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CN119165163A - Piwil1和eva1a在甲状腺乳头状癌诊断和治疗中的应用 - Google Patents

Piwil1和eva1a在甲状腺乳头状癌诊断和治疗中的应用 Download PDF

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CN119165163A
CN119165163A CN202310725811.7A CN202310725811A CN119165163A CN 119165163 A CN119165163 A CN 119165163A CN 202310725811 A CN202310725811 A CN 202310725811A CN 119165163 A CN119165163 A CN 119165163A
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eva1a
piwil1
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thyroid cancer
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朱庆云
陈佳君
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SHANGHAI PUNAN HOSPITAL
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Abstract

本发明提供了PIWIL1和EVA1A在甲状腺乳头癌诊断和治疗中的应用。具体地，本发明提供了PIWIL1和EVA1A诊断试剂的组合及其在制备判断甲状腺乳头状癌发生风险以及预后判断的试剂盒中的用途。本发明的诊断试剂组合可高效、快速地判断甲状腺乳头状癌患者的预后情况。本发明还提供了PIWIL1抑制剂和EVA1A抑制剂联用的治疗方法，本发明的疗法对甲状腺癌的治疗有显著的治疗效果。

Description

PIWIL1和EVA1A在甲状腺乳头状癌诊断和治疗中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术和临床医学领域，具体地，涉及PIWIL1和EVA1A在甲状腺乳头癌诊断和治疗中的应用。
背景技术
甲状腺乳头状癌(PTC)是甲状腺恶性肿瘤中最普遍的病理亚型。在美国，PTC约占甲状腺或内分泌肿瘤确诊病例的87％。在过去十年中，PTC的发病率平均每年增加3.1％。以往的调查表明，淋巴结转移(LNM)是PTC扩散的主要机制，近一半的患者在诊断时有LNM表现。
此外，PTC的LNM已被证明会对预后产生不利影响，增加复发风险，并降低长期生存率，特别是在年龄大于45岁的患者中。
因此，探索新的诊断和治疗靶点和PTC发展的潜在机制非常重要。
目前，本领域仍缺乏甲状腺乳头状癌发生风险标志物的相关报道，甲状腺癌的更有效治疗方法也有待开发。
因此，本领域迫切需要开发用于临床诊断的高灵敏度和特异度的甲状腺癌风险标志物，用于甲状腺癌的早期诊断和及时的干预治疗；并且需要更新的更有效、更有针对性地治疗甲状腺乳头状癌的药物和方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高灵敏度和高特异性对甲状腺乳头状癌发生风险和预后情况进行判断的试剂组合及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种诊断试剂组合，所述诊断试剂包括：
(A)PIWIL1检测试剂；和
(B)EVA1A检测试剂。
在另一优选例中，所述诊断试剂用于检测待测样品中标志物的表达水平。
在另一优选例中，所述待测样品来自选自下组的对象：甲状腺乳头状癌对象，甲状腺乳头状癌高风险对象，无甲状腺乳头状癌对象、或其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种诊断试剂组合的用途，用于制备一诊断试剂盒，所述诊断试剂盒用于(a)对甲状腺乳头状癌进行预后评估；和/或(b)诊断甲状腺乳头状癌的发生风险；
其中，所述诊断试剂组合用于检测风险标志物的水平，并且所述诊断试剂组合包括：
(A)PIWIL1检测试剂；和
(B)EVA1A检测试剂。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括标签或说明书，所述标签或说明书提供了下表A的预后判断的标准：
表A
在另一优选例中，对标志物PIWIL1的表达水平C1a与对照参比值C0a进行比较，以及对标志物EVA1A的表达水平C1b和对照参比值C0b进行比较，若C1a或C1b显著高于C0a或C0b时，则提示为上调；若C1a或C1b显著低于C0a或C0b时，则提示为下调；若C1a或C1b既不显著高于也不显著低于C0a或C0b时，则提示为正常；
在另一优选例中，所述的上调指，对于标志物PIWIL1而言，C1a/C0a≥1.5，较佳地≥2；对于标志物EVA1A而言，C1b/C0b≥1.5，较佳地≥2。
在另一优选例中，所述的下调指，对于标志物PIWIL1而言，C1a/C0a≤2/3，较佳地≤1/2；对于标志物EVA1A而言，C1b/C0b≤2/3，较佳地≤1/2。
在另一优选例中，所述的正常指，对于标志物PIWIL1而言，C1a/C0a介于0.67-1.5，较佳地0.7-1.3，更佳地0.8-1.2；对于标志物EVA1A而言，C1b/C0b介于0.67-1.5，较佳地0.7-1.3，更佳地0.8-1.2。
在另一优选例中，所述诊断是针对离体样本的诊断。
在另一优选例中，所述诊断试剂用于检测离体样本中所述风险标志物的水平。
在另一优选例中，所述离体样本包括组织样本，较佳地为癌症组织样本和癌旁组织样本。
在另一优选例中，所述的检测试剂偶联有或带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在另一优选例中，所述判断试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白质芯片。
在另一优选例中，所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的特异性寡核苷酸探针，所述的特异性寡核苷酸探针包括与任一所述的甲状腺乳头状癌风险标志物的多核苷酸(mRNA或cDNA)特异性结合的探针。
在另一优选例中，所述的蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的特异性抗体，所述的特异性抗体包括抗所述甲状腺乳头状癌风险标志物的特异性抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在另一优选例中，所述的试剂包括引物、探针、gRNA或其组合，更佳地为用于PCR、qPCR、RT-PCR的引物对或探针。
在另一优选例中，所述甲状腺乳头状癌风险标志物的检测可通过如下的方法进行检测：测序、PCR、或其组合。
在另一优选例中，所述甲状腺癌风险标志物的检测可定量检测。
在另一优选例中，所述诊断试剂用于检测待测样品中标志物的表达水平。
在另一优选例中，所述待测样品来自于人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述待测样品来自于人。
在另一优选例中，所述待测样品来自选自下组的对象：甲状腺乳头状癌对象，甲状腺乳头状癌高风险对象，无甲状腺乳头状癌对象、或其组合。
在本发明的第三方面，提供了一种甲状腺乳头状癌的预后评估设备，所述评估设备包括：
(a)输入模块，所述输入模块用于输入某一检测对象组织中风险标志物数据；
其中，所述的风险标志物是PIWIL1和EVA1A；
(b)处理模块，所述处理模块用于处理甲状腺乳头状癌的预后风险标志物数据，并给出预后风险评估值，其中，所述处理包括：对输入的标志物的表达水平C1a和C1b与对照参比值C0a和C0b进行比较，若C1a或C1b显著高于C0a或C0b时，则提示为上调；若C1a或C1b显著低于C0a或C0b时，则提示为下调；若C1a或C1b既不显著高于也不显著低于C0a或C0b时，则提示为正常；并将比较结果代入表A的判定标准，得出该对象的预后风险高低情况；
其中，所述表A如下：
表A
和
(c)输出模块，所述输出模块用于输出所述的评估结果。
在另一优选例中，所述设备还包括一检测模块，所述检测模块用于检测所述预后风险标志物的水平。
在另一优选例中，所述检测模块选自下组：ELISA分析仪、PCR测序仪、测序仪、或其组合。
在另一优选例中，所述设备还包括一控制模块，所述控制模块用于控制各模块的运行。
在本发明的第四方面，提供了一种活性成分组合，所述活性成分组合包括：
(Z1)第一活性成分，所述的第一活性成分为PIWIL1抑制剂；和
(Z2)第二活性成分，所述的第二活性成分为EVA1A抑制剂。
在本发明的第五方面，提供了一种活性成分组合在制备用于治疗甲状腺乳头状癌的药物组合物中的用途，所述活性成分组合包括：
(Z1)第一活性成分，所述的第一活性成分为PIWIL1抑制剂；和
(Z2)第二活性成分，所述的第二活性成分为EVA1A抑制剂。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(Z1)第一活性成分，所述的第一活性成分为PIWIL1抑制剂；
(Z2)第二活性成分，所述的第二活性成分为EVA1A抑制剂；和
(Z3)药学上可接受的载体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了PIWIL1在PTC组织中高度表达并与EVA1A呈正相关：(A)PIWIL1在各种癌症类型中的表达(癌症基因组图谱数据库)PTC临床标本(n＝20)和邻近组织(n＝20)中(B)PIWIL1和(C)EVA1A的mRNA水平；GAPDH用于标准化；(D)PTC临床标本中PIWIL1mRNA水平与EVA1AmRNA水平的线性回归和相关性分析；(E)PIWIL1蛋白质印迹的代表性图像；(F)EVA1A蛋白质印迹的代表性图像；(G)PTC和邻近组织中PIWIL1和EVA1A蛋白水平的相对变化；每个实验进行三次，数据以平均值±SD表示；PIWIL1，piRNA结合蛋白1；EVA1A、Eva-1同源物A；PTC，甲状腺乳头状癌；#：p＜0.05。
图2显示了PIWIL1的过表达促进了EVA1A在TPC-1细胞中的表达：(A)EVA1A和(B)PIWIL1在各种PTC细胞系(NTHY-ORI3-1、TPC-1、KTC-3、WRO、PDTC-1、SW579和FTC-133)中的mRNA水平；GAPDH用于标准化；(C)EVA1A过表达或敲低后TPC-1细胞中PIWIL1的mRNA水平；GAPDH用于标准化；(D)PIWIL1过表达或敲低后TPC-1细胞中PIWIL1的mRNA水平；GAPDH用于标准化；(E)EVA1A过表达或敲低时TPC-1细胞中EVA1A的mRNA水平；GAPDH用于标准化；(F)PIWIL1过表达或敲低时TPC-1细胞中EVA1A的mRNA水平；GAPDH用于标准化；每个实验进行三次，数据以平均值±SD表示；PIWIL1，piRNA结合蛋白1；EVA1A、Eva-1同源物A；PTC，甲状腺乳头状癌；#：p＜0.05；N＝9。
图3显示了PIWIL1的过表达促进了EVA1A在KTC-3细胞中的表达：(A)EVA1A或(B)PIWIL1过表达或敲低时TPC-1细胞中PIWIL1的mRNA水平；GAPDH用于标准化；(C)EVA1A或(D)PIWIL1过表达或敲低时TPC-1细胞中EVA1A的RNA水平；GAPDH用于标准化；每个实验进行三次，数据以平均值±SD表示；PIWIL1，piRNA结合蛋白1；EVA1A、Eva-1同源物A.#：p<0.05；N＝9。
图4显示了PIWIL1和EVA1A在体外促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖：TPC-1细胞在(A)EVA1A或(B)PIWIL1过表达或敲低时的生存能力；KTC-3细胞在(C)EVA1A或(D)PIWIL1过表达或敲低时的生存能力；每个实验进行三次，数据以平均值±SD表示；PIWIL1，piRNA结合蛋白1；EVA1A、Eva-1同源物A.#：p<0.05；N＝9。
图5显示了PIWIL1和EVA1A在体外增加了甲状腺乳头状癌细胞的细胞周期活性：(A)EVA1A或(B)PIWIL1过表达或敲低后，TPC-1细胞在细胞周期的每个阶段中的百分比；(C)EVA1A或(D)PIWIL1过表达或敲除后细胞周期每个阶段中KTC-3细胞的百分比；通过流式细胞术分析(E)EVA1A或(F)PIWIL1过表达或敲低后TPC-1细胞的细胞周期活性；每个实验进行三次，数据以平均值±SD表示；PIWIL1，piRNA结合蛋白1；EVA1A、Eva-1同源物A.#：p<0.05；N＝9。
图6显示了PIWIL1和EVA1A在体外抑制甲状腺乳头状癌细胞的凋亡：(A)EVA1A或(B)PIWIL1过表达或敲低后TPC-1细胞的凋亡；(C)EVA1A或(D)PIWIL1过表达或敲低后KTC-3细胞的凋亡；通过流式细胞术分析(E)EVA1A或(F)PIWIL1过表达或敲低后TPC-1细胞的凋亡；每个实验进行三次，数据以平均值±SD表示；PIWIL1，piRNA结合蛋白1；EVA1A、Eva-1同源物A.#：p<0.05；N＝9。
图7显示了PIWIL1和EVA1A在体外促进甲状腺乳头状癌细胞的侵袭：(A)EVA1A或(B)PIWIL1过表达或敲低时TPC-1细胞的Transwell细胞计数；(C)EVA1A或(D)PIWIL1C过表达或敲低时KTC-3细胞的Transwell细胞计数；(E)通过Transwell侵袭试验分析EVA1A过表达或敲低后TPC-1细胞的侵袭；(F)通过Transwell侵袭测定分析PIWIL1过表达或敲低后TPC-1细胞的侵袭；每个实验进行三次，数据以平均值±SD表示；PIWIL1，piRNA结合蛋白1；EVA1A、Eva-1同源物A.#：p<0.05；N＝9。
图8显示了PIWIL1在体外和体内通过EVA1A促进甲状腺乳头状癌的增殖和凋亡：(A)(B)在EVA1A过表达和PIWIL1敲低或PIWIL1过表达和EVA1A敲低时TPC-1细胞的存活率和凋亡；(C)(D)在EVA1A过表达和PIWIL1敲低，或PIWIL1过表达和EVA1A敲低时KTC-3细胞的存活率和(D)凋亡；(E)注射过表达EVA1A和PIWIL1敲除的TPC-1细胞或过表达PIWIL1和EVA1A敲除的TPP-1细胞后来自动物模型的异种移植物肿瘤的图像；(F)注射过表达EVA1A和PIWIL1敲除的TPC-1细胞，或注射过表达PIWIL1和EVA1A敲除的TPP-1细胞后，动物模型的肿瘤大小；每个实验进行三次，数据以平均值±SD表示；PIWIL1，piRNA结合蛋白1；EVA1A、Eva-1同源物A.#：p<0.05；N＝9。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了甲状腺乳头状癌(PTC)风险标志物PIWIL1和EVA1A存在紧密的相互作用关系，并相应开发了用于对甲状腺乳头状癌发生风险和预后情况进行判断的诊断试剂/试剂盒和设备。使用PIWIL1检测试剂和EVA1A检测试剂的组合进行诊断，可高灵敏和高特异性地对甲状腺乳头状癌的发生风险和预后情况进行诊断和评估。
本发明人还发现，使用本发明的抑制剂组合(PIWIL1抑制剂和EVA1A抑制剂)可有效抑制甲状腺乳头状癌的发展。在此基础上完成了本发明。
术语
本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样本可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。
如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如Western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。
如本文所用，术语“参比值”或“对照参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比较甲状腺乳头状癌风险标志物的mRNA表达和/或蛋白的表达，并进行统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的族群、医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。
PIWIL1
PIWIL亚家族的Argonaute蛋白通过结合睾丸中的piRNA在生殖功能中起着核心作用。然而，最近的证据表明，这些蛋白质也可能与其他疾病，特别是癌症有关。
piRNA结合蛋白1(PIWIL1)是PIWI蛋白家族中研究最广泛的蛋白。它已涉及调节各种生理和病理过程，包括DNA损伤反应，细胞周期进程，凋亡，细胞增殖和紧密连接形成等。特别是，它已被证明在调节几种癌症的进展中起重要作用。然而，PIWIL1对甲状腺乳头状癌(PTC)发病机理的贡献仍有待阐明。
EVA1A
EVA1A(Eva-1同源物A)的功能为溶酶体和内质网相关蛋白，可调节细胞增殖和凋亡。在HCC和非小细胞肺癌的临床样本中已经观察到EVA1A的下调，它通过自噬和凋亡抑制肿瘤细胞的生长。
相反，对The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库的分析显示，EVA1A在甲状腺癌组织中明显上调(P<0.0001)，尽管迄今为止没有揭示过EVA1A和PIWIL1在甲状腺癌中存在关联。
一些研究表明，EVA1A与肿瘤发生有关。Ren等人证明微小RNA-125b抑制EVA1A介导的自噬，逆转肝细胞癌中的奥沙利铂耐药性。胰腺癌组织中EVA1A的差异表达表明其参与了胰腺癌症的进展。
甲状腺乳头状癌风险标志物
如本文所用，术语“本发明的甲状腺乳头状癌风险标志物”、“本发明的甲状腺乳头癌风险标志物”和“本发明的风险标志物”可互换使用，指“PIWIL1、EVA1A、或其组合”。
在本发明中，术语“甲状腺乳头状癌风险标志物基因”、“甲状腺乳头状癌风险标志物的多核苷酸”可互换使用，都指PIWIL1、EVA1A、或其组合中所示的任一甲状腺乳头状癌风险标志物的核苷酸序列。
需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。
在得到了甲状腺乳头状癌风险标志物的信息的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的甲状腺乳头状癌风险标志物的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的甲状腺乳头状癌风险标志物。
检测方法
基于甲状腺乳头状癌患者的甲状腺乳头状癌风险标志物PIWIL1和EVA1A表达水平在组织中升高，本发明还提供了相应的诊断甲状腺乳头状癌发生风险和预后风险的方法。
本发明涉及定量和定位检测人甲状腺乳头状癌风险标志物水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的甲状腺乳头状癌风险标志物水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)甲状腺乳头状癌发生的风险，和/或甲状腺乳头状癌的预后评价。
一种优选的方法是对甲状腺乳头状癌风险标志物进行定量检测。
优选地，一种检测样本中是否存在甲状腺乳头状癌风险标志物的方法是利用特异性抗原进行检测，它包括：将样本与抗原蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样本中存在甲状腺乳头状癌风险标志物。
本发明甲状腺乳头状癌风险标志物可用于甲状腺乳头状癌的诊断。甲状腺乳头状癌风险标志物的抗原蛋白可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样本中的甲状腺乳头状癌风险标志物白。
基于本发明的研究，本发明甲状腺乳头状癌风险标志物水平，在甲状腺乳头状癌患者中存在显著上升。因此，本发明甲状腺乳头状癌风险标志物可用作检测或诊断(尤其是辅助性诊断和/或早期诊断)甲状腺乳头状癌发生风险的标志物。
在检测时，当甲状腺乳头状癌风险标志物是上调的标志物且标志物水平C1与正常人群中的相应水平C0的比值(C1/C0)≥1.5，较佳地≥2更佳地≥3；则均可视为甲状腺乳头状癌发生的风险上升。当甲状腺乳头状癌风险标志物是下调的标志物，且正常人群中的相应水平C0与标志物水平C1的比值(C1/C0)≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥3；则均可视为甲状腺乳头状癌发生的风险上升。
检测试剂盒
基于本发明甲状腺乳头状癌风险标志物与甲状腺乳头状癌发生风险和预后的相关性，因此本发明甲状腺乳头状癌风险标志物可以作为甲状腺乳头状癌发生的诊断标志物，和/或甲状腺乳头状癌预后评估标志物。
本发明提供的甲状腺乳头状癌风险标志物包括PIWIL1和EVA1A。
发明还提供了一种诊断甲状腺乳头状癌发生的试剂盒，所述的试剂盒含有一检测试剂，所述检测试剂用于检测本发明甲状腺乳头状癌风险标志物。优选地，所述试剂盒含有本发明的甲状腺乳头状癌风险标志物的抗原，或其活性片段。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于诊断甲状腺乳头状癌发生风险和/或评价甲状腺乳头状癌预后情况。
药物组合物及施用方法
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体偶联物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
在本发明中，可将所述的表达载体直接施用于对象，也可将所述的表达载体与药学上可接受的载体制备成药物组合后进行施用。所述的施用包括静脉注射。
治疗方法
本发明还提供了一种治疗PIWIL1高表达或EVA1A高表达的甲状腺乳头状癌的方法，即，将安全有效量的本发明药物组合物施用于所需对象，从而治疗PIWIL1高表达或EVA1A高表达的甲状腺乳头状癌。
通常，“PIWIL1高表达或EVA1A高表达甲状腺乳头状癌”指的是所述的肿瘤中，PIWIL1或EVA1A的表达量E1与癌旁组织或正常组织中PIWIL1或EVA1A的量E0相比具有显著性差异，较佳地，所述“高表达”指的是E1≥1.5E0，更佳地E1≥2E0。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的诊断试剂组合可以高灵敏度、和更高准确度地判断甲状腺乳头状癌的发生风险和预后情况。
(b)本发明的药物组合物可以有效抑制甲状腺乳头状癌的发展。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
材料和方法
研究对象
本发明收集了20对甲状腺乳头状癌(PTC)组织和邻近的正常组织。
本发明实验细胞为人甲状腺癌细胞系(NTHY-ORI 3-1、TPC-1、KTC-3、WRO、SW579和FTC-133)，购自美国典型培养物保藏中心。
本发明动物体内实验采用裸鼠(BALB/c裸鼠；雄性，4周龄)，取自公司(上海西普博克实验动物有限公司)，在无致病条件下培养。
TCGA数据库
本发明收集了468例PTC患者资料，这些资料显示出完整的临床病理特征，包括年龄、性别、LNM、肿瘤大小、临床分期和组织学类型。数据来自TCGA数据门户(https://tcga-data.nci.nih.gov/docs/publications/tcga/)以便进一步分析。
蛋白质印迹
通过用RIPA缓冲液(Sigma，USA)裂解从PTC和邻近的正常组织中提取总蛋白。使用BCA测定法(Beyotime，中国)评估蛋白质的数量和质量。将等量的蛋白质加载到12％的凝胶(Bio-Rad，USA)上，并转移到PVDF膜(GE Healthcare，USA)。将这些膜在脱脂乳(Beyotime，中国)中孵育1小时，然后与针对PIWIL1、EVA1A或GAPDH(Sigma，美国)的一级抗体在4hC下孵育过夜。随后，用TBST洗涤膜，并在室温下暴露于第二抗体(Sigma，USA)2小时。最后，使用ECL发光试剂(Absin Bioscience Inc.，中国股份有限公司)对印迹进行可视化，并使用Image-Pro Plus 6.0(Media Control netics，Inc.)量化带强度。
细胞培养
人甲状腺癌细胞系(NTHY-ORI 3-1、TPC-1、KTC-3、WRO、SW579和FTC-133)购自美国典型培养物保藏中心。使用添加20％FBS(Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.)的高糖DMEM(Millipore，Sigma)培养细胞。将细胞置于T-75烧瓶(美国科宁)中，并在37℃的5％CO2气氛中培养。
细胞凋亡测定
使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京科创生物技术有限公司)评估细胞的凋亡率。收集细胞并将其悬浮在5×105细胞/ml的结合缓冲液中。接下来，用膜联蛋白V-FITC(10μl)和PI(5μl)标记细胞，并使用(BD Biosciences)通过流式细胞术分析细胞凋亡。采用Flowjo V10.0.7软件对所得流式细胞仪数据进行分析。
细胞周期测定
使用胰蛋白酶消化TPC-1或KTC-3细胞，然后在37℃下以400x g离心10分钟。用PBS洗涤两次后，将细胞在-20℃下用75％乙醇固定过夜。测试前，用PBS洗涤细胞两次，然后用500μl PI染色溶液染色。将染色的细胞在室温下在黑暗中固定20分钟。使用流式细胞仪(BD Biosciences)进行细胞周期测定，并使用Flowjo V10.0.7软件分析结果。
细胞活力测定
根据制造商的说明，使用细胞计数试剂盒(CCK)-8测定法(Abcam)评估TPC-1或KTC-3细胞的生存能力。每组细胞悬浮液以5×104个细胞/ml的浓度接种到96孔板中，并在高糖DMEM中培养24小时。然后用90μl新鲜培养基和5μl CCK-8溶液的混合物代替培养基。96well板在37hC下培养2小时，然后使用微孔板阅读器(BioTek Instruments，Inc.)在450nm处测量每个孔的光密度。
Transwell侵入试验
细胞在生长培养基中培养，2×104细胞接种在transwell室(Corning，Inc.)。Matrigel(Millipore，Sigma)用于预涂膜。用含有5％血清作为诱导剂的RPMI-1640培养基填充室的底部。48小时后，使用棉签去除未侵入的细胞。用8％多聚甲醛固定室底部的侵入细胞，并在用0.1％结晶紫染色后在光学显微镜(Zeiss，德国)下观察。
逆转录定量PCR(RT-qPCR)
按照制造商的说明，使用(Millipore，Sigma)分离细胞的总RNA。在ABIPRISM 7500实时PCR系统(Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.)中，使用SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒(上海叶森生物科技有限公司)进行反转录(RT)。每个反应均进行三次。使用2-ΔΔCt方法分析所获得的数据，并通过使用GAPDH作为负载对照来标准化基因的表达。所使用的qPCR引物列于表1中。
表1用于聚合酶链式反应的引物
小干扰RNA(siRNA)
为了抑制EVA1A或PIWIL1的表达，将培养至75-85％合流率的TPC-1或KTC-3细胞转染特定siRNA(100nM)或使用2000(Invitrogen；Thermo FisherScientific，Inc.)打乱siRNA(100nM)。在37℃和5％CO2下培养6小时后，添加含有10％FBS的生长培养基(Gibco；Thermo-Fisher科学，Inc.)。转染48小时后收获细胞用于RNA提取。这些siRNA是从Genomedicech(中国上海)获得的。
慢病毒转染
EVA1A或PIWIL1过表达是通过从GeneChem，Inc.获得的慢病毒载体诱导的。阴性对照载体和特定慢病毒载体也是从同一来源获得的。培养TPC-1或KTC-3细胞并将其接种到12孔板中，然后使用2000(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.)与相应的慢病毒载体孵育。然后培养细胞72小时，每6小时更换一次培养基。
动物实验
裸鼠(BALB/c裸鼠；雄性，4周龄)取自公司(上海西普博克实验动物有限公司)，在无致病条件下培养。将小鼠随机分为五组(N＝6)，并重复实验三次。为了诱导异种移植物肿瘤的发展，TPC-1细胞(2×107个细胞/ml，200μl)皮下注射。每7天测量肿瘤的体积和重量，直到对小鼠实施安乐死的42天研究期结束。收集肿瘤结节以评估肿瘤大小。将组织冷冻在液氮中以进行进一步分析。所有动物研究均在普南医院动物护理委员会(PNHEA2021001)批准后进行。
统计分析
数据分析采用SPSS 21.0软件(IBM Corp.)进行，线性回归和相关分析确定EVA1AmRNA与PIWIL1 mRNA之间的关系。数据以平均值±标准差表示，每个实验至少重复三次。p值小于0.05被认为具有统计学意义。
实施例1PIWIL1在PTC组织中表现出高表达并与EVA1A呈正相关
使用TCGA数据库评估了PIWIL1在各种肿瘤中的表达。
结果显示，与正常甲状腺组织相比，在PTC中观察到的表达显著增加(图第1A)。
临床标本(n＝20)中PIWIL1表达的RT-qPCR验证与TCGA数据一致(图1B)。
此外，EVA1A mRNA水平在PTC组织中上调(n＝20)(图1C)，在PTC组织的EVA1A和PIWIL1表达之间观察到正相关(图1D)。
相对于邻近组织，PTC组织中PIWIL1和EVA1A的蛋白质水平均显著升高(图1E-G)。
实施例2PIWIL1在PTC细胞中诱导EVA1A的表达
本发明人评估了各种甲状腺癌症细胞系(NTHY-OR13-1、TPC-1、KTC-3、WRO、PDTC-1、SW579和FTC-133)中EVA1A和PIWIL1的mRNA水平。只有TPC-1和KTC-3细胞显示PIWIL1和EVA1A的mRNA水平显著上调(图2A和B)。因此，本发明人选择了TPC-1和KTC-3细胞进行进一步的实验。
细胞测试结果显示，在EVA1A敲低或过表达TPC-1细胞中，PIWIL1的表达没有显著变化(图2C和E)。
相反，PIWIL1可以调节TPC-1细胞中EVA1A的表达(图2D和F)。
此外，KTC-3细胞的RT-qPCR分析证实了这些结果(图3A-D)。
总之，本发明人的数据表明，PIWIL1的过表达促进了EVA1A在PTC细胞中的表达。
实施例3PIWIL1和EVA1A对PTC细胞的影响
3.1PIWIL1和EVA1A促进PTC细胞增殖
通过细胞活力测定评估PTC细胞系(TPC-1和KTC-3)的增殖。
与对照组(未经处理或用siRNA或慢病毒对照处理的PTC细胞)相比，TPC-1细胞中的PIWIL1或EVA1A过表达导致细胞活力的阳性增加，而敲低PIWIL1和EVA1A导致细胞活力降低(图4A和B)。
这些发现也通过KTC-3细胞中的细胞活力测定得到了验证(图4C和D)。
总之，结果表明PIWIL1或EVA1A的上调增强了体外PTC细胞的增殖。
3.2PIWIL1和EVA1A增强PTC细胞的细胞周期活性
评估PIWIL1和EVA1A对PTC细胞的细胞周期的影响。
TPC-1细胞中任一基因的过表达增加了G2/M期细胞的百分比，而下调导致细胞周期停滞(图第5A、B和E段)。在KTC-3细胞中观察到类似的结果(图5C、D和F)。
这些发现表明，PIWIL1或EVA1A的过表达增强了体外PTC细胞中的细胞周期活性(图5A-F)。
3.3PIWIL1和EVA1A抑制PTC细胞凋亡
凋亡测定表明，PIWIL1或EVA1A的过表达在体外阻碍了TPC-1细胞的凋亡。相反，敲低PIWIL1或EVA1A增强了TPC-1细胞的凋亡(图6A、B和E)。
在KTC-3细胞中也进行了类似的观察(图6C、D和F)，这共同表明PIWIL1或EVA1A过表达在体外抑制PTC细胞的凋亡。
3.4PIWIL1和EVA1A促进PTC细胞的侵袭
Transwell侵袭分析表明，PIWIL1或EVA1A的过表达加剧了TPC-1细胞的侵袭，而它们的下调减弱了这种侵袭(图7A、B和E)。对KTC-3细胞进行的Transwell侵入测定进一步证实了这些发现(图7C、D和F)。
因此，结果表明，PIWIL1或EVA1A的过表达增强了PTC细胞的侵袭。
实施例4PIWIL1通过EVA1A在体外和体内促进PTC细胞增殖和凋亡
4.1体外实验
通过操纵PIWIL1和EVA1A在TPC-1和KTC-3细胞中的表达水平，进一步探讨了它们之间的关系。具体而言，在TPC-1和KTC-3细胞中进行了PIWIL1的过表达和EVA1A的敲低，或EVA1A的过表达并敲低PIWIL1。使用细胞活力和细胞凋亡测定来评估这些操作对增殖和细胞凋亡的影响。
TPC-1中的结果(图8A和B)和KTC-3(图8C和D)细胞显示，PIWIL1在体外通过EVA1A促进PTC细胞增殖和凋亡。
4.2体内实验
本发明人通过建立异种移植物肿瘤小鼠模型验证了PIWIL1和EVA1A的体内功能。
本发明人的数据表明，过表达PIWIL1的肿瘤显示出大小增加，这在EVA1A敲低时减弱。
相反，PIWIL1表达减少的肿瘤表现出尺寸减小，这被EVA1A过表达阻断。
这些发现支持了PIWIL1在体内通过EVA1A促进PTC的观点(图8E和F)。
总之，本发明的结果表明，PIWIL1在体外和体内通过EVA1A促进PTC细胞的增殖和凋亡，从而使PTC恶化。
基于本发明的上述实验，由于PIWIL1和EVA1A存在紧密的相互关系且PIWIL1通过EVA1A来促进甲状腺乳头状癌(PTC)的发生和进展，因此，可基于以下判断标准进行预后判断(或参见表A)，并相应采取优化的个性化治疗方案：
(a)当PIWIL1和EVA1A中的两者的表达水平均为上调，或一个为上调而另一个为正常时，甲状腺乳头状癌(PTC)的预后差(或甲状腺乳头状癌的发生风险高)；
(b)当PIWIL1和EVA1A中的两者的表达水平均为正常(与正常人群比较)，或一个为下调而另一个为正常时，甲状腺乳头状癌(PTC)的预后好(或甲状腺乳头状癌的发生风险低)；
(c)当PIWIL1的表达水平均为上调，而EVA1A的表达水平为下调时，甲状腺乳头状癌(PTC)的预后好(或甲状腺乳头状癌的发生风险低)；
(d)当PIWIL1的表达水平均为下调，而EVA1A的表达水平为上调时，甲状腺乳头状癌(PTC)的预后较好(或甲状腺乳头状癌的发生风险较低)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种诊断试剂组合，其特征在于，所述诊断试剂组合包括：
(A)PIWIL1检测试剂；和
(B)EVA1A检测试剂。
2.如权利要求所述的诊断试剂组合，其特征在于，所述诊断试剂用于检测待测样品中标志物的表达水平。
3.如权利要求1所述的诊断试剂组合，其特征在于，所述待测样品来自选自下组的对象：甲状腺乳头状癌对象、甲状腺乳头状癌高风险对象、无甲状腺乳头状癌对象、或其组合。
4.一种诊断试剂组合的用途，其特征在于，用于制备一诊断试剂盒，所述诊断试剂盒用于(a)对甲状腺乳头状癌进行预后评估；和/或(b)诊断甲状腺乳头状癌的发生风险；
其中，所述诊断试剂组合用于检测风险标志物的水平，并且所述诊断试剂组合包括：
(A)PIWIL1检测试剂；和
(B)EVA1A检测试剂。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂用于检测离体样本中所述风险标志物的水平。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述试剂盒中还包括标签或说明书，所述标签或说明书提供了下表A的预后判断的标准：
表A
7.一种甲状腺乳头状癌的预后评估设备，其特征在于，所述评估设备包括：
(a)输入模块，所述输入模块用于输入某一检测对象组织中预后风险标志物数据；
其中，所述的预后风险标志物是PIWIL1和EVA1A；
(b)处理模块，所述处理模块用于处理甲状腺乳头状癌的预后风险标志物数据，并给出预后风险评估值，其中，所述处理包括：对输入的标志物的表达水平C1a和C1b与对照参比值C0a和C0b进行比较，若C1a或C1b显著高于C0a或C0b时，则提示为上调；若C1a或C1b显著低于C0a或C0b时，则提示为下调；若C1a或C1b既不显著高于也不显著低于C0a或C0b时，则提示为正常；并将比较结果代入表A的判定标准，得出该对象的预后风险高低情况；
其中，所述表A如下：
表A
和
(c)输出模块，所述输出模块用于输出所述的评估结果。
8.一种活性成分组合，其特征在于，所述活性成分组合包括：
(Z1)第一活性成分，所述的第一活性成分为PIWIL1抑制剂；和
(Z2)第二活性成分，所述的第二活性成分为EVA1A抑制剂。
9.一种活性成分组合在制备用于治疗甲状腺乳头状癌的药物组合物中的用途，其特征在于，所述活性成分组合包括：
(Z1)第一活性成分，所述的第一活性成分为PIWIL1抑制剂；和
(Z2)第二活性成分，所述的第二活性成分为EVA1A抑制剂。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
(Z1)第一活性成分，所述的第一活性成分为PIWIL1抑制剂；
(Z2)第二活性成分，所述的第二活性成分为EVA1A抑制剂；和
(Z3)药学上可接受的载体。
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