CN119162158B - 一种在红球菌中高效表达酰胺酶的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在红球菌中高效表达的酰胺酶的方法及其应用。本发明研究发现在红球菌中可以高效表达的酰胺酶，进一步通过启动子筛选或优化进一步提高其表达效率。本发明的方法得到的重组红球菌，发酵培养得到的酰胺酶活性有显著提高，表达效率显著提高，为工业化生产酰胺酶奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种在红球菌中高效表达酰胺酶的方法及其应用。
背景技术
酰胺酶，又称酰胺水解酶，是一类能够催化酰胺键断裂生成相应羧酸和氨的水解酶，广泛存在于细菌（广谱酰胺酶）、霉菌（青霉素酰化酶）、真菌（甲酰胺酶、乙酰胺酶以及广谱酰胺酶）、酵母（烟酰胺酶以及广谱酰胺酶）、植物（肽酶）和动物（花生四烯酸乙醇胺酰胺酶）等生物体中。绝大部分酰胺酶的底物谱广，能高效催化各种脂肪族、芳香族以及杂环族酰胺的水解，酰胺酶因具有良好的化学和立体选择性，在手性羧酸，酰胺衍生物和光学纯氨基酸等手性化合物的合成中极具潜力，正日益受到工业界的重视。
2020，Mochamed Chafik Bourkaib等发现来自生二素链霉菌（Streptomyces ambofaciens） ATCC23877中的酰胺酶在水环境中具有催化生成N-酰基氨基酸的能力（Mochamed Chafik Bourkaib，Stephane Delaunay，Xavier Framboisier,LaurenceHotel, Bertrand Aigle, Catherine Humeau, Yann Guiavarch, Isabelle Chevalot.N-acylation of L-amino acids in aqueous media: Evaluation of the catalyticperformances of Streptomyces ambofaciens aminoacylases. Enzyme and microbialtechnology 137(2020)109536.）。同时，他们还证实了酰胺酶Sam-AA是野生菌株S. ambofaciens ATCC23877拥有N-α-酰化活性的主要原因。
S. ambofaciens ATCC23877菌株生长缓慢，培养时间过长。同时，S. ambofaciens ATCC23877粗提物的N-α-酰化活性较低，不足以用于工业应用。因此，如何提供一种可以大规模生产氨基酰化酶的方法，同时操作简便，生产效率高，已成为亟待解决的问题。
发明内容
为了克服上述不足，本发明提供了一种重组酰胺酶基因及其应用。本发明通过在红球菌中高效表达的酰胺酶，进一步通过启动子优化提高其表达效率，实现了酰胺酶的高效、特异性表达。
本发明提供一种在红球菌中高效表达酰胺酶的方法，其是将酰胺酶基因构建表达载体导入红球菌中得到重组红球菌，通过培养所述重组红球菌表达获得所述酰胺酶。
具体地，所述红球菌选自ATCC 12674、GMCC 1.10360、DSM 44193、CGMCC 1.5301或CGMCC 1.4904的红球菌，均可以购买得到。
更具体地，所述酰胺酶基因来源于生二素链霉菌（Streptomyces ambofaciens）。
具体例子中，所述酰胺酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
更优选地，所述酰胺酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步优选地，所述酰胺酶基因表达采用的启动子是为P3、P4或P5，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。
本发明提供所述方法中得到的重组红球菌。
本发明进一步提供一种制备酰化酶催化剂的方法，其通过发酵培养所述重组红球菌，以获得的湿菌体或粗酶液或纯酶作为生物催化剂。
本发明还提供所述重组红球菌在生物催化合成辛酰基表面活性剂中的应用。
具体地，通过所述重组红球菌发酵培养后经离心，弃上清液，收集沉淀即得的湿菌体作为全细胞催化剂，以辛酸和氨基酸为底物构成反应体系。
更具体地，所述湿菌体在反应体系的用量为5-30g/L，辛酸浓度为1.44-72g/L，所述氨基酸以总体积60%-100%饱和氨基酸溶液参与反应；
反应条件为：温度35-65℃，pH5.5～8.5，搅拌速度100-300rpm的条件下进行生物催化反应；所述氨基酸选自甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、赖氨酸和丙氨酸。
在具体实例中，所述湿菌体按如下方法制备：将所述重组红球菌接种至含有100μg/ml卡那霉素抗性的TSB液体培养基，30℃，200rpm培养24h，再以2%（v/v）接种量接种至新鲜的含有100μg/ml卡那霉素抗性的发酵培养基，30℃，200rpm培养48h；再于4℃，8000rpm离心20min，弃上清液，收集沉淀，即获得所述的湿菌体。
附图说明
图1 Sam-AA_pET28a(+)质粒图谱。
图2 Sam-AA_pDD57质粒图谱。
图3 启动子优化后各表达菌株酶活性。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但不构成本发明的限制。
实施例1、Sam-AA大肠杆菌表达菌株酶活性测定
Sam-AA基因片段（来源于生二素链霉菌（Streptomyces ambofaciens），NCBI编号WP_053128363.1）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，重组到pET28a（+）载体上，即为Sam-aa_pET28a(+)质粒。其核苷酸序列见SEQ ID NO.2所示（编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示），质粒图谱如图1所示。
将Sam-AA_pET28a(+)质粒转入BL21(DE3)的感受态细胞，即获得Smm-aa大肠杆菌表达菌株。
将Smm-AA大肠杆菌表达菌株接种至含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm培养12h，再以1%（v/v）接种量接种至新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，20℃，200rpm，诱导培养15h后。4℃，8000rpm离心20min，弃上清液，收集沉淀，即获得含有表达重组质粒的重组Sam-aa大肠杆菌的湿菌体。该菌体可直接作为生物催化剂。
辛酰基丙氨酸合成酶活性测定：辛酸144mg，饱和丙氨酸溶液10ml，湿菌体0.1g，pH8.0。于37℃反应24h。反应结束后，使用HPLC分析反应液，得到辛酰基丙氨酸合成酶活性。反应及分析针对各反应体系实施3次以上，对操作等导致的数据偏差进行了纠正。
分析条件：色谱柱：C18，4.6mm×250mm，5μm；检测波长：紫外（UV）=200nm；流动相：50%的乙腈和50%的0.05%三氟乙酸水溶液；柱温：30℃；流速：1mL/min；检测时间：15min。
实施例2、Sam-aa红球菌表达菌株酶活性测定
Sam-aa大肠杆菌表达菌株对辛酰基丙氨酸合成酶活性极低，故本发明寻找到与链霉菌来源较近的工程菌红球菌，作为Sam-AA表达菌株，以期提高其酶活性。
以实施例1中Sam-AA_pET28a(+)质粒为模板，通过PCR扩增该片段。其中，PCR扩增Sam-AA的引物为：上游引物1为：5’-attaagaaggagatatacatATGAGTGATTCAGGAACAGCT-3’，下游引物2为：5’-aagctggatccagctcgaattcaCGACGCATCGATGAAACGGTC-3’。
PCR体系各组分添加量（总体积50 μL）：PrimerStar 25μL，ddH2O 20μL，上下游引物各1.5μL，模板2uL。PCR扩增程序为：98℃预变性2min；进入循环（98℃变性10s；56℃退火15s；72℃延伸30s），共25个循环，72℃终延伸5min。扩增的目的基因片段大小约1.4kb。
载体片段的获得：使用上游引物3为：5’-tgaattcgagctggatccagcttcctcgctcac-3’，下游引物4为：5’-atgtatatctccttcttaattaagcatgc-3’扩增pDD57质粒，PCR体系和反应条件如上所述。
通过纯化回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，后，使用诺唯赞一步重组试剂盒将上述两个片段进行同源重组，反应体系为：基因片段1μL，载体片段1μL，5×缓冲液 2μL，重组酶1μL。37℃反应30min。将连接后的载体转入大肠杆菌Top10感受态中，经测序得到Sam-aa红球表达质粒Sam-AA_pDD57，其质粒图谱如图2所示。
将Sam-aa红球表达质粒Sam-AA_pDD57分别转入ATCC 12674、GMCC 1.10360、DSM44193、CGMCC 1.5301及CGMCC 1.4904（可购买得到）红球表达菌株。将其于TSB液体培养基30℃，220rpm培养24h。以2%的接种量转接至发酵培养基（葡萄糖30g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨3g/L，麦芽提取物3g/L，磷酸氢二钾0.5g/l，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁1g/L，尿素1g/L，pH调至7），30℃，220rpm培养48h。8000rpm离心收集全细胞，即获得含有表达重组质粒的重组Sam-aa红球菌的湿菌体。
按照实施例1所述辛酰基丙氨酸合成酶活性测定方法，对以上湿菌体进行酶活性测定，其相对于大肠杆菌BL21(DE3)的酶活性结果如表1所示。
表1 不同表达菌株酶活性比较
由表1可以看出，在红球菌中Sam-aa的辛酰基丙氨酸合成酶活性显著高于BL21(DE3)，说明红球菌中Sam-aa的表达效率显著高于BL21(DE3)。
实施例3、红球菌启动子优化
为进一步提高Sam-aa辛酰基丙氨酸合成酶活性，对表达载体进行一系列启动子优化。
人工合成启动子片段P1、P2、P3、P4和P5，其碱基序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。并采用同源重组的方法连接到Sam-aa红球表达质粒Sam-AA_pDD57，构建成功含有启动子P1、P2、P3、P4和P5的表达质粒，并转入ATCC 12674红球表达菌株。根据实施例2所示方法，进行红球菌中Sam-aa的辛酰基丙氨酸合成酶活性测定。其相对于P0的相对酶活性见图3所示。其中，P0指未进行启动子优化的Sam-aa ATCC 12674红球表达菌株。从图3所示结果可以看出， P3、P4和P5启动子均可显著提高红球菌中Sam-aa的辛酰基丙氨酸合成酶活性，说明P3、P4和P5启动子均可显著提高红球菌中Sam-aa的表达效率。
Claims (8)
1.一种在红球菌中表达酰胺酶的方法，其特征在于，将酰胺酶基因构建表达载体导入红球菌中得到重组红球菌，通过培养所述重组红球菌表达获得所述酰胺酶；
所述酰胺酶基因表达采用的启动子是P3、P5启动子，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7所示；
所述酰胺酶基因来源于生二素链霉菌（Streptomyces ambofaciens）。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红球菌选自ATCC 12674、CGMCC1.10360、DSM 44193、CGMCC 1.5301或CGMCC 1.4904的红球菌。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酰胺酶基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酰胺酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.如权利要求1至4任一项所述方法中得到的重组红球菌。
6.一种制备酰化酶催化剂的方法，其特征在于通过发酵培养如权利要求5所述重组红球菌，以获得的湿菌体或粗酶液或纯酶作为生物催化剂。
7.权利要求5所述重组红球菌在生物催化合成辛酰基表面活性剂中的应用，其特征在于，通过所述重组红球菌发酵培养后经离心，弃上清液，收集沉淀即得的湿菌体作为全细胞催化剂，以辛酸和丙氨酸为底物构成反应体系。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述湿菌体在反应体系的用量为5-30g/L，辛酸浓度为1.44-72g/L，所述丙氨酸以总体积60%-100%饱和丙氨酸溶液参与反应；
反应条件为：温度35-65℃，pH5.5～8.5，搅拌速度100-300rpm的条件下进行生物催化反应。
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