些实施方案中，固体支持物的核酸序列和/或检测试剂的核酸标签包含双链DNA。在一些实施方案中，固体支持物的核酸序列和/或检测试剂的核酸标签包含RNA或杂交的DNA-RNA。在一些实施方案中，固体支持物的核酸序列和/或检测试剂的核酸标签包含一种或多种化学修饰的碱基，比如自然界中通常未发现的一种或多种化学修饰的碱基。一种或多种化学修饰的碱基可提高PCR反应的特异性和/或减少核酸序列(例如寡核苷酸)之间的非特异性结合。
核酸标签可以任何方式连接或结合于分子识别元件和/或连接或结合于分子识别元件的任何部分。在一些实施方案中，核酸标签共价或非共价连接于分子识别元件。在一些实施方案中，接头用于将核酸标签连接于分子识别元件。核酸标签可连接于分子识别元件(例如抗体)的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，分子识别元件为抗体或其片段，并且核酸标签可连接(例如共价连接)于抗体或其片段的可结晶片段(Fc)区域。
在一些实施方案中，核酸标签可为化学合成的单链DNA (ssDNA)。在一些实施方案中，连接于分子识别元件的双链DNA(dsDNA)标签提供可提供减少的非特异性结合的检测试剂。在一些实施方案中，通过设计(例如与引物或与核酸标签的)互补链以确保其在测定期间保持退火，任选地直至其期望的释放，来减轻dsDNA与结合于固体支持物的引物的杂交。如本领域技术人员将认识到的，DNA链可以由序列、温度和化学环境确定的速率经历解链和退火(绽裂(fraying))。末端的这种绽裂可增加与其他核酸分子(比如结合于固体支持物的引物或探针)的非特异性结合或不期望的杂交。为了防止dsDNA标签的互补链与结合于固体支持物的正向引物杂交，互补链可以更短，即缺少与正向引物互补的序列。在这种情况下，标签可为部分dsDNA和部分ssDNA。
在一些实施方案中，核酸标签可为发夹标签序列和/或带有GC夹的序列。发夹序列和/或带有GC夹的序列可减少与检测试剂一起温育期间末端的绽裂和/或不期望的杂交。在一些实施方案中，核酸标签可为RNA序列，并且可使用逆转录酶。RNA序列可包含具有内部结构的RNA发夹，所述内部结构可防止样品捕获期间的杂交。
在一些实施方案中，核酸标签可被蛋白、膜、胶束、肽、噬菌体等包裹，使得其直至期望(例如密封在反应孔中之后)才能杂交于结合于固体支持物的核酸序列(例如引物)。
在一些实施方案中，核酸标签包含限制性酶位点。可设计包含限制性酶位点的核酸标签，使得酶裂解发夹或GC夹，并且这可用于释放核酸序列以进行有效的PCR分析。在一些实施方案中，核酸标签包含可光裂解的键或可化学裂解的二硫化物接头，其可用于从检测试剂中释放全部或部分核酸标签。
本发明的核酸标签不需要含有独特区域和共有区域，比如图7所示的。在一些实施方案中，检测试剂的核酸标签包含完全或部分独特的序列，并且可将正向或反向引物的混合物添加至用于这种序列的主混合物中。
在一些实施方案中，核酸标签包含至少一个共有区域，其为不同检测试剂的核酸标签中的保守核酸序列，并且其足够大以使得可通过用一种或多种引物对扩增来检测一些或全部序列。保守的核酸序列可存在于5'区域和/或位于独特区域之外的3'区域中。对于所有两种或更多种不同的检测试剂，保守区域可存在于所有核酸标签中。因此，可设计用于不同检测试剂的核酸标签，使得其可被独特的引物对和被所有检测试剂的核酸标签共有的通用引物对扩增。该实施方案可用于测定开发期间的故障排除，使得非特异性结合和/或交叉反应性可易于可视化。在一些实施方案中，本发明的核酸标签包含至少两个核酸序列，一个通过独特的反向引物扩增和另一个通过通用反向引物扩增。
可使用本领域技术人员已知的任何方法将核酸标签连接于分子识别元件以提供检测试剂。在一些实施方案中，使用传统的化学方法、点击化学、基因工程和/或分子工程方法，将核酸标签连接于分子识别元件。
在一些实施方案中，本发明检测试剂的分子识别元件可被功能化为用核酸标签和任选地扩增结合于固体支持物的核酸序列的引物和/或探针功能化的纳米颗粒。然而，在一些实施方案中，避免了可变浓度的多重引物组以减少测定变化。
在一些实施方案中，当检测试剂包含含有核酸的分子识别元件时，则核酸标签可由全部或部分分子识别元件提供。就是说，分子识别元件本身可充当核酸标签。
根据一些实施方案，提供多种检测试剂，其包括第一多种检测试剂，其中第一多种检测试剂中的每种检测试剂包含：第一分子识别元件(例如抗体)和第一核酸标签；和第二多种检测试剂，其中第二多种检测试剂中的每种检测试剂包含：第二分子识别元件(例如抗体)和第二核酸标签；其中第一和第二核酸标签各自包含第一部分和第二部分；和其中第一核酸标签的第一部分的核酸序列不同于第二核酸标签的第一部分的核酸序列。在一些实施方案中，用于第一和第二核酸标签的第二部分的核酸序列为相同或基本上相同的。在一些实施方案中，用于第一和第二核酸标签的第一部分在相应标签的5'区域中和第二部分在相应标签的3'区域中。第一核酸标签可连接于(例如接合于、结合于和/或融合)第一分子识别元件，和第二核酸标签可连接于(例如接合于、结合于和/或融合)第二分子识别元件。
根据一些实施方案提供包含本文所述的固体支持物和/或本文所述的检测试剂的组合物、试剂盒、装置和/或系统。当存在对应于固体支持物和检测试剂的靶标时，固体支持物和检测试剂可形成复合物。组合物、试剂盒、装置和/或系统可包含任选地包含两种或更多种不同编码的固体支持物的多种固体支持物以及任选地包含两种或更多种不同的检测试剂的多种检测试剂。
在一些实施方案中，可通过用独特的染料或荧光染料的独特组合编码每个组来制备珠粒组，如图7中的珠粒“A”、“B”和“C”所示。例如，珠粒组“A”可用红色荧光染料染色，而珠粒组“B”用蓝色荧光染料染色。在一些实施方案中，在将每组与针对特定靶标分子的不同生物素化的捕获抗体一起温育之前，将所有组用链霉亲和素功能化。最后，将每组与独特的生物素化的引物(例如正向引物)一起温育。在一些实施方案中，通过将独特的核酸标签共价连接于用于每种靶标的检测抗体来制备检测试剂。在一些实施方案中，标签为60个核苷酸(nt)的单链DNA(ssDNA)，其在5'末端或区域具有独特的序列，和在3'末端或区域具有在所有标签中保守的共有序列。每种标签通过两种引物扩增：正向引物(每种标签均不同)和共同的反向引物。在一些实施方案中，正向引物可包含与连接于检测抗体的标签的5'区域或5'末端中的序列相同或基本上相同的序列。或者，标签的3'末端可连接于检测抗体。在一些实施方案中，可将与所有标签的保守的3'末端或区域互补的反向引物添加至PCR主混合物中。以这种方式，珠粒组A将携带捕获抗体A和仅可扩增连接于检测抗体A的核酸标签A的正向引物A两者。珠粒组B将携带捕获抗体B和仅可扩增连接于检测抗体B的核酸标签B的正向引物B两者。由于标签的3'末端或区域包含保守序列，因此添加至主混合物中的引物用作核酸标签A和核酸标签B两者的反向引物。
在一些实施方案中，本发明的固体支持物不包含可与核酸标签杂交的互补序列。在没有靶标的情况下，这种杂交可导致检测试剂从温育混合物中显著下拉，从而产生非常高的背景信号。为此，在一些实施方案中，由于正向引物在序列上与标签的5'末端或区域相同或基本上相同(不互补)，所以仅将正向引物连接于固体支持物。可将与标签互补的反向引物添加至PCR主混合物中，使得可进行PCR。
在一些实施方案中，在存在针对不同靶标的固体支持物的混合物的情况下进行测定，并将固体支持物与样品一起温育。固体支持物可捕获靶标，并且样品基质可被洗去。然后可将固体支持物与对应于固体支持物的多种检测抗体试剂的混合物一起温育，以标记捕获的靶标从而形成复合物。可洗涤复合物和/或将其加载到阵列(例如经大小定制使得大多数反应孔仅含有单个珠粒微孔阵列)中。可任选地在例如通过用不混溶的油密封而流体分离每个反应之前，添加含有与所有标签的3'末端或区域互补的共同反向引物的PCR主混合物。在PCR的变性步骤期间，可将连接于固体支持物的正向引物释放到分离的反应孔中，使得每个孔现均含有完整的PCR引物组。例如，如果存在检测抗体缀合物A，则含有A型珠粒的孔将为PCR阳性；和如果存在检测抗体缀合物B，则含有B型珠粒的孔将为PCR阳性。然而，含有A型珠粒和非特异性结合的检测抗体缀合物B的反应将不会是PCR阳性，因为A型珠粒携带的引物不能扩增检测抗体缀合物B上的核酸标签(图8)。以这种方式，优化为单重反应的iPCR测定在多重时可能需要较少的重新优化，因为可通过每个珠粒组扩增和/或检测的总检测抗体浓度不会随着向测定中添加另外的靶标而变化。
在一些实施方案中，本发明的方法捕获和/或导致约0-约10000000个检测试剂作为复合物与其相应的固体支持物的结合。例如，本发明的方法可捕获和/或导致约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、2000、2200、2500、2750、3000、3500、4000、4500或5000-约10000、25000、50000、75000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、5000000或10000000个检测试剂作为复合物与其相应的固体支持物的结合。
在一些实施方案中，本发明的组合物、试剂盒、装置和/或系统进一步包含扩增剂。示例性的扩增剂包括(但不限于)反向引物、ssDNA夹板和连接酶等。在一些实施方案中，扩增剂具有与检测试剂和固体支持物的核酸序列的至少一部分互补的核酸序列，任选地其中核酸序列的该部分在核酸标签的3'区域中。扩增剂可与固体支持物和/或检测试剂分开。在一些实施方案中，扩增剂连接于固体支持物，任选地其中扩增剂为生物素化的。
本发明的固体支持物及其相应的检测试剂可分开储存于本发明的组合物、试剂盒、装置和/或系统中。在一些实施方案中，本发明的检测试剂和扩增剂分开储存于本发明的组合物、试剂盒、装置和/或系统中。在一些实施方案中，本发明的固体支持物和扩增剂在存在扩增剂且其未连接于固体支持物时分开储存。
根据一些实施方案提供一种检测样品中的靶标的方法。所述方法可包括合并本发明的固体支持物和包含靶标的样品以形成包含靶标结合的固体支持物的第一组合物。
本文使用的“合并(Combining)”和“合并(combine)”是指使两种或更多种组分足够接近和/或接触以任选地当在合适的条件下时结合和/或反应。可将本发明的检测试剂与靶标结合的固体支持物组合以形成包含固体支持物、靶标和检测试剂的复合物，其中检测试剂包含结合于靶标的分子识别元件以及核酸标签。核酸标签的至少一部分和结合于固体支持物的核酸序列的至少一部分配置成参与核酸扩增过程。核酸标签的至少一部分被扩增，从而允许检测样品中的靶标。可使用和/或执行任何合适的扩增方法，比如(但不限于)PCR和/或滚环扩增(RCA)。
在一些实施方案中，所述方法可包括一个或多个洗涤步骤，任选地使用水溶液。可进行一个或多个洗涤步骤以洗涤靶标结合的固体支持物和/或洗涤复合物。一个或多个洗涤步骤可去除未反应的和/或非结合的组分和/或非特异性地结合于复合物的那些。
在一些实施方案中，在本发明的方法中使用扩增剂。方法可包括使扩增剂和包含固体支持物、靶标和检测试剂的复合物合并和/或反应。在合并扩增剂和复合物的步骤之前、期间和/或之后，当扩增剂连接于固体支持物时，可从固体支持物中释放出扩增剂。在一些实施方案中，扩增剂保持在固体支持物上。在一些实施方案中，扩增剂不连接于固体支持物，而是添加至包含复合物的组合物中。
在一些实施方案中，扩增剂为核酸序列(例如引物)，其可任选地在扩增步骤之前从固体支持物中释放。在一些实施方案中，结合于固体支持物和/或从固体支持物中释放的核酸序列的至少一部分被扩增。在一些实施方案中，扩增剂包含ssDNA夹板和连接酶，其在合适的条件下反应以将两个寡核苷酸连接在一起。在一些实施方案中，本发明的固体支持物包含寡核苷酸(例如ssDNA寡核苷酸)，和本发明的检测试剂包含寡核苷酸(例如ssDNA寡核苷酸)，并且当在存在ssDNA夹板和连接酶和合适的条件(例如当寡核苷酸彼此紧邻，比如当每个寡核苷酸结合于同一靶标)的情况下时，两个寡核苷酸被连接和/或延伸，并且然后可扩增寡核苷酸的至少一部分。在一些实施方案中，本发明的固体支持物包含寡核苷酸(例如ssDNA寡核苷酸)，和本发明的检测试剂包含寡核苷酸(例如具有可杂交于固体支持物的ssDNA寡核苷酸的3'突出端的寡核苷酸)，并且当彼此紧邻时，比如当每个寡核苷酸结合于同一靶标时，两个寡核苷酸杂交、延伸，并且然后可扩增寡核苷酸的至少一部分。
在一些实施方案中，当靶标和固体支持物合并时，本发明的检测试剂存在于包含相应的本发明固体支持物的组合物中。在一些实施方案中，将本发明的检测试剂、其相应的本发明固体支持物和靶标同时合并。
本发明的方法可包括扩增相同和/或不同的一个或多个核酸序列。在一些实施方案中，本发明的方法包括聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，本发明的方法包括扩增检测试剂的核酸标签的至少一部分。在一些实施方案中，扩增检测试剂的核酸标签的至少一部分使用PCR进行。在一些实施方案中，扩增检测试剂的核酸标签的至少一部分不涉及PCR，并且使用另一种核酸扩增技术，比如(但不限于)环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增、链置换扩增、转录介导的扩增和/或核酸环路，其中酶促降解的标签可启动由杂交驱动的链反应。
在一些实施方案中，本发明的方法使用邻近连接测定(proximity ligationassay，PLA)进行。在一些实施方案中，本发明的方法使用结合诱导的DNA扩增(BINDA)、邻近延伸测定(Proximity Extension Assay，PEA)和/或三重PLA进行。在一些实施方案中，本发明的方法为在包含多个孔的微流体装置中进行的多重测定(例如免疫聚合酶链反应(iPCR)测定)，并且所述方法进一步包括将固体支持物与一个或多个另外的固体支持物以及所述多个孔的至少一个孔中分离。
微流体装置可以包含或可以不包含刚性或固体微孔阵列。在一些实施方案中，本发明的固体支持物可在不混溶的油(比如乳液PCR、BioRad Digital Droplet PCR系统、RainDance PCR系统或称为BEaMing的技术中使用的那些)中的水性PCR主混合物的液滴中分离。在一些实施方案中，正向引物经共价键或多个生物素基团结合(例如拴系)于本发明的固体支持物(例如珠粒)，使得可在破乳之后通过流式细胞仪读出信号。某些等温扩增技术可以乳液/液滴形式使用，或者如果扩增子保持连接于固体支持物则可以本体溶液的形式使用。在一些实施方案中，本发明的基底、装置和/或方法可包括(但不限于)如美国申请公开号2015/0211048、国际申请号PCT/US2016/042913、国际申请号PCT/US2016/043463和国际申请号PCT/US2016/055407中所述的(例如基底、装置和/或方法)，所述申请每一个的内容通过参考以其全部结合至本文中。在一些实施方案中，本发明的方法包括使用珠粒(例如超顺磁性珠粒)将试剂和/或靶标递送到反应孔中的方法，比如例如在美国申请公开号2015/0211048和国际申请号PCT/US2016/042913中所述的，所述申请每一个的内容通过参考以其全部结合至本文中。
在一些实施方案中，本发明的化合物、组合物、试剂盒、系统、装置和/或方法可用于进行任何合适的反应，比如(但不限于)涉及生物分子的测定，比如PCR反应；基于空间阵列的测定，比如可重配置的多元件诊断(reconfigurable multi-element diagnostic，ReMeDx)测定，紧凑阵列中的单重反应(singleplex reactions in a compact array，SiRCA)；包括水性反应组合物的测定；在塑料基底上进行的测定和/或国际公开号WO 2013/176767中描述的测定，其内容通过参考结合至本文中。
在一些实施方案中，本发明的方法包括制备本发明的固体支持物。本发明的固体支持物可通过使固体支持物(任选地包含一个或多个接头)与分子识别元件和核酸序列同时和/或在不同时间接触而形成。在一些实施方案中，可在分开的时间添加分子识别元件和核酸序列，以助于提供在多个珠粒中的每个各自珠粒上具有基本上相同数目(即在±20％以内)的分子识别元件和核酸序列的多个珠粒。在一些实施方案中，制备本发明固体支持物的方法包括使固体支持物与一种或多种填充剂接触，所述填充剂比如(但不限于)：生物素、生物素化的聚合物、生物素化的核酸聚合物、生物素化的碳水化合物、生物素化的量子点或其他纳米颗粒、生物素化的肽和/或生物素化的蛋白。填充剂可助于控制添加至固体支持物的分子识别元件和/或核酸序列的量和/或可助于减少测定期间的非特异性结合。
在一些实施方案中，可通过使用立足点置换引物(toe-hold displacementprimer)、发夹引物、部分可消化的发夹引物和/或阻断NA序列来减少检测试剂与连接于固体支持物的核酸序列(例如引物)的不期望的杂交。引物可在5'和/或3'末端或者5'和3'两端拴系于固体支持物。在一些实施方案中，如果提供合适的条件，则可使用双链引物。
在一些实施方案中，可在本发明的方法中控制温育条件和/或扩增条件，使得不利于检测试剂与连接于固体支持物的核酸序列的杂交，但是PCR扩增仍可随后在方法的检测阶段期间发生。例如，可在有利于解链状态的温育条件(例如低盐或添加甜菜碱)下使用低解链温度引物，使得引物不与检测试剂杂交。然而，在PCR期间可使用有利于更高解链温度的条件(例如更高的盐或去除甜菜碱)，使得引物可有效地扩增检测试剂的核酸序列。
可使用本领域技术人员已知的任何方法，比如通过视觉观察和/或化学或生化测定，在本发明的方法中检测靶标。在一些实施方案中，本发明的方法包括通过检测测定信号来检测靶标。测定信号可为例如荧光信号，比如来自dsDNA插入染料和/或来自含有猝灭剂和染料的探针的水解的荧光信号。
在一些实施方案中，荧光用于检测。在一些实施方案中，本发明的方法包括和/或提供荧光读出。在一些实施方案中，本发明的方法包括和/或提供通过使扩增子杂交于固态传感器，通过方法比如焦磷酸测序对扩增子进行测序和/或形成沉淀(比如LAMP扩增期间发现的沉淀)所得的电子读出。
本发明的方法可提高测定的特异性和/或可减少测定的背景信号。在一些实施方案中，本发明的方法降低在固体支持物和非靶标分子(例如错误抗原)之间观察到的交叉反应性。本文使用的“观察到的交叉反应性”是指与固体支持物和非靶标分子(例如错误抗原)之间的相互作用相关的检测到的信号。在一些实施方案中，可视觉观察检测到的信号。在一些实施方案中，本发明的方法减少观察到的固体支持物的非特异性结合，比如如图5所示，以假阳性观察到的荧光信号。在一些实施方案中，本发明的方法改善测定的信噪比，改善测定的灵敏度和/或降低观察到的测定的交叉反应性。在一些实施方案中，本发明的化合物、组合物、装置、试剂盒、系统和/或方法改善多重免疫PCR(iPCR)测定。
在一些实施方案中，可通过对每种靶标使用不同的核酸序列来减少对于靶标观察到的交叉反应性和/或背景信号，和/或减少观察到的交叉反应性和/或背景信号以进行多重基于探针的qPCR，其中每种探针均标记有光谱上不同的荧光染料。在这种情况下，从探针水解观察到的荧光增加可参考珠粒的编码，以确定是否形成正确的复合物。
在一些实施方案中，仔细选择用于检测试剂的NA标签的序列，使得由正确的PCR扩增产生的扩增子将具有离散的解链温度，任选地具有不同的解链温度，使得其可区分于非特异性扩增产物和任选地彼此区分。不同解链温度扩增子的使用可用作区别一个珠粒群与另一个的编码手段和/或用作确认编码信号的手段。与对照方法(例如使用已知的固体支持物和检测试剂的iPCR)相比较，本发明的方法可将测定的背景信号减少约0.5、1、1.5、2、2.5或3个数量级。
本发明的化合物、组合物、试剂盒、装置、系统和/或方法可用于多重免疫测定小组。本发明的一些实施方案可用于定性和/或定量医学和/或兽医诊断测试、法医测试、生物危害材料的鉴定、环境监测、研究和开发和/或类似用途。在一些实施方案中，多重复用否则会表现出高水平交叉反应性的分子识别元件(例如抗体)对的能力可实现目前尚未实现的新诊断测试。
在以下非限制性实施例中更详细地解释本发明。
实施例
实施例1
使用本文所述的固体支持物和检测试剂开发了单分子的基于珠粒的免疫测定(称为“Protein SiRCA技术”)。将这些测定与类似的iPCR测定进行比较，以显示Protein SiRCA技术可如何减少来自非特异性结合和抗体交叉反应的背景。
首先，制备了iPCR测定试剂。通过用编码染料和捕获抗体功能化3μm ProMag COOH修饰的超顺磁性珠粒，制备用于细胞因子IL-6、IL-7、IL-8、IL-10和TNF-α的珠粒组。通过使用TriLink Biotechnologies Protein-Oligo Conjugation Kit将相同的60nt ssDNA标签连接于相关的检测抗体来制备检测抗体缀合物(图3)。iPCR测定如图4所示进行。单重测定显示出极好的灵敏度(图9A)。在5重测定中，在接近检测限(LOD)(一般地处于或低于约1pg/mL)进行的测量显示，对于大多数珠粒组具有极好的灵敏度(图9B)。然而，在多重复用时，对于所有珠粒组，尤其是对于IL-8，背景信号均显著增加(图9B和图9C)。
通过将链霉亲和素包被的Dynabead与生物素化的捕获抗体一起温育来制备Protein SiRCA珠粒(图10)。使用TriLink Biotechnologies Chromalink BiotinAntibody Labeling Kit在内部将抗体进行生物素化。然后将抗体标记的珠粒与生物素化的正向引物一起温育，引物用荧光染料共价标记(图10)以编码珠粒。制备3组用于细胞因子IL-7、IL-8和IL-10的珠粒。图11显示来自每组的代表性珠粒的两个编码波长的荧光强度曲线图。图11还显示具有共价连接的染料的3种iPCR珠粒的编码簇。每个珠粒组的紧密聚集使得能够在多重实验中准确识别每种珠粒类型。
在单重测定中，将Protein SiRCA珠粒的阳性百分比与常规iPCR珠粒进行比较。iPCR珠粒与Protein SiRCA珠粒的不同之处在于，iPCR珠粒未用链霉亲和素功能化或未包被有引物；其共价连接于编码染料和捕获抗体。将每种靶标的iPCR和Protein SiRCA珠粒与血清(空白)或血清中的90fM靶标细胞因子(阳性对照)一起温育。由于该初始测试的目的为确定捕获抗体对不同测定珠粒的灵敏度或活性，因此将每个珠粒组与针对iPCR开发的适当抗体缀合物一起温育(即所有检测缀合物均具有相同的NA标签)。将两种引物均添加至PCR主混合物中。图12显示血清空白和90fM每种细胞因子的所得信号。一般而言，就信号背景比而言，Protein SiRCA珠粒的表现非常类似于iPCR珠粒，对于这些测定，Protein SiRCA珠粒显示出略更高的信号和略更高的背景。
接下来，制备用于Protein SiRCA的检测抗体缀合物。在iPCR中，对各抗体缀合物使用相同的NA标签。如图7所示，在Protein SiRCA中，对各缀合物均使用不同的NA标签。在单重测定中使用缺少正向引物的iPCR珠粒，以比较iPCR和Protein SiRCA缀合物的活性。因此，将用于每种标签的引物添加至每个单重测定的主混合物中。在其他相同的实验中，检测抗体缀合物活性的比较表明，所有Protein SiRCA缀合物的灵敏度均低于iPCR缀合物(图13)。缀合物的表征显示Protein SiRCA抗体均标记不足，使得很大一部分抗体缺少NA标签。这些无标签抗体可结合捕获的靶标分子，但不会产生可检测(可转换)的PCR信号。iPCR和Protein SiRCA缀合物之间标记效率的差异很可能是由于缀合试剂盒(TriLinkBiotechnologies Protein-Oligo Conjugation Kit)中购买的抗体储备液或老化试剂的批次可变性所致，因为iPCR和Protein SiRCA缀合物在不同的时间制备。在缀合物之间观察到的差异很可能是由于抗体缀合物制备中的可变性而不是Protein SiRCA缀合物的固有特征。
为了说明珠粒类型、编码方案、抗体与珠粒的连接、引物递送、抗体缀合物标记效率以及不同NA标签序列的PCR扩增效率的差异，针对iPCR和Protein SiRCA进行基线单重测定(图14)。在单重测定中，IL-7和IL-8的背景信号在Protein SiRCA中略较高，但是IL-10Protein SiRCA的背景信号较低。
接下来，使用3种iPCR抗体缀合物对IL-7、IL-8和IL-10进行含有iPCR珠粒的三重iPCR测定。将用于所有3种细胞因子的珠粒混合在一起，并然后与缓冲液(空白)或90fM每种细胞因子一起温育。在PCR主混合物中提供用于共同iPCR NA标签的单组正向和反向引物。正如早期工作所预期的，IL-8显示出非常高的背景信号；这种高的阳性孔百分比表明，每珠粒很可能存在几种非特异性结合的检测抗体复合物。当将90fM IL-7或IL-10掺入到样品缓冲液中时，在适当的珠粒组中观察到测定信号的显著增加。然而，向样品缓冲液中添加90fMIL-8没有导致IL-8珠粒中的信号明显增加超过背景，表明该浓度低于三重iPCR测定中的检测限(图15)。用于每种珠粒类型的4种不同测定条件(空白和90fM每种细胞因子)的比较图如图15所示。来自IL-8珠粒的高信号很可能是由于其他检测抗体缀合物的非特异性结合所致。
使用Protein SiRCA珠粒以及用于IL-7、IL-8和IL-10的检测抗体缀合物重复相同的三重测定。将用于所有3种细胞因子的珠粒混合在一起，并然后与缓冲液(空白)或90fM每种细胞因子一起温育(图16)。PCR主混合物中仅提供共同的反向引物，因为用于每种结合物标签的独特正向引物均通过珠粒本身递送至孔中。显示来自用于4个实验(空白和90fM每种细胞因子)的每个珠粒组的信号的比较图如图16所示。当存在其相应分析物时，对于所有珠粒可以看到信号可辨别增加超过背景。
iPCR和Protein SiRCA测定的直接比较如图17所示。对于单重测定数据，与iPCR相比较，IL-7在Protein SiRCA中显示出较低的信号背景比，很可能是由于Protein SiRCA抗体缀合物的问题所致。与iPCR相比较，IL-10在Protein SiRCA中显示出信号背景比的显著改善。然而，在IL-8珠粒中可以看到最显著的改善。然而，在IL-8珠粒中可以看到最显著的改善。Protein SiRCA IL-8珠粒的背景信号比iPCR中所见的低大于一个数量级，这允许足够的信号背景比以易于辨别90fM IL-8和空白之间的差异。
前述为对本发明的说明，并且不应解释为对其的限制。本发明由以下权利要求定义，其中包括权利要求的等同内容。本文引用的所有公开、专利申请、专利、专利公开和其他参考文献通过参考以其全部结合，以用于与其中呈现参考文献的句子和/或段落相关的教导。

Claims (10)

1.一种试剂盒，其包含：
(i)固体支持物(例如珠粒)，其中所述固体支持物包含：
编码剂(例如染料)；
第一核酸序列(例如寡核苷酸和/或引物)；和
第一分子识别元件(例如抗体)；和
(ii)检测试剂，其包含第二分子识别元件(例如抗体)和第二核酸序列，
其中第一核酸序列的至少一部分和第二核酸序列的至少一部分配置成参与核酸扩增过程。
2.权利要求1的试剂盒，其中所述固体支持物进一步包含接头(例如特异性结合对的一个构件)并且所述接头在所述固体支持物的表面上，任选地其中所述固体支持物用多个接头包被和/或功能化。
3.任何一项前述权利要求的试剂盒，其中第一分子识别元件和/或第一核酸序列连接(例如共价和/或非共价)于所述接头(例如所述特异性结合对的一个构件)。
4.任何一项前述权利要求的试剂盒，其中所述接头为链霉亲和素和第一分子识别元件为生物素化的分子识别元件，并且第一分子识别元件经由链霉亲和素和生物素的结合而连接于所述固体支持物。
5.任何一项前述权利要求的试剂盒，其中所述接头为链霉亲和素和第一核酸序列为生物素化的，并且第一核酸序列经由链霉亲和素和生物素的结合而连接于所述固体支持物。
6.任何一项前述权利要求的试剂盒，其中第一核酸序列包含约10、20或25个核苷酸-约30、40、50或60个核苷酸。
7.任何一项前述权利要求的试剂盒，其中第二核酸序列包含约20、30、40、50或60个核苷酸-约70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280或300个核苷酸。
8.任何一项前述权利要求的试剂盒，其中第二核酸序列包含与第一核酸序列中的序列(例如约5个或更多个连续核苷酸)基本上相同的序列(例如约5个或更多个连续核苷酸)，任选地其中与第一核酸序列中的序列基本上相同的所述序列存在于第二核酸序列的5'区域中。
9.任何一项前述权利要求的试剂盒，其中第一核酸序列和/或第二核酸序列包含单链DNA。
10.任何一项前述权利要求的试剂盒，其中第一核酸序列和/或第二核酸序列包含双链DNA。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013176767A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Microfluidic devices, solid supports for reagents and related methods
WO2017112025A2 (en) 2015-10-05 2017-06-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Decoding methods for multiplexing assays and associated fluidic devices, kits, and solid supports
CN112154190A (zh) 2018-05-18 2020-12-29 北卡罗来纳-查佩尔山大学 用于改善基材的表面性质的组合物、装置和方法
CN112236512B (zh) 2018-11-13 2025-06-10 北卡罗来纳-查佩尔山大学 具有微流体装置的分析系统、微流体装置和相关方法
CN114994324B (zh) * 2021-03-02 2025-06-06 上海泌码生命科学有限公司 用于免疫检测的组合物、试剂盒、检测方法及应用
CN115948518A (zh) * 2022-07-28 2023-04-11 广州合一生物科技有限公司 一种用于单细胞检测的编码微珠及其制备方法
CN117405878B (zh) * 2023-10-12 2024-06-11 上海领检科技有限公司 一种二氧化硅微球复合物及其制备方法和用途
CN118091110B (zh) * 2024-04-03 2025-03-25 中国科学院过程工程研究所 一种用于单分子免疫检测的生物探针及检测方法和用途
CN118006730B (zh) * 2024-04-10 2024-08-13 江西省转化医学研究院 阿尔兹海默症标志物蛋白免疫pcr检测试剂及试剂盒
CN120193049A (zh) * 2025-02-27 2025-06-24 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 一种zo-1蛋白定量试剂盒及其应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE0001670D0 (sv) * 2000-05-04 2000-05-04 Forskarpatent I Syd Ab Mass-spectrometry-based biosensor
JP4457001B2 (ja) * 2002-05-31 2010-04-28 セクレタリー・デパートメント・オブ・アトミック・エナジー ドナー／アクセプター部分が相補鎖上となる標的核酸検出のｍｅｔ／ｆｒｅｔに基づく方法
CA2529898C (en) * 2003-06-27 2017-12-05 Nanosphere, Inc. Bio-barcode based detection of target analytes
EP1660858A4 (en) * 2003-07-21 2007-10-24 Amplified Proteomics Inc MULTIPLEX analyte
WO2005086647A2 (en) * 2004-02-23 2005-09-22 University Of Maryland, Baltimore Immuno-pcr method for the detection of a biomolecule in a test sample
US20050260609A1 (en) * 2004-05-24 2005-11-24 Lapidus Stanley N Methods and devices for sequencing nucleic acids
US9347092B2 (en) * 2009-02-25 2016-05-24 Roche Molecular System, Inc. Solid support for high-throughput nucleic acid analysis
JP5457222B2 (ja) * 2009-02-25 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 小型化ハイスループット核酸分析
WO2011143583A1 (en) * 2010-05-13 2011-11-17 Illumina, Inc. Binding assays for markers
CA2869481A1 (en) * 2012-04-13 2013-10-17 Sequenta, Inc. Detection and quantitation of sample contamination in immune repertoire analysis
WO2013176767A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Microfluidic devices, solid supports for reagents and related methods
WO2014165061A1 (en) * 2013-03-13 2014-10-09 Meso Scale Technologies, Llc. Improved assay methods
CN105431575B (zh) * 2013-05-09 2017-08-29 生物辐射实验室股份有限公司 磁性免疫数字pcr试验
EP2997039B1 (en) * 2013-05-14 2019-06-26 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Stabilized liquid formulations containing receptors
WO2015070037A2 (en) * 2013-11-08 2015-05-14 Prognosys Biosciences, Inc. Polynucleotide conjugates and methods for analyte detection
DK3299469T3 (da) * 2014-04-21 2020-03-30 Harvard College Systemer og fremgangsmåder til at stregkodemarkere nukleinsyre
US20160060687A1 (en) * 2014-07-18 2016-03-03 Cdi Laboratories, Inc. Methods and compositions to identify, quantify, and characterize target analytes and binding moieties
EP3233128A4 (en) * 2014-12-18 2018-05-23 GE Healthcare UK Limited Analyte detection on a solid support by nucleic acid amplification coupled to an immunoassay
EP3365350B1 (en) * 2015-10-20 2024-03-13 Quateris LLC Multiplex dna immuno-sandwich assay (mdisa)
WO2017204294A1 (ja) * 2016-05-25 2017-11-30 株式会社ニコン 標的生体分子の特定方法、標的生体分子特定用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子特定装置
US20180163270A1 (en) * 2016-12-12 2018-06-14 Cepheid Integrated immuno-pcr and nucleic acid analysis in an automated reaction cartridge

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