CN119176877B - 一种靶向b细胞cd20的纳米抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于生物技术领域，公开了一种靶向B细胞CD20的纳米抗体及其应用。纳米抗体互补决定区域CDR1～CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1～9。本发明提供的纳米抗体可以特异性结合人血液中的B细胞，从而清除产生病理性抗体的B细胞。本发明提供的纳米抗体，与传统抗体相比，具有更小的分子量，稳定性强，成本低，易于表达且表达量高，适用于大规模生产。本发明将纳米抗体与固相载体相结合，可以靶向清除血液中的B细胞，在较短时间内减少病人血液中B细胞数量，降低抗体水平，从而改善生活质量，减少并发症，为那些对传统治疗无效或不耐受的患者提供了新的治疗选择。

Description

一种靶向B细胞CD20的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向B细胞CD20的纳米抗体及其应用。

背景技术

B细胞是免疫系统的重要淋巴细胞，恶性肿瘤、自身免疫性疾病、淋巴瘤和白血病是常见的B细胞相关疾病，这些疾病的发病机制与B细胞过度活化产生大量自身抗体相关。因此，以B淋巴细胞表面分子为靶点的B淋巴靶向治疗得到了近年来广泛的关注和研究。B淋巴细胞清除策略是利用抗体药物靶向结合B细胞亚群的特定抗原，通过抗体依赖介导的细胞毒性作用或补体，或通过靶向B细胞存活需要的细胞因子，如B细胞激活因子（-cellactivation factor, BAFF）诱导B细胞凋亡，达到清除B细胞的目的。B细胞清除主要的靶点是CD20，CD19和BAFF，用于治疗自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮，多发性硬化症。

CD20是一种在B细胞表面表达的非糖基化蛋白，主要由B细胞开始表达，初始B细胞增殖活化至浆细胞的过程表达下调，在终末分化的浆母细胞和浆细胞中失去表达。CD20在B细胞的表达具有特异性，且在单核细胞及粒细胞，大部分T细胞和其他组织细胞不表达。靶向CD20的药物可通过阻断向浆细胞分化发育，以降低产生自身免疫性抗体的浆细胞水平，同时保留B细胞前体，幼稚B细胞和长寿浆细胞的再生库。

目前以CD20单克隆抗体为代表的B淋巴稀薄清除治疗是目前较为成熟的方案，如Rituximab(利妥昔)、Ocrelizumab、Ofatumumab。除了B细胞清除，还有针对B细胞生长因子（BAFF）的中和药物，包括GAFF中和抗体（如Belimumab，贝利单抗）。Rituximab是一种嵌合型抗CD20单克隆抗体(chimeric anti-CD20 mAb)，由人类IgG1和鼠源可变区组成。它能够特异性地结合到B细胞表面的CD20抗原上，并诱导B细胞凋亡(自我毁灭)来破坏B细胞功能。Rituximab主要用于治疗某些类型的癌症和自身免疫性疾病，如非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、类风湿性关节炎等。由于其嵌合型结构，Rituximab相对于鼠源抗体具有更好的免疫原性和耐受性。

然而研究表明，长期服用Rituximab，可能导致免疫系统的暂时性抑制，增加感染的风险，部分患者可能对单抗或其成分产生过敏反应，表现为皮疹、呼吸困难等症状，并且导致血细胞（如白细胞、红细胞和血小板）计数降低，这可能会影响患者的健康和恢复能力

纳米抗体是从骆驼科动物（如骆驼、羊驼和骆马）中提取的一种特殊类型的抗体，其大小仅为常规抗体的十分之一。这使得它们能够更容易地穿透组织，到达常规抗体无法到达的地方。纳米抗体具有极高的热稳定性和化学稳定性，使其在各种恶劣环境下都能保持活性。由于纳米抗体的结构简单，因此可以很容易地进行基因工程改造，以产生具有特定功能的抗体。此外，纳米抗体也可以通过细菌、酵母等微生物进行大规模生产，大大降低了生产成本。纳米抗体可以同时识别多个抗原表位，这使得它们在诊断和治疗多种疾病方面具有很大的潜力。纳米抗体由于其独特的结构和性质，使其在靶向药物输送、免疫诊断、肿瘤治疗等方面显示出高效的性能。纳米抗体已经被广泛应用于医学、生物技术、农业等领域，包括疾病的早期诊断、治疗，以及作为研究工具等。开发靶向B细胞的纳米抗体，对于B细胞相关疾病的治疗和研究，具有至关重要的意义。

血液净化是一项至关重要的医疗技术，它通过从血液中去除有害物质来治疗多种疾病和中毒状况。通过使用特定的吸附剂，如免疫吸附剂，可以针对性地吸附特定的致病因子，例如自身抗体或炎症介质。免疫吸附是一种技术，它利用特定的抗原、抗体或具有独特理化亲和力的配体与吸附介质结合，形成选择性或特异性的吸附柱。当与药物治疗结合使用时，免疫吸附能显著提高患者对药物的反应性，从而增强药物效果，减少副作用，缩短治疗时间，并降低疾病复发的风险。通过将靶向B细胞的抗体将与固相载体相结合，可以特异性结合人血液中的B细胞，从而清除产生病理性抗体的B细胞。吸附效率高，吸附性能稳定，靶向清除B细胞，非特异性吸附量低，特异性好，在临床治疗上安全性能好，经济效益高。可能成为B细胞相关疾病的治疗的新途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种靶向B细胞CD20的纳米抗体及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

第一个方面，本发明提供一种靶向B细胞CD20的纳米抗体，包括框架区域和互补决定区域，所述纳米抗体互补决定区域CDR1～CDR3的氨基酸序列选自以下组合中的任意一种：

组合1，其CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；

组合2，其CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示；

组合3，其CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9所示。

在一些实例中，其为嵌合抗体、人源化抗体、融合Fc片段的纳米抗体。

在一些实例中，所述纳米抗体氨基酸序列的选自以下选自以下组合中的任意一种：

CA05：

QVQLVESGGGPVQSGGSLRLSCAGSRNIYSPYSMGDYGLSWFRQAPGEEREGVALIDRDDSTFYADSV KGRFTISQDDAKTNLFLQMNSLKPEDSAMYYCAAAAKPKEHGLFDSWGQGTQVTVSS；

CB01：

QVQLQESGGGPVQAGDSLRLSCAASGNIYSGNIYSRHSMGWFRQVPGKEREGVAINRDDSSRFTLSQDDAKTNLFLQMNSLKPTDTAYYCAAGWMATLAWSDWFRGRGTQVTVSS；

CD09：

QVQLQESGGGPVQSGGSLRLSCAASRNIYSRPYMAWFRQAPGKEREGVATSSTFGSTVYADSVKGRFTISRDDAKTNLFLQMNSLKPEDSAMYYCAAGFDYLSPSDYGYWGQGTQVTVSS。

上述序列中，下划线标记的部分为CDR区，未标记的部分为FR区。

在一些纳米抗体的实例中，其为嵌合抗体、人源化抗体、融合Fc片段的纳米抗体。

通过引入抗体Fc区，可以实现纳米抗体的二聚化。Fc区的引入，还可以利用Fc的亲和性，简化抗体的纯化操作。Fc的引入，还有利于延长抗体的半衰期，提高抗体在体内的稳定性。抗体Fc区没有特殊要求，优选为人源抗体的Fc区。所述抗体Fc区包括人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgM、IgE的Fc段或其变体、改造体。

第二个方面，本发明提供一种二价或多价纳米抗体，包括至少一条本发明第一个方面所述的纳米抗体。

二价或多价纳米抗体由单条纳米抗体通过接头元件连接而成。接头元件优选为柔性肽，包括但不限于(G4S)n，n为1或以上的整数，优选的，n为1～4的整数。二价或多价纳米抗体中的纳米抗体可以相同，也可以不同。

第三个方面，本发明第一个方面和本发明第二个方面所述的纳米抗体的应用，所述应用包括但不限于：

制备B细胞免疫吸附剂；

制备B细胞检测试剂；

制备靶向CD20免疫偶联物；

制备治疗B细胞相关疾病的抗体药物。

在一些实例中，所述免疫偶联物由纳米抗体和连接在纳米抗体上的偶联物构成，如抗体与小分子组成的ADC药物。

在一些实例中，所述偶联物为药物。

在一些实例中，所述B细胞相关疾病选自肿瘤及自身免疫性疾病。

在一些实例中，肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、胶质母细胞瘤；自身免疫性疾病包括但不限于红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、 特发性炎症性肌炎、系统性硬化症、原发性干燥综合征。

第四个方面，本发明提供一种免疫吸附剂，包括固相载体，所述固相载体上偶联有本发明第一个方面和本发明第二个方面所述的纳米抗体。

在一些实例中，所述固相载体选自壳聚糖、琼脂糖、纤维素、葡聚糖、树脂、纤维素中的至少一种。

第五个方面，本发明提供一种血液净化器械，包括本发明第四个方面所述的免疫吸附剂。

第六个方面，本发明提供编码本发明第一个方面或本发明第二个方面所述纳米抗体的基因。

第七个方面，本发明提供一种表达载体，其表达本发明第一个方面或本发明第二个方面所述的纳米抗体，或含有本发明第六个方面所述的基因。

本发明的有益效果是：

本发明提供的纳米抗体可以特异性结合人血液中的B细胞，从而清除产生病理性抗体的B细胞。本发明提供的纳米抗体，与传统抗体相比，具有更小的分子量，稳定性强，成本低，易于表达且表达量高，适用于大规模生产。

本发明将纳米抗体将与固相载体相结合，可能靶向清除血液中的B细胞，在较短时间内减少病人血液中B细胞数量，降低抗体水平，从而改善生活质量，减少并发症，为那些对传统治疗无效或不耐受的患者提供了新的治疗选择。

附图说明

图1为纯化的纳米抗体电泳图，其中，Marker各条带的分子量自上而下依次为180kD、130kD、100kD、70kD、55kD、40kD、35kD、25kD、15kD、10kD。

具体实施方式

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。

本文所用术语“抗原结合片段”是指抗体结构中特异性与靶标抗原结合的一个或多个部分，包括但不限VHH，含有CDR的片段等。本文中所提到的“特异性结合”是指存在于纳米抗体或其抗原结合片段与抗原之间的一种非共价的相互作用。在本发明中，术语“亲和力”指的是大分子，尤其是纳米抗体，与其对应抗原之间相互作用的强度。这种结合能力反映了纳米抗体与特定抗原之间的相互作用特性。要精确评估本发明中纳米抗体的亲和力，可以采用多种体外实验方法进行测量，包括表面等离子体共振技术和ELISA测定。

在本发明中，所使用的“可变”一词指的是抗体中可变区在序列上的差异化特征，这些差异促成了不同抗体对其特定抗原的精确结合与识别。抗体的可变性主要集中在重链可变区的三个互补决定区（CDR），亦称为超变区。在天然的重链可变区，存在四个框架区（FR区），这些区域相对保守，并且通常呈现β折叠的构型。FR区通过形成连接环的三个CDR相连，这些CDR局部地形成了β折叠结构。每个链条中的CDR通过FR区紧密相邻，并与另一条链的CDR共同构成抗体的抗原结合位点。虽然恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合过程，但它们展现出不同的效应功能，例如参与介导抗体依赖性细胞毒性作用。

在免疫学中，“表位”是指位于抗原分子表面，能够被单个抗体分子识别并结合的区域。通常，一个抗原可能拥有多个不同的表位，这使得它能够与多种不同的抗体发生反应。表位的类型主要分为两类：线性表位和构象表位。线性表位是由抗原分子中连续的氨基酸序列组成，而构象表位则是由抗原分子中不连续的氨基酸残基通过空间结构相互靠近形成的。这两种类型的表位都是抗体识别和结合的关键部位。

“双表位特异性”指的是一种能力，其中抗体或免疫受体能够特异性地识别并结合至相同靶标蛋白上的两个或多个不同表位，或者不同靶标蛋白上的多个表位。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源/驼源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源/驼源性抗体诱发的免疫应答反应。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，是指将驼源VHH的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量驼源蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(因特网 www.mrccpe.com.ac.uk/vbase)中获得，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。

术语抗体的“抗原结合片段”或“功能片段”是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。

本文中使用的术语“抗体框架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。

下面结合实例及实验数据，进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：CD20为抗原的蛋白制备

采用以下抗原制备抗-CD20抗体。采用来自人CD20 (Uniprot登录号P11836-1，具体的氨基酸序列为：MTTPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFFMRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWGGIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSIMDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP，如SEQ ID NO.13所示)的氨基酸序列的C-末端的氨基酸残基265-290的多肽用作抗原。

CD20抗原的制备方法包括：制备含有人His标签到其C末端的人CD20的氨基酸残基265-290的抗原的核酸序列分子，克隆到质粒pcDNA3.1上，将克隆的载体转化到HEK293T细胞中表达，使用钴离子柱纯化，得到CD20抗原。

实施例2：CD20抗原的羊驼免疫

在免疫接种过程中，每次使用0.5 mg左右的抗原，总体积不超过1.5 mL。注射部位为羊驼颈部淋巴结附近，分为左右两侧进行注射，每侧注射2点，每点约注射0.4 mL乳化后的抗原。每隔两周进行一次免疫接种，至少需进行5次。在每次免疫前需采集血液样本用于免疫效果评估。在第5次免疫后5-7天，进行大量采血以分离淋巴细胞。

淋巴细胞的分离如下，从羊驼颈静脉采集血液，使用含抗凝剂（EDTA）的采集50 mL血液样本。采集的血液与等体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）或无血清培养基混合稀释，然后在离心管中加入淋巴细胞分离液，将稀释血液缓慢加在分离液上层进行密度梯度离心，条件通常为室温下400g至600g，持续20至30分钟。离心后，从形成的层次中小心吸取淋巴细胞层，转移到新的离心管中，并用大量PBS或无血清培养基洗涤细胞，随后通过200g至300g离心10分钟沉淀细胞并弃去上清液，重复2洗涤。最后，用培养基重悬淋巴细胞进行计数和台盼蓝染色法评估存活率。

接下来是RNA提取和cDNA合成步骤：将淋巴细胞与氯仿混合均匀，经过离心处理后，将上清液转移到新的离心管中。加入异丙醇以沉淀RNA，然后用75%乙醇清洗沉淀物，最后将其溶解于无RNA酶的水中。根据反转录试剂盒的操作说明，将提取的RNA反转录成cDNA。

抗体片段扩增步骤如下：首先以cDNA为模板，使用特定的引物对VHH抗体片段进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳来分离目标条带。然后以第一次PCR扩增后回收的DNA为模板，再次进行PCR扩增以提高特异性抗体片段的含量。最后将扩增后的抗体片段克隆至噬菌体质粒中。

实施例3：CD20纳米抗体噬菌体文库构建和筛选

构建噬菌体文库的过程主要包括三个关键步骤：首先，选择SacI和SpeI两个酶切位点，通过PCR扩增得到的多样化抗体基因序列与噬菌粒载体pComb3XSS连接，形成重组载体并转化到大肠杆菌TG1感受态细胞中。利用电穿孔技术进行细胞转化，然后在复苏培养基中进行培养。转移10ml培养至对数期的大肠杆菌TG1至新的无菌50ml离心管内，加入

4×10¹⁰pfu的M13KO7辅助噬菌体，轻柔混匀后，37℃水浴静置培养30分钟，使噬菌体侵染大肠杆菌。2,800g，室温，离心10分钟，小心去除上清液以去除培养基内的葡萄糖。随后用50ml的2×TY培养基（含有100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml的卡那霉素）重悬菌体于250ml锥形瓶内，30℃，200rpm，培养过夜。离心，上清液中加入20%PEG300/2.5MNaCl溶液，沉淀噬菌粒得到噬菌体文库。

在ELISA板上包被重组人CD20抗原，100µL/孔（即5µg/孔），4℃过夜，弃去包被液，用ELISA洗液（PBST:0.05%Tween-20的PBS）洗板3次；用5%脱脂奶粉封闭，洗板3次，然后每孔加入100µL的噬菌体库溶液，37℃孵育2h，洗板3次；每孔加入100µL Glycine-HCl缓冲液（pH=2.2）洗脱液室温下轻摇10min，吸出洗脱液，然后在洗脱液中迅速加入1M Tris-HCl缓冲液（pH=9.6)）将pH调至7.0-8.0，完成第一轮筛选。吸取所有洗脱后的噬菌体，加入到10mL生长至对数期的TG1菌液中，37℃静置30min后，220rpm培养30min-1h；加入辅助噬菌体培养后同上沉淀噬菌粒。重复上述步骤进行第二轮和第三轮的筛选。

从第 3 轮筛选后的洗脱库滴定平板上挑取 96 个单克隆，分别进行培养。在 96孔酶标板中包被 1μg/mL CD20抗原，加入噬菌体原液，加入 1:5000的 M13-HRP二抗，TMB显色，用酶标仪读取OD450 nm 值。选择OD值最高的3个，如表1所示。

表1、抗人CD20纳米抗体羊驼免疫效价ELISA结果

由表1可知，不同的纳米抗体对抗原CD20蛋白的亲和力不同，CA05具有更高的亲和力。

将上述3个纳米抗体进行测序，得到不同纳米抗体的氨基酸序列如表2所示。

表2、不同靶向CD20纳米抗体的氨基酸序列

从编码所选抗体的核苷酸序列中分析重链可变区的氨基酸序列，根据Kabat定义确定互补决定区（CDR）。不同靶向CD20纳米抗体CDR的氨基酸序列如表3所示。

表3、纳米抗体CDR的氨基酸序列

实施例4：纳米抗体的表达量检测

选择NheI和XhoI两个酶切位点将编码上述纳米抗体的核苷酸序列转入质粒PET28a中，用大肠杆菌BL21（DE）3进行表达，取表达菌株甘油菌10μL至50mL LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养4h，然后加入IPTG至终浓度为0.5mM，以37℃，180rpm振荡培养诱导表达，于诱导后6h收集菌体，超声破碎后得到3株菌的破碎上清。破碎上清分别用镍离子螯合填料进行纯化，用PBS溶液平衡，上样，然后用500mM咪唑洗脱收集洗脱液得到纯化后的抗体。用12%的分离胶跑电泳进行鉴定，其电泳图如图1所示。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，结果如表4所示。

表4、不同纳米抗体的表达量检测结果

从表达量看CA05的表达量最高，综合表达量和抗体活性，CA05和CB01效果更好。由图1可知，3个抗体的分子量均为14 kD左右，说明其与预期相符。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种靶向B细胞CD20的纳米抗体，包括框架区域和互补决定区域，其特征在于，所述纳米抗体互补决定区域CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列为QVQLVESGGGPVQSGGSLRLSCAGSRNIYSPYSMGDYGLSWFRQAPGEEREGVALIDRDDSTFYADSVKGRFTISQDDAKTNLFLQMNSLKPEDSAMYYCAAAAKPKEHGLFDSWGQGTQVTVSS。

3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，其为嵌合抗体、人源化抗体、融合Fc片段的纳米抗体。

4.一种二价或多价纳米抗体，其特征在于，包括至少一条权利要求1～3任一项所述的纳米抗体。

5.权利要求1～4任一项所述的纳米抗体的应用，其特征在于，所述应用包括：

制备B细胞免疫吸附剂；

制备B细胞检测试剂。

6.一种免疫吸附剂，包括固相载体，其特征在于，所述固相载体上偶联有权利要求1～4任一项所述的纳米抗体。

7.根据权利要求6所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述固相载体选自壳聚糖、琼脂糖、纤维素、葡聚糖、树脂中的至少一种。

8.一种血液净化器械，其特征在于，包括权利要求6或7所述的免疫吸附剂。

9.编码权利要求1～4任一项所述纳米抗体的基因。

10.一种表达载体，其特征在于，其表达权利要求1～4任一项所述的纳米抗体，或含有权利要求9所述的基因。