CN119162206B - 一种AhRabF1基因及其在抗花生叶斑病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种AhRabF1基因及其在抗花生叶斑病中的应用。本发明以花生抗叶斑病种质PI 196622为实验材料，克隆了所述AhRabF1基因，并通过荧光定量PCR验证了AhRabF1基因在不同组织中的表达模式，该基因在叶片中的表达丰度更高。本发明通过构建AhRabF1基因超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化技术获得AhRabF1过表达转基因植株，经实验验证AhRabF1过表达花生植株对叶斑病的抗性明显高于野生型植株。花生AhRabF1基因的鉴定和功能分析丰富了花生抗病育种的基因资源，对抗病植物的育种和筛选具有重要的理论意义和应用价值。

Description

一种AhRabF1基因及其在抗花生叶斑病中的应用

技术领域

本发明属于植物病害防治基因工程技术领域，具体涉及一种花生AhRabF1基因及其在抗花生叶斑病中的应用。

背景技术

叶斑病是花生主要的叶部病害，分为早斑病（也称褐斑病）和晩斑病（也称黑斑病），不同类型的叶斑病可以在一株植株或一片叶子上同时发生。该病普遍发生于所有花生产区，已成为世界范围内花生减产的主要原因之一。该病通过病原菌侵染，主要在叶片上形成病斑，叶柄托叶和茎秆都能受害，严重时可造成大量叶片掉落，影响植物光合作用的进行，可导致花生减产5%-15%，甚至个别年份减产超过30%。

应用杀菌剂等化学药剂是当前田间防治叶斑病的重要措施，对花生叶部病害的防治效果一般在60%左右，但却提高了生产成本，增加了农民的经济负担，还会对人体健康和环境产生有害的影响。因此，选育和推广花生抗病品种是针对花生叶斑病的根本有效措施。但传统的杂交育种不仅周期长，而且选育的品种很难兼具抗性、产量和品质。目前可以通过与基因组学相结合，找到抗性基因和标记能够加速抗叶斑病花生品种的培育。

前期在进行叶斑病抗性基因全基因组关联分析的研究中，定位到一个与抗病性相关的基因，经注释为GTP结合蛋白基因，许多研究表明GTP结合蛋白具有诸多方面作用，如调控细胞的极性、细胞生长，形态发育，胞质分裂，激素信号，以及植物与病原菌互作等。本发明在花生中克隆了该基因，命名为AhRabF1基因，深入研究其在抗花生叶斑病中的作用。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供了一种AhRabF1基因及其在抗花生叶斑病中的应用，本发明通过实验证明了所述AhRabF1基因具有抗花生叶斑病的功能，为花生抗病育种提供候选基因和理论支持。

为解决上述技术问题，本发明拟采用的技术方案是：

本发明提供了一种花生AhRabF1基因，所述AhRabF1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

进一步的，所述AhRabF1基因的扩增引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

进一步的，所述AhRabF1基因定位在细胞质。

本发明还提供了所述AhRabF1基因编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了所述的花生AhRabF1基因在抗花生叶斑病中的应用。

进一步的，所述应用包括以下步骤：

（1）PCR扩增克隆AhRabF1基因；

（2）将克隆的AhRabF1基因全长CDS连接表达载体，得到过表达重组载体；

（3）将过表达重组载体转化到农杆菌中，得到过表达重组菌株；

（4）将过表达重组菌株转化进植物中，筛选并得到AhRabF1基因过表达株系。

进一步的，所述步骤（1）中PCR扩增的体系为：2×Taq Master Mix(Dye Plus) 10μL；RabF1-1F 1μL；RabF1-1R 1μL；cDNA模板1μL；ddH₂O 7μL。

进一步的，所述步骤（1）中PCR扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，61℃ 30s，72℃60s，重复35个循环；72℃ 5min。

进一步的，所述AhRabF1基因过表达株系能够增强花生抗叶斑病的能力。

本发明还提供了所述的花生AhRabF1基因在选育具有叶斑病抗性的花生品种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果是：本发明从花生种质PI 196622中筛选并克隆了一个AhRabF1基因，并通过荧光定量 PCR 验证了AhRabF1基因在不同组织中的表达模式，该基因在叶片中的表达丰度更高。本发明通过构建AhRabF1基因超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化技术获得过表达转基因植株，经实验验证过表达花生植株对叶斑病的抗性明显高于野生型对照植株。花生AhRabF1基因的鉴定和功能分析丰富了花生抗病育种的基因资源，对抗病植物的育种和筛选具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为花生AhRabF1基因的PCR扩增图，泳道M为D2000 Marker；泳道1-4为扩增产物；

图2为花生AhRabF1蛋白与其他物种RabF1蛋白序列的系统进化树，注：Arachishypogaea：花生；Cicer arietinum：鹰嘴豆；Glycine max：大豆；Lotus japonicus：日本莲花；Lupinus angustifolius：羽扇豆；Prosopis alba：白马苜蓿；Trifolium pratense：三叶草；Vitis vinifera：葡萄；

图3为AhRabF1基因的亚细胞定位结果；

图4为AhRabF1基因在VIGS（病毒诱导的基因沉默）植株叶片和对照植株叶片中的相对表达量，如纵坐标所示，横坐标为检测株编号，其中 1为ck对照植株，2-9分别是基因沉默植株，实验材料为PI 196622；

图5为基因沉默植株和对照植株叶片在离体接种病原菌4d后的对比图，图中左边-：对照的植株叶片，图中右边+：VIGS沉默植株叶片；

图6为AhRabF1基因在过表达植株叶片和对照植株叶片中的相对表达量，如纵坐标所示，横坐标为检测株编号，其中1为ck对照植株，2-6分别是过表达植株，实验材料为花育967；

图7为过表达植株和对照植株在接种病原菌15d后的对比图，图中左边-：对照植株，图中右边+：过表达植株；

图8为过表达植株和对照植株在接种病原菌21d后叶片的对比图，图中左边为对照ck植株叶片，右边为过表达植株叶片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1 花生AhRabF1基因克隆及表达模式分析

1. 实验材料

1.1 植物材料

本发明使用的材料为花生种质PI 196622，该种质起源于科特迪瓦，从 USDA-ARSGermplasm Resources Information Network (GRIN) (ars-grin.gov)网站上申请即可获得该种质。

1.2 实验试剂

花生叶片RNA提取采用南京诺唯赞生物科技有限公司的植物RNA提取试剂盒，花生种子RNA提取采用北京天根生物科技有限公司植物总RNA提取试剂盒，cDNA合成采用艾科瑞Evo M-MLV Plus cDNA合成试剂盒和诺贝莱生物ReScript Ⅱ RT Super Mix for qPCR试剂盒，荧光定量PCR试剂盒购置于艾科瑞生物科技有限公司，目的基因回收采用北京天根生物科技有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

D2000 Marker、TaqMix等购自北京天根生物科技有限。

50×TAE缓冲液、PDA固体培养基、DNA上样缓冲液、DNA Marker 和Gelred购置于青岛生工生物科技有限公司。

2.实验方法与实验结果

2.1 RNA提取与cDNA合成

针对花生种子与叶片的不同特点选取不同的研磨方式，研磨种子时，将种子提前切成薄片，置于提前用DEPC水浸泡并在180℃烘箱烘烤过的研钵中，倒入液氮快速研磨，直至成为细腻的粉末，用预冷的药匙取黄豆粒大小粉末装入提前加有裂解液的1.5mL离心管中，全过程佩戴棉手套，防止冻伤。研磨叶片时，选取健康且叶龄相似的叶片1~2片，放入1.5mL离心管中，一同加入用DEPC水处理后烘干的3mm钢珠2颗，将离心管与适配器放入液氮预冷2-3min，立刻安装适配器，并将离心管置于冷冻磨样器上研磨充分，研磨后立刻加入裂解液。种子和叶片均加入裂解液后，即按照植物RNA提取试剂盒说明书提取花生种子和叶片的总RNA。

获得RNA后，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测RNA的完整性。

提取所述花生种质PI 196622的RNA，将RNA反转录合成cDNA ，以cDNA为模板通过PCR扩增AhRabF1基因的完整编码区，所述AhRabF1基因序列如下（SEQ ID NO.1），共603个碱基。

ATGGGCTGTGGCTCCTCCACTCTAGGTAGGGATTCGAGACCGCTTGGTCGAGACAATTCTGAGAATGGTGGAGGGCAGGACGCCAAGAACCTTCGTGTTAAGCTTGTTCTCTTAGGTGATTCTGGCGTCGGTAAAAGCTGTATTGTTCTACGGTTTGTCCGTGGTCAATTCGATCCAACATCCAAGGTAACTGTTGGAGCATCTTTTTTGTCGCAAACGATAGCACTGCAAGACTCTACAACAGTTAAGTTTGAAATATGGGATACTGCTGGTCAAGAGAGGTATGCTGCATTGGCACCCCTATATTATCGTGGTGCAGCGGTTGCAGTTATTGTCTATGATATTACAAGCCCGGAATCTTTCAGCAAAGCACAATACTGGGTTAAGGAGCTACAAAAGCACGGAAGCCCTGAAATAGTTCTGGCATTGGTTGGTAATAAAGCTGATCTTCATGAGAAGCGAGAGGTGGCTGTTCAGGATGGTATTGACTATGCAGAGAAGAACGGAATGTTCTTTATAGAGACATCTGCAAAGACAGCAGACAACATAAATGAACTCTTTGAGGAAATTGCGAAAAGACTGCCTCGCCCTTCAGCTTCTTGA

所述AhRabF1基因编码产生的蛋白的氨基酸序列如下（SEQ ID NO.2）：

MGCGSSTLGRDSRPLGRDNSENGGGQDAKNLRVKLVLLGDSGVGKSCIVLRFVRGQFDPTSKVTVGASFLSQTIALQDSTTVKFEIWDTAGQERYAALAPLYYRGAAVAVIVYDITSPESFSKAQYWVKELQKHGSPEIVLALVGNKADLHEKREVAVQDGIDYAEKNGMFFIETSAKTADNINELFEEIAKRLPRPSAS*

扩增AhRabF1基因的引物为RabF1-1F、RabF1-1R：

RabF1-1F：ATGGGCTGTGGCTCCTCCA（SEQ ID NO.3）；

RabF1-1R：TCAAGAAGCTGAAGGGCGAGG（SEQ ID NO.4）。

AhRabF1基因扩增体系为：2×Taq Master Mix(Dye Plus) 10μL；RabF1-1F 1μL；RabF1-1R 1μL；cDNA模板 1μL；ddH₂O 7μL。AhRabF1基因PCR扩增程序为：94℃ 5min；94℃30s；61℃ 30s；72℃ 60s；重复35个循环，72℃ 5min。PCR扩增的结果如图1所示，花生AhRabF1蛋白与其他物种中RabF1蛋白质序列的系统进化树如图2所示。

2.2花生AhRabF1基因的不同组织表达模式分析

根据克隆AhRabF1基因序列设计RT-qPCR引物，选用actin为内参基因。以种子和叶片的cDNA为RT-qPCR的模板，分析AhRabF1基因在不同组织的表达模式。每个样品做3次重复。将样品放入AB7500荧光定量PCR仪中，程序为95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，72℃ 20s，重复40个循环。程序结束后软件会生成溶解曲线与峰值数，用来计算该基因的相对表达量，明确其在不同组织部位的表达模式。

RT-qPCR结果显示AhRabF1基因在叶片中的表达量为种子中表达量的3.72倍。因为花生叶斑病是叶部病害，所以该基因在叶片中的表达量比种子中高。

2.3花生叶斑病病原菌分离及接种

2.3.1病原菌的分离

取带有花生叶斑病病斑的叶片，在病健交界处切下直径5mm的组织，先在75%的乙醇溶液中浸泡2min，用灭菌ddH₂O冲洗3次，再在1%的次氯酸钠溶液中浸泡1min，然后用灭菌ddH₂O冲洗3次，使用无菌滤纸吸干叶片表面水分后，正面朝上置于PDA培养基，放入28℃恒温培养箱中培养，获得花生叶斑病病原菌。

2.3.2植株接种

取花生叶斑病病原菌，配制叶斑病菌悬液，正反涂抹在相同叶龄的花生叶片上，在温度为28℃的恒温人工气候箱中培养，用塑料膜包裹罩住，保持相对湿度＞90%，从接种第3d开始，观察植株生长情况。

2.3.3离体叶片接种

分别取VIGS植株和对照植株的第3 ~4片真叶，在超净工作台上用75%的乙醇溶液中浸泡1min后灭菌ddH₂O冲洗，使用无菌滤纸吸干叶片表面水分，正面朝上置于PDA培养基中。挑取病原菌菌丝团置于花生叶片正面中脉距叶基三分之二的位置，然后将培养皿放在相对湿度90%、温度28℃的光照培养箱中培养，16 h光照/8 h黑暗。每份材料接种6片花生叶，3d后观察叶片发病状况。

2.4接种前后花生AhRabF1基因表达模式分析

接种7d后，取植株叶片进行RNA提取，反转录合成cDNA，再对cDNA浓度进行测定。每个样品3次重复，以RabF1-q-F1、RabF1-q-R1为扩增AhRabF1基因引物，以actin-F、action-R为内参基因引物，引物序列如下：

RabF1-q-F1：AGAGGTATGCTGCATTGGCAC（SEQ ID NO.5）；

RabF1-q-R1：CAGGGCTTCCGTGCTTTTGTA（SEQ ID NO.6）；

actin-F：TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC（SEQ ID NO.7）；

actin-R：AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC（SEQ ID NO.8）。

配置好反应体系后，放入AB7500荧光定量PCR仪中，按照95℃ 30s；95℃ 5s，60℃30s，72℃ 20s，重复40个循环的程序进行RT-qPCR。程序结束后，通过计算相对表达量来比较病菌侵染前后该基因在花生叶片中的表达差异。

实验结果表明花生叶片在叶斑病病菌侵染后，AhRabF1基因表达上调，说明AhRabF1基因参与花生抗叶斑病途径的分子调控。

实施例2：亚细胞定位

1、设计合成扩增目的基因的引物

RabF1-F3：CTCTCGAGCTTTCGCGAGCTCATGGGCTGTGGCTCCTCC；

RabF1-R3：GCCCTTGCTCACCATGGATCCAGAAGCTGAAGGGCGAGGC。

2、目的片段扩增

以pRI101- AhRabF1质粒为模板，使用Prime STAR HS DNA聚合酶扩增目的基因全长，PCR反应体系如下：

5×buffer 10μL

dNTP（2.5mM each） 4μL

引物RabF1-F3（10 μM/L） 1.5μL

引物RabF1-R3（10 μM/L） 1.5μL

Prime STAR HS DNA聚合酶(2.5U/μL) 0.5μL

cDNA 1 μL

ddH₂O 31.5 μL

PCR反应条件为： 98 ℃ 10s，55 ℃ 5s，72℃ 40s（30个循环）；72 ℃，5min。PCR结束后电泳检测，切胶并回收目的片段。

3、双酶切表达载体

将1300sGFP载体质粒用SacI、BamHI进行双酶切，37℃水浴15min后，琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收目的片段。

4、连接转化、筛选测序

采用重组连接试剂盒进行连接，50℃反应30min后，转化DH5α感受态。涂布LB平板（硫酸卡那霉素，50μg/mL），过夜培养，长出菌落后，PCR筛选阳性克隆，送阳性菌液测序。测序结果证实载体构建成功。

筛选引物：

RabF1-258F：ATGGGATACTGCTGGTCAAG；

eGFP-R：ACTTGTGGCCGTTTACGTCG；

以下为测序拼接结果（下划线标记序列为全长序列），SEQ ID NO.9：

TCACCAAAGGGTAATTCGGGAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTCCAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCGAGCTTTCGCGAGCTCATGGGCTGTGGCTCCTCCACTCTAGGTAGGGATTCGAGACCGCTTGGTCGAGACAATTCTGA GAATGGTGGAGGGCAGGACGCCAAGAACCTTCGTGTTAAGCTTGTTCTCTTAGGTGATTCTGGCGTCGGTAAAAGCT GTATTGTTCTACGGTTTGTCCGTGGTCAATTCGATCCAACATCCAAGGTAACTGTTGGAGCATCTTTTTTGTCGCAA ACGATAGCACTGCAAGACTCTACAACAGTTAAGTTTGAAATATGGGATACTGCTGGTCAAGAGAGGTATGCTGCATT GGCACCCCTATATTATCGTGGTGCAGCGGTTGCAGTTATTGTCTATGATATTACAAGCCCGGAATCTTTCAGCAAAG CACAATACTGGGTTAAGGAGCTACAAAAGCACGGAAGCCCTGAAATAGTTCTGGCATTGGTTGGTAATAAAGCTGAT CTTCATGAGAAGCGAGAGGTGGCTGTTCAGGATGGTATTGACTATGCAGAGAAGAACGGAATGTTCTTTATAGAGAC ATCTGCAAAGACAGCAGACAACATAAATGAACTCTTTGAGGAAATTGCGAAAAGACTGCCTCGCCCTTCAGCTTCTT GAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCCTGTCGAA

5、亚细胞定位结果

AhRabF1以及空载体1300S-GFP进行菌液扩繁并提取质粒。AhRabF1以及空载体1300S-GFP的质粒分别与细胞核marker转化拟南芥原生质体，弱光下培养8-10 h，在激光共聚焦显微镜下观察AhRabF1的亚细胞定位，如图3所示，结果显示定位在细胞质。

荧光蛋白激发波长和发射波长如下：

红色荧光蛋白RFP：激发波长为532nm，发射波长为588nm；

绿色荧光蛋白GFP：激发波长为488nm，发射波长为507nm。

实施例3：花生VIGS（病毒诱导的基因沉默）实验

1、试剂配制

500mM MgCl₂（氯化镁）：10.1g MgCl₂·6H₂O溶于100mL灭菌蒸馏水，0.22μm过滤除菌，4℃保存，工作浓度10 mM；

100mM MES（2-N-吗啉基乙磺酸）：2.12g MES（无水）固体粉末溶于100 mL灭菌蒸馏水，0.22μm过滤除菌，4℃保存，工作浓度10 mM；

74mM AS（乙酰丁香酮）：145mg AS粉末溶于10mL 无水乙醇，4℃保存，工作浓度200μM；

MM缓冲液：每100ml缓冲液需2mLMgCl₂和10mL MES，剩余体积用灭菌蒸馏水补足；

MMA缓冲液：在MM缓冲液中加入AS，每100mL加270μL，用HCl或Mg(OH)₂调pH至5.2-5.7；

2、菌种活化

自-80℃取出GV3101菌种（含有pTRV2:: AhRabF1质粒），置于冰上融化，取100μL菌液加入到5mL LB液体培养基（含有终浓度为50μg/mL卡那霉素Kan和利福平Rif），28℃，200rpm振荡培养至菌液OD₆₀₀值约为0.3-1.8时4℃保存备用；同样方法活化含有空载体pTRV2质粒的GV3101菌种。

3、制备菌悬液（配制量根据实验需求决定，不要长期存放）

将活化的菌液100μL加入到 5mL 上述含抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养12h；然后取出5 mL菌液加入到100mL LB 液体培养基（含有50μLKan、100μL Rif、10mL MES和27μL AS）中28℃，200rpm振荡培养12h。待菌液OD₆₀₀值达到1.5-2.0时，室温6000rpm离心10 min收集菌体，弃上清，用少量MMA缓冲液吸打重悬菌体，直至完全混匀，无菌体结块，至此获得菌悬液。

4、侵染方法

将pTRV1和pTRV2:: AhRabF1菌悬液等浓度等体积混合，室温下避光静置3-4h后倒入烧杯中，取30株萌发14d的花生幼苗完全浸入菌悬液中；将烧杯放入真空罐中，真空罐与真空泵以胶皮软管相连，抽真空时，先将真空罐的放气阀置于开启状态，再打开真空泵，待真空泵压力表达到0.6-0.8时开始计时，7min后依次关闭真空罐放气阀、真空泵、缓慢打开真空罐放气阀，待真空罐内外气压平衡后取出烧杯；弃菌悬液，将幼苗表面的菌体用无菌去离子水冲洗干净；将幼苗依次放入含有1/5 Hoagland's营养液的水培盒中，黑暗培养16h，之后将人工气候箱调至16h（光照）/8h（黑暗），7d后将所有幼苗转入营养土中继续培养。

以抗病花生PI 196622为实验材料，对照组注射含有pTRV2空载体质粒的菌液，实验组注射含有pTRV2:: AhRabF1质粒的菌液。

5、转化植株鉴定方法

侵染7d后，分别提取基因沉默植株和对照植株叶片DNA，以引物pTRV2-F：TTGTTACTCAAGGAAGCACGAT；AhRabF1-278R：TCTTGACCAGCAGTATCCC AT检测阳性基因沉默植株，扩增产物约为357bp。

6、AhRabF1基因在沉默植株中的表达量鉴定

侵染7d后，分别提取基因沉默植株的叶片和对照植株叶片的RNA，反转录合成cDNA后，通过RT-qPCR检测AhRabF1基因的表达情况。

检测引物序列如下：

RabF1-q-F1：AGAGGTATGCTGCATTGGCAC；

RabF1-q-R1：CAGGGCTTCCGTGCTTTTGTA；

actin-F：TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC；

actin-R：AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC。

7、实验结果

通过VIGS实验，本发明中基因沉默植株的叶片中AhRabF1基因的表达量与对照相比都有所降低，对照植株ck中AhRabF1基因表达量是1，沉默植株中AhRabF1基因表达量从0.26到0.82不等（图4）。

从图5可以直观看出，在接种4d后，沉默AhRabF1基因的叶片出现病斑，而对照ck叶片未出现病斑。以上结果证明，所述抑制AhRabF1基因的表达显著降低花生对叶斑病的抗性。

实施例4：花生过表达实验

1、试剂配制

500mM MgCl₂（氯化镁）：10.1g MgCl₂·6H₂O溶于100mL灭菌水，0.22μm过滤除菌，4℃保存，工作浓度10 mM；

500mM MES（2-N-吗啉基乙磺酸）：10.6g MES（无水）固体粉末溶于100 mL蒸馏水，0.22μm过滤除菌，4℃保存，工作浓度10 mM；

100mM AS（乙酰丁香酮）：196mg AS粉末溶于10mL 无水乙醇，4℃保存，工作浓度100μM；

1L侵染缓冲液MMA：959ml灭菌水+1mL 100mM乙酰丁香酮+20mL 500mM MES+20mL500mM MgCl₂

2、菌种活化

自-80℃取出GV3101菌种（含有pRI101:: AhRabF1质粒），置于冰上融化，取100μL菌液加入到5mL LB液体培养基（含有终浓度为50μg/mL卡那霉素Kan和利福平Rif），28℃，200rpm振荡培养至菌液OD₆₀₀约为0.3-1.8，4℃保存备用；同样方法活化含有pRI101空载体质粒的GV3101菌种。

3、制备菌悬液

将活化的菌液50μL加入到 50mL上述含抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至菌液OD₆₀₀值为0.6-0.8时，室温6000rpm离心10 min收集沉淀，然后加入50mL侵染缓冲液重悬菌体直至完全混匀获得菌悬液。

4、侵染方法

采用花萼管注射法侵染花生植株，注射时间一般在早上8:00之前进行，使用1mL医用注射器吸取菌悬液注入花朵的花萼管内，并对注射花朵及之后的新生果针进行标记，确保收获到转基因荚果。

以感病花生品种花育967为实验材料，对照组注射含有pRI101空载体质粒的菌液，实验组注射含有pRI101:: AhRabF1质粒的菌液。

5、过表达转基因植株鉴定

收获荚果后，切取花生种子远胚端小片子叶（约5ug），采用SDS法提取基因组DNA，通过鉴定引物筛选出转基因种子，鉴定引物为35S：GACGCACAATCCCACTATCC；AhRabF1-278R：TCTTGACCAGCAGTATCCCAT。扩增产物约为443bp。

6、AhRabF1基因在过表达植株中的表达量鉴定

将上述转基因和对照种子分别种植于人工气候箱中，21d后，分别提取转基因植株和对照植株的叶片RNA，反转录合成cDNA后，通过RT-qPCR检测AhRabF1基因的表达情况，检测引物序列如下：

RabF1-q-F1：AGAGGTATGCTGCATTGGCAC；

RabF1-q-R1：CAGGGCTTCCGTGCTTTTGTA；

actin-F：TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC；

actin-R：AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC。

7、实验结果

通过过表达实验，本发明中过表达植株叶片中AhRabF1基因的表达量与对照相比都有所提高，对照植株ck中AhRabF1基因表达量是1，过表达植株中AhRabF1基因表达量从1.95到3.43不等。

从图7和图8可以看出，接种病原菌一段时间后，AhRabF1过表达植株生长健壮，叶片未出现病斑；而对照植株已经出现病叶，对照叶片上出现病斑。本实施例的实验结果进一步证明过表达AhRabF1基因能增强花生对叶斑病的抗性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.AhRabF1基因在抗花生叶斑病中的应用，其特征在于，所述AhRabF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的AhRabF1基因在抗花生叶斑病中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

（1）PCR扩增克隆AhRabF1基因；

（2）将克隆的AhRabF1基因全长CDS连接表达载体，得到过表达重组载体；

（3）将过表达重组载体转化到农杆菌中，得到过表达重组菌株；

（4）将过表达重组菌株转化进植物中，筛选并得到AhRabF1基因过表达株系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中PCR扩增的体系为：2×TaqMaster Mix Dye Plus 10μL；RabF1-1F 1μL；RabF1-1R 1μL；cDNA模板 1μL；ddH₂O 7μL。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中PCR扩增程序为：94℃5min；94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 60s，重复35个循环；72℃ 5min。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，AhRabF1基因过表达株系能够增强花生抗叶斑病的能力。

6.花生AhRabF1基因在选育具有叶斑病抗性的花生品种中的应用，其特征在于，所述AhRabF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。