CN119192311A - BnaGSTU11基因在调控甘蓝型油菜菌核病抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

BnaGSTU11基因在调控甘蓝型油菜菌核病抗性中的应用，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明从甘蓝型油菜中分离克隆了一种编码谷胱甘肽硫转移酶的基因BnaGSTU11，上述基因编码的蛋白酶可以通过清除活性氧和自由基的方式，增强甘蓝型油菜菌核病抗性。抗菌核病性基因BnaGSTU11的发现，为培育抗菌核病的油菜新种质提供了新的遗传资源，也为其他作物菌核病抗性基因的挖掘提供了新的思路。

Description

BnaGSTU11基因在调控甘蓝型油菜菌核病抗性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及BnaGSTU11基因在调控甘蓝型油菜菌核病抗性中的应用。

背景技术

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是世界上最重要的油料作物之一，属于十字花科芸苔属的一员。其不仅是食用油的主要来源，在化工和能源方面也有举足轻重的作用。

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种典型的死体营养性病原菌，菌核病是由核盘菌引起的，宿主无特异性，侵染包含油菜在内的400多种植物，且主要是草本植物(Boland,G.J.R.Hall,Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum.CanadianJournal of Plant Pathology,1994.16(2):p.93-108.)。空气传播的子囊孢子是导致菌核病发病的关键(Clarkson,J.P.,L.Fawcett,S.G.AnthonyC.Young,A model forSclerotinia sclerotioruminfection and disease development in lettuce,based onthe effects of temperature,relative humidity and ascospore density.PLoS ONE,2014.9(4):p.e94049.)，核盘菌的子囊孢子主要附着点为油菜花瓣，而花瓣作为次级介质介导核盘菌入侵油菜的其他组织，通过产生草酸和细胞壁降解酶引发细胞受损，引发严重的菌核病(Hegedus,D.D.S.R.Rimmer,Sclerotinia sclerotiorum:when"to be or not tobe"a pathogen？FEMS Microbiol Lett,2005.251(2):p.177-84.)。而菌核病对油菜极具破坏性，严重影响油菜籽的产量和品质。

在植物生长发育过程中，需要不断适应外界环境的变化，当外界环境的改变对植物生长造成威胁时，植物会启动适当的信号级联反应，激活体内的防御反应机制，进而保护自身免受损伤。GSTs表达的增强可以被认为是一种应激反应准备的标志物(Moreira,D.C.,D.P.PaulaM.Hermes-Lima,Changes in metabolism and antioxidant systems duringtropical diapause in the sunflower caterpillar Chlosyne lacinia(Lepidoptera:Nymphalidae).Insect Biochemistry and Molecular Biology,2021.134.)。其中，GSTU基因特异地存在于植物体内。研究表明，GSTU广泛参与植物对逆境的响应。同时，GSTU也在其他植物中响应植物抗逆抗病反应。在小麦中，TaGSTU6能增强小麦对白粉的耐受性(Wang,Q.,J.Guo,P.Jin,M.Guo,J.Guo,P.Cheng,Q.LiB.Wang,GlutathioneS-transferaseinteractions enhance wheat resistance to powdery mildew but not wheat striperust.Plant Physiology,2022.190(2):p.1418-1439.)，在木薯(Manihot esculentacrantz)中，转录因子MeLSD3可以和核因子YC15、YA2/4，YB18形成复合物，激活下游MeGSTU37和MeGSTU39的表达，增强了木薯对氧化胁迫的耐受性(Zeng,H.,H.Xu,H.Wang,H.Chen,G.Wang,Y.Bai,Y.WeiH.Shi,LSD3 mediates the oxidative stress responsethrough fine-tuning APX2 activity and the NF-YC15-GSTs module in cassava.ThePlant Journal,2022.110(5):p.1447-1461.)

目前，BnaGSTU11在甘蓝型油菜中抗菌核病的功能还未有文献和专利的报道。研究发现，对油菜进行核盘菌接菌处理之后，BnaGSTU11的表达量显著提高，过表达BnaGSTU11的转基因甘蓝型油菜的菌核病抗性显著增强。传统的育种手段能够有效获得抗菌核病油菜，但是周期较长。利用转基因技术提高甘蓝型油菜内源基因BnaGSTU11的表达，增强甘蓝型油菜菌核病的抗性和提高产量，从而获得抗菌核病油菜新种质具有光明的前景。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供BnaGSTU11基因在调控甘蓝型油菜菌核病抗性中的应用，通过在甘蓝型油菜中过表达BnaGSTU11，可以提高甘蓝型油菜对菌核病的抗性，为创制油菜抗菌核病的新种质提供遗传资源。

技术方案：一种甘蓝型油菜蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

编码所述甘蓝型油菜蛋白的核酸分子，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

含有上述核酸序列的表达载体。

上述表达载体为质粒、噬菌体或病毒。

含有上述表达载体的宿主细胞。

上述宿主细胞为大肠杆菌、酵母或植物细胞。

上述甘蓝型油菜蛋白在调控甘蓝型油菜菌核病抗性中的应用。

一种编码所述甘蓝型油菜蛋白的基因序列的突变体，该突变体基因编码的蛋白具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少80％的序列同源性，并且保留了调控甘蓝型油菜菌核病功能。

一种提高甘蓝型油菜抗菌核病的方法，包含将上述核酸分子转入甘蓝型油菜中过表达。

具体步骤如下：(1)从Darmor中克隆SEQ ID NO:1所示的DNA片段，将其连接过表达载体中形成重组表达载体；(2)利用电击法将带有重组表达载体的质粒转化农杆菌GV3101；将带有重组载体质粒的农杆菌通过农杆菌转化法转化甘蓝型油菜，获得转基因植株。

有益效果：(1)本发明从甘蓝型油菜中分离克隆了一种编码谷胱甘肽硫转移酶的基因BnaGSTU11，上述基因编码的蛋白酶可以通过清除活性氧和自由基的方式，增强甘蓝型油菜菌核病抗性。抗菌核病性基因BnaGSTU11的发现，为培育抗菌核病的油菜新种质提供了新的遗传资源，也为其他作物菌核病抗性基因的挖掘提供了新的思路。(2)将含有上述基因编码序列的重组过表达载体通过电击法转化根癌农杆菌GV3101。(3)将含有上述基因编码序列的重组过表达载体的农杆菌通过农杆菌侵染法转化甘蓝型油菜，获得BnaGSTU11过量表达的株系，与非转基因株系相比，过表达BnaGSTU11能够增强甘蓝型油菜对菌核病的抗性，为BnaGSTU11基因的抗病功能研究提供了原材料。(4)本发明通过BnaGSTU11过量表达株系在抗菌核病方面的一系列研究，充分证明了BnaGSTU11参与了甘蓝型油菜的菌核病抗性，阐明了BnaGSTU11在甘蓝型油菜的抗病过程中具有重要的生物学意义。(5)甘蓝型油菜菌核病抗性基因的挖掘一直是油菜科研工作者的研究重点。BnaGSTU11这一抗性基因的开发和利用，将极大的推进甘蓝型油菜菌核病抗性方面的研究，同时也为挖掘其他作物的核盘菌抗性基因，探讨抗核盘菌分子机理提供了理论指导。

附图说明

为了更清楚的说明本发明中的具体实施方案和技术方案。下面对具体实施方案做简单的介绍。

序列表SEQ ID NO:1是油菜Darmor中BnaGSTU11的基因编码序列；

序列表SEQ ID NO:2是从油菜Darmor中克隆得到的BnaGSTU11氨基酸序列；

图1BnaGSTU11(BnaCnng49200D)在核盘菌接菌0h、3h、6h、9h、12h后表达量变化；

图2BnaGSTU11过量表达载体构建示意图；

图3农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化示意图；

图4BnaGSTU11过量表达植株中BnaGSTU11的表达情况，图中J9712为野生型对照，其他均为BnaGSTU11转基因过表达株系；

图5T₁代甘蓝型油菜转基因过表达株系真叶接菌图。BnaGSTU11过量表达转基因甘蓝型油菜的核盘菌抗性表型鉴定，图中J9712为野生型对照，其他均为BnaGSTU11过表达转基因株系。

图6T₁代甘蓝型油菜转基因过表达株系真叶接菌病斑面积统计。

具体实施方案

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，现详细说明本发明的具体实施方案。该详细说明不应理解为对本发明的限制，而应理解对本发明的技术层面更为清晰、完整和详细的阐述。在不违背本发明范围和精神的情况下，本领域的技术人员可对本发明的具体实施方案做出改进以便多重运用。本领域的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施例均在本发明的保护范围内。

实施例1、qRT-PCR分析BnaGSTU11在核盘菌接菌前后表达情况

(1)甘蓝型油菜J9712叶片接菌处理

取四叶一心生长时期的甘蓝型油菜J9712叶片进行核盘菌的接菌处理，处理前对植株进行正常照顾，避免植株受到其他胁迫。在接菌0h，3h，6h，9h，12h后采样。

(2)甘蓝型油菜总RNA的提取

利用RNA isolater Total RNA Extraction Reagent(南京诺唯赞生物技术有限公司提供)试剂抽提步骤(1)中的核盘菌处理0h，3h，6h，9h，12h后叶片的总RNA。

(3)实时定量PCR

反转录试剂使用HiScript IIQ Select RT Super Mix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒(南京诺唯赞生物技术有限公司提供)，荧光定量试剂使用2×Q3 SYBR qPCR Mastermix(Universal)(扬州擎科生物科技有限公司提供)。利用油菜看家基因BnaActin7和BnaUBC9作为内参：

BnaActin7-F:AAGTACTCTTCCAGCCGTCGC；

BnaActin7-R:ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG；

BnaUBQ9-F:TCCATCCGACAGCCCTTACTCT；

BnaUBQ9-R:ACACTTTGGTCCTAAAAGCCACC；

BnaGSTU11引物序列为：

GSTU11-qPCR-F:CCATCCTTCCCTCAGACCCA；

GSTU11-qPCR-R:CTTTTGCTACCGCCACTCCA；

该对引物是针对BnaGSTU11的编码序列设计的荧光定量PCR特异性引物。荧光定量反应体系为10μL：含有SYBR Mix 5μL，正反向引物(10μmol/L)各0.2μL,ddH₂O 2.6μL和模板cDNA 2μL。扩增条件为95℃30sec，循环反应：95℃10sec，60℃30sec，共40个循环。溶解曲线：采用仪器默认溶解曲线采集程序。每个样品至少三个技术重复，反应结束后，计算获得BnaGSTU11在核盘菌接菌前后的动态表达变化。如图1所示。

实施例2：BnaGSTU11编码序列的分离和克隆

(1)RNA提取和cDNA的合成

以甘蓝型油菜中Darmor为实验材料，生长条件为22±2℃，湿度为70％，光周期为光照16h，黑暗8h。油菜叶片总RNA的提取参照RNA isolater Total RNA ExtractionReagent(南京诺唯赞生物技术有限公司提供)试剂说明书进行。cDNA的合成采用HiScriptⅢ1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒(南京诺唯赞生物技术有限公司提供)。利用油菜基因组数据库BnTIR(http://yanglab.hzau.edu.cn/BnTIR/)对BnaGSTU11编码序列进行搜索，设计引物：

GSTU11-1-F:AACCAGCCAAAAGTGTAATGGG；

GSTU11-1-R:GTCCGTGCCTTTAAATTAGCCG；

以甘蓝型油菜Darmor的cDNA为模板，利用高保真酶进行PCR扩增。PCR扩增条件为：95℃3min，95℃15sec，58℃15sec，72℃1min，共35个循环，72℃5min，25℃5min，PCR反应结束后，对反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收单一条带的琼脂糖凝胶。

(2)连接

目的片段的回收参照扬州万禾生物科技有限公司提供的胶回收试剂盒操作。目的片段与5min TA/Blunt-Zero Cloning Kit的TA克隆载体(南京诺唯赞生物技术有限公司提供)的连接体系为：4.5μL目的片段。0.5μL TA克隆载体在25℃连接30min。通过热激法将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，菌液离心后涂布于含有1000mg/L的kana抗生素的LB固体培养基上，在37℃培养箱中培养12-16h后挑取单克隆进行菌液PCR，将阳性克隆菌液送至扬州擎科生物科技有限公司测序，并将测序正确的菌液命名BnaGSTU11-CDS。

实施例3：过表达BnaGSTU11转基因植株的获得

(1)BnaGSTU11过量表达载体的构建

在克隆扩增引物两端分别加上酶切位点(SpeI和AscI)和同源臂，将该引物命名为：GSTU11-PMDC83-F:AGGACCTCGACTCTAGAACTAGTATGGGTCTAATCAGTGAAG；

GSTU11-PMDC83-R:GGCCCCCCCTCGAGGCGCGCCTCATTTAAAGATTGAAG。

通过PCR扩增的方法，获得含有酶切位点和同源臂的BnaGSTU11的CDS序列。对pMDC83空载体进行双酶切，利用胶回收试剂盒(扬州万禾生物科技有限公司提供)对上述二者进行切胶回收，胶回收的pMDC83空载体及含有酶切位点和同源臂的BnaGSTU11的cDNA片段利用Clone Express IIOne Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物技术有限公司提供)试剂进行连接，转化大肠杆菌后涂板，于37℃培养箱中培养12-16h，挑取单克隆进行菌液PCR，将获得的阳性克隆送至扬州擎科生物科技有限公司测序，将测序成功的菌液命名为pMDC83-BnaGSTU11。

(2)油菜的遗传转化

甘蓝型油菜的遗传转化方法在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的转化方法的基础上稍作改进。通过下胚轴侵染法，通过将含有重组载体pMDC83-BnaGSTU11的质粒转化农杆菌GV3101，以甘蓝型油菜J9712的下胚轴为受体进行农杆菌侵染，通过筛选和分化，获得转基因植株。具体步骤如下:

(a)通过电击法，将含有重组载体pMDC83-BnaGSTU11的质粒转入根癌农杆菌GV3101中。具体步骤为：取100μL的农杆菌感受态，加入1.5 -2.5μL的重组质粒，将二者混匀后加入电转杯中，将电转杯加帽后放入电转仪中电转，电转结束后立即加入500μL的无抗性LB液体培养基对农杆菌进行培养，吹洗均匀，吸取混合菌液30-50μL涂于含有kana和Rif抗生素的LB固体培养基上。将培养基放入28℃的培养箱中培养36-48h，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，按照1:1的比例向阳性菌液加入50％的甘油进行保菌，-80℃超低温保存，用于后续的遗传转化。

(b)种子的灭菌

75％酒精浸泡甘蓝型油菜J9712种子1min；2％ NaClO消毒种子，15min；灭菌的ddH₂O冲洗种子4-5遍。

(c)播种

用灼烧灭菌后的镊子将灭过菌的种子铺到M₀培养基中，24℃黑暗培养4-5天。

(d)活化农杆菌

于28℃，250rpm摇床中震荡培养20h-24h至含有重组载体的农杆菌，直至其OD₆₀₀达到0.8。

(e)外植体的获得和农杆菌侵染

用灼烧灭菌的无菌镊子和解剖刀切取播种4-5天的幼苗下胚轴，每个切段长度为1.0～1.5cm。取2mL菌液，6000rpm，离心5min后，加入2mL的DM溶液重悬沉淀，重复离心一次，最后再加入2mL的DM重悬沉淀之后倒入含18mL的DM的大平皿中(即稀释10倍)，随即加入20μL(即1：1000的比例)的AS激素摇匀，配置成侵染液。侵染时间通常为10～15min。侵染结束后，用镊子将外植体放置铺有2层滤纸的平皿中，晾干10min。晾干后将其摆放在M₁培养基上。倒置黑暗培养36-48h。

(f)外植体的分化和生根

M₁培养基上培养36-48h之后将外植体转移到M₂培养基上培养20天，恢复正长光周期处理。20天后，选取M₂上愈伤组织膨大的外植体转移到M₃培养基上，重复2-3次M₃迭代，直至外植体上长出绿芽。当M₃上长出绿芽的外植体发现明显生长点后，用解剖刀将幼苗小心翼翼的切下，将再生小苗转移至M₄培养基上进行生根处理。2-4周后可将形成的组培苗转移至土壤中进行土培。示意图见图3。

各培养基配方(以1L培养基为例)：

实施例4：过表达BnaGSTU11转基因植株的阳性鉴定

(1)转基因植株DNA的提取

当转基因植株转移到土培一周后，可对其进行阳性鉴定。采用的是常规的快速提取植物DNA的方法，具体步骤为：

(a)采取油菜叶片组织2-3g，置于2.0EP管中，然后加入冷却后的灼烧灭菌后的钢珠和500μL的Buffer(以1L培养基为例：60.5g Tris-base+适量纯水，用浓盐酸调pH至7.5，随后加入17.5g NaCl和102.69g蔗糖)；

(b)将样品置于打样机中碾磨210sec；

(c)将碾磨后的样品沸水浴10min，随后12000rpm离心5min；

(d)吸取样品上清液50μL作为DNA原液，将原液稀释到100ng/μL后作为DNA模板浓度。

(2)阳性转基因植株检测

吸取1μL稀释过后的DNA作为模板，用PCR扩增的方式对其植株进行阳性鉴定。所用引物为：

GSTU11-pMDC83-F:AGGACCTCGACTCTAGAACTAGTATGGGTCTAATCAGTGAAG；

pMDC83-GFP-R:CATCACCTTCACCCTCTCCAC。

阴性对照为非转基因野生型油菜DNA，阳性对照为含有重组载体的质粒。PCR扩增结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现特异性的目标条带，判断甘蓝型油菜基因组中是否成功导入pMDC83-BnaGSTU11。

实施例5：过表达BnaGSTU11使转基因甘蓝型油菜菌核病病斑面积减少

过表达BnaGSTU11转基因油菜的qPCR鉴定

为了鉴定BnaGSTU11是否在油菜中过量表达，采用qPCR的方法对实施例3中鉴定的阳性植株繁种后的T₁代株系进行分析，对照组为野生型油菜J9712。所用引物序列为：

GSTU11-qPCR-F：CCATCCTTCCCTCAGACCCA；

GSTU11-qPCR-R：CTTTTGCTACCGCCACTCCA。

qPCR结果显示，BnaGSTU11过表达株系的表达量均高于野生型对照组。见图4。取T₁代的过表达BnaGSTU11转基因植株油菜的各株系的叶片进行离体叶片接菌，对其进行核盘菌抗性表型鉴定，对照组为野生型油菜J9712。实验结果显示，BnaGSTU11过表达株系的病斑面积明显小于对照组J9712，过表达BnaGSTU11能增强甘蓝型油菜菌核病的抗性。见图5和图6。

由此可知，BnaGSTU11能够有效提高甘蓝型油菜菌核病的抗性，对提高甘蓝型油菜的产量和品质具有深刻的影响。同时也为挖掘其他作物菌核病抗性基因提供了理论指导。

以上实施方案是对本发明的优选实施方案进行描述，并非对本发明进行限定。在不脱离本发明的精神或范围的前提下，相关技术人员对本发明进行的技术改进和同等替代，均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甘蓝型油菜蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.编码权利要求1所述甘蓝型油菜蛋白的核酸分子，其特征在于，其核酸序列如SEQ IDNO:1所示。

3.含有权利要求2所述核酸序列的表达载体。

4.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒、噬菌体或病毒。

5.含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母或植物细胞。

7.权利要求1所述甘蓝型油菜蛋白在调控甘蓝型油菜菌核病抗性中的应用。

8.一种编码权利要求1所述甘蓝型油菜蛋白的基因序列的突变体，其特征在于，该突变体基因编码的蛋白具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少80%的序列同源性，并且保留了调控甘蓝型油菜菌核病功能。

9.一种提高甘蓝型油菜抗菌核病的方法，其特征在于，包含将权利要求2所述核酸分子转入甘蓝型油菜中过表达。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤如下：（1）从Darmor中克隆SEQ IDNO:1所示的DNA片段，将其连接过表达载体中形成重组表达载体；（2）利用电击法将带有重组表达载体的质粒转化农杆菌GV3101；将带有重组载体质粒的农杆菌通过农杆菌转化法转化甘蓝型油菜，获得转基因植株。