CN1192038C

CN1192038C - 抗hiv－1的单克隆抗体及由它制备的疫苗

Info

Publication number: CN1192038C
Application number: CNB951978969A
Authority: CN
Inventors: H·卡特英格; A·布克阿谢尔; W·埃尔内斯特; C·鲍尔昂; M·珀特谢尔; A·特里科拉; R·普雷德尔; C·谢马特茨; A·克利马; F·施泰因德尔; T·穆斯特尔
Original assignee: Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
Current assignee: Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1995-04-19
Publication date: 2005-03-09
Anticipated expiration: 2015-04-19
Also published as: CN1186500A

Abstract

本发明公开了可用于制备疫苗的抗体，所述疫苗用于对需要治疗的人进行主动和/或被动免疫。本发明也提供人类单克隆抗体，它们与CL1至CL6细胞系保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)，PHLSPorton Down，Salisbury，英国)产生的上述抗体是功能等价物。本发明的还有一个目的是提供产生本文公开和要求保护的任意一种抗体的杂交瘤和或CHO细胞系。本发明进一步涉及本发明抗体的混合物，以及用单独的抗体或其混合物进行HIV-1感染的体外或体内检测、预防和或治疗。

Description

抗HIV-1的单克隆抗体及由它制备的疫苗

技术领域

本发明属于免疫学领域，特别涉及HIV-1感染的检测、预防和治疗以及AIDS治疗。更具体地说，它涉及单克隆抗体、由这些抗体制备的药物和疫苗以及在应用这些抗体的基础上形成的方法，用于分析和/或临床应用的药物及疫苗。

发明背景

在感染有I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的患者的血清中，在感染一段时间而没有任何明显的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的临床表现时，其血清中可检测到抗病毒的抗体。在主动免疫应答的这一阶段，在循环中预计可出现大量抗原特异性B细胞。这些B细胞可用作融合伙伴来生产抗HIV-1的人单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体按已知的方法制备，例如按RKennet等在《单克隆抗体和功能细胞系；进展及应用》(Plenum Press(纽约)，1984)中所描述的。

本发明中应用的其它材料和方法以已知的方法为依据，如病毒学杂志67：6642-6647，1993中所描述的。

本文所描述的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系CL1至CL6的存活样品保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)，公共卫生实验室设施(the Public Health Laboratory Service，PHLS)，应用微生物学和研究中心，Porton Down，Salisbury SP4 OJG，英国。根据保藏号对它们进行识别：

CL1-保藏号No.90091704(1990年9月17日保藏)；

CL2-保藏号No.93091517(1993年9月15日保藏)；

CL3-保藏号No.95032235(1995年3月22日保藏)；

CL4-保藏号No.95032236(1995年3月22日保藏)；

CL5-保藏号No.95032240(1995年3月22日保藏)；

CL6-保藏号No.95032241(1995年3月22日保藏)。

此后，当用缩写形式时，这些细胞系产生的相应单克隆抗体记作MAbCL1，MAb CL2至MAb CL6。

最近几年人们广泛应用单克隆抗体，尤其是人的单克隆抗体以增加对抗体中和HIV-1的认识，所述抗体是因HIV-1衍生的免疫原的免疫或患者的感染而产生的(病毒学杂志62：2107-2114，1988；免疫学76：515-534，1992；病毒学杂志，67：6642-6647，1993：US 5087557)，HIV-1在免疫学的压力下可迅速改变形状，逃避患者免疫系统释放的抗体或研究者开发利用的抗体的捕获，对此人们付出了许多努力来克服它的这一有害性能，其结果是目前市场上还没有用于主动或被动免疫的基于抗体的(或其它的)疫苗。

当发现HIV-1被膜糖蛋白gp160的小亚基gp41上的一个抗原决定簇(EP 570 357 A2)时就前进了显著的一步，该抗原决定簇与HIV-1分离物BH10的gp41位于662-667位的氨基酸序列“ELDKWA”一致作者报道中和HIV-1的人单克隆抗体与该抗原决定簇特异性结合该抗体被证明是对结合表位和其多样性进行生化分析的有力工具。gp41表位的高度保守状态的发现给找到适于更可靠地预防人类HIV-1感染和或更有效地治疗HIV-1感染的患者的疫苗组合物带来了希望

在WO，A，9507354中相同作者报告了另外一些经验和结果，它们来自用他们的与ELDKWA表位特异性结合的中和HIV-1的人类单克隆抗体所进行的实验，这一人类单克隆抗体被命名为2F5，保藏于PHLS，保藏号为90091704。特别是，当以一定的方式如产生肽ELDKWAS，LELDKWAS，和逃避突变株ELDNWAS，LELDNWAS，ELNKWAS和LELNKWAS等来延长相应的核苷酸序列时，它们能提高DNA整合到宿主基因组的稳定性以及ELDKWA肽的表达等。

EP 570 357 A2中所报道的结果激励着本发明的发明人增加他们研究的积极性，最终使他们得到本文公开的新的和创造性的发现。

EP 570 357 A2和许多其它的专利申请及科学出版物把注意力集中于结合gb41的中和抗体，但Ho等(病毒学杂志65：489-493，1991)报道了一命名为15e的人类单克隆抗体，该抗体与HIV-1多重分离物的被膜糖蛋白gp120具有反应性。他们还公开了从表位作图及与E.coli中产生的重组片段的结合性研究中获得的结果。从这些研究中得出这样的结论：15e表位是构象依赖性的，并且不同于先前识别的gp120功能结构域，这表明这一表位代表一个对中和HIV-1和结合CD4很重要的新位点

尽管在利用中和HIV-1的单克隆抗体这一领域中取得了有希望的结果，但是在这一途径中至少存在一个主要的缺陷。该缺陷在于广泛使用HIV-1分离物的实验室株，它已适应了实验条件，毒性或多或少都有所减弱，因此如果它有任何代表意义的话也只很少地代表HIV-1初级分离物的特性和行为。因此，当针对实验室HIV-1株产生的疫苗组合物用于对抗如感染者血液样品中的HIV-1初级分离物时通常无效(J.Cohen，科学，262：980-981，1993)。

第二个主要的缺陷过去是并且现在仍然是HIV-1病毒通过改变形态逃避抗体捕获的能力，这经常使研究者的异常努力几乎无效。这种逃避突变的特征在于靶抗原决定簇中的一个仅有一个或几个氨基酸改变，这可能是自发或诱发突变的结果。

发明概述

因此本发明公开了这样一些抗体，它们能克服现有技术的缺点，并且能用于生产给需要主动和/或被动免疫治疗的病人应用的疫苗。本发明还提供人类单克隆抗体，它们在功能上与上述由CL1至CL6中任何一种细胞系所产生的抗体相同。本发明还有一个目的是提供杂交瘤和/或CHO细胞系，它们产生本文公开和要求保护的任何一种抗体

本发明还涉及本发明的抗体的混合物，以及体外和体内应用单个抗体或其混合物预防和/或治疗HIV-1感染，和/或改进的检测HIV-1感染的方法。

细胞系CL1至CL4产生的单克隆抗体识别HIV被膜糖蛋白，尤其是gp160的特异性抗原决定簇。CL1至CL4抗体识别并结合gp41/gp160的一段氨基酸序列，该序列与HIV-1分离物BH10的gp41位于662至667(“ELDKWA”)位的表位一致(GenBank保藏号M15654；Swissprot数据库登记号为ENV$HIV10)。CL2和CL3的单克隆抗体与两个不同的抗原决定簇结合，更具体而言，是与gp120/gp160的片段结合，而该片段与分别位于HIV-1分离物BH10(GenBank保藏号M15654；Swissprot数据库登记号为ENV$HIV10)的加工过的gp120的79至184和326至400的表位序列一致。

尽管由CL1至CL4产生的独特型抗体是针对HIV-1病毒的体外和体内捕获和中和的，但由CL5和CL6所释放的抗独特型抗体却起着相反的作用，即它们模拟病毒，更具体而言，它们模拟HIV-1病毒的相应抗原决定簇。CL5和CL6的抗独特型抗体具有这样的性质，即它们如病毒自身一样，基本上在gp160的同一位置(抗原决定簇)与CL2的独特型抗体结合。

本发明一些实施方案的详述

当为了发现新的抗HIV-1抗体而进行实验时，发明人发现在体外能有效中和HIV-1的人单克隆抗体包括多种初级HIV-1分离物，如HIV-1初级分离物92RW009，92RW021，92UG037，92TH014，92BR030，N70-2，DJ259(全部从用于HIV-1分离和表征的WHO网络获得)，或WYG，WRF，WRB，WSC，WHW(从奥地利病人中分离到的)。

奇怪的是，已证明这些抗体识别并与HIV-1糖蛋白gp160的两个不同的抗原决定簇相结合。

此外，这些抗体所结合的靶体非常独特。用不同公司、研究所提供的41种不同HIV-1结合抗体组成的混合物进行对比试验，结果显示，混合物中没有一种其它抗体与上面确定出的抗体相竞争，例如与来源于CL2细胞系的人单克隆抗体竞争结合gp120/gp160的目的抗原片段，该片段与H1V-1分离物BH10的gp120的79至184和326至400的氨基酸序列一致。

另外，对感染HIV-1的患者的血清和血浆所进行的研究显示在所测验样品中不存在CL2型的抗体。这一发现又一次强调了这些中和HIV-1的人类单克隆抗体的独特性，同时表明，以合适的形式应用这些抗体对人类个体进行预防性和/或治疗性治疗，或许存在抵抗HIV-1感染的特别潜力。

本发明的另一个实施方案包括这样的CL2型抗体，已发现只有当抗原决定簇以糖基化形式存在时，它才与上述gp120/gp160的抗原决定簇结合；当该片段去糖基化时它们不与这些抗原性的糖肽片段结合，如通过肽-N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18；此后称作“PN Gase F”)的作用去糖基化的。

本发明的另一实施方案还包括这样的CL2型人类单克隆抗体，其特征还在于当衣霉素不存在时，它能与SF9昆虫细胞/杆状病毒表达系统中产生的gp120片段特异性结合，而当衣霉素存在时，则不与表达的gp120片段结合。已知衣霉素对糖蛋白生物合成中糖基转移酶的糖基化作用有抑制活性。

本发明人在体外实验中能成功地证实，在前面所讲的CL2型抗体中也存在这样的样品，它能抑制上述HIV-1初级分离物引起的人淋巴细胞感染。

本发明也涉及这样的CL2型抗体，它具有上述特性的一种或多种并且还具有与杂交瘤细胞系CL5和CL6的抗独特型单克隆抗体进行特异反应的特征，尽管它们能与CL5和CL6两种抗独特型抗体中的一个或另一个结合，但至少它们的一部分与由CL6产生的抗独特型huMAb结合，并且其结合方式可特异性封阻抗体抑制HIV-1初级分离物感染人淋巴细胞的能力。

在本发明的另一实施方案中，CL2型抗体包含的抗体至少有上述的一种特征或性质，此外已证明能够与杂交瘤细胞系CL2产生的抗体竞争gp120/160的抗原决定簇。因此这类抗体至少在功能上与CL2释放的抗体非常相近，并且可认为与它功能上等价。

本发明的另一实施方案是针对杂交瘤细胞系CL2所产生的最有益的人单克隆抗体。该抗体可用于例如HIV-1感染者的被动免疫，但用作生化工具来制备预防和/或治疗HIV-1感染的体内应用的疫苗或许更有益

本发明一个值得注意的实施方案包括利用重组的CHO细胞来产生CL2型抗体。成功地鉴定出这些抗体识别和结合的抗原决定簇后，发明人又成功地把各个遗传信息转化给CHO细胞，形成稳定的细胞系CL3，该细胞系能比杂交瘤细胞系CL2本身更有效地合成CL2型抗体

另一实施方案中，公开的抗独特型抗体能与CL2型的独特型抗体特异性结合，并且/或者与至少其中一些相互作用，其作用方式能消除它们的抗HIV保护能力，即能够阻碍它们抑制HIV-1初级分离物感染人类淋巴细胞。因此预计这种抗独特型抗体在构象上与HIV-1病毒相关，这样它们可能含有与病毒糖蛋白(如gp160)相似或一致的抗原片段。

下面实施方案中的抗体似乎很引人注意，因为它们是抗独特型类型且将它们所具有的上述实施方案中抗独特型抗体的特征与它们的性能联系在一起，施用给哺乳动物后，它们能诱导人或动物个体产生和释放抗HIV-1抗体。任选地，所诱导抗体具有这样的性质，即它们与前面任何一个相应实施方案中的至少一种CL2型抗体竞争与gp120/160的特异性抗原决定簇的结合。这组抗独特型抗体的特殊代表就是杂交瘤细胞系CL6产生的那种抗体。

前面实施方案中的抗独特型抗体可对实验动物或HIV-1受害者进行主动免疫，优选对尚未感染者进行主动免疫，主动免疫中所产生的抗体可用作疫苗的组分来进行被动免疫或用作研究对象来设计和/或合成或基因工程制备这类抗体，任选地，这些(独特型)抗体功能上与CL2型抗体等价，即它们与CL2型抗体竞争性结合gp120/gp160的特异性抗原决定簇。

在本发明的另一实施方案，也是最令人兴奋的一个实施方案中，人类单克隆抗体有很强的中和HIV-1的活性，并与gp160的小亚基(此后称作gp41/gp160)结合，。临床前研究证明，静脉内施用给人类HIV-1感染个体，可显著降低其血清和/或血浆中循环HIV-1的水平(见

实施例8和图6)。

此外，这些抗体中至少有一部分可被进一步表征为它们也与杂交瘤细胞系CL1产生的独特型抗体竞争性结合gp41/gp160抗原决定簇。最后，由细胞系CL1自身所产生的抗体可作为能降低HIV-1水平的抗体中的重要一员。

与用CHO细胞系CL3产生CL2型抗体的情况相似，本发明人又成功地克隆了重组CHO细胞系CL4，它产生的抗体与CL1的抗体竞争性结合gp41/gp160抗原决定簇，由此可认为多少与CL1抗体等价，这种重组CHO细胞系更易于生长，能更有效地用于相应抗体的制备。

各种体外实验已证明，CL2型抗体及CL1型抗体能中和各种不同的包括一些逃逸突变株(escape mutant)在内的实验室和初级HIV-1分离物，这通常是它们中的任何一种单独应用时产生的，这进一步显示，两种抗体类型均可产生交叉反应，即它们协同相互作用，使得它们中的每一种可捕获另一种抗体的HIV-1逃逸突变株。因此，它们的混合物是抵抗HIV-1感染和AIDS的强大工具。提供包括至少一种CL1型抗体和至少一种CL2型抗体的混合物是本发明的目的之一。

本发明也涉及产生前面所讲任何一种抗体的细胞系，尤其是如前所述由其保藏号识别的CL1-CL6。

本发明的另一实施方案提供了肽片段，它们包含至少一种gp41/gp160和gp120/gp160的抗原决定簇。希望这些肽片段具有这样的性质，即施用给哺乳动物(如动物或人类个体)之后，它们能对HIV-I感染诱导免疫应答，任选地产生和/或释放中和HIV-1的抗体。

在另一实施方案中，为了增强这些肽片段对免疫系统的抗原递呈作用，可把它们与合适的载体连接。这些载体可以在例如包括蛋白质在内的有机聚合物，也可应用任何其它适宜的和生理可接受性载体。为了增强对HIV-1病毒和/或感染细胞所产生的免疫应答，许多情况下把肽片段与修饰的，即减毒的和/或重组的病毒连接或许更有利，例如，与修饰的流感病毒或修饰的乙型肝炎病毒或与病毒的部分连接，如与病毒的糖蛋白，如流感病毒的血凝素或乙型肝炎病毒的表面抗原连接。

生产可靠的疫苗以抵抗HIV-1感染和/或在治疗过程中治疗已明显感染HIV-1的患者，这也是本发明的一个重要目标。在包括人类在内的高等动物的预防和治疗中，可用至少由CL2和CL1的独特型抗体中的一种形式的疫苗进行主动免疫。可提供有说服力的证据表明在临床前的研究的治疗过程中血清阳性患者的血浆和血清中HIV-1的水平降低(参见实施例8和图6)。细胞系CL1独特型抗体的预防能力也在给人留下深刻印象的SCID-小鼠试验及黑猩猩试验中被证实用活的HIV-1病毒攻击时，抗体处理过的小鼠和黑猩猩均没有形成HIV-1感染，而没有处理过的对照组中的动物则感染HIV-1。

应用至少一种前面所述的抗独特型抗体来生产用于主动免疫的疫苗可有助于成功地抵抗HIV-1感染。抗独特型抗体以及由它而来的药物和疫苗可初步用于HIV-1所危及人群的预防性治疗，最好在与HIV-1病毒接触前应用，由于它们具有独特的互补位特征，所以也可施用给已感染的患者以刺激其免疫系统释放相应的和更强劲的中和HIV-1的抗体。它们也可直接施用给人或至少与一种适宜的载体和/或本领域中通常应用的添加剂联合应用，和/或与其他药物一起应用但是抗独特型抗体也可为例如载有它们相应抗原决定簇(互补位)的融合蛋白的设计和构建充当“模型模板”。

许多情况下可优选单个抗体或至少两种不同的抗体组成的混合物与免疫血清和/或抗生素联合应用，以进一步增加相应制备的抗体疫苗的益处。

在其他情况中，至少用一种本文列举的gp41/gp160和gp120/gp160的抗原性肽片段代替相应疫苗和药物中的抗独特型抗体或许更有利。因此本发明也涉及到该肽片段以及它在制备药物和/或疫苗中的应用，而后者可对HIV-1危及者或感染者进行预防性和/或治疗性处理。该片段任选地用作融合蛋白，其中它们与适宜的载体连接，载体可以是重组的或减毒的病毒或是病毒的一部分，如流感病毒的血凝素或乙型肝炎病毒的表面抗原，或者是其它的能有效地把抗原性部位递呈给免疫系统的合适载体。但是该抗原片段也可直接在人类个体中用于预防和/或治疗HIV-1感染，所述人类个体如属于HIV-1高危人群之一者，包括从事HIV-1病毒研究的医学和科学工作者和/或感染者。

这里所指的独特型抗体还可用于检测和/或确定HIV-1感染的细胞和/或HIV-1病毒，也可用作单个抗体或用作抗体鸡尾酒。同样，一种或多种抗独特型抗体和/或上述的肽片段可成功地用于与病毒或HIV-1感染的细胞相结合的抗HIV-1抗体的检测和/或确定。因此，本发明的独特型和抗独特型抗体均可被制备并用于为分析试验方法和/或可商业应用的检测试剂盒。

最后，本发明还有一部分是，为需要治疗的HIV-1感染患者提供一种治疗方法，并提供一种方法使人免受HIV-1感染。有明显HIV-1感染的患者可用一种疫苗进行治疗，该疫苗包含至少一种CL2和CL1型独特型抗体，优选二者的混合物。但是，某些情况下为了诱导额外的(可能更强效的)抗体以中和病毒并降低感染患者血液中HIV-1水平，优选施用至少一种抗独特型抗体和/或抗原性肽片段。

在抗体和/或抗原性肽片段基础上形成的疫苗还包括适宜的(即生理可接受的)载体以及本领域中通常应用的添加物。施用给患者的剂量大约为1-10μg/kg体重，优选每天静脉内注射1次。病情不严重或长期治疗时剂量可降低到0.5-5μg/kg体重。根据感染的情况，治疗可在一定的时间间隔内重复进行，例如每天两到三次，或隔天或隔周。

本发明的疫苗可包括本文公开的任何一种独特型或抗独特型抗体或任何一种肽片段，它既可单独又可与适宜的载体结合和/或与载体分子连接。在某些情况下，如HIV-1急性感染和/或已发展到相当程度，这时可优选应用独特型抗体的混合物，而在其它情况下应用抗独特型抗体的混合物和/或优选应用与载体连接的gp160肽片段将更有利。建议施用抗体或载体连接的gp160肽片段的剂量为0.5-10μg/kg体重，每天施用1-3次，可在一定的时间间隔内重复施用，如以周、月或年的间隔，这取决于HIV-1感染的状态或对HIV感染个体治疗情况的估计。

附图简述

图1表明了杂交瘤细胞系CL2释放的人单克隆抗体与HIV-1gp160的糖蛋白亚基gp120的反应性；

图2表明了CL2抗体与糖基化和去糖基化形式的HIV-1 gp160的反应性；

图3表明了衣霉素存在或不存在时CL2抗体与重组gp120的反应性；

图4表明了p24抗原ELISA中，抗独特型抗体对CL2细胞系HIV-1中和抗体的阻滞效应；

图5按两种不同抗独特型抗体结合方式的特点，表明了在众多不同的抗HIV抗体中，CL2细胞系抗体的独特性；

图6表明人类患者体内施用细胞系CL1的抗体后，对HIV-1的中和效应。

为了能够更充分地理解本发明，下面给出了实施例。应该理解，这些实施例仅以说明为目的，而不应解释为在任何一方面对本发明进行限制。

实施例1(图1)：GST/HIV-gp120融合蛋白与细胞系CL2的抗体的反应性

由CL2制备的人单克隆抗体(此后称作MAb CL2)对HIV-1被膜糖蛋白gp120的结合特点：

将重叠的gp120片段融合到谷胱甘肽S-转移酶(GST)，用昆虫细胞/杆状病毒系统进行表达。用表达不同GST-gp120片段的重组杆状病毒克隆感染SF9细胞，首先用SF9的细胞溶解产物检测它们产生GST的水平。然后分析GST-gp120融合蛋白的溶解产物，以确定MAb CL2的结合亲合性。图中给出的Ab CL2的OD值与不同的rgp120片段相对应。预先用2μg/ml的谷胱甘肽铺微滴度板，然后加细胞溶解物培养1小时，之后与1μg/ml MAb CL2培养1小时，用辣根过氧化物酶结合的抗人IgG检测，这样可显示出与等量GST融合蛋白相对应的细胞溶解物的光密度。

如图1所示，GST融合蛋白包含的片段1与HIV-1的BH10分离物的gp120的氨基酸1-95相对应，片段2与gp120的氨基酸79-184相对应，片段3与氨基酸170-279，片段4与氨基酸264-354，片段5与氨基酸326-400，片段6与氨基酸384-481相对应。

实施例2(图2)：与去糖基化的gp160_HIV MN结合的抗体

N-去糖基化蛋白质样品(500ng重组gp160_HIV MN)在变性缓冲液(0.5％SDS，1％β-巯基乙醇)中煮沸10分钟，然后添加1/10体积的每种10×酶反应缓冲液和10％NP-40。反应混合物与2000U的PNGaseF(Boehringer Mannheim)在37℃培养12小时。在10-20％Tris/Glycin胶中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质印迹后，相同的膜与5μg/ml MAb CL2(A组)和5μg/ml MAb CL1(B组)培养作对照。

图2中泳道1-3显示：

泳道1：未处理的gp160_HIV MN；

泳道2：gp160_HIV MN，没有酶的情况下经PNGaseF处理；

泳道3：PNGase处理过的gp160_HIV MN；分子量标记以kDa为单位。

图2中可以看到，经PNGaseF的去糖基化作用后MAb CL2不与gp160结合(A组，泳道3)，而MAb CL1与经PNGaseF处理过的gp160结合(B组，泳道3)。

实施例3(图3)：衣霉素(TM)存在或不存在时重组GST/HIVgp120融合蛋白与MAb CL2和抗GST抗血清的反应性

用野生型杆状病毒或表达GST-gp120的重组杆状病毒感染SF9昆虫细胞，感染5小时后加入终浓度为5μg/ml的衣霉素。48小时后收集细胞并溶解之，用ELISA检测抗GST反应性和MAb CL2反应性把杆状病毒感染细胞的溶解物(从1×10⁷细胞/ml中获得)转移到预先铺有2μg/ml谷胱甘肽的微滴定板中，培养1.5小时。分别用GST-抗血清(稀释度1∶2000)或MAb 2G12(1.5μg/ml)和辣根过氧化物酶结合的抗鼠/抗人IgG检测GST融合蛋白或gp120。在492nm处测吸收值。

如图3中所能看到的，当衣霉素存在时，MAb CL2不与gp120融合蛋白结合，而抗GST却可以结合，尽管其水平较低，

实施例4：MAb CL2中和HIV-1初级分离物的能力

按Purtscher等(1994)所描述的用PBMC进行中和测定，方法是与系列抗体稀释液一起在37℃预培养病毒1小时，随后感染从HIV阴性供者血沉棕黄层细胞制备的经PHA刺激的新鲜PBMC。7-12天后估测中和能力，方法是比较抗体存在或不存在时由细胞产生的p24抗原的数量。

表1：用PBMC进行中和测定时MAb CL2中和能力的总结

初级分离物亚型分化单位中和能力

92RW009 A +++

92RW021 A +++

92UG037 A +++

92TH014 B +++

92BR030 B +++

N70-2 B +

DJ259 C +

WYG 未知 +++

WRF 未知 +++

WRB 未知 +++

WSC 未知 +

WHM 未知 +

注：+++ 浓度＜1μg/ml时的90％中和

++ 浓度为1-50μg/m1时的90％中和

+ 浓度＜50μg/ml时的50％中和

实施例5：(图4)合胞体抑制试验/抗独特型阻滞

进行抗独特型(A2)阻滞试验以表明抗独特型抗体A2是否通过与MAb CL2的中和互补位结合而阻滞其中和能力。抗独特型抗体不存在时MAb CL1和CL2的合胞体抑制浓度(EC₅₀)分别为2.0和8.8μg/ml(应用了HIV-1分离物RF)。抗独特型抗体加入到MAb CL2中表明，抗体M1A3和M4C12并不改变中和能力，但是当M1G1(＝CL6产生的抗独特型抗体)与MAb CL2共同培养时，可观察到明显的损伤(表2)。MAb CL1直接针对gp41的合胞体抑制能力并不被所测验的抗独特型抗体影响。抗独特型抗体以100μg/ml的浓度单独应用以及作为非中和对照应用MAb 3D6时没有观测到合胞体抑制。

表2：M1G1、M1A3或M4C12存在时，

MAb CL2和MAb CL1的EC₅₀

MAb	单独	加入的抗独特型(μg/ml)
		加入的抗独特型(μg/ml)			+M1G1(＝MAb CL6)	+M1A3(＝MAb CL5)	+M4C12
				100	+M1G1(＝MAb CL6)	+M1A3(＝MAb CL5)	+M4C12	100	100
MAb CL2	2.02			100	5.26	2.63	0.66	100	100
MAb CL2	2.02	MAb CL1	8.83	7.43	5.26	2.63	0.66	8.83	6.25

把抗独特型抗体在培养液中稀释为200μg/ml，把Mab CL2和CL1(作为对照抗体)稀释为10μg/ml。MAb CL2和CL1的起始浓度为100μg/ml，制备50μl的2倍稀释度的系列稀释液，每样4份。每孔加入50μl的抗独特型抗体(200μg/ml)，在37℃培养箱中预培养1小时。把HIV-1分离物RF稀释到大约10²-10³ TCID₅₀/ml作为病毒的接种物，每孔加入50μl的病毒悬液，37℃培养1小时后，每孔加入50μl的AA-2细胞悬液(10⁶细胞/ml；参见CHAFFEE等，1988，实验医学杂志，168：605-621)，然后37℃、5％ CO₂条件下培养细胞5天，随后显微镜下估算合胞体的形成。每孔中至少出现一个合胞体时没作HIV-1感染的指示，用Reed和Muench(1938)的方法计算50％有效浓度(EC₅₀)。

然后合并一次稀释的所有孔，以p24抗原ELISA的方式对p24进行定量测定，所得p24的值对应MAb浓度作图。其结果在图4中可见到，图4表明了在包含MAb CL2(图A)和MAb CL1(图B)及不同数量的抗独特型抗体的培养物中所产生的抗原p24。

实施例6(图6)：抗独特型抗体与不同的抗gp160抗体的反应性

一组人类抗gp160抗体和HIV-1阳性个体的合并血清(HIVIG)在M1G1(＝MAb CL6)和M1A3(＝MAb CL5)存在时，在铺有gp160的微滴度板上培养，以提高抗独特型抗体的反应性。图5中，图A和B表明M1G1和M1A3特异性结合MAb CL2。两种抗独特型抗体都仅与MAb CL2反应而不与其它被测验的人类抗体反应(MAb CL1和5F3和HIVIG是人类抗HIV-1抗体的代表性实施例)。

图5，图A和图B：用2μg/ml的gp160(Immuno AG，Vienna)覆盖96孔板。人类单克隆抗体样品的起始稀释在浓度大约为200ng/ml时开始，HIVIG预先以1∶100稀释。对人类抗体的8个稀释液进行2ⁿ稀释。M1G1和M1A3的浓度为1μg/ml。人和鼠的抗体稀释液被转移到测试板中并同时培养1小时。然后把过氧化物酶结合的羊抗鼠IgG加到板中，培养1小时后每孔加入染液；以620nm为参照，在492nm处读吸收值。

实施例7：用HIV-1分子克隆Cl82进行的免疫筛选试验

表3

筛选条件
筛选条件				MAb	μg/ml	出现的病毒	EC₅₀＞50μg/ml
MAb CL1	256.31.60.8	无无有有	++	MAb	μg/ml	出现的病毒	EC₅₀＞50μg/ml
MAb CL1	256.31.60.8	无无有有	++	MAb CL2	256.31.60.8	无有有ND	++
MAb CL2+CL2	25	无		MAb CL2	256.31.60.8	无有有ND	++

(混合物50/50)

6.31.60.80.4

无无1)2)

--

ND，未做

1)对MAb CL2的中和抗性；混合物和MAb CL1仍然中和

2)对MAb CL1的中和抗性；混合物和MAb CL2仍然中和

实施例8(图6)：用3剂MAb CL1治疗前后，在HIV-1感染个体血清样品培养物中p24的产生过程

血清与PHA刺激的、从健康、HIV阴性供者而来的PBMC共同培养培养上清液每周以1∶2更换2次。每周在培养物中添加新鲜的PHA刺激的PBMC。对培养物检测5周。

图6表明施用MAb CL1之前(三角形)患者血清样品培养物中合胞体形成增加，如在p24产物零水平的直线所显示的，施用MAb CL1后能有力中和患者HIV-1的感染。

实施例9：黑猩猩实验中HIV-1感染的体内预防

与Merck研究中心(West Point，Pennsylvania 19486，美国)协作，选择了四只黑猩猩来测验体内中和作用。

体内试验之前，先从每只黑猩猩分离出CD4⁺初级T细胞(PBMC’S)来测验对HIV初级分离物B类体外感染的受纳性。所有的体外试验中应用M.Purtscher等的常规方法，这在《Aids研究和人类逆转录病毒》Vol.10，Nr.12，1994，Mary Ann Liebert，Inc.，Publ.中有所描述。所有四只黑猩猩的CD4 PBMC均容纳病毒体外繁殖这表明体内也应该能成功地感染。

给两只黑猩猩输注单克隆抗体CL1(PHLS保藏号90091704)。将静脉内输注用的抗体施用给动物，其300ml溶液中含有大约1mg/ml，稳定在1％的人血清白蛋白中，pH值为7。另外二只动物仅用人血清白蛋白处理。

HIV-1初级分离物处理1天后，四只黑猩猩均接受攻击，静脉内注射3倍黑猩猩感染剂量的病毒。常规地对四只动物HIV-1的感染情况监测4个月。

结果：经抗体CL1处理的两只黑猩猩没有表现出HIV-1感染的症状；它们免受感染。两只对照动物即仅用人血清白蛋白处理过的动物均为HIV-1阳性。

实施例10：SCID小鼠试验中HIV-1感染的体内预防

另一个证明MAb CL1体内中和作用的实验与Transgene(Strasbourg，法国)合作进行，

把编码MAb CL1轻链和重链的基因提供给Transgene，利用基因工程的标准技术对小鼠成纤维细胞(3T3)进行基因操作。产生MAbCL1的转化的小鼠成纤维细胞在体外在GOREDEX^纤维上增殖，形成细胞团。然后把细胞团皮下供给SCID小鼠，这样在这些小鼠中可形成细胞器，它能以一定的方式把MAb CL1释放到血流中。

用人类的白细胞系统经常规方法对SCID小鼠进行重构，这样可建立适于HIV-1感染的动物模型。

MAb CL1抗体水平高于抗体2毫克的那些SCID小鼠对HIV-1IIIB的攻击有保护作用，而每ml血清中抗体水平较低的那些小鼠则表现出感染的显著延迟，经处理的及其它相似方式作用的血清中没有MAbCL1的SCID小鼠全部感染。

Claims

1.中和HIV-1的人类单克隆抗体，其特征在于它在体外与HIV-1gp120的两个不同的抗原决定簇结合。

2.权利要求1的抗体，其特征在于抗原决定簇是gp120的片段，并相当于HIV-1分离物BH10的加工过的gp120氨基酸序列79至184和326至400。

3.权利要求1或2的抗体，其特征在于它不与所述抗原决定簇的经PNGase F处理过的形式结合。

4.权利要求1或2的抗体，其特征在于当衣霉素不存在时，它与SF9昆虫细胞/杆状病毒表达系统中产生的gp120片段进行特异性结合，而衣霉素存在时则不结合。

5.权利要求1或2的抗体，其特征在于它能够在体外抑制HIV-1初级分离物感染人类淋巴细胞。

6.权利要求5的抗体，其特征在于它抑制HIV-1初级分离物感染人类淋巴细胞的能力能被细胞系CL6产生的单克隆抗体特异性阻滞，CL6保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英国，保藏号为95032241。

7.权利要求1或2的抗体，其特征在于它与细胞系CL5和CL6中的至少一种所产生的单克隆抗体特异性结合。

8.权利要求1或2的抗体，其特征在于它与杂交瘤细胞系CL2产生的抗体竞争与所述抗原决定簇的结合，CL2保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英国，保藏号为93091517。

9.权利要求1或2的抗体，其特征在于它是由杂交瘤细胞系CL2产生的，CL2保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英国，保藏号为93091517。

10.权利要求1或2的抗体，其特征在于它是由重组的CHO细胞系CL3产生的，CL3保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英国，保藏号为95032235。

11.一种单克隆抗体，其特征在于它在体外特异性结合于与HIV-1gp120的两个不同的抗原决定簇结合的中和HIV-1的人类单克隆抗体，并且/或者在体外阻遏与HIV-1 gp120的两个不同的抗原决定簇结合的中和HIV-1的人类单克隆抗体抑制HIV-1初级分离物对人类淋巴细胞的感染。

12.权利要求11的抗体，其特征在于当施用给动物或人类个体之后，它能诱导中和HIV-1的抗体，而该抗体任选地与结合于HIV-1 gp120的两个不同的抗原决定簇的中和HIV-1的人类单克隆抗体竞争与所述HIV-1的抗原决定簇的结合。

13.权利要求11或12的抗体，其特征在于它由杂交瘤细胞系CL6产生，CL6保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英国，保藏号为95032241。

14.权利要求11的抗体，其特征在于它由杂交瘤细胞系CL5产生，CL5保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英国，保藏号为95032240。

15.用权利要求11的抗体对动物或人类个体进行主动免疫时诱导产生的一种抗体，它任选地与结合于HIV-1 gp120的两个不同的抗原决定簇的中和HIV-1的单克隆抗体竞争与HIV-1的抗原决定簇的结合。

16.一种中和HIV-1的人类单克隆抗体的混合物，其特征在于它包含权利要求1的至少一种抗体或权利要求15的至少一种抗体，以及细胞系CL1或CL4产生的至少一种抗体，CL1保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英国，保藏号为90091704，CL4保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英国，保藏号为95032236。

17.权利要求16的混合物，其特征在于它可在体外防止HIV-1突变株的逃选，所述逃逸通常是由单独应用混合物的任何一种所述抗体引起的。

18.一种产生单克隆抗体的细胞系，其特征在于它能产生权利要求1的单克隆抗体。

19.一种产生单克隆抗体的细胞系，其特征在于它能产生权利要求11的单克隆抗体。

20.一种产生单克隆抗体的细胞系，它选自细胞系CL2、CL3、CL5、CL6，它们均保藏于PHLS Porton Down，Salisbury，英国。

21.一种肽片段，它包含至少一种抗原决定簇，所述抗原决定簇为gp120的片段，并且相当于HIV-1分离物BH10的加工过的gp120氨基酸序列79至184和326至400。

22.权利要求21的肽片段，其特征在于施用给动物或人类个体之后，它能诱导针对HIV-1的免疫应答，任选地诱导中和HIV-1的抗体的释放。

23.权利要求21或22的肽片段，其特征在于它与适宜的载体连接以形成融合蛋白。

24.权利要求23的肽片段，其特征在于载体是病毒或病毒的一部分，任选地是流感病毒的血凝素或乙型肝炎病毒的表面抗原。

25.一种预防和/或治疗HIV-1感染的疫苗，其特征在于它包含至少一种权利要求11的抗体，和/或至少一种权利要求21的肽片段，并且任选地包含至少一种适宜的载体和/或其它的添加物。

26.权利要求25的疫苗，其特征在于它包含适宜施用0.5至10μg/kg体重的剂量的抗体和/或肽片段。

27.至少一种权利要求1的单克隆抗体在制备用于体内预防和/或治疗HIV-1感染的药物组合物中的应用。

28.至少一种权利要求15的单克隆抗体在制备用于体内预防和/或治疗HIV-1感染的药物组合物中的应用。

29.权利要求27的应用，其中至少一种抗体在混合物中与常规的免疫血清和/或抗生素一起应用。

30.权利要求27的应用，其中至少应用了至少两种不同的抗体。

31.至少一种权利要求1的抗体在检测和/或确定人血液和/或血清样品中HIV-1感染和/或感染的细胞中的应用。

32.至少一种权利要求15的抗体在检测和/或确定人血液和/或血清样品中HIV-1感染和/或感染的细胞中的应用。

33.至少一种权利要求11的抗体在检测和/或确定离体生物样品中的抗HIV-1抗体中的应用

34.至少一种权利要求21的肽片段在检测和/或确定离体生物样品中的抗HIV-1抗体中的应用。

35.至少一种权利要求21的肽片段在制备抗HIV-1感染的用于人类个体主动免疫的疫苗中的应用。

36.一种用于预防和/或治疗HIV-1感染的药物组合物，其特征在于它包含权利要求16中限定的中和HIV-1的人类单克隆抗体的混合物。