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CN119162073A - 一株柠檬酸杆菌基因工程菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

一株柠檬酸杆菌基因工程菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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CN119162073A
CN119162073A CN202411550139.3A CN202411550139A CN119162073A CN 119162073 A CN119162073 A CN 119162073A CN 202411550139 A CN202411550139 A CN 202411550139A CN 119162073 A CN119162073 A CN 119162073A
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citrobacter
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cysh
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刘朱东
张敏
魏小武
杨华
杜东霞
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HUNAN PROVINCE MICROBIOLOGY INSTITUTE
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Abstract

本发明公开了一株柠檬酸杆菌基因工程菌株及其构建方法和应用。该菌株以柠檬酸杆菌XT1‑2‑2为出发菌株，在表达硫酸盐还原酶APS的cysH基因前端插入红霉素强启动子PermE改造得到，所述的原始柠檬酸杆菌为Citrobacter sp. XT1‑2‑2。本发明是基于该原始菌株利用红霉素强启动子过表达cysH基因获得的工程菌株，保藏编号为：CCTCC NO：M 20241948，其具有显著降镉活性，可以作为镉污染稻田的生态修复菌株，为后续在镉污染稻田中进行生态修复的研究奠定了基础。

Description

一株柠檬酸杆菌基因工程菌株及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及高效固镉工程菌株及其构建方法和应用，具体指通过高效固镉工程菌株的构建，获得到一株工程菌株，还涉及对该菌株的镉耐受和镉吸附等功能的应用。
背景技术
镉对人体还有很强的生物毒性，在土壤中难以降解并且具有生物累积性，容易通过食物链在动植物以及人体内积累，直接威胁人体健康。常用的物理和化学修复方法相对成本较高，试剂的使用在农作物土壤中容易造成土壤的二次污染和土壤结构的改变。使用植物进行土壤重金属修复容易受到植物的生长周期以及生物量的限制导致其效果不够明显和及时。因此利用微生物进行土壤重金属修复，不仅高效、经济、环保，而且微生物的使用改善了土壤的微生物菌群，提高了土壤的生物活性。
土壤中的微生物可以在高镉污染的土壤中自然生存，并且通过菌体内复杂的酶促反应以及菌株对重金属的细胞代谢、氧化还原、吸附吸收等功能调控土壤中Cd的含量以及存在形态，降低了Cd在土壤中的含量。近几年来，大量的科研工作者分离并筛选出了耐镉性强并且对农作物生长具有促生作用的功能微生物，通过对其在田间应用来降低土壤中Cd的毒性以及植物对镉的吸收。有研究表明菌剂的添加和使用不仅能促进水稻的生长，而且对苗期水稻镉污染具有显著的缓解效应，添加菌剂处理的水稻地上部镉含量分别比处理前下降 59.9%，镉迁移系数降低 33.3%，镉富集系数减少 58.8%，水稻单株镉积累量降低24.3%。
发明内容
本发明的首要目的是提供一株插入红霉素强启动子过表达cysH基因的柠檬酸杆菌工程菌， 硫酸盐还原酶（APS）蛋白表达水平有所增加，促进了硫酸盐代谢途径中SO4 2-到SO3 2-的转化，使得本发明得到的工程菌株具有高效的降镉活性，在水稻田重金属镉修复功能中具有很大的潜力。
本发明分离筛选出的具有耐镉和固镉活性的原始菌株柠檬酸杆菌XT1-2-2，已经获得了该菌的全部基因组数据，初步对该菌进行了功能富集分析以及KEGG代谢通路分析。由于该菌株遗传操作系统相对清晰，能够高效的对其进行遗传修饰改造。本发明柠檬酸杆菌基因工程菌株，其命名为Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS，保藏编号为：CCTCC NO：M20241948。
本发明的第二个目的在于提供上述基因工程菌株的构建方法，该构建方法以原始的柠檬酸杆菌（Citrobacter sp.）XT1-2-2为出发菌，将红霉素强启动子PermE插入cysH基因前面改造得到具有固镉能力的工程菌株。
进一步地，是一种在柠檬酸杆菌XT1-2-2感受态细胞中进行电击转化导入带有红霉素强启动子和APS片段的重组质粒的基因工程方法。
具体包括以下步骤：
1） 以柠檬酸杆菌XT1-2-2菌株基因组DNA为模板，设计带有酶切位点的cysH上下游引物，PCR扩增出带有酶切位点的cysH基因片段，同时以含有红霉素强启动子PermE的载体为模版，设计带有酶切位点的PermE上下游引物，扩增带有酶切位点的PermE片段；通过融合PCR的方法将PermE与cysH片段进行融合，得到PermE-cysJ重组片段；
2） 通过双酶切将质粒和PermE-cysH重组片段进行双酶切，通过连接酶将线性化的质粒和PermE-cysH重组片段进行连接，获得重组载体；
3） 将构建好的重组载体通过电击转化导入到柠檬酸杆菌XT1-2-2的感受态细胞中，通过抗性筛选得到阳性转化子，即Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS。
进一步地，步骤1）以柠檬酸杆菌XT1-2-2菌株基因组DNA为模板，设计带有XbaI酶切位点的cysH上下游引物，PCR扩增出带有酶切位点的cysH基因片段，同时以含有红霉素强启动子PermE的pOJ260-PremE为模版，设计带有EcoRI酶切位点的PermE上下游引物，扩增带有酶切位点的PermE片段；通过融合PCR的方法将PermE与cysH片段进行融合，得到PermE-cysJ重组片段。
步骤2）通过XbaI和EcoRI双酶切将pBBR1MCS-2质粒和PermE-cysH重组片段进行双酶切，通过T4连接酶将线性化的pBBR1MCS-2质粒和PermE-cysH重组片段进行连接，获得重组载体pBBR1MCS-PermE-cysH。
步骤3）将构建好的重组载体pBBR1MCS-PermE-cysH通过电击转化导入到柠檬酸杆菌XT1-2-2的感受态细胞中，通过50 μg/mL的卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，即Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS。
本发明的第三个目的在于提供上述基因工程菌株在土壤中修复并降低重金属镉污染中的应用。
对上述应用方法的验证主要包括液体培养基中镉去除能力提升、镉动态吸附能力明显增强、APS蛋白表达量明显增加、试剂盒检测APS蛋白酶酶活增强以及透射电镜观察下菌株镉吸附能力明显增强来进行。
（1） 液体培养基中镉去除能力提升：
将出发菌株和本发明所述的基因工程菌株在100 mL蓝盖瓶中进行培养，其中本发明所述工程菌株培养基中加入终浓度为50 μg/mL的kan抗性，分别转接至Cd2+含量为50 mg/L的100 mL液体SRB培养基的三角瓶中，进行液体培养基中镉的去除能力检测实验：处理1：Citrobacter sp. XT1-2-2；处理2：Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS。在不同培养时间测定0 h，20 h，40 h，60 h，80 h，100 h和120 h上清中的镉含量。通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS，Agilent-7500cx）测定收集的上清液中Cd2+的浓度。
（2） 镉动态吸附能力明显增强：
将出发菌株和本发明所述的基因工程菌株在100 mL蓝盖瓶中进行培养，其中本发明所述工程菌株培养基中加入终浓度为50 μg/mL的kan抗性，将菌株培养至OD600nm=0.5，菌株活性保持稳定。将出发菌株和本发明所述的基因工程菌株加入到制备好的含40 mg/L的Cd2+溶液。在15 min，30 min，60 min，120 min，240 min测定溶液上清中的镉含量。通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS，Agilent-7500cx）测定收集的上清液中Cd2+的浓度。
（3） APS蛋白表达量明显增加：
将出发菌株和本发明所述的基因工程菌株在100 mL蓝盖瓶中进行培养，其中本发明所述工程菌株培养基中加入终浓度为50 μg/mL的kan抗性，分别转接至100 mL液体SRB培养基的三角瓶中培养，用PBS（12 mM，pH=7.6，在4℃预冷）洗涤4次。将细胞沉淀重新悬浮在100 μL溶菌酶（200 mg/mL）中，每管中加入500 μL裂解缓冲液，通过超声波破碎提取全细胞蛋白（JY92超声波细胞研磨机，宁波新芝生物技术公司），通过SDS-PAGE观察发现APS蛋白表达量明显增加。
（4） APS蛋白酶活增强：
将上述获得的出发菌株和本发明所述基因工程菌株的蛋白样品进行硫酸盐还原酶（APS）的酶活性检测。通过Quickcheck SRB™试剂盒进行显色反应，然后在酶标仪对96孔板进行分析检测。
（5） 透射电镜观察下菌株镉吸附能力明显增强：
将出发菌株和本发明所述的基因工程菌株在100 mL蓝盖瓶中含有相对应抗性种子液中培养，分别转接至Cd2+含量为50 mg/L的100 mL液体SRB培养基和未含Cd2+ 液体SRB培养基的三角瓶中，用透射电子显微镜（TEM）（H-7650，日立，日本）拍摄菌体的图像。
本发明的有益效果在于：
本发明将来源于柠檬酸杆菌XT1-2-2的硫酸盐还原酶基因cysH通过基因工程的方法成功在红霉素强启动子PermE的作用下进行了过表达，并成功的构建了Citrobacter sp.XT1-2-2-::APS，并且具有一定的重金属镉修复潜力的工程菌株，可以有效的提升在水稻田中对重金属镉的耐受能力，通过透射电镜观察可以明显看到工程菌株对金属镉的吸附效果显著增强。这对于出发菌株而言，是首次通过广宿主载体pBBR1MCS-2在柠檬酸杆菌XT1-2-2中成功的将硫酸盐还原酶（APS）基因cysH进行过表达，并在一定程度上提高了宿主菌镉耐受性，硫酸盐还原酶酶活以及镉富集量。该发明也对以Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS作为功能菌株在降低水稻镉吸收中提供了更多的应用可能。
本发明所述的菌株，其分类命名为柠檬酸杆菌Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS；其保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为中国. 武汉. 武汉大学，保藏日期为2024年9月9日，保藏号为CCTCC NO：M 20241948。
附图说明
图1. 红霉素强启动子PermE、硫酸盐还原酶（APS）基因cysH和PermE+cysH片段融合PCR产物；
图中1. PermE红霉素强启动子片段PCR扩增电泳图；2. cysH片段PCR扩增电泳图；3. PermE+cysH片段融合PCR扩增电泳图；
图2. 广宿主表达载体pBBR1MCS-PermE-cysH的构建图谱；
图3. 表达载体pBBR1MCS-PermE-cysH的双酶切检测电泳和阳性转化子筛选实验结果图；
图中Ａ．1.2均为双酶切检测条带；Ｂ．Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS阳性转化子SRB固体培养基筛选结果
图4. 野生型菌株和工程菌株，液体培养基中不同培养时间Cd2+去除能力测定图；
图5. 野生型菌株和工程菌株的镉动态吸附能力对比图；
图6. 野生型菌株和工程菌株硫酸盐还原酶蛋白SDS-PAGE电泳表达差异图；
图7. 野生型菌株和工程菌株硫酸盐还原酶（APS）的酶活性检测图；
图8. 野生型菌株和工程菌株透射电镜观察图；
图9. PermE红霉素强启动子过表达cysH及硫酸盐代谢途径示意图；
图中A. PermE红霉素强启动子过表达cysJ模式图；B.硫酸盐代谢途径示意图。
具体实施方式
本发明的生物材料来源说明：
1. 质粒来源：质粒pBBR1MCS-2是一种广宿主穿梭载体，购买自Addgene全球质粒共享平台并保存，质粒编号为#85168。
2. 质粒来源：质粒pOJ260-PermE为实验室之前购买并保藏使用的一种基因敲除表达载体，购买于。
3. 出发菌株柠檬酸杆菌XT1-2-2的来源：前期工作中，申请人所在科研团队在湖南省镉污染稻田中筛选获得的具有较好固镉功能的菌株，通过基因组测序以及16S rRNA比对，确定了该菌为柠檬酸杆菌，并命名为XT1-2-2。引物的设计与合成：自行设计并由上海生物工程技术公司合成。
启动子是基因表达必须的顺式作用元件，在基因转录水平调控中具有重要的作用，启动子活性的强弱直接影响了基因的表达水平。本发明在柠檬酸杆菌XT1-2-2中开展了硫酸盐代谢途径启动子筛选研究，我们对公开的已有的启动子序列进行汇总，对能够在柠檬酸杆菌XT1-2-2中进行使用的启动子进行筛选，从中选择了内源启动子PSACE_2101，外源强启动子PermE和组成型启动子Psf进行柠檬酸杆菌硫酸盐代谢途径相关基因的过表达实验。其中PSACE_2101片段和Psf片段分别与目标基因融合电转入柠檬酸杆菌XT1-2-2后，与野生菌株相比，突变菌株在培养时未产生H2S，进而在培养过程中未能使含有Fe2+的培养基变成黑色，因而，后续实验主要开展了外源强启动子PermE分别与目标基因的融合及过表达实验。
实施例1
本实施例说明构建包含PermE-APS片段的重组载体pBBR1MCS-PermE-cysH的方法。其过程包括：
1. 设计带有酶切位点的红霉素强启动子片段和APS片段的上下游引物：
PermE-F：5’-CCGGAATTCCTGGACTTCTAGAGCTAGCC-3’（EcoRI）
PermE-R：5’-GCATGCCGGTCGACTCTA-3’
PermE-APS-F：5’-GATCCTCTAGAGTCGACCGGCATGCATGTCCGTACTTGATCTACA-3’
PermE-APS-R：5’-TGCTCTAGATTACCCTTCGTGCAGCCCGC-3’（XbaI）
2. 以pOJ260-PermE为模版，PCR扩增PermE片段，PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃ 30 s，58.5℃ 30 s，72℃ 50 s，72℃ 5 min，30个循环。结束后，纯化PCR产物。以柠檬酸杆菌XT1-2-2基因组为模版，PCR扩增APS片段，PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，58.5℃ 30 s，72℃ 1 min 50 s，72℃ 5 min，30个循环。结束后，纯化PCR产物。然后将PermE和APS片段进行融合PCR。首先加入两个片段，高保真primer STAR酶，dNTP，ddH2O，PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，58.5℃ 30 s，72℃ 1 min 50 s，72℃ 5 min，13个循环。然后加入引物PermE-F和PermE-APS-R，进行第二步融合PCR。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，58.5℃ 30 s，72℃ 2 min，72℃ 5 min，30个循环。
3. 通过XbaI和EcoRI双酶切将pBBR1MCS-2质粒和PermE-cysH重组片段进行双酶切，通过T4连接酶将线性化的pBBR1MCS-2质粒和PermE-cysH重组片段进行连接，获得重组载体pBBR1MCS-PermE-cysH；重组的载体经过XbaI和EcoRI双酶切，结果如图3所示，证明了重组载体pBBR1MCS-PermE-cysH构建成功；
实施例2
本实施例2说明将构建好的重组载体pBBR1MCS-PermE-cysH通过电击转化导入到柠檬酸杆菌XT1-2-2的感受态细胞中，通过50 μg/mL的卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子的方法，即Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS。
（1） Citrobacter sp. XT1-2-2感受态细胞的制备：接种 Citrobacter sp. XT1-2-2到10 mL SRB液体培养基中，37℃培养至对数期；取1 mL（2%）预培养菌液接种到50 mLSRB液体培养基的锥形瓶中，37℃静置培养24 h至OD600nm 达到0.4-0.5；将菌液转移到2个50mL离心管中，冰上放置10 min，同时预冷离心机、离心管、tip头和CaCl2溶液；离心收集菌体（9000 rpm，4℃，5 min），在无菌工作台倒出上清液，将离心管倒置片刻使上清液流尽；加入25 mL预冷的0.1 mol/L的CaCl2，轻吹并悬浮细胞，冰上放置5-10 min。9000 rpm，4℃，5min离心，去上清；用25 mL预冷的0.1 mol/L的CaCl2重复洗涤1遍，冷冻离心去上清；用2 mL冰预冷的含15%甘油的0.1 mol/L 的CaCl2重悬菌体，用枪轻吹悬浮菌体；按100 μL/管分装感受态细胞，-80℃冻存。
电转化条件：取50 ng重组载体pBBR1MCS-PermE-cysH，按照如下电机转化条件：1250 V，10 μF，3.3 kΩ，1mm。用1 mLSRB液体培养基悬浮后，转入15 mL离心管中30℃，复苏培养12 h，通过50 μg/mL的kan抗性筛选在固体SRB培养基上筛选得到阳性转化子即目的菌株Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS，筛选的阳性转化子在平板上的实验结果如图3B 所示。
实施例3
本实施例3说明构建成功的工程菌株Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS和野生型菌株在液体培养基中镉去除能力、镉动态吸附能力以及硫酸盐还原酶活性差异。
（1） 液体培养基中镉去除能力对比：接种Citrobacter sp. XT1-2-2和工程菌株Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS到10mL SRB液体培养基中，37℃培养至对数期；取1 mL（2%）预培养菌液接种到50 mL SRB液体培养基的锥形瓶中，37℃静置培养48 h至OD600nm 达到0.4-0.5；分别转接至Cd2+含量为50 mg/L的100 mL液体SRB培养基的三角瓶中，进行液体培养基中镉的去除能力检测实验：处理1：Citrobacter sp. XT1-2-2；处理2：Citrobactersp. XT1-2-2-::APS。在不同培养时间0 h，20 h，40 h，60 h，80 h，100 h和120 h分别收集上清液，并通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS，Agilent-7500cx）测定收集的上清液中Cd2+的浓度。结果如图4所示，从图中看到，随着时间的推移，基因工程菌株液体培养基中的镉含量降低程度明显比野生型菌株更大，表明了工程菌株在液体培养基中比野生型菌株的去镉能力更强。
（2） 镉动态吸附能力对比：接种 Citrobacter sp. XT1-2-2和工程菌株Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS到10mL SRB液体培养基中，37℃培养至对数期；取1 mL（2%）预培养菌液接种到50 mL SRB液体培养基的锥形瓶中，37℃静置培养48 h至OD600nm 达到0.4-0.5；制备100 mg/L的镉溶液，加入培养好的菌株。分别在15 min，30 min，60 min，120 min，240 min取上清液，并通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS，Agilent-7500cx）测定收集的上清液中Cd2+的浓度。结果如图5所示，基因工程菌株的镉动态吸附能力显著提升。
（3） 硫酸盐还原酶活性差异：接种Citrobacter sp. XT1-2-2和工程菌株Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS到10 mL SRB液体培养基中，37℃培养至对数期；取1 mL（2%）预培养菌液接种到50 mL SRB液体培养基的锥形瓶中，37℃静置培养48 h至OD600nm 达到0.4-0.5；将野生型菌株和本发明所述基因工程菌株的蛋白样品进行硫酸盐还原酶（APS）的酶活性检测。通过Quickcheck SRB™试剂盒进行显色反应，然后在酶标仪对96孔板进行分析检测。结果表明，基因工程菌株Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS的硫酸盐还原酶酶活性增强，见图7。
实施例4
本实施例4说明构建成功的工程菌株Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS和野生型菌株硫酸盐还原酶蛋白SDS-PAGE表达差异和透射电镜观察菌株形态差异
（1） 硫酸盐还原酶蛋白SDS-PAGE表达差异：接种 Citrobacter sp. XT1-2-2和工程菌株Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS到10 mL SRB液体培养基中，37℃培养至对数期；取1 mL（2%）预培养菌液接种到50 mL SRB液体培养基的锥形瓶中，37℃静置培养48 h至OD600nm 达到0.4-0.5；用PBS（12 mM，pH=7.6，在4℃预冷）洗涤4次。将细胞沉淀重新悬浮在100 μL溶菌酶（200 mg/mL）中，每管中加入500 μL裂解缓冲液，通过超声波破碎提取细菌菌体全蛋白（JY92超声波细胞研磨机，宁波新芝生物技术公司），通过SDS-PAGE电泳观察发现APS蛋白表达量明显增加，见图6。
（2） 将野生型菌株和本发明所述的基因工程菌株在100 mL蓝盖瓶中含有相对应抗性种子液中培养，分别转接至Cd2+含量为50 mg/L的100 mL液体SRB培养基和未含Cd2+ 液体SRB培养基的蓝盖瓶中，用透射电子显微镜（TEM）（H-7650，日立，日本）拍摄菌体的图像。通过透射电镜观察菌株形态，结果如图8所示，工程菌株吸附镉的含量明显较多，且菌体形态发生了较大的变化。
以上实施例证明，通过本发明构建方法得到的基因工程菌株Citrobacter sp.XT1-2-2-::APS可以进一步提升野生型菌株的镉吸附能力和耐受能力，此发明为重金属污染防治的微生物修复提供了一种新颖可行的办法。

Claims (8)

1. 一株柠檬酸杆菌基因工程菌株，其命名为Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS，保藏编号为：CCTCC NO：M 20241948。
2. 权利要求1所述的柠檬酸杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于：该菌株以原始的柠檬酸杆菌（Citrobacter sp.）XT1-2-2为出发菌，将红霉素强启动子插入cysH基因前面改造得到具有降镉能力的工程菌株。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在柠檬酸杆菌XT1-2-2感受态细胞中进行电击转化导入带有红霉素强启动子和APS片段的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1） 以柠檬酸杆菌XT1-2-2菌株基因组DNA为模板，设计带有酶切位点的cysH上下游引物，PCR扩增出带有酶切位点的cysH基因片段，同时以含有红霉素强启动子PermE的载体为模版，设计带有酶切位点的PermE上下游引物，扩增带有酶切位点的PermE片段；通过融合PCR的方法将PermE与cysH片段进行融合，得到PermE-cysJ重组片段；
2） 通过双酶切将质粒和PermE-cysH重组片段进行双酶切，通过连接酶将线性化的质粒和PermE-cysH重组片段进行连接，获得重组载体；
3） 将构建好的重组载体通过电击转化导入到柠檬酸杆菌XT1-2-2的感受态细胞中，通过抗性筛选得到阳性转化子，即Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，
步骤1）以柠檬酸杆菌XT1-2-2菌株基因组DNA为模板，设计带有XbaI酶切位点的cysH上下游引物，PCR扩增出带有酶切位点的cysH基因片段，同时以含有红霉素强启动子PermE的pOJ260-PremE为模版，设计带有EcoRI酶切位点的PermE上下游引物，扩增带有酶切位点的PermE片段；通过融合PCR的方法将PermE与cysH片段进行融合，得到PermE-cysJ重组片段。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，
步骤2）通过XbaI和EcoRI双酶切将pBBR1MCS-2质粒和PermE-cysH重组片段进行双酶切，通过T4连接酶将线性化的pBBR1MCS-2质粒和PermE-cysH重组片段进行连接，获得重组载体pBBR1MCS-PermE-cysH。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，
步骤3）将构建好的重组载体pBBR1MCS-PermE-cysH通过电击转化导入到柠檬酸杆菌XT1-2-2的感受态细胞中，通过50 μg/mL的卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，即Citrobacter sp. XT1-2-2-::APS。
8.权利要求1所述的柠檬酸杆菌基因工程菌株的应用方法，其特征在于，用于修复土壤重金属镉污染。
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