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CN119120476A - 用于抑制细胞中lpa的表达的核酸 - Google Patents

用于抑制细胞中lpa的表达的核酸 Download PDF

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CN119120476A
CN119120476A CN202411317688.6A CN202411317688A CN119120476A CN 119120476 A CN119120476 A CN 119120476A CN 202411317688 A CN202411317688 A CN 202411317688A CN 119120476 A CN119120476 A CN 119120476A
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S·舒伯特
S·滕鲍姆
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J·豪普特曼
A·温格尔特纳
D·A·瑞德尔
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Abstract

本发明涉及产品和组合物以及它们的用途。特别地，本发明涉及干扰LPA基因表达或抑制其表达的核酸产品，所述核酸产品用于治疗、预防心血管疾病诸如冠心病或主动脉瓣狭窄或中风或与含Lp(a)粒子的升高相关联的任何其他病症、病理或综合征，或降低遭受心血管疾病诸如冠心病或主动脉瓣狭窄或中风或与含Lp(a)粒子的升高相关联的任何其他病症、病理或综合征的风险。

Description

用于抑制细胞中LPA的表达的核酸
本申请是申请号为201880073189.3、申请日为2018年11月13日、发明名称为“用于抑制细胞中LPA的表达的核酸”的中国专利申请的分案申请。
本发明涉及产品和组合物以及它们的用途。特别地，本发明涉及干扰LPA基因表达或抑制其表达的核酸产品。所述治疗性Lp(a)降低疗法用于预防中风、动脉粥样硬化、血栓形成和心血管疾病诸如冠心病和主动脉瓣狭窄或与含Lp(a)粒子的水平升高相关联的任何其他病症、病理或综合征，以及降低遭受中风、动脉粥样硬化、血栓形成和心血管疾病诸如冠心病和主动脉瓣狭窄或与含Lp(a)粒子的水平升高相关联的任何其他病症、病理或综合征的风险。
背景技术
已显示能够互补性结合表达的mRNA的双链RNA(dsRNA)能够通过已被称为RNA干扰(RNAi)的机理来阻断基因表达(Fire等,1998,Nature.1998年2月19日；391(6669):806-11以及Elbashir等,2001,Nature.2001年5月24日；411(6836):494-8)。短dsRNA在包括脊椎动物的许多生物体中引导基因特异性转录后沉默，并且已成为一种可用于研究基因功能的工具。RNAi由RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导，所述复合物是一种使与装载至RISC复合物中的沉默触发物同源的信使RNA降解的序列特异性多组分核酸酶。干扰RNA(在本文中被称为iRNA)诸如siRNA、抗第二链RNA和微小RNA是通过基因沉默，即通过使mRNA分子降解来抑制蛋白质的基因翻译以阻止形成蛋白质的寡核苷酸。对于在医学中的治疗应用来说，基因沉默剂正变得日益重要。
根据Watts和Corey,Journal of Pathology(2012；第226卷,第365-379页)，存在可用于设计核酸沉默触发物的算法，但所有这些算法都具有严重局限性。可能要采用各种实验方法来鉴定强力iRNA，因为算法不考虑诸如靶标mRNA的三级结构或RNA结合蛋白牵连的因素。因此，发现具有最小脱靶效应的强力核酸沉默触发物是一个复杂过程。对于这些高度带电荷分子的药物开发来说，必要的是它们可被经济地合成，分配至靶标组织中，进入细胞，并且在可接受的毒性限度内发挥功能。
Lp(a)是一种主要在肝中表达的异质低密度脂蛋白粒子(Witztum和Ginsberg,JLipid Res.2016年3月；57(3):336-9)。它由载脂蛋白(a)(Apolipoprotein(a))(Apo(a)由LPA基因编码)通过ApoB多肽连接于LDL组成。遗传限定的高Lp(a)血清水平不受膳食和运动的影响，并且通过相关联的动脉粥样硬化潜在性而与罹患心血管疾病的风险增加相关联(Alonso等,Journal of the American College of Cardiology第63卷,第19期,2014)。根据诊断学和预防医学，患者的Lp(a)血清水平是冠心病和主动脉瓣狭窄的一种高度普遍的独立遗传风险因素(Saeedi和Frohlich Clinical Diabetes and Endocrinology(2016)2:7)。除间接标准一般性LDL降低措施之外，不存在当前被核准的特定Lp(a)降低疗法。因此，当前需要用于有效治疗、预防诸如以下以及与以下相关的病症以及降低罹患诸如以下以及与以下相关的病症的风险的方法：中风、动脉粥样硬化、血栓形成和心血管疾病诸如冠心病、主动脉瓣狭窄以及其他尚未鉴定的相关病症、病理或综合征。本发明解决这个未满足的医学需要：
本发明的第一方面涉及一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73。
在一个实施方案中，核酸在第一链中包含具有参考序列SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73中的任一者的至少15个，优选地，至少16个，更优选地，至少17个，还更优选地，至少18个，并且最优选地，至少19个核苷酸的序列。
在一个实施方案中，相对于包含在第一链序列中的具有参考序列的部分，第一链序列中的单核苷酸错配的数目是至多三，优选地是至多二，更优选地是至多一，并且最优选地是零。
第二链可包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40、42、44、64、66、68、70、72或74的核苷酸序列。
第一链可包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9的核苷酸序列，和/或第二链可包含SEQID NO:6和SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
第一链和/或第二链的长度可各自为17-35个核苷酸，并且至少一个双链体区域的长度可为10-25个核苷酸。双链体可包含两个单独链，或它可包含含有第一链和第二链的单一链。
核酸可：a)在两个末端均是钝性末端；b)在一个末端具有突出部分，并且在另一末端具有钝性末端；或c)在两个末端均具有突出部分。
第一链和/或第二链上的一个或多个核苷酸可被修饰以形成经修饰核苷酸。第一链的奇数编号核苷酸中的一个或多个可被修饰。第一链的偶数编号核苷酸中的一个或多个可由至少第二修饰加以修饰，其中所述至少第二修饰不同于一个或多个奇数核苷酸上的修饰。一个或多个经修饰偶数编号核苷酸中的至少一者可邻近于一个或多个经修饰奇数编号核苷酸中的至少一者。
在本发明的核酸中，第一链中的多个奇数编号核苷酸可被修饰。第一链中的多个偶数编号核苷酸可由第二修饰加以修饰。第一链可包含由共同修饰加以修饰的邻近核苷酸。第一链还可包含由第二不同修饰加以修饰的邻近核苷酸。
第二链的奇数编号核苷酸中的一个或多个可由不同于第一链上的奇数编号核苷酸的修饰的修饰加以修饰，和/或第二链的偶数编号核苷酸中的一个或多个可由第一链的奇数编号核苷酸的相同修饰加以修饰。第二链的一个或多个经修饰偶数编号核苷酸中的至少一者可邻近于一个或多个经修饰奇数编号核苷酸。第二链的多个奇数编号核苷酸可由共同修饰加以修饰，和/或多个偶数编号核苷酸可由存在于第一链奇数编号核苷酸上的相同修饰加以修饰。第二链上的多个奇数编号核苷酸可由第二修饰加以修饰，其中所述第二修饰不同于第一链奇数编号核苷酸的修饰。
第二链可包含由共同修饰加以修饰的邻近核苷酸，所述共同修饰可为不同于第一链的奇数编号核苷酸的修饰的第二修饰。
在本发明的核酸中，第一链中的奇数编号核苷酸中的每一个和第二链中的偶数编号核苷酸中的每一个可用共同修饰加以修饰，并且第一链中的偶数编号核苷酸中的每一个可用第二修饰加以修饰，并且第二链中的奇数编号核苷酸中的每一个可用第二不同修饰加以修饰。
本发明的核酸可具有第一链的相对于第二链的未修饰或以不同方式修饰的核苷酸，移位至少一个核苷酸的经修饰核苷酸。
一个或多个修饰可各自以及单独地选自由以下组成的组：3'-末端脱氧胸腺嘧啶、2'-O-甲基、2'-脱氧修饰、2'-氨基修饰、2'-烷基修饰、吗啉代基修饰、氨基磷酸酯修饰、5'-硫代磷酸酯基团修饰、5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物修饰以及胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团修饰，和/或经修饰核苷酸可为锁核苷酸、无碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任一者。
至少一个修饰可为2'-O-甲基，和/或至少一个修饰可为2'-F。
作为第二方面，本发明还提供了一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73，其中第一链的核苷酸由在奇数编号核苷酸上的第一修饰加以修饰，并且由在偶数编号核苷酸上的第二修饰加以修饰，并且所述第二链的核苷酸由在偶数编号核苷酸上的第三修饰加以修饰，并且由在奇数编号核苷酸上的第四修饰加以修饰，其中至少所述第一修饰不同于所述第二修饰，并且所述第三修饰不同于所述第四修饰。第二链可包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、64、66、68、70、72或74的核苷酸序列。第三修饰和第一修饰可相同，和/或第二修饰和第四修饰可相同。
第一修饰可为2’OMe，并且第二修饰可为2’F。
在第二方面的核酸中，第一链可包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9的核苷酸序列，并且第二链可包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
序列和修饰可如下表中所示；所述表格显示基于如本文提供的表1的摘录的优选序列：
SEQ ID NO:5 5’auaacucuguccauuacca 3’ 6162717181736152736
SEQ ID NO:6 5’ugguaauggacagaguuau 3’ 1845261846364645161
SEQ ID NO:9 5’auaacucuguccauuaccg 3’ 6162717181736152738
SEQ ID NO:10 5’cgguaauggacagaguuau 3’ 3845261846364645161
其中特定修饰由以下数字描绘
1＝2’F-dU；
2＝2’F-dA；
3＝2’F-dC；
4＝2’F-dG；
5＝2’-OMe-rU；
6＝2’-OMe-rA；
7＝2’-OMe-rC；
8＝2’-OMe-rG。
本发明的核酸可在第一链和/或第二链的一个、两个或三个末端3’核苷酸和/或一个、两个或三个末端5’核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。它可包含在第一链上的三个末端3’核苷酸中的每个核苷酸之间和在第一链上的三个末端5’核苷酸中的每个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯键，以及在第二链的3’末端的三个末端核苷酸之间的两个硫代磷酸酯键。
这种核酸可缀合于配体。
作为第三方面，本发明还提供了一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73，并且其中所述核酸缀合于配体。
配体可包含(i)一个或多个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分及其衍生物，和(ii)接头，其中所述接头使所述GalNAc部分缀合于如在任何先前方面所定义的序列。接头可为二价或三价或四价分支结构。核苷酸可如本文所定义加以修饰。
配体可包括式I：
[S-X1-P-X2]3-A-X3-(I)
其中：
S代表糖，其中所述糖是N-乙酰基半乳糖胺；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m是1、2或3；
P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地是硫代磷酸酯)；
X2是亚烷基或式(-CH2)n-O-CH2-亚烷基醚，其中n＝1-6；
A是分支单元；
X3代表桥接单元；
其中本发明的核酸通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地通过硫代磷酸酯)缀合于X3。
因此，本发明另外提供了一种具有以下结构中的一者的缀合核酸
其中Z代表如本文在之前定义的核酸。
或者，本发明的核酸可缀合于具有以下结构的配体
本发明还涉及一种用于抑制细胞中LPA基因的表达的缀合物，所述缀合物包含含有本发明的任何方面的核酸的核酸部分和配体部分，所述核酸部分包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一RNA链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二RNA链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述LPA基因转录的RNA的至少一部分，所述配体部分包含接头部分，优选地包含丝氨醇衍生接头部分，以及用于在体内靶向细胞，并且只缀合于一个或两个RNA链的3’和/或5’末端的靶向性配体，其中所述第一RNA链的5’末端未被缀合，其中：
(i)所述第二RNA链在5’末端缀合于所述靶向性配体，并且其中(a)所述第二RNA链还在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第一RNA链的3’末端未被缀合；或(b)所述第一RNA链在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的3’末端未被缀合；或(c)所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均还在3’末端缀合于所述靶向性配体；或
(ii)所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的5’末端未被缀合，或
本发明涉及一种用于抑制细胞中LPA基因的表达的缀合物，所述缀合物包含核酸部分和配体部分，所述核酸部分包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一RNA链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二RNA链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述LPA基因转录的RNA的至少一部分，所述配体部分包含接头部分以及用于在体内靶向细胞，并且只缀合于一个或两个RNA链的3’和/或5’末端的靶向性配体，其中所述第一RNA链的5’末端未被缀合，其中：
(i)所述第二RNA链在5’末端缀合于所述靶向性配体，并且其中(a)所述第二RNA链还在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第一RNA链的3’末端未被缀合；或(b)所述第一RNA链在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的3’末端未被缀合；或(c)所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均还在3’末端缀合于所述靶向性配体；或
(ii)所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的5’末端未被缀合。
接头部分可以例如是丝氨醇衍生接头部分，或本文所述的其他接头类型中的一者。
本发明还提供了一种包含本发明的任何方面的核酸或缀合核酸以及生理上可接受的赋形剂的组合物。
还提供了一种用于治疗疾病、病症或综合征和/或制造用于治疗疾病、病症或综合征的药剂的根据本发明的任何方面的核酸或缀合核酸。
本发明提供了一种治疗或预防疾病、病症或综合征的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用包含根据本发明的任何方面的核酸或缀合核酸的组合物。核酸或缀合核酸可以皮下方式、静脉内方式或使用任何其他施加途径诸如口服、经直肠或腹膜内施加途径向受试者施用。
在皮下施加之后，本发明物可以组织特异性方式递送至肝(肝细胞)，并且特异性靶向LPA，以降低非所要副作用以及实现达到所需作用所必需的较低治疗剂量。
本发明物或包含本发明的核酸或缀合核酸的药物组合物可用于治疗疾病、病症或综合征。治疗可以是为了预防中风、动脉粥样硬化、血栓形成或心血管疾病诸如冠心病或主动脉瓣狭窄以及与含Lp(a)粒子水平升高相关的任何其他疾病或病理，以及降低罹患中风、动脉粥样硬化、血栓形成或心血管疾病诸如冠心病或主动脉瓣狭窄以及与含Lp(a)粒子水平升高相关的任何其他疾病或病理的风险。
还包括了一种制备本发明的核酸或缀合核酸的方法。
具体实施方式
本发明涉及一种核酸及其组合物，所述核酸是双链的，并且针对LPA的表达的RNA转录物。这些核酸或缀合核酸可用于治疗和预防其中LPA基因产物的表达降低是合乎需要的多种疾病、病症和综合征。
本发明的第一方面涉及一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73。
核酸可包含：含有SEQ ID NO:9的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:5的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列；或含有SEQ IDNO:7的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:11的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:13的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:17的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列；或含有SEQ IDNO:21的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:23的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:25的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:27的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:29的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:31的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:32的核苷酸序列；或含有SEQ IDNO:33的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:34的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:35的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:36的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:37的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:38的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:39的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:40的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:41的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:42的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:43的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列；或含有SEQ IDNO:63的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:64的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:65的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:66的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:67的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:68的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:69的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:70的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:71的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:72的核苷酸序列；或含有SEQ ID NO:73的核苷酸序列的第一链，并且任选地，其中第二链包含SEQ ID NO:74的核苷酸序列。
LPA基因包含高度重复序列。因此，具有极其类似序列的第一链核酸可与mRNA的极其不同靶标区域具有完全序列互补性。
本发明的一相关方面是一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，其中所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含：第一链；和第二链，其中所述第二链至少部分地互补于所述第一链，其中所述第一链包含具有参考序列SEQ ID NO:9、5、1、3、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73中的任一者的至少15个，优选地，至少16个，更优选地，至少17个，还更优选地，至少18个，并且最优选地，至少19个核苷酸的序列，并且其中相对于包含在第一链序列中的具有参考序列的部分，第一链序列中的单核苷酸错配和/或缺失和/或插入的数目是至多三，优选地是至多二，更优选地是至多一，并且最优选地是零。
在一个方面，核酸的第一链包含具有参考序列中的任一者，优选地具有参考序列SEQ ID NO:9和5中的任一者的至少18个核苷酸的序列，并且相对于包含在第一链序列中的具有参考序列的部分，第一链序列中的单核苷酸错配和/或缺失和/或插入的数目是至多一，并且优选地是零。
在一个方面，核酸的第一链包含具有参考序列SEQ ID NO:9和5中的任一者的至少19个核苷酸的序列。
第一(反义)链与靶标序列之间，或第一链与第二(有义)链之间的某一数目的错配、缺失或插入在siRNA的情形下可被容许，并且在某些情况下甚至具有使活性增加的潜力。
就核酸来说，其意指能够干扰基因表达的包含两个包含核苷酸的链的核酸。抑制可为完全的或部分的，并且以靶向方式导致基因表达的下调。核酸包含两个单独多核苷酸链；即第一链，其也可为引导链；以及第二链，其也可为过客链。第一链和第二链可为自身互补的同一多核苷酸分子的一部分，所述多核苷酸分子向回‘折叠’以形成双链分子。核酸可为siRNA分子。
核酸可包含核糖核苷酸、经修饰核糖核苷酸、脱氧核苷酸、脱氧核糖核苷酸或能够模拟核苷酸以致它们可与靶标序列或互补链上的相应碱基‘配对’的核苷酸类似物非核苷酸。核酸可还包含由第一链(在本领域中也被称为引导链)的全部或一部分和第二链(在本领域中也被称为过客链)的全部或一部分形成的双链核酸部分或双链体区域。双链体区域定义为以在第一链与第二链之间形成的第一碱基对开始，并且以在第一链与第二链之间形成的末个碱基对结束，包括所述第一碱基对和所述末个碱基对。
就双链体区域来说，其意指彼此通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对或允许在互补或大致上互补的寡核苷酸链之间达成双链体的任何其他方式形成碱基对的两个互补或大致上互补寡核苷酸中的区域。举例来说，具有21个核苷酸单元的寡核苷酸链可与具有21个核苷酸单元的另一寡核苷酸进行碱基配对，但每个链上仅19个核苷酸是互补的或大致上互补的，以致“双链体区域”由19个碱基对组成。其余碱基对可以5′和3′突出部分形式，或以单链区域形式存在。此外，在双链体区域内，不要求100％互补性；在双链体区域内，大致上互补性是可允许的。大致上互补性是指各链之间的使得它们能够在生物条件下退火的互补性。用于凭经验确定两个链是否能够在生物条件下退火的技术在本领域中是熟知的。或者，可合成两个链，并且在生物条件下添加到一起以确定它们是否彼此退火。
形成至少一个双链体区域的第一链的部分和第二链的部分可为完全互补的，并且是至少部分地彼此互补的。视核酸的长度而定，未必要求就第一链与第二链之间的碱基互补性而言的完全匹配。然而，第一链和第二链必须能够在生理条件下杂交。
第一链与第二链之间在至少一个双链体区域中的互补性可因为在任一链中都不存在核苷酸错配或额外/缺失的核苷酸而是完全的。或者，互补性可以不是完全的。互补性可为约70％至约100％。更特别地，互补性可为至少70％、75％、80％、85％、90％或95％以及中间值。
在本发明的情形下，如例如在“包含第一链的至少一部分的一个双链体区域”的情况下的“……的一部分”应被理解为意指双链体区域包含给定参考链序列的至少10个核苷酸，优选地，至少12个核苷酸，更优选地，至少14个核苷酸，还更优选地，至少16个核苷酸，甚至更优选地，至少18个核苷酸，并且最优选地，所有核苷酸。参考序列的在双链体区域中的部分与参考序列的相应部分是至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，还更优选至少95％，并且最优选100％同一的。或者，相对于参考序列的部分，单核苷酸错配的数目是至多三个，优选至多二个，更优选至多一个，并且最优选为零。
第一链和第二链可各自包含含有与表1中所列的序列中的任一者相差至多3个核苷酸的至少15个连续核苷酸的互补性区域。
核酸可包含含有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、64、66、68、70、72或74的核苷酸序列的第二序列。
本发明的核酸的使用涉及在第一链的全部或一部分与靶标核酸的一部分之间形成双链体区域。靶标核酸的与第一链形成双链体区域的部分是靶标核酸序列或简称为靶标序列，所述双链体区域定义为以在第一链与靶标序列之间形成的第一碱基对开始，并且以在第一链与靶标序列之间形成的末个碱基对结束，包括所述第一碱基对和所述末个碱基对。在第一链与第二链之间形成的双链体区域无需与在第一链与靶标序列之间形成的双链体区域相同。也就是说，第二链可具有与靶标序列不同的序列；然而，第一链必须能够与第二链和靶标序列两者至少在生理条件下形成双链体结构。
第一链与靶标序列之间的互补性可为完全的(在任一核酸中都无核苷酸错配或额外/缺失的核苷酸)。
第一链与靶标序列之间的互补性可以不是完全的。互补性可为约70％至约100％。更特别地，互补性可为至少70％、80％、85％、90％或95％以及中间值。
第一链与靶标序列的互补序列之间的同一性可在约75％至约100％的范围内。更特别地，互补性可为至少75％、80％、85％、90％或95％以及中间值，前提是核酸能够降低或抑制LPA的表达。
在第一链与靶标序列之间具有小于100％互补性的核酸可能够在与在第一链与靶标序列之间具有完全互补性的核酸相同的水平上使LPA的表达降低。或者，它可能够在是由具有完全互补性的核酸实现的降低水平的15％-100％的水平上使LPA的表达降低。
核酸可包含长度各自为19-25个核苷酸的第一链和第二链。第一链和第二链可具有不同长度。
核酸的长度可为15-25个核苷酸对。核酸的长度可为17-23个核苷酸对。核酸的长度可为17-25个核苷酸对。核酸的长度可为23-24个核苷酸对。核酸的长度可为19-21个核苷酸对。核酸的长度可为21-23个核苷酸对。
核酸可包含由19-25个核苷酸碱基对组成的双链体区域。双链体区域可由17、18、19、20、21、22、23、24或25个可为连续的碱基对组成。
核酸可包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的第一链序列。核酸可包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10的第二链序列。
优选地，核酸介导RNA干扰。
在一个实施方案中，用于抑制细胞中LPA的表达的核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链和至少部分地互补于所述第一链的第二链，其中所述第一链包含具有至少15个，优选地，至少16个，更优选地，至少17个，还更优选地，至少18个，并且最优选地，至少19个核苷酸的序列，所述序列具有与序列SEQ ID NO:9、5、1、3、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73中的任一者的至少70％，优选地，至少80％，更优选地，至少90％，还更优选地，至少95％，并且最优选地，100％的序列同一性。
在另一方面，相较于在不存在核酸或缀合核酸下观察到的表达，如所描述的核酸或缀合核酸可使LPA的表达降低至少15％。先前方面中的任一者的所有优选特征都也适用于这个方面。特别地，相比于在不存在核酸或缀合核酸下或在非沉默对照存在下观察到的LPA的表达，LPA的表达可被降低至至少以下给定％或小于以下给定％：90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％或更小以及中间值。
核酸可在两个末端均是钝性末端；在一个末端具有突出部分，并且在另一末端具有钝性末端；或在两个末端均具有突出部分。
如本文所用的“突出部分”具有它在本领域中的普通和惯用含义，即核酸的延伸超出双链核酸中的互补链的末端核苷酸的单链部分。术语“钝性末端”包括两个链在相同位置终止的双链核酸，无论一个或多个末端核苷酸是否是碱基配对的。第一链和第二链在钝性末端的末端核苷酸可为碱基配对的。第一链和第二链在钝性末端的末端核苷酸可为不配对的。第一链和第二链在钝性末端的两个末端核苷酸可为碱基配对的。第一链和第二链在钝性末端的两个末端核苷酸可为不配对的。
核酸可在一个末端具有突出部分，并且在另一末端具有钝性末端。核酸可在两个末端均具有突出部分。核酸可在两个末端均是钝性末端。核酸可在第一链的5'末端和第二链的3'末端，或在第一链的3’末端和第二链的5'末端是钝性末端。
核酸可在3'或5'末端包含突出部分。核酸可在第一链上具有3'突出部分。核酸可在第二链上具有3'突出部分。核酸可在第一链上具有5'突出部分。核酸可在第二链上具有5'突出部分。核酸可在第一链的5'末端与3'末端两者处均具有突出部分。核酸可在第二链的5'末端与3'末端两者处均具有突出部分。核酸可在第一链上具有5'突出部分，并且在第二链上具有3'突出部分。核酸可在第一链上具有3'突出部分，并且在第二链上具有5'突出部分。核酸可在第一链上具有3'突出部分，并且在第二链上具有3'突出部分。核酸可在第一链上具有5'突出部分，并且在第二链上具有5'突出部分。
在第二链或第一链的3’末端或5’末端的突出部分的长度可选自由1、2、3、4和5个核苷酸组成的组。任选地，突出部分可由1或2个可经修饰或可未经修饰的核苷酸组成。
未修饰的多核苷酸，特别是核糖核苷酸，可倾向于由细胞核酸酶降解，因此，修饰/经修饰核苷酸可被包括在本发明的核酸中。所述修饰可有助于通过使核酸针对核酸酶更具抗性来使它们稳定。这种改进的抗性允许核酸持续更久时期在介导RNA干扰方面具有活性，并且当核酸将被用于治疗时是尤其合乎需要的。
本发明的核酸的第二链和/或第一链上的一个或多个核苷酸可被修饰。
对本发明的核酸的修饰通常提供一种在克服潜在局限性方面的强力工具，所述局限性包括但不限于为天然RNA分子所固有的体外和体内稳定性和生物可用度。本发明的核酸可由化学修饰加以修饰。经修饰核酸还可使在人中诱导干扰素活性的可能性最小。修饰可还使核酸向靶细胞的功能性递送增强。本发明的经修饰核酸可包含第一链或第二链中的任一者或两者的一个或多个经化学修饰核糖核苷酸。核糖核苷酸可包含对碱基、糖或磷酸部分的化学修饰。核糖核酸可通过用核酸或碱基的类似物进行取代或插入加以修饰。
本发明的核酸的一个或多个核苷酸可被修饰。核酸可包含至少一个经修饰核苷酸。经修饰核苷酸可在第一链中。经修饰核苷酸可在第二链中。经修饰核苷酸可在双链体区域中。经修饰核苷酸可在双链体区域外部，即在单链区域中。经修饰核苷酸可在第一链上，并且可在双链体区域外部。经修饰核苷酸可在第二链上，并且可在双链体区域外部。第一链的3’末端核苷酸可为经修饰核苷酸。第二链的3’末端核苷酸可为经修饰核苷酸。第一链的5’末端核苷酸可为经修饰核苷酸。第二链的5’末端核苷酸可为经修饰核苷酸。
本发明的核酸可具有1个经修饰核苷酸，或本发明的核酸可具有约2-4个经修饰核苷酸，或核酸可具有约4-6个经修饰核苷酸、约6-8个经修饰核苷酸、约8-10个经修饰核苷酸、约10-12个经修饰核苷酸、约12-14个经修饰核苷酸、约14-16个经修饰核苷酸、约16-18个经修饰核苷酸、约18-20个经修饰核苷酸、约20-22个经修饰核苷酸、约22-24个经修饰核苷酸、24-26个经修饰核苷酸或约26-28个经修饰核苷酸。在每种情况下，相较于相同但不具有所述经修饰核苷酸的核酸，包含所述经修饰核苷酸的核酸保留它的活性的至少50％，或反之亦然。相较于相同但不具有所述经修饰核苷酸的核酸，核酸可保留它的活性的55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％以及中间值，或可具有是不具有所述经修饰核苷酸的相同核酸的活性的超过100％的活性。
经修饰核苷酸可为嘌呤或嘧啶。至少半数嘌呤可被修饰。至少半数嘧啶可被修饰。所有嘌呤都可被修饰。所有嘧啶都可被修饰。经修饰核苷酸可选自由以下组成的组：3'末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2’修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、吗啉代基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物的核苷酸以及连接于胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团的末端核苷酸。
核酸可包含含有经修饰核苷酸的核苷酸，其中碱基选自2-氨基腺苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如5-溴尿苷)、6-氮杂嘧啶、6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、怀丁苷(wybutosine)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、5'-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、β-D-半乳糖基Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲基氧基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基Q核苷、尿苷-5-氧基乙酸和2-硫代胞苷。
本文讨论的核酸包括未修饰RNA以及已被修饰例如以使功效改进的RNA，以及核苷替代物的聚合物。未修饰RNA是指其中核酸的组分即糖、碱基和磷酸部分与在自然界中存在的组分例如如天然地存在于人体中的组分相同或基本上相同的分子。如本文所用的经修饰核苷酸是指其中核苷酸的组分即糖、碱基和磷酸部分中的一个或多个不同于在自然界中存在的那些的核苷酸。尽管它们被称为经修饰核苷酸，但由于修饰，它们将当然还包括不是核苷酸的分子，例如其中核糖磷酸骨架被允许在链之间进行杂交的非核糖磷酸构建体替换的多核苷酸分子，即经修饰核苷酸模拟核糖磷酸骨架。
以下描述的存在于核酸内的许多修饰将在多核苷酸分子内重复，诸如对碱基或磷酸部分的修饰，或磷酸部分的非连接性O。在一些情况下，修饰将存在于多核苷酸中所有可能的位置/核苷酸处，但在许多情况下，它将不会如此。修饰可仅存在于3′或5′末端位置处，可仅存在于末端区域中，诸如在末端核苷酸上的某一位置处或在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。修饰可存在于双链区域、单链区域中或两者中。修饰可仅存在于本发明的核酸的双链区域中，或可仅存在于本发明的核酸的单链区域中。在非连接性O位置处的硫代磷酸酯修饰可仅存在于一个或两个末端处，可仅存在于末端区域中，例如在末端核苷酸上的某一位置处或在链的最后2、3、4或5个核苷酸中，或可存在于双链体中和/或单链区域中，特别是在末端。5′末端或3’末端可被磷酸化。
本发明的核酸的稳定性可通过在突出部分中包括特定碱基，或在单链突出部分中例如在5′或3′突出部分中或在两者中包括经修饰核苷酸来增加。嘌呤核苷酸可被包括在突出部分中。3′或5′突出部分中的碱基中的全部或一些可被修饰。修饰可包括在核糖的2′OH基团处使用修饰，使用脱氧核糖核苷酸而非核糖核苷酸，以及在磷酸酯基团中的修饰，诸如硫代磷酸酯修饰。突出部分无需与靶标序列同源。
核酸酶可水解核酸磷酸二酯键。然而，对核酸的化学修饰可赋予改进的性质，并且可致使寡核糖核苷酸对核酸酶更加稳定。
如本文所用的经修饰核酸可包括以下中的一个或多个：
(i)对非连接性磷酸氧中的一个或两个和/或对连接性磷酸氧(即使在本发明的核酸的5'和3'末端，也被称为连接性的)中的一个或多个的改变，例如替换；
(ii)对核糖的成分，例如对核糖上的2′羟基的改变，例如替换；
(iii)用“脱磷酸”接头对磷酸部分的替换；
(iv)对天然存在的碱基的修饰或替换；
(v)对核糖-磷酸骨架的替换或修饰；
(vi)对RNA的3′末端或5′末端的修饰，例如对末端磷酸酯基团的移除、修饰或替换，或使某一部分例如经荧光标记部分缀合于RNA的3′或5′末端。
术语替换、修饰、改变指示与天然存在的分子的差异。
以下更详细讨论特定修饰。
经修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。在二硫代磷酸酯的情况下，两个非连接性氧均被硫替换。磷酸酯基团中的一个、每个或两个非连接性氧可独立地成为S、Se、B、C、H、N或OR(R是烷基或芳基)中的任一者。
磷酸酯接头还可通过用氮(桥接氨基磷酸酯)、硫(桥接硫代磷酸酯)和碳(桥接亚甲基膦酸酯)替换连接性氧加以修饰。替换可存在于末端氧处。用氮替换非连接性氧是可能的。
经修饰核苷酸可包括对糖基团的修饰。2′羟基(OH)可用许多不同“氧基”或“脱氧”取代基修饰或替换。
“氧基”-2′羟基修饰的实例包括烷氧基或芳基氧基(OR，例如R═H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“锁”核酸(LNA)，其中2′羟基例如通过亚甲基桥连接于同一核糖的4′碳；O-胺(胺＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、多氨基)和氨基烷氧基O(CH2)n胺(例如胺＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、多氨基)。
“脱氧”修饰包括氢、卤素、氨基(例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-胺(胺＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)、—NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷基-硫基-烷基；硫代烷氧基；以及可任选地被例如氨基官能基取代的烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基。某些实施方案的其他取代基包括2′-甲氧基乙基、2′-OCH3、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基和2′-氟代。
糖基团还可含有一个或多个相比于核糖中相应碳的构型，具有相反立体化学构型的碳。因此，经修饰核苷酸可含有诸如阿拉伯糖的糖。
经修饰核苷酸还可包括在C—1′处缺乏核苷碱基的“无碱基”糖。这些无碱基糖可还在组成性糖原子中的一个或多个处含有修饰。
2′修饰可与一个或多个磷酸酯接头修饰(例如硫代磷酸酯)组合使用。
磷酸酯基团可单独地由非含磷连接头替换。
可替换磷酸酯基团的部分的实例包括硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、氧化乙烯接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基和亚甲基氧基甲基亚氨基。在某些实施方案中，替换可包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。
磷酸酯接头和核糖可由核酸酶抗性核苷酸替换。
实例包括吗啉代基、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。在某些实施方案中，可使用PNA替代物。
寡核苷酸的3′和5′末端可被修饰。所述修饰可在分子的3′末端或5′末端或两个末端。它们可包括对整个末端磷酸酯或对磷酸酯基团的原子中的一个或多个的修饰或替换。举例来说，寡核苷酸的3′和5′末端可缀合于其他功能性分子实体，诸如标记部分例如荧光团(例如芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)，或保护基(例如基于硫、硅、硼或酯)。功能性分子实体可通过磷酸酯基团和/或接头连接于糖。接头的末端原子可连接于或替换磷酸酯基团的连接性原子或糖的C-3′或C-5′O、N、S或C基团。或者，接头可连接于或替换核苷酸替代物(例如PNA)的末端原子。这些间隔体或接头可包括例如—(CH2)n—、—(CH2)nN—、—(CH2)nO—、—(CH2)nS—、—(CH2CH2O)nCH2CH2O—(例如n＝3或6)、无碱基糖、酰胺、羧基、胺、氧基胺、氧基亚胺、硫醚、二硫醚、硫脲、磺酰胺或吗啉代基、或生物素和荧光素试剂。3′末端可为—OH基团。
末端修饰的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素(psoralene)、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、得克萨卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶、EDTA、亲脂性载体(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六基)甘油、香叶基氧基己基、十六基甘油、龙脑(borneol)、薄荷醇(menthol)、1,3-丙二醇、十七基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合物(例如触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、多氨基、烷基、取代的烷基、经放射性标记的标记、酶、半抗原(例如生物素)、运输/吸收促进剂(例如阿司匹林(aspirin)、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)。
末端修饰可由于许多原因而添加，包括用以调节活性或用以调节对降解的抗性。可用于调节活性的末端修饰包括用磷酸酯或磷酸酯类似物对5′末端的修饰。本发明的核酸在第一链或第二链上可加以5′磷酸化，或在5′末端包括磷酰基类似物。5′-磷酸酯修饰包括可与RISC介导的基因沉默相容的那些。适合修饰包括：5′-单磷酸酯((HO)2(O)P—O-5′)；5′-二磷酸酯((HO)2(O)P—O—P(HO)(O)—O-5′)；5′-三磷酸酯((HO)2(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5′)；5′-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化)(7m-G-O-5′-(HO)(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5′)；5′-腺苷帽(Appp)和任何经修饰或未修饰核苷酸帽结构(N—O-5′-(HO)(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5′)；5′-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P—O-5′)；5′-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P—O-5′)、5′-硫代磷酸酯((HO)2(O)P—S-5′)；氧/硫替换的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何额外组合(例如5′-α-硫代三磷酸酯、5′-γ-硫代三磷酸酯等)、5′-氨基磷酸酯((HO)2(O)P—NH-5′、(HO)(NH2)(O)P—O-5′)、5′-烷基膦酸酯(R＝烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)—O-5′-、(OH)2(O)P-5′-CH2-)、5'乙烯基膦酸酯、5′-烷基醚膦酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)—O-5′-)。
本发明的核酸可在第一链和/或第二链的末端中的一个或多个上包括一个或多个硫代磷酸酯修饰。任选地，第一链的每个或任一末端可包含一个或两个或三个经硫代磷酸酯修饰的核苷酸。任选地，第二链的每个或任一末端可包含一个或两个或三个经硫代磷酸酯修饰的核苷酸。
末端修饰还可用于监测分布，并且在所述情况下，待添加的基团可包括荧光团，例如荧光素或Alexa染料。末端修饰还可用于使摄取增强，可用于此的修饰包括胆固醇。末端修饰还可用于使RNA剂交联于另一部分。
腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶是见于RNA中的最常见碱基。这些碱基可被修饰或替换以提供具有改进的性质的RNA。举例来说，核酸酶抗性寡核糖核苷酸可用这些碱基或用合成和天然核苷碱基(例如肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、异鸟苷或杀结核菌素(tubercidine))以及以上修饰中的任一者制备。或者，可采用以上碱基和“通用碱基”中的任一者的经取代或经修饰类似物。实例包括2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、8-卤基、氨基、硫醇、硫烷基、羟基以及其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤、5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、3-脱氮杂-5-氮杂胞嘧啶、2-氨基嘌呤、5-烷基尿嘧啶、7-烷基鸟嘌呤、5-烷基胞嘧啶、7-脱氮杂腺嘌呤、N6,N6-二甲基腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-氨基-烯丙基-尿嘧啶、N3-甲基尿嘧啶、取代的1,2,4-三唑、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N<4>-乙酰基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲基硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、N-甲基鸟嘌呤或O-烷基化碱基。
如本文所用，术语“非配对核苷酸类似物”意指包括非碱基配对部分的核苷酸类似物，所述非碱基配对部分包括但不限于：6脱氨基腺苷(水粉蕈素)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me核糖U、N3-Me核糖T、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me dC。在一些实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其他实施方案中，它是脱氧核糖核苷酸。
如本文所用，术语“末端官能团”包括不限于卤素、醇、胺、羧酸、酯、酰胺、醛、酮、醚基团。
某些部分可连接于第一链或第二链的5'末端。这些部分包括无碱基核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、对无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分的修饰，包括2′O烷基修饰；倒置无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分及其修饰、C6-亚氨基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA和L-RNA；5′OMe核苷酸；以及核苷酸类似物，包括4′,5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃赤藓糖基)核苷酸；4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5'-氨基-烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；12-氨基十二基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1,5-失水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏式-呋喃戊糖基核苷酸；无环3′,4′-断核苷酸；3,4-二羟基丁基核苷酸；3,5-二羟基戊基核苷酸、5′-5′-倒置无碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；以及桥接或非桥接甲基膦酸酯和5′-巯基部分。
本发明的核酸可包括一个或多个倒置核苷酸，例如倒置胸苷或倒置腺嘌呤(例如参见Takei等,2002.JBC 277(26):23800-06)。
如本文所用，关于基因表达的术语“抑制”、“下调”或“降低”意指基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等同RNA分子(例如mRNA)的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性被降低至低于在不存在本发明的核酸或缀合核酸下或关于与人转录物不具有已知同源性的siRNA分子(在本文中被称为非沉默对照)观察到的表达或水平或活性。所述对照可以与本发明的分子类似的方式加以缀合和修饰，并且通过相同途径递送至靶细胞中；举例来说，相比于在不存在核酸或缀合核酸下或在非沉默对照存在下观察到的表达，表达可被降低至90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％或中间值或更小。
本发明的核酸可包含无碱基核苷酸。如本文所用的术语“无碱基”是指缺乏碱基或在1'位具有其他化学基团而非碱基的部分，例如3',3'-连接或5',5'-连接的脱氧无碱基核糖衍生物。
核酸可在第二链和/或第一链上包含一个或多个经修饰核苷酸。交替核苷酸可被修饰以形成经修饰核苷酸。
如本文所述的交替意指以规则方式相继发生。换句话说，交替意指重复依次发生。举例来说，如果一个核苷酸被修饰，那么下一连续核苷酸不被修饰，并且随后连续核苷酸被修饰，以此类推。一个核苷酸可用第一修饰加以修饰，下一连续核苷酸可用第二修饰加以修饰，并且随后连续核苷酸用所述第一修饰加以修饰，以此类推，其中所述第一修饰和所述第二修饰是不同的。
本发明的核酸的第一链的奇数编号核苷酸中的一个或多个可被修饰，其中第一链按5’至3’编号，最5’核苷酸是第一链的1号核苷酸。如本文所述的术语“奇数编号”意指不可被二整除的编号。奇数编号的实例是1、3、5、7、9、11等。本发明的核酸的第一链的偶数编号核苷酸中的一个或多个可被修饰，其中第一链按5’至3’编号。如本文所述的术语“偶数编号”意指可被二均等整除的编号。偶数编号的实例是2、4、6、8、10、12、14等。本发明的核酸的第二链的奇数编号核苷酸中的一个或多个可被修饰，其中第二链按3'至5'编号，最3’核苷酸是第二链的1号核苷酸。本发明的核酸的第二链的偶数编号核苷酸中的一个或多个可被修饰，其中第二链按3'至5'编号。
第一链和/或第二链上的一个或多个核苷酸可被修饰以形成经修饰核苷酸。第一链的奇数编号核苷酸中的一个或多个可被修饰。第一链的偶数编号核苷酸中的一个或多个可由至少第二修饰加以修饰，其中所述至少第二修饰不同于一个或多个奇数核苷酸上的修饰。一个或多个经修饰偶数编号核苷酸中的至少一者可邻近于一个或多个经修饰奇数编号核苷酸中的至少一者。
在本发明的核酸中，第一链中的多个奇数编号核苷酸可被修饰。第一链中的多个偶数编号核苷酸可由第二修饰加以修饰。第一链可包含由共同修饰加以修饰的邻近核苷酸。第一链还可包含由第二不同修饰加以修饰的邻近核苷酸。
第二链的奇数编号核苷酸中的一个或多个可由不同于第一链上的奇数编号核苷酸的修饰的修饰加以修饰，和/或第二链的偶数编号核苷酸中的一个或多个可由第一链的奇数编号核苷酸的相同修饰加以修饰。第二链的一个或多个经修饰偶数编号核苷酸中的至少一者可邻近于一个或多个经修饰奇数编号核苷酸。第二链的多个奇数编号核苷酸可由共同修饰加以修饰，和/或多个偶数编号核苷酸可由存在于第一链奇数编号核苷酸上的相同修饰加以修饰。第二链上的多个奇数编号核苷酸可由第二修饰加以修饰，其中所述第二修饰不同于第一链奇数编号核苷酸的修饰。
第二链可包含由共同修饰加以修饰的邻近核苷酸，所述共同修饰可为不同于第一链的奇数编号核苷酸的修饰的第二修饰。
在本发明的核酸中，第一链中的奇数编号核苷酸中的每一个和第二链中的偶数编号核苷酸中的每一个可用共同修饰加以修饰，并且第一链中的偶数编号核苷酸中的每一个可用第二修饰加以修饰，并且第二链中的奇数编号核苷酸中的每一个可用所述第二修饰加以修饰。
本发明的核酸可具有第一链的相对于第二链的未修饰或以不同方式修饰的核苷酸，移位至少一个核苷酸的经修饰核苷酸。
第一链中的奇数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可被修饰，并且第二链中的偶数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可被修饰。任一或两个链上的交替核苷酸中的一个或多个或每一个可由第二修饰加以修饰。第一链中的偶数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可被修饰，并且第二链中的偶数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可被修饰。任一或两个链上的交替核苷酸中的一个或多个或每一个可由第二修饰加以修饰。第一链中的奇数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可被修饰，并且第二链中的奇数编号核苷酸中的一个或多个可由共同修饰加以修饰。任一或两个链上的交替核苷酸中的一个或多个或每一个可由第二修饰加以修饰。第一链中的偶数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可被修饰，并且第二链中的奇数编号核苷酸中的一个或多个或每一个可由共同修饰加以修饰。任一或两个链上的交替核苷酸中的一个或多个或每一个可由第二修饰加以修饰。
本发明的核酸可包括单链或双链构建体，所述构建体在链中的一者或两者中包含至少两个具有交替修饰的区域。这些交替区域可包含多达约12个核苷酸，但优选地包含约3至约10个核苷酸。交替核苷酸的区域可位于本发明的核酸的一个或两个链的末端。核酸可在每个末端(3'和5')包含具有交替核苷酸的4至约10个核苷酸，并且这些区域可由约5至约12个连续未修饰或以不同方式或以共同方式修饰的核苷酸分隔。
第一链的奇数编号核苷酸可被修饰，并且偶数编号核苷酸可用第二修饰加以修饰。第二链可包含用共同修饰加以修饰的邻近核苷酸，所述共同修饰可与第一链的奇数编号核苷酸的修饰相同。第二链的一个或多个核苷酸还可用第二修饰加以修饰。一个或多个具有第二修饰的核苷酸可彼此邻近，并且邻近于具有与第一链的奇数编号核苷酸的修饰相同的修饰的核苷酸。第一链还可在3’末端以及在5’末端在两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。第二链可在5’末端在两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。第二链还可在5’末端缀合于配体。
本发明的核酸可包含含有用共同修饰加以修饰的邻近核苷酸的第一链。所述核苷酸中的一个或多个可邻近于一个或多个可用第二修饰加以修饰的核苷酸。一个或多个具有第二修饰的核苷酸可为邻近的。第二链可包含用共同修饰加以修饰的邻近核苷酸，所述共同修饰可与第一链的一个或多个核苷酸的修饰中的一者相同。第二链的一个或多个核苷酸还可用第二修饰加以修饰。一个或多个具有第二修饰的核苷酸可为邻近的。第一链还可在5’末端以及在3’末端在两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。第二链可在3’末端在两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。第二链还可在5’末端缀合于配体。
在第一链上从5'至3'以及在第二链上从3'至5'，在第一链上编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的核苷酸可由修饰加以修饰。在第一链上编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可由第二修饰加以修饰。在第二链上编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸可由修饰加以修饰。在第二链上编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可由第二修饰加以修饰。对于本发明的核酸，核苷酸在第一链上从5'至3'以及在第二链上从3'至5'加以编号。
在第一链上编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可由修饰加以修饰。在第一链上编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸可由第二修饰加以修饰。在第二链上编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸可由修饰加以修饰。在第二链上编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可由第二修饰加以修饰。
明显的是，如果第一链和/或第二链的长度短于25个核苷酸，诸如长度为19个核苷酸，那么不存在编号为20、21、22、23、24和25的核苷酸被修饰。技术熟练人员会了解以上描述相应地适用于较短链。
第一链上的一个或多个经修饰核苷酸可与第二链上的具有共同修饰的经修饰核苷酸配对。第一链上的一个或多个经修饰核苷酸可与第二链上的具有不同修饰的经修饰核苷酸配对。第一链上的一个或多个经修饰核苷酸可与第二链上的未修饰核苷酸配对。第二链上的一个或多个经修饰核苷酸可与第一链上的未修饰核苷酸配对。换句话说，可使两个链上的交替核苷酸对准，诸如(例如)第二链的交替区域中的所有修饰都与第一链中的相同修饰配对，或替代地，修饰可偏移一个核苷酸，其中一个链的交替区域中的共同修饰与另一链中的相异修饰(即第二或其他修饰)配对。另一选项是在链中的每一个中具有相异修饰。
相对于第二链上的经修饰核苷酸，第一链上的修饰可移位一个核苷酸，以使以共同方式修饰的核苷酸不彼此配对。
一个或多个修饰可各自以及单独地选自由以下组成的组：3'-末端脱氧胸腺嘧啶、2'-O-甲基、2'-脱氧修饰、2'-氨基修饰、2'-烷基修饰、吗啉代基修饰、氨基磷酸酯修饰、5'-硫代磷酸酯基团修饰、5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物修饰以及胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团修饰，和/或经修饰核苷酸可为锁核苷酸、无碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任一者。
至少一个修饰可为2'-O-甲基，和/或至少一个修饰可为2'-F。如本文所述的其他修饰可存在于第一链和/或第二链上。
本发明的核酸可在链末端中的一者或若干者处包含倒置RNA核苷酸。所述倒置核苷酸对核酸提供稳定性。优选地，核酸在链中的至少一者的3’末端中的一者或若干者处和/或在第二链的5’末端包含至少某一倒置核苷酸。更优选地，核酸在第二链的3’末端包含倒置核苷酸。最优选地，核酸在第二链的3’末端包含倒置RNA核苷酸，并且这个核苷酸优选地是倒置A。倒置核苷酸优选地不以突出部分形式，而是以与另一链中的相应核苷酸相对的方式存在于链的末端。具有这种修饰的核酸是稳定的，并且易于合成。
在整个发明描述中，“相同或共同修饰”意指对任何核苷酸进行的相同修饰，如A、G、C或U用诸如甲基或氟代的基团加以修饰。这不用于意指在相同核苷酸上具有相同添加物。举例来说，2’F-dU、2’F-dA、2’F-dC、2’F-dG全都被视为是相同或共同修饰，2’-OMe-rU、2’-OMe-rA；2’-OMe-rC；2’-OMe-rG也是如此。2’F修饰是不同于2’OMe修饰的修饰。
本发明的一些代表性经修饰核酸序列显示于实例中。这些实例意图是代表性的而非限制性的。
优选地，核酸可包含某一修饰以及第二或其他修饰，所述修饰各自以及单独地选自包含2'-O-甲基修饰和2'-F修饰的组。核酸可包含是可为第一修饰的2'-O-甲基(2’OMe)的修饰，以及是2'-F的第二修饰。本发明的核酸还可包括可存在于每个或两个链的每个或任何末端的末端1、2或3个核苷酸中或之间的硫代磷酸酯修饰和/或脱氧修饰。
作为另一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73的核苷酸序列，其中第一链的核苷酸由在奇数编号核苷酸上的第一修饰加以修饰，并且由在偶数编号核苷酸上的第二修饰加以修饰，并且第二链的核苷酸由在偶数编号核苷酸上的第三修饰加以修饰，并且由在奇数编号核苷酸上的第四修饰加以修饰，其中至少所述第一修饰不同于所述第二修饰，并且所述第三修饰不同于所述第四修饰。第三修饰和第一修饰可相同或不同，第二修饰和第四修饰可相同或不同。第一修饰和第二修饰可彼此不同，并且第三修饰和第四修饰可彼此不同。
第二链可包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、64、66、68、70、72或74的核苷酸序列。第一链的核苷酸可由在奇数编号核苷酸上的第一修饰加以修饰，并且用在偶数编号核苷酸上的第二修饰加以修饰，并且第二链可在奇数编号核苷酸上用所述第二修饰加以修饰，并且在偶数编号核苷酸上用所述第一修饰加以修饰。第一修饰可为2’OMe，并且第二修饰可为2’F。第一链可包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的核苷酸序列，和/或第二链可包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10的核苷酸序列。修饰可为如表1中阐述的那些。
本发明的核酸可缀合于配体。将寡核苷酸特别是本发明的双链核酸在体内高效递送至细胞是重要的，并且要求特异性靶向以及实质性保护以免于遭受细胞外环境特别是血清蛋白质。一种实现特异性靶向的方法是使配体缀合于核酸。配体有助于使核酸靶向所需靶标部位。有需要缀合适于所需受体分子的配体以使缀合的分子通过诸如不同的受体介导胞吞路径或在功能上类似的过程的机理被靶细胞摄取。
一个实例是由不同比率的膜ASGR1和ASGR2受体的多聚体组成的无唾液酸糖蛋白受体复合物(ASGP-R)，所述复合物在肝细胞上是高度充足的，并且对此处描述的GalNAc部分具有高亲和力。使用三触角簇糖苷作为缀合配体的最初公开内容中的一者在美国专利号US 5,885,968中。具有三个GalNAc配体，并且包含磷酸酯基团的缀合物是已知的，并且描述于Dubber等(Bioconjug.Chem.2003年1月-2月；14(1):239-46.)中。ASGP-R复合物对N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)的亲和力比对D-Gal的亲和力高50倍。
特异性识别糖基化蛋白或其他寡糖的末端β-半乳糖基亚基(Weigel,P.H.等,Biochim.Biophys.Acta.2002年9月19日；1572(2-3):341-63)的无唾液酸糖蛋白受体复合物(ASGP-R)可用于通过使半乳糖或半乳糖胺共价偶联于药物物质来将药物递送至肝的表达所述受体复合物的肝细胞(Ishibashi,S.等,J Biol.Chem.1994年11月11日；269(45):27803-6)。此外，结合亲和力可通过多价效应而显著增加，所述多价效应通过使靶向性部分重复来实现(Biessen EA等,J Med Chem.1995年4月28日；38(9):1538-46.)。
ASGP-R复合物是用于达成含有末端β-半乳糖基的糖蛋白主动摄取至细胞的内体的介体。因此，ASGPR高度适于达成缀合于所述配体的药物候选物如例如核酸靶向递送至受体表达性细胞中(Akinc等,Mol Ther.2010年7月；18(7):1357-64)。
更通常地，配体可包含被选择来对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲和力的糖。特别地，受体在哺乳动物肝细胞的表面上，例如之前描述的肝无唾液酸糖蛋白受体复合物(ASGP-R)。
糖可选自N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和海藻糖。糖可为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。
因此，用于本发明中的配体可包含(i)一个或多个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分及其衍生物，和(ii)接头，其中所述接头使所述GalNAc部分缀合于如在任何先前方面定义的序列。接头可为二价或三价或四价分支结构。核苷酸可如本文所定义加以修饰。
“GalNAc”是指2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常被称为N-乙酰基半乳糖胺。提及“GalNAc”或“N-乙酰基半乳糖胺”包括β形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖与α形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖两者。β形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖与α形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖两者可互换使用。优选地，本发明化合物包含β形式，即2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖。
因此，配体可包含GalNAc。
配体可包括式I化合物：
[S-X1-P-X2]3-A-X3-(I)
其中：
S代表糖，其中所述糖是N-乙酰基半乳糖胺；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m是1、2或3；
P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地是硫代磷酸酯)；
X2是亚烷基或式(-CH2)n-O-CH2-亚烷基醚，其中n＝1-6；
A是分支单元；
X3代表桥接单元；
其中本发明的核酸通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地通过硫代磷酸酯)缀合于X3。
在式I中，分支单元“A”分成三支以接纳三个糖配体。分支单元共价连接于配体的其余栓系部分以及核酸。分支单元可包括分支脂族基团，所述分支脂族基团包含选自烷基、酰胺基团、二硫醚基团、聚乙二醇基团、醚基团、硫醚基团和羟基氨基的基团。分支单元可包含选自烷基和醚基团的基团。
分支单元A可具有选自以下的结构：
其中每个A1独立地代表O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地代表从1至20的整数。
分支单元可具有选自以下的结构：
其中每个A1独立地代表O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地代表从1至20的整数。
分支单元可具有选自以下的结构：
其中A1是O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地代表从1至20的整数。
分支单元可具有结构：
分支单元可具有结构：
分支单元可具有结构：
任选地，分支单元仅由碳原子组成。
“X3”部分是桥接单元。桥接单元是直链，并且共价结合于分支单元和核酸。
X3可选自-C1-C20亚烷基-、-C2-C20亚烯基-、式-(C1-C20亚烷基)–O–(C1-C20亚烷基)-亚烷基醚、-C(O)-C1-C20亚烷基-、-C0-C4亚烷基(Cy)C0-C4亚烷基-，其中Cy代表取代或未取代的5或6元亚环烷基、亚芳基、亚杂环基或亚杂芳基环，-C1-C4亚烷基-NHC(O)-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-C(O)NH-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-SC(O)-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-C(O)S-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-OC(O)-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-C(O)O-C1-C4亚烷基-和-C1-C6亚烷基-S-S-C1-C6亚烷基-。
X3可为式-(C1-C20亚烷基)–O–(C1-C20亚烷基)-亚烷基醚。X3可为式-(C1-C20亚烷基)–O–(C4-C20亚烷基)-亚烷基醚，其中所述(C4-C20亚烷基)连接于Z。X3可选自由以下组成的组：-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-和-CH2-O-C8H16-，尤其是-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-和-CH2-O-C8H16-，其中在每种情况下，-CH2-基团连接于A。
配体可包括式(II)化合物：
[S-X1-P-X2]3-A-X3-(II)
其中：
S代表糖；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m是1、2或3；
P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地是硫代磷酸酯)；
X2是C1-C8亚烷基；
A是选自以下的分支单元：
X3是桥接单元；
其中本发明的核酸通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地通过硫代磷酸酯)缀合于X3
分支单元A可具有结构：
分支单元A可具有结构：
其中X3连接于氮原子。
X3可为C1-C20亚烷基。优选地，X3选自由以下组成的组：-C3H6-、-C4H8-、-C6H12-和-C8H16-，尤其是-C4H8-、-C6H12-和-C8H16-。
配体可包括式(III)化合物：
[S-X1-P-X2]3-A-X3-(III)
其中：
S代表糖；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m是1、2或3；
P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地是硫代磷酸酯)；
X2是式-C3H6-O-CH2-亚烷基醚；
A是分支单元；
X3是具有选自由以下组成的组的式的亚烷基醚：-CH2-O-CH2-、-CH2-O-C2H4-、-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-和-CH2-O-C8H16-，其中在每种情况下，-CH2-基团连接于A，
并且其中X3通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地通过硫代磷酸酯)缀合于本发明的核酸。
分支单元可包括碳。优选地，分支单元是碳。
X3可选自由以下组成的组：-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-和-CH2-O-C8H16-。优选地，X3选自由以下组成的组：-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-和-CH2-O-C8H16。
对于以上方面中的任一者，当P代表经修饰的磷酸酯基团时，P可由以下表示：
其中Y1和Y2各自独立地代表＝O、＝S、-O-、-OH、-SH、-BH3、-OCH2CO2、-OCH2CO2Rx、-OCH2C(S)ORx和–ORx，其中Rx代表C1-C6烷基，并且其中指示与化合物的其余部分的连接。
就经修饰的磷酸酯来说，其意指其中非连接性氧中的一个或多个被替换的磷酸酯基团。经修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。在二硫代磷酸酯的情况下，两个非连接性氧均被硫替换。磷酸酯基团中的一个、每个或两个非连接性氧可独立地成为S、Se、B、C、H、N或OR(R是烷基或芳基)中的任一者。
磷酸酯还可通过用氮(桥接氨基磷酸酯)、硫(桥接硫代磷酸酯)和碳(桥接亚甲基膦酸酯)替换连接性氧加以修饰。替换可存在于末端氧处。用氮替换非连接性氧是可能的。
举例来说，Y1可代表-OH，并且Y2可代表＝O或＝S；或
Y1可代表-O-，并且Y2可代表＝O或＝S；
Y1可代表＝O，并且Y2可代表–CH3、-SH、-ORx或–BH3
Y1可代表＝S，并且Y2可代表–CH3、ORx或–SH。
技术熟练人员应了解，在某些情况下，在Y1与Y2之间将存在离域。
优选地，经修饰的磷酸酯基团是硫代磷酸酯基团。硫代磷酸酯基团包括双硫代磷酸酯(即其中Y1代表＝S，并且Y2代表–S-)和单硫代磷酸酯(即其中Y1代表-O-，并且Y2代表＝S，或其中Y1代表＝O，并且Y2代表–S-)。优选地，P是单硫代磷酸酯。本发明者已发现具有替换磷酸酯基团的硫代磷酸酯基团的缀合物在体内具有改进的效能和作用持续时间。
P还可为乙基磷酸酯(即其中Y1代表＝O，并且Y2代表OCH2CH3)。
糖可被选择来对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲和力。特别地，受体在哺乳动物肝细胞的表面上，例如肝无唾液酸糖蛋白受体复合物(ASGP-R)。
对于以上方面中的任一者，糖可选自具有半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和果糖中的一个或多个的N-乙酰基。通常，待用于本发明中的配体可包括N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。优选地，本发明化合物可具有3个配体，所述配体将各自优选地包括N-乙酰基半乳糖胺。
“GalNAc”是指2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常被称为N-乙酰基半乳糖胺。提及“GalNAc”或“N-乙酰基半乳糖胺”包括β形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖与α形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖两者。在某些实施方案中，β形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖与α形式：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖两者可互换使用。优选地，本发明化合物包含β形式，即2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖。
2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖
2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖
2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖
对于以上式(III)化合物中的任一者，X1可为(-CH2-CH2-O)(-CH2)2-。X1可为(-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-。X1可为(-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-。优选地，X1是(-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-。或者，X1代表C3-C6亚烷基。X1可为亚丙基。X1可为亚丁基。X1可为亚戊基。X1可为亚己基。优选地，烷基是直链亚烷基。特别地，X1可为亚丁基。
对于式(III)化合物，X2代表式-C3H6-O-CH2-亚烷基醚，即C3烷氧基亚甲基或–CH2CH2CH2OCH2-。
本发明提供了一种具有以下结构中的一者的缀合核酸：
其中Z是如本文在之前定义的核酸。
式(I)、(II)或(III)配体可连接在第一(反义)链的3’末端，和/或连接在第二(有义)链的3’末端和/或5’末端中的任一者处。核酸可包含超过一个式(I)、(II)或(III)配体。然而，单一式(I)、(II)或(III)配体是优选的，因为单一所述配体足以达成核酸高效靶向靶细胞。
优选地，第一(反义)链的5’末端不连接于式(I)、(II)或(III)配体，因为在这个位置中的配体可潜在干扰核酸的生物活性。
相比于在3’末端具有相同配体的相同核酸，在链的5’末端具有单一式(I)、(II)或(III)配体的核酸得以可更容易，并且因此更廉价地合成。因此，优选地，具有式(I)、(II)或(III)中的任一者的单一配体共价连接于核酸的第二链的5’末端(与所述5’末端缀合)。
在一个实施方案中，核酸缀合于包含脂质的配体，并且更优选地缀合于包含胆固醇的配体。
本发明缀合物可包含如本文公开的任何核酸缀合于如本文公开的任何一个或多个配体。
本发明还涉及一种用于抑制细胞中LPA基因的表达的缀合物，所述缀合物包含含有本发明的任何方面的核酸的核酸部分和至少一个配体部分，所述核酸部分包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一RNA链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二RNA链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述LPA基因转录的RNA的至少一部分，所述至少一个配体部分包含接头部分，优选地包含丝氨醇衍生接头部分，以及用于在体内靶向细胞，并且只缀合于一个或两个RNA链的3’和/或5’末端的靶向性配体，其中所述第一RNA链的5’末端未被缀合，其中：
(i)所述第二RNA链在5’末端缀合于所述靶向性配体，并且其中(a)所述第二RNA链还在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第一RNA链的3’末端未被缀合；或(b)所述第一RNA链在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的3’末端未被缀合；或(c)所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均还在3’末端缀合于所述靶向性配体；或
(ii)所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的5’末端未被缀合。
在本发明的一实施方案中，第二RNA链(即有义链)在5’末端缀合于靶向性配体，第一RNA链(即反义链)在3’末端缀合于靶向性配体，并且第二RNA链(即有义链)的3’末端未被缀合，以致形成具有如图40A中所示的示意结构的缀合物。
在本发明的一实施方案中，第二RNA链(即有义链)在5’末端缀合于靶向性配体，第二RNA链(即有义链)还在3’末端缀合于靶向性配体，并且第一RNA链(即反义链)的3’末端未被缀合，以致形成具有如图40B中所示的示意结构的缀合物。
在本发明的一实施方案中，第二RNA链(即有义链)与第一RNA链(即反义链)两者均在3’末端缀合于靶向性配体，并且第二RNA链(即有义链)的5’末端未被缀合，以致形成具有如图40C中所示的示意结构的缀合物。
在本发明的一实施方案中，第二RNA链(即有义链)在5’末端缀合于靶向性配体，并且第二RNA链(即有义链)与第一RNA链(即反义链)两者均还在3’末端缀合于靶向性配体，以致形成具有如图40D中所示的示意结构的缀合物。
在以上实施方案中的任一者中，指示使配体缀合于核酸部分的末端的接头；配体可为GalNAc部分诸如GalNAc；并且如40E中所示的示意结构代表核酸部分。
这些示意图不意图限制第一链或第二链中的核苷酸的数目，各图也不代表关于碱基的互补性的任何种类的限制或任何其他限制。
配体可为单体或多聚的(例如二聚的、三聚的等)。
适合地，配体是单体，因此含有单一靶向性配体部分，例如单一GalNAc部分。
或者，配体可为二聚配体，其中配体部分包含两个接头部分诸如丝氨醇衍生接头部分或非丝氨醇接头部分，各自连接于单一靶向性配体部分。
或者，配体可为三聚配体，其中配体部分包含三个接头部分诸如丝氨醇衍生接头部分或非丝氨醇接头部分，各自连接于单一靶向性配体部分。
两个或三个丝氨醇衍生接头部分可例如如下所示加以串联连接：
其中n是1或2，并且Y是S或O。
优选地，配体是单体。
适合地，缀合RNA链通过包括另一接头的接头部分缀合于靶向性配体，其中所述另一接头是或包含饱和、未分支或分支C1-15烷基链，其中任选地，一个或多个碳(例如1、2或3个碳，适合地是1或2个碳，特别是1个碳)由选自O、N、S(O)p的杂原子替换，其中p是0、1或2(例如CH2基团用O，或用NH，或用S，或用SO2替换，或在链的末端或在分支上的–CH3基团用OH或用NH2替换)，其中所述链任选地被一个或多个氧代基(例如1至3诸如1个基团)取代。
适合地，接头部分是丝氨醇衍生接头部分。
更适合地，另一接头包含饱和、未分支C1-15烷基链，其中一个或多个碳(例如1、2或3个碳，适合地是1或2个碳，特别是1个碳)由氧原子替换。
更适合地，另一接头包含PEG链。
更适合地，另一接头包含饱和、未分支C1-15烷基链。
更适合地，另一接头包含饱和、未分支C1-6烷基链。
更适合地，另一接头包含饱和、未分支C4或C6烷基链，例如C4烷基链。
在一实施方案中，是式(V)连接部分：
其中n、Y和L1在以下定义，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。
因此，在一实施方案中，靶向性配体部分是式(VI)连接部分：
其中n、Y和L1在以下定义，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。
适合地，是式(XIV)连接部分：
其中n、Y、R1和L在以下定义，L连接于靶向性配体例如GalNAc，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。
适合地，靶向性配体部分是式(IV)连接部分：
其中n、Y、R1和L在以下定义，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。
适合地，是式(VII)连接部分：
其中n、Y和L2在以下定义，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。
适合地，靶向性配体部分是式(VIII)连接部分：
其中n、Y和L2在以下定义，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。
适合地，是式(IX)连接部分：
其中F、Y和L在以下定义，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。
适合地，靶向性配体部分是式(IXa)连接部分：
其中F、Y和L在以下定义，并且磷酸基团的O连接于RNA链的末端寡核苷。
适合地，L是：
在以上结构中的任一者中，适合地，配体选自GalNAc和半乳糖部分，尤其是GalNAc部分。或者，GalNac可由另一靶向性配体例如糖替换。
在本发明的一实施方案中，第一RNA链是式(X)的化合物：
其中b是0或1；并且
第二RNA链是式(XI)的化合物：
其中：
c和d独立地是0或1；
Z1和Z2分别是第一RNA链和第二RNA链的RNA部分；Y是O或S；
n是0、1、2或3；并且
L1是连接至配体的接头；
并且其中b+c+d是2或3。
适合地，第一RNA链是式(XV)的化合物
其中b是0或1；并且
第二RNA链是式(XVI)化合物：
其中c和d独立地是0或1；
其中：
Z1和Z2分别是第一RNA链和第二RNA链的RNA部分；
Y是O或S；
R1是H或甲基；
n是0、1、2或3；并且
在式(XV)和(XVId中，L是相同的或不同的，并且选自由以下组成的组：
-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s＝1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v是2-12；并且
其中如果末端C(O)存在，则其连接于NH基团；
并且其中b+c+d是2或3。
适合地，第一RNA链是式(XII)化合物：
其中b是0或1；并且
第二RNA链是式(XIII)化合物：
其中：
c和d独立地是0或1；
Z1和Z2分别是第一RNA链和第二RNA链的RNA部分；
Y是O或S；
n是0、1、2或3；并且
在式(XII)和(XIII)中，L2是相同的或不同的，并且在由b、c和d加括号的部分中，是相同的或不同的，并且选自由以下组成的组：
或
n是0，并且L2是：
并且末端OH基团不存在，以致形成以下部分：
其中
F是饱和、分支或未分支(诸如未分支)C1-8烷基(例如C1-6烷基)链，其中碳原子中的一者任选地被氧原子替换，前提是所述氧原子与另一杂原子(例如O或N原子)由至少2个碳原子分隔；
在式(I)和(II)中，L是相同的或不同的，并且选自由以下组成的组：
-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s＝1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v是2-12；并且
其中如果末端C(O)存在，则其连接于NH基团；
并且其中b+c+d是2或3。
在其中存在GalNAc的上式中的任一者中，GalNAc可被替代成任何其他靶向性配体诸如本文提及的那些。
适合地，b是0，c是1，并且d是1；b是1，c是0，并且d是1；b是1，c是1，并且d是0；或b是1，c是1，并且d是1。
更适合地，b是0，c是1，并且d是1；b是1，c是0，并且d是1；或b是1，c是1，并且d是1。
最适合地，b是0，c是1，并且d是1。
在一个实施方案中，Y是O。在另一实施方案中，Y是S。
在一个实施方案中，R1是H或甲基。在一个实施方案中，R1是H。在另一实施方案中，R1是甲基。
在一个实施方案中，n是0、1、2或3。适合地，n是0。
在一个实施方案中，L选自由以下组成的组：
-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s＝1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v是2-12；
其中末端C(O)连接于NH基团。
适合地，L是-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12。适合地，r＝2-6。更适合地，r＝4或6，例如4。
适合地，L是：
实例F部分包括(CH2)1-6，例如(CH2)1-4，例如CH2、(CH2)4、(CH2)5或(CH2)6，或CH2O(CH2)2-3例如CH2O(CH2)CH3。
适合地，L2是：
适合地，L2是：
适合地，L2是：
适合地，L2是：
适合地，n是0，并且L2是：
并且末端OH基团不存在，以致形成以下部分：
其中Y如在本文中其他地方所定义。
在由b、c和d加括号的部分内，L2通常是相同的。在由b、c和d加括号的部分之间，L2可相同或不同。在一实施方案中，由c加括号的部分中的L2与由d加括号的部分中的L2相同。在一实施方案中，由c加括号的部分中的L2不与由d加括号的部分中的L2相同。在一实施方案中，由b、c和d加括号的部分中的L2是相同的，例如当接头部分是丝氨醇衍生接头部分时。
丝氨醇衍生接头部分可基于呈任何立体化学形式的丝氨醇，即由L-丝氨酸异构体、D-丝氨酸异构体、外消旋丝氨酸或异构体的其他组合衍生。在本发明的一优选方面，丝氨醇-GalNAc部分(SerGN)具有以下立体化学：
即基于由L-丝氨酸异构体衍生的(S)-丝氨醇-亚酰胺或(S)-丝氨醇丁二酸酯固体载体化构建单元。
在一个实施方案中，所靶向细胞是肝细胞。
一般性合成流程：1
实例化合物可根据以下描述以及为本领域技术人员所知的方法合成。尽管流程说明特定缀合物的合成，但应了解其他要求保护的缀合物可通过类似方法制备。寡核苷酸链和接头构建单元的组装可例如通过应用亚磷酰胺方法的固相合成进行。固相合成可从碱基或经修饰构建单元装载的lcaa CPG开始。亚磷酰胺合成偶联循环由以下组成：1)移除DMT，2)使用所需DMT掩蔽亚磷酰胺和活化剂进行链延伸，所述活化剂可为苯甲基硫基四唑(BTT)，3)对非延伸寡核苷酸链进行加帽，随后通过碘(如果需要磷酸二酯键)或EDITH(如果需要硫代磷酸酯键)使P(III)氧化成P(V)，并且再次加帽(加帽/氧化/加帽或加帽/硫代/加帽)。GalNAc缀合可通过GalNAc-羧酸构建单元与先前组装和纯化的连接有必要数目的经氨基修饰接头构建单元的寡核苷酸形成肽键来实现。必要构建单元可商购获得，或以下描述合成。所有最终单链产物都通过AEX-HPLC分析以证明它们的纯度。纯度以FLP％(全长产物％)给出，所述FLP％是在对最终产物的AEX-HPLC分析的紫外迹线的情况下，所指定产物信号下UV面积的百分比。相应单链产物的身份通过LC-MS分析来证明。
合成子的合成
流程1：DMT-丝氨醇(TFA)接头合成子的合成
i)三氟乙酸乙酯，NEt3，MeOH，0℃，16小时，2：86％5：90％，ii)DMTCl，吡啶，0℃，16小时，74％，iii)LiBH4，EtOH/THF(1/1，v/v)，0℃，1小时，76％，iv)2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺，EtNiPr2，CH2Cl2，56％，v)丁二酸酐，DMAP，吡啶，室温，16小时，38％，vi)HBTU，DIEA，氨基-lcaa CPG(500A)，室温，18小时，29％(26umol/g装载量)。
(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-亚磷酰胺7可根据文献公开方法(Hoevelmann等Chem.Sci.,2016,7,128-135)从(L)-丝氨酸甲酯衍生物1合成。
(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯6可通过在催化剂诸如DMAP存在下用丁二酸酐使中间体5转化来制备。
将6装载至固体载体诸如可控孔度玻璃(CPG)载体可通过使用偶联试剂诸如HBTU，与固体载体诸如经氨基修饰天然CPG载体(500A)形成肽键来实现。将(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯6和偶联试剂诸如HBTU溶解于溶剂诸如CH3CN中。将碱诸如二异丙基乙胺添加至溶液中，并且将反应混合物搅拌2分钟。将固体载体诸如天然氨基-lcaa-CPG载体(500A，3g，胺含量：136umol/g)添加至反应混合物中，并且形成混悬液。在室温下在腕动式振荡器上温和振荡混悬液16小时，接着过滤，并且用溶剂诸如DCM和EtOH洗涤。在真空下干燥载体2小时。载体上的未反应胺可通过与乙酸酐/二甲基吡啶/N-甲基咪唑一起在室温下搅拌来加帽。对载体的洗涤可如上加以重复。在真空下干燥固体载体以产生固体载体10。
流程2：GalNAc合成子9的合成
(vii)TMSOTf，DCM，己烯醇，viii)RuCl3，NaIO4，DCM，CH3CN，H2O，46％(历经两步)。
对GalNAc合成子9的合成可根据如Nair等(2014)中所述的方法，从可商购获得的全乙酰化半乳糖胺8起始来制备。
单链丝氨醇衍生GalNAc缀合物的合成
流程3：用于丝氨醇衍生接头的一般性寡核苷酸合成程序
3’单GalNAc缀合寡核苷酸(诸如化合物A0264)的寡核苷酸合成概述于图13中，并且概述于流程3中。如在实例化合物A0264的情况下，合成使用(S)-DMT-丝氨醇(TFA)–丁二酸酯-lcaa-CPG 10加以开始。在需要额外丝氨醇构建单元的情况下，(S)-DMT-丝氨醇(TFA)亚酰胺(7)用于适当固相合成循环中。举例来说，为制备化合物A0329，在碱基序列被完全组装之后，用额外丝氨醇亚酰胺偶联完成链组装。此外，5’单GalNAc缀合寡核苷酸的寡核苷酸合成可从装载有它的有关序列的适当核苷的固体载体开始。在实例化合物A0220中，这可为2’fA。寡核苷酸链根据它的序列组装，并且在适当时，使用构建单元(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-亚酰胺(7)。在完成链延伸后，移除末个偶联亚酰胺构建单元的保护性DMT基团，如在亚磷酰胺合成循环的步骤1)中。
在完成末个合成仪步骤后，单链可通过用胺处理诸如40％甲胺水溶液处理来从固体载体裂解去除。任何剩余保护基也在这个步骤中被移除，并且甲胺处理还释放丝氨醇氨基官能基。粗产物接着各自通过AEX-HPLC和SEC纯化以产生用于进行进一步GalNAc缀合的前体寡核苷酸。
流程4：丝氨醇衍生前体寡核苷酸的GalNAc缀合合成
固相合成后GalNAc缀合通过由肽偶联试剂诸如HBTU使GalN(Ac4)-C4酸(9)预活化来实现。接着使预活化酸9与11(例如A0264)中的氨基反应以形成中间GalN(Ac4)缀合物。GalNAc部分中的保护羟基的乙酰基通过甲胺处理来裂解去除以产生所需实例化合物12(例如A0268)，所述化合物通过AEX-HPLC和SEC来进一步纯化。单链非丝氨醇衍生GalNAc缀合物的合成
除丝氨醇以外的经氨基修饰构建单元可从各种供应商处商购获得，并且可替代丝氨醇用于提供允许达成GalNAc缀合的反应性氨基。举例来说，通过使用氨基修饰剂装载的CPG诸如10-1至10-3，随后如上所述进行序列组装，以及最终进行氨基修饰剂亚磷酰胺诸如13-1、13-2或13-4的偶联，下表6中所示的可商购获得的构建单元可用于提供非丝氨醇衍生的经氨基修饰前体寡核苷酸14(流程5A)
举例来说，为制备14(A0653)，GlyC3Am-CPG(10-2)与GlyC3Am-亚酰胺13-2组合使用。在结构上不同的修饰剂可用于制备14，例如对于A0651，C7Am-CPG与作为第二氨基修饰的C6Am-亚酰胺组合使用。以类似方式，可商购获得的氨基修饰剂装载的CPG 10-5和经氨基修饰亚磷酰胺13-5可用于合成经氨基修饰前体分子14(A0655)。
表6：可商购获得的构建单元
流程5：一般性寡核苷酸合成程序
所得前体寡核苷酸14可接着与GalN(Ac4)-C4酸(9)缀合以产生所需实例化合物15(流程6)。
流程6：前体寡核苷酸的GalNAc缀合合成
参考缀合物3-4中的单链三触角GalNAc缀合物的合成
三触角GalNAc簇缀合的siRNA的寡核苷酸合成概述于图14中。如在实例化合物A0006的情况下，寡核苷酸链组装使用基底负载的载体例如5’DMT-2’FdA(bz)-丁二酸酯-lcaa-CPG加以开始。重复由以下组成的亚磷酰胺合成偶联循环直至达到产物的全长：1)移除DMT，2)使用所需DMT掩蔽亚磷酰胺进行链延伸，3)对非延伸寡核苷酸链进行加帽，随后通过碘或EDITH(如果需要硫代磷酸酯键)使P(III)氧化成P(V)，并且再次加帽(加帽/氧化/加帽或加帽/硫代/加帽)。对于三价三触角GalNAc簇的柱上缀合，在使用必要三价分支亚酰胺C4XLT-phos的情况下应用相同合成循环，随后使用GalNAc亚酰胺ST23-phos进行另一轮合成循环。在完成此末个合成仪步骤后，将寡核苷酸从固体载体裂解，并且可通过甲胺处理来移除额外保护基。粗产物接着各自通过AEX-HPLC和SEC纯化。
一般性双链形成程序
为获得双链缀合物，将独个单链以60OD/mL的浓度溶解于H2O中。两种独个寡核苷酸溶液可一起添加至反应容器中。对于反应监测，可进行滴定。第一链相比于第二链以过量25％添加，如通过在260nm下的紫外吸收所测定。将反应混合物例如加热至80℃，持续5分钟，接着缓慢冷却至室温。双链形成可通过离子对反相HPLC来监测。根据残余单链的UV面积，可计算第二链的需要量，并且添加至反应混合物中。再次将反应例如加热至80℃，并且缓慢冷却至室温。可重复这个程序直至检测到小于10％的残余单链。
以上方法(包括流程1-6以及图13和图14)可易于改适以用另一靶向性配体例如糖替换GalNac。
在以上方面中的任一者，替代固相合成后缀合，有可能制备预先形成的丝氨醇(GN)-亚磷酰胺，并且将此用于柱上缀合。
一般性合成流程：2
实例化合物可根据以下描述以及为本领域技术人员所知的方法合成。寡核苷酸链和接头构建单元的组装可例如通过应用亚磷酰胺方法的固相合成进行。GalNAc缀合可通过GalNAc-羧酸构建单元与先前组装和纯化的连接有必要数目的经氨基修饰接头构建单元的寡核苷酸形成肽键来实现。
流程1：DMT-丝氨醇(TFA)接头合成子的合成
i)三氟乙酸乙酯，NEt3，MeOH，0℃，16小时，2：86％5：90％，ii)DMTCl，吡啶，0℃，16小时，74％，iii)LiBH4，EtOH/THF(1/1，v/v)，0℃，1小时，76％，iv)2-氰基乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺，EtNiPr2，CH2Cl2，56％，v)丁二酸酐，DMAP，吡啶，室温，16小时，38％，vi)HBTU，DIEA，氨基-lcaa CPG(500A)，室温，18小时，29％。
DMT-丝氨醇(TFA)-亚磷酰胺7可根据文献公开方法(Hoevelmann等Chem.Sci.,2016,7,128-135)从丝氨醇衍生物1合成。
DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯6可通过在催化剂诸如DMAP存在下用丁二酸酐使中间体5转化来制备。
将6装载至固体载体诸如CPG载体可通过使用偶联试剂诸如HBTU，与固体载体诸如经氨基修饰天然CPG载体(500A)形成肽键来实现。将DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯6和偶联试剂诸如HBTU溶解于溶剂诸如CH3CN中。将碱诸如二异丙基乙胺添加至溶液中，并且将反应混合物搅拌2分钟。将固体载体诸如天然氨基-lcaa-CPG载体(500A，3g，胺含量：136μmol/g)添加至反应混合物中，并且形成混悬液。在室温下在腕动式振荡器上温和振荡混悬液16小时，接着过滤，并且用溶剂诸如DCM和EtOH洗涤。在真空下干燥载体2小时。载体上的未反应胺可通过与乙酸酐/二甲基吡啶/N-甲基咪唑一起在室温下搅拌来加帽。对载体的洗涤可如上加以重复。在真空下干燥固体载体以产生固体载体10。
流程2：GalNAc合成子9的合成
(vii)TMSOTf，DCM，己烯醇，viii)RuCl3，NaIO4，DCM，CH3CN，H2O，46％(历经两步)。
对GalNAc合成子9的合成可根据如Nair等J.Am.Chem.Soc.,2014,136(49),第16958–16961页中所述的方法，从可商购获得的全乙酰化半乳糖胺8起始来制备。
流程3：一般性寡核苷酸合成程序
所有寡核苷酸都可使用在以下详细描述的标准亚磷酰胺化学在AKTA oligopilot10合成仪上合成。
3’和5’GalNAc缀合寡核苷酸前体(诸如化合物X0385B-prec)的寡核苷酸合成概述于图17中，并且概述于流程3中。合成使用DMT-丝氨醇(TFA)–丁二酸酯-lcaa-CPG 10加以开始。应用亚磷酰胺合成循环直至达到产物的全长。在完成链延伸后，可以与在每个单独合成循环中相同的方式移除末个偶联亚酰胺构建单元的保护性DMT基团。为完成对实例化合物X0385B-prec(其在第二链的3’和5’末端具有丝氨醇衍生接头部分)的合成，在碱基序列被完全组装之后，用额外丝氨醇亚酰胺偶联完成链组装。
在完成末个合成仪步骤后，单链可通过用胺诸如40％甲胺水溶液处理来从固体载体裂解去除。任何剩余保护基也在这个步骤中被移除，并且甲胺处理还释放丝氨醇氨基官能基。所得粗制寡核苷酸可通过离子交换色谱法(Resource Q，6mL，GE Healthcare)，使用梯度诸如氯化钠梯度在AKTA Pure HPLC系统上纯化。来自IEX纯化的过量盐可通过SEC移除以产生经氨基修饰前体寡核苷酸11。将含有产物的级分合并，在尺寸排阻柱(Zetadex，EMPBiotech)上脱盐，并且冻干。
流程4：一般性GalNAc缀合程序
(i)9，HBTU，DIPEA，DMSO；11，H2O，DMSO，DIPEA；于是得到活化的9，11；接着采用40％ MeNH2，H2O
如上所述的GalNAc合成子9的缀合可通过使用为技术熟练人员所知的标准肽偶联条件，使9偶联于相应寡核苷酸链11的丝氨醇-氨基官能基来实现。举例来说，将相应经氨基修饰前体分子11溶解于H2O中，并且添加极性溶剂诸如DMSO(例如DMSO/H2O，2/1，v/v)，随后添加碱诸如DIPEA(例如总体积的2.5％)。在单独反应容器中，对GalNAc合成子9的预活化可通过使2当量(根据经氨基修饰前体寡核苷酸中的氨基官能基)的羧酸组分与2当量的偶联试剂诸如HBTU在8当量的碱诸如DIPEA存在下在极性溶剂诸如DMSO中反应来进行。在2分钟之后，将活化的化合物9添加至相应经氨基修饰前体分子11的溶液中。反应进展可通过LCMS或AEX-HPLC监测。在完成缀合反应(例如30分钟)后，粗产物可通过添加10x iPrOH 0.1x2MNaCl来沉淀，并且通过离心倾析加以收集。在碱性条件诸如40％MeNH2(1mL/500OD)下移除乙酰基羟基保护基。在室温下15分钟之后，添加H2O(1:10v/v)，并且分离化合物12(诸如图17中所示的X0385B)，通过阴离子交换和尺寸排阻色谱法再次纯化，接着冻干。
一般性双链形成程序
将独个单链以60OD/mL的浓度溶解于H2O中。两种独个寡核苷酸溶液可一起添加至反应容器中。对于反应监测，可进行滴定。第一链相比于第二链以过量25％添加，如通过在260nm下的紫外吸收所测定。将反应混合物例如加热至80℃，持续5分钟，接着缓慢冷却至室温。双链形成可通过离子对反相HPLC来监测。根据残余单链的UV面积，可计算第二链的需要量，并且添加至反应混合物中。再次将反应例如加热至80℃，并且缓慢冷却至室温。可重复这个程序直至检测到小于10％的残余单链。
以上方法(包括流程1-4以及图17)可易于改适以用另一靶向性配体例如糖替换GalNac。
本发明涉及一种用于抑制细胞中LPA基因的表达的缀合物，所述缀合物包含核酸部分和配体部分，所述核酸部分包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一RNA链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二RNA链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述LPA基因转录的RNA的至少一部分，所述配体部分包含接头部分以及用于在体内靶向细胞，并且只缀合于一个或两个RNA链的3’和/或5’末端的靶向性配体，其中所述第一RNA链的5’末端未被缀合，其中：
(i)所述第二RNA链在5’末端缀合于所述靶向性配体，并且其中(a)所述第二RNA链还在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第一RNA链的3’末端未被缀合；或(b)所述第一RNA链在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的3’末端未被缀合；或(c)所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均还在3’末端缀合于所述靶向性配体；或
(ii)所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的5’末端未被缀合。
接头部分可以例如是丝氨醇衍生接头部分，或本文所述的其他接头类型中的一者。
作为另一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73，其中所述核酸缀合于配体。第二链可包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、64、66、68、70、72或74的核苷酸序列。第一链和/或第二链的核苷酸可如本文所述加以修饰。
优选地，核酸包含缀合于式I配体(如上所阐述)的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10，其中所述配体缀合于如所描述的核酸，并且其中第一链在奇数编号核苷酸上用2'OMe修饰加以修饰，并且在偶数编号核苷酸上用2’F加以修饰，并且第二链在偶数编号核苷酸上用2’OMe加以修饰，并且在奇数编号核苷酸上用2’F加以修饰。
更优选地，核酸包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10，其中核酸缀合于式I配体(如上所阐述)，并且此外，其中核酸具有如下所示的是如本文提供的表1的摘录的修饰样式。
其中特定修饰由数字描绘
1＝2’F-dU；
2＝2’-F-dA；
3＝2’F-dC；
4＝2’F-dG；
5＝2’-OMe-rU；
6＝2’-OMe-rA；
7＝2’-OMe-rC；
8＝2’-OMe-rG。
配体可包含GalNAc，并且图4A或图4B还说明本发明的实例。
本发明还提供了包含本发明的核酸或缀合核酸的药物组合物。药物组合物可单独或与其他药剂组合用作药剂或诊断剂。举例来说，本发明的一种或多种核酸缀合物可与递送媒介物(例如脂质体)和/或赋形剂诸如载体、稀释剂组合。还可添加其他试剂诸如防腐剂和稳定剂。用于递送核酸的方法在本领域中是已知的，并且在本领域技术人员的知识范围内。
本发明的核酸或缀合核酸还可与单独施用或例如以组合单位剂量形式同时施用的其他治疗性化合物组合施用。本发明还包括一种药物组合物，其包含存在于生理上/药学上可接受的赋形剂诸如稳定剂、防腐剂、稀释剂、缓冲剂等中的本发明的一种或多种核酸或缀合核酸。
本发明的药剂和药物组合物的剂量水平可由本领域技术人员通过常规实验确定。在一个实施方案中，单位剂量可含有约0.01mg/kg体重与约100mg/kg体重之间的核酸或缀合核酸。或者，剂量可为10mg/kg体重至25mg/kg体重，或1mg/kg体重至10mg/kg体重，或0.05mg/kg体重至5mg/kg体重，或0.1mg/kg体重至5mg/kg体重，或0.1mg/kg体重至1mg/kg体重，或0.1mg/kg体重至0.5mg/kg体重，或0.5mg/kg体重至1mg/kg体重。剂量水平还可通过其他参数诸如(例如)体表面积计算。
药物组合物可为无菌可注射水性混悬液或溶液，或呈冻干形式。
本发明的药物组合物和药剂可以药学上有效剂量向哺乳动物受试者施用。哺乳动物可选自人、非人灵长类动物、猿猴或原猴、狗、猫、马、牛、猪、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、仓鼠、刺猬和豚鼠、或其他相关物种。在此基础上，如本文所用的措词“LPA”或“LPA”表示以上提及的物种中的任一者中的核酸或蛋白质，条件是所述核酸或蛋白质在所述物种中天然地或人工地表达，但优选地，这个措词表示人核酸或蛋白质。
本发明的另一方面涉及用于治疗疾病、病症或综合征的本发明的一种核酸或缀合核酸或包含本发明的所述核酸或缀合核酸的药物组合物。治疗可以是为了预防中风、动脉粥样硬化、血栓形成或心血管疾病诸如冠心病或主动脉瓣狭窄以及与含Lp(a)粒子水平升高相关的任何其他疾病或病理，以及降低罹患中风、动脉粥样硬化、血栓形成或心血管疾病诸如冠心病或主动脉瓣狭窄以及与含Lp(a)粒子水平升高相关的任何其他疾病或病理的风险。本发明包括一种药物组合物，其包含存在于生理上/药学上可接受的赋形剂诸如稳定剂、防腐剂、稀释剂、缓冲剂等中的本发明的一种或多种核酸或缀合核酸。
药物组合物可为无菌可注射水性混悬液或溶液，或呈冻干形式，或被附着、吸收或包括至任何其他适合盖仑(galenic)载体物质或至所述载体物质中，诸如丸粒、片剂、胶囊、纳米粒子、凝胶剂、片剂、珠粒或类似结构。
本文所述的核酸可能够抑制LPA的表达。本文所述的核酸可能够部分地抑制LPA的表达。抑制可为完全的，即相较于在不存在本发明的核酸下的LPA表达水平是0％。对LPA表达的抑制可为部分的，即它可为在不存在本发明的核酸下的LPA表达的15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或中间值。当在受试者诸如人患者中使用时，抑制可持续2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、10周、11周、12周、13周、14周或多达3个月。本发明的核酸或缀合核酸或包括所述核酸或缀合核酸的组合物可用于包括每周一次或两次、每周、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、或每八周进行治疗的方案中，或用于采用不同给药频率诸如之前提及的间隔的组合的方案中。核酸可以皮下方式、静脉内方式或使用任何其他施加途径诸如口服、经直肠或腹膜内施加途径进行使用。
相较于未处理细胞和/或受试者，在用本发明的核酸或缀合核酸处理或接受本发明的核酸或缀合核酸的细胞和/或受试者中，LPA表达可被抑制从15％直至100％但至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％或中间值的范围。抑制水平可允许治疗与LPA表达或过度表达相关的疾病，或可用于进一步探究LPA基因产物的功能和生理作用。
本发明的另一方面涉及本发明的一种用于制造用以治疗疾病、病症或综合征诸如如上所列的那些或与Lp(a)的水平升高相关的额外病理的药剂，或用于其中需要抑制LPA表达的额外治疗方法中的核酸或缀合核酸。
本发明中还包括一种治疗或预防疾病、病症或综合征诸如以上所列的那些的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用包含如本文所述的核酸或缀合核酸的药物组合物(以改善所述病理)。核酸组合物可以包括每周两次、每周一次、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、或每八周进行治疗的方案，或以采用不同给药频率诸如之前提及的间隔的组合的方案施用。核酸或缀合核酸可以皮下方式或静脉内方式或其他施加途径诸如口服、经直肠或腹膜内施加途径进行使用。
本发明的核酸或缀合核酸还可被施用以与单独施用或例如以组合单位剂量形式同时施用的其他治疗性化合物组合使用。还有可能的是与其他生物活性分子实体诸如肽、细胞配体或人工配体或小分子和大分子进行分子缀合。
本发明的核酸或缀合核酸可使用本领域中的常规方法产生，所述常规方法包括化学合成，或在体外(例如进行转录)或在体内表达核酸。举例来说，使用固相化学合成，或使用基于核酸的表达载体，包括病毒衍生物或部分或完全合成表达系统。在一个实施方案中，表达载体可用于在体外，在中间宿主生物体或细胞类型内，在中间或最终生物体内，或在所需靶细胞内产生本发明的核酸。本文所述的核酸的产生方法(合成或酶促转录)为本领域技术人员所知。
本发明物由通过细胞RNA干扰机理结合LPA基因转录物来介导LPA mRNA降解的化学分子实体组成。发明的分子化合物可以具有但不限于N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)糖部分的缀合物形式使用，所述糖部分确保通过特异性结合无唾液酸糖蛋白受体复合物(ASGPR)达成肝细胞特异性细胞摄取。本发明物可连接于其他不同化学结构，从而赋予如在以下中提及的不同性质。核酸的化学修饰样式的使用赋予在血清中的核酸酶稳定性，并且使得例如皮下施加途径可行。
本发明物的特征在于在分子和组织定向递送水平下具有高特异性，从而潜在赋予比当前可用治疗更好的安全性概况。
本发明还提供了一种根据本文所述的本发明的任何方面的核酸，其中第一RNA链具有末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，并且所述末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸通过磷酸二酯键连接于第一链中的第二核苷酸。
在一个实施方案中，第一链可包括超过1个磷酸二酯键。
在一个实施方案中，第一链可在至少三个末端5’核苷酸与之间包含磷酸二酯键。
在一个实施方案中，第一链可在至少四个末端5’核苷酸之间包含磷酸二酯键。
在一个实施方案中，第一链可包括式(XVII)：
(vp)-N(po)[N(po)]n-
(XVII)
其中‘(vp)-’是5’(E)-乙烯基膦酸酯，‘N’是核苷酸，‘po’是磷酸二酯键，并且n是1至(第一链中的核苷酸的总数–2)，优选地，其中n是1至(第一链中的核苷酸的总数-3)，更优选地，其中n是1至(第一链中的核苷酸的总数-4)。
在一个实施方案中，第一链可包括至少一个硫代磷酸酯(ps)键。
在一个实施方案中，第一链可还包含在两个末端3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键，或在三个末端3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
在一个实施方案中，第一链中的其他核苷酸之间的键联是磷酸二酯键。
在一个实施方案中，第一链可包括超过1个硫代磷酸酯键。
在另一实施方案中，第二链可包含在两个末端3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键，或在三个末端3’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
在另一实施方案中，第二链可包含在两个末端5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键，或在三个末端5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
在一实施方案中，末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸是RNA核苷酸。
末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸是其中在5’末端的天然磷酸酯基团已用E-乙烯基膦酸酯替换的核苷酸，其中5’磷酸化链的末端核苷酸的桥接5’氧原子用甲炔基(-CH＝)替换：
在5’末端具有天然磷酸酯的核苷酸
在5’末端具有E-乙烯基膦酸酯的核苷酸
5’(E)乙烯基膦酸酯是5’磷酸酯模拟物。生物模拟物是能够执行与所模拟的原始分子相同的功能，并且在结构上极其类似于所述原始分子的分子。在本发明的情形下，5’(E)乙烯基膦酸酯模拟正常5’磷酸酯的功能，例如使得能够达成高效RISC装载。此外，由于它的略微改变的结构，所以5’(E)乙烯基膦酸酯能够通过保护5’末端核苷酸免遭由酶诸如磷酸酶进行的脱磷酸而使它稳定。
本发明的一个方面是一种如本文公开的用于抑制细胞中靶标基因的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述靶标基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链在多个位置处包括经修饰核苷酸或未修饰核苷酸以促进由RISC对所述核酸的加工。
在一个方面，“促进由RISC进行的加工”意指核酸可由RISC加工，例如存在的任何修饰都将容许核酸由RISC加工，适合的是以致可发生siRNA活性。
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置13的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。
第二链上“对应于”第一链上某一位置的核苷酸适合地是与第一链上的那个核苷酸进行碱基配对的核苷酸。
在一个方面，第二链上对应于第一链的位置13的核苷酸是与第一链的位置13形成碱基对的核苷酸。
在一个方面，第二链上对应于第一链的位置11的核苷酸是与第一链的位置11形成碱基对的核苷酸。
在一个方面，第二链上对应于第一链的位置12的核苷酸是与第一链的位置12形成碱基对的核苷酸。
这个命名法可应用于第二链的其他位置。举例来说，在是双链，并且具有钝性末端的19聚体核酸中，第一链的位置13将与第二链的位置7配对。第一链的位置11将与第二链的位置9配对。这个命名法可应用于第二链的其他位置。
对应于第一链的位置13的核苷酸适合地是第二链的从双链区域的第一核苷酸起始，从第二链的3'开始计数的位置13。同样地，第二链的位置11适合地是从双链区域的第一核苷酸起始，从第二链的3'开始的第11核苷酸。这个命名法可应用于第二链的其他位置。
在一个方面，在部分互补的第一链和第二链的情况下，第二链上“对应于”第一链上某一位置的核苷酸可未必形成碱基对(如果那个位置是存在错配所处的位置)，但命名法的原则仍然适用。
优选的是第一链和第二链历经双链体区域是完全互补的(忽略任何突出部分区域)，并且在核酸的双链区域内不存在错配。
还优选的是：
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11和13的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。
在一个方面，第二链上对应于第一链的位置12的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。关于核酸的这个限制可与本文所述的任何其他限制一起得见。
因此，本发明的另一方面是一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11-13的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中第一链和/或第二链的大于50％的核苷酸包含2’O-甲基修饰，诸如第一链和/或第二链的大于55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％或更多包含2’O-甲基修饰，优选地测量为第一链与第二链两者的总核苷酸的百分比。
一种如本文公开的核酸，其中第一链和/或第二链的大于50％的核苷酸包含天然存在的RNA修饰，诸如其中第一链和/或第二链的大于55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％或更多包含这种修饰，优选地测量为第一链与第二链两者的总核苷酸的百分比。适合天然存在的修饰不仅包括2O’甲基，而且包括其他2’糖修饰，特别是产生DNA核苷酸的2’H修饰。
一种如本文公开的核酸，所述核酸在第一链和/或第二链上包含至多20％，诸如至多15％诸如多于10％的具有不是2’O甲基修饰的2'修饰的核苷酸，优选地以第一链与第二链两者的总核苷酸的百分比形式表示。
一种如本文公开的核酸，所述核酸包含在第一链和/或第二链上包含至多20％(诸如至多15％或至多10％)的2'氟代修饰，优选地以两个链的总核苷酸的百分比形式表示。
一种如本文公开的核酸，其中所有核苷酸都用2’O-甲基修饰加以修饰，例外之处是第一链的从5’末端开始的位置2和14以及第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸。优选地，不用2’O-甲基加以修饰的核苷酸在2’位用氟代加以修饰。
优选的是一种如本文公开的核酸，其中所述核酸的所有核苷酸都在糖的2’位被修饰。优选地，这些核苷酸用2’-氟代修饰加以修饰，其中所述修饰不是2’O-甲基修饰。
本发明的核酸可包含一个或多个在2’位用2’H加以修饰的核苷酸，因此在核酸内具有DNA核苷酸。本发明的核酸可在第一链的从第一链的5’末端开始计数的位置2和/或14处包含DNA核苷酸。核酸可在第二链上包含对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的DNA核苷酸。
在一个方面，每个本发明的核酸存在至多一个DNA。
本发明的核酸可包含一个或多个LNA核苷酸。本发明的核酸可在第一链的从第一链的5’末端开始计数的位置2和/或14处包含LNA核苷酸。核酸可在第二链上包含对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的LNA。
在一个方面，核酸在第一链上用交替2-O甲基修饰和2氟代修饰加以修饰，并且位置2和14(从5’末端起始)用2'氟代加以修饰。优选地，第二链在第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸处用2’氟代修饰加以修饰。优选地，第二链在起始于互补(双链)区域的第一位置，从3’末端开始计数的位置11-13处用2’氟代修饰加以修饰，并且其余修饰是天然存在的修饰，优选地是2’O-甲基。
在一个方面，本发明的核酸在第二链的3’末端包含一个或多个使用5’-5’键联或3’-3’键联，优选地使用3’-3’键联的倒置核糖核苷酸，优选地，倒置腺嘌呤。
在一个方面，核酸包含一个或多个二硫代磷酸酯键，诸如1、2、3或4个二硫代磷酸酯键。优选地，存在多达4个二硫代磷酸酯键，在第一链和第二链的5’和3’末端各有一个。
核酸的所有特征都可与本文公开的本发明的所有其他方面组合。
特别地，优选的是作为SiRNA分子的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且核酸包含以下中的一个或多个或全部：
(i)在第二链的3’末端的倒置核苷酸，优选地采用3’-3’键联；
(ii)一个或多个二硫代磷酸酯键；
(iii)对应于第一链的位置11或13的第二链核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，优选地，其中这些位置中的一者或两者包含2’氟代修饰；
(iv)核酸包含的全部核苷酸中的至少80％具有2’-O-甲基修饰；
(v)核酸包含至多20％的具有2’氟代修饰的核苷酸。
本发明还提供了一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸以及第二链的从5’末端开始在位置7和/或9、或7-9处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且至少90％的其余核苷酸是经2’-O甲基修饰的，或包含另一天然存在的2’修饰。
不具有突出部分的钝性双链19碱基核酸的特定优选实例是：
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置7处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置9处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置7和9处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置7-9处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置7和/或9、或7-9处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置7和/或9、或7-9处的核苷酸不用2’O-甲基修饰加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且第二链的从5’末端开始在位置7和/或9、或7-9处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中第一链和/或第二链的大于50％的核苷酸包含2’O-甲基修饰，诸如第一链和/或第二链的大于55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％或更多包含2’O-甲基修饰，优选地测量为第一链与第二链两者的总核苷酸的百分比。
一种如本文公开的核酸，其中第一链和/或第二链的大于50％的核苷酸包含天然存在的RNA修饰，诸如其中第一链和/或第二链的大于55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％或更多包含这种修饰，优选地测量为第一链与第二链两者的总核苷酸的百分比。适合天然存在的修饰不仅包括2O’甲基，而且包括其他2’糖修饰，特别是产生DNA核苷酸的2’H修饰。
一种如本文公开的核酸，所述核酸在第一链和/或第二链上包含至多20％，诸如至多15％诸如多于10％的具有不是2’O甲基修饰的2'修饰的核苷酸，优选地以第一链与第二链两者的总核苷酸的百分比形式表示。
一种如本文公开的核酸，所述核酸包含在第一链和/或第二链上包含至多20％(诸如至多15％或至多10％)的2'氟代修饰，优选地以两个链的总核苷酸的百分比形式表示。
一种如本文公开的核酸，其中所有核苷酸都用2’O-甲基修饰加以修饰，例外之处是第一链的从5’末端开始的位置2和14以及第二链的从5’末端开始在位置7和/或9处的核苷酸。优选地，不用2’O-甲基加以修饰的核苷酸在2’位用氟代加以修饰。
一种如本文公开的核酸，其中所有核苷酸都用2’O-甲基修饰加以修饰，例外之处是第一链的从5’末端开始的位置2和14以及第二链的从5’末端开始在位置7-9处的核苷酸。优选地，不用2’O-甲基加以修饰的核苷酸在2’位用氟代加以修饰。
对于包含20碱基对双链体区域的核酸，第二链优选地在从双链体的5’末端开始计数的分别对应于第一链的位置13、12和11的核苷酸8或9或10处不具有2’O-甲基。
对于包含21碱基对双链体区域的核酸，第二链优选地在从双链体的5’末端开始计数的分别对应于第一链的位置13、12和11的核苷酸9或10或11处不具有2’O-甲基。
本发明还涉及本文公开的所有经修饰序列的未修饰序列。
本发明现将参考以下非限制性附图和实施例来描述。
附图
图1显示关于抑制人RT-4细胞中的LPA mRNA表达的非缀合siRNA分子筛选的结果。
图2A和图2B显示非缀合LPA靶向siRNA分子关于人RT-4细胞中的LPA mRNA表达的剂量响应。
图3显示由通过受体介导的摄取递送的不同剂量的GalNAc-L1LPA-1038缀合siRNA分子对人和食蟹猴原代肝细胞中的LPA mRNA表达的抑制。
图4A和图4B分别显示具有例示寡核苷酸与其缀合的不同L1和L6接头的GalNAc配体的结构的实例。
图5显示在原代人肝细胞中由通过受体介导的摄取递送的所指示L6缀合GalNAcsiRNA使LPA-mRNA敲低的代表性实例。
图6描绘缀合物1。
图7描绘缀合物2。
图8描绘缀合物3。
图9描绘参考缀合物1。
图10描绘参考缀合物2。
图11描绘参考缀合物3。
图12描绘参考缀合物4。
在图6-图12以及图19-图30中的每一个中，顶链是反义链，并且底链是有义链。此外，为更清楚地显示核酸与配体部分之间的连接，在相应缀合链的末端的核苷酸被完全绘画。
图13显示A0268的合成，所述A0268是3’单GalNAc缀合单链寡核苷酸，并且是缀合物1和缀合物3的合成中的起始物质。(ps)表示硫代磷酸酯键。
图14显示A0006的合成，所述A0006是用于合成参考缀合物4的5’三触角GalNAc缀合单链寡核苷酸。(ps)表示硫代磷酸酯键。
图15说明对TTR敲低的体外测定。特别地，图15A显示对由参考缀合物(RC)1和3达成的TTR敲低以及未处理对照“UT”的体外测定；图15B显示对由参考缀合物(RC)2和3达成的TTR敲低以及未处理对照“UT”的体外测定；并且图15C显示对由缀合物1、2和3以及由RC3达成的TTR敲低以及未处理对照“UT”的体外测定。参考缀合物1和2代表比较缀合物。参考缀合物3代表非靶向GalNAc siRNA，并且“未处理”(“UT”)代表未处理细胞。RC3与UT两者是阴性对照。mRNA水平相对于PtenII加以归一化。
图16显示n＝4的c57BL/6小鼠群组中在用1mg/kg-缀合物1-3、参考缀合物(RC)1、2和4皮下处理后7、14和27天，以及模拟处理(PBS)个体的血清TTR的时间过程。
图17显示3’和5’GalNAc缀合寡核苷酸前体(诸如化合物X0385B-prec)的寡核苷酸合成。
图18显示在原代食蟹猴肝细胞中，相较于三触角GalNAc单元在第二链5’处，两个单一GalNAc单元缀合于第二链的LPA靶向siRNA达成相等敲低剂量响应。
图19A描绘缀合物4。在反义链和有义链的5’和3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。丝氨醇-GalNAc接头通过磷酸二酯键缀合于有义链的3’末端和5’末端。
图19B描绘缀合物5。在反义链的5’和3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。丝氨醇-GalNAc接头通过硫代磷酸酯键缀合于有义链的3’末端和5’末端。
图20描绘缀合物6。在反义链的5’和3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。丝氨醇-GalNAc接头通过磷酸二酯键缀合于有义链的3’末端和5’末端。
图21描绘缀合物7。在反义链和有义链的5’和3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。丝氨醇-GalNAc接头通过硫代磷酸酯键缀合于有义链的3’末端和5’末端。丝氨醇-GalNAc接头通过硫代磷酸酯键彼此连接。
图22描绘缀合物8。在反义链和有义链的5’和3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。GalNAc-C6-氨基修饰剂接头缀合在有义链的5’末端，并且GalNAc-C7-氨基修饰剂接头缀合在有义链的3’末端。
图23描绘缀合物9。在反义链和有义链的5’和3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。GalNAc-GlyC3-氨基修饰剂接头缀合在有义链的5’和3’末端。
图24描绘缀合物10。在反义链和有义链的5’和3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。并且有义链在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。GalNAc-哌啶基-氨基修饰剂接头缀合在有义链的5’和3’末端。
图25描绘缀合物11。在反义链和有义链的5’和3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。GalNAc-C3-氨基修饰剂接头缀合在有义链的5’和3’末端。
图26描绘缀合物12。在反义链和有义链的5’和3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。GalNAc-C6-氨基修饰剂接头缀合在有义链的5’末端，并且GalNAc-GlyC3-氨基修饰剂接头缀合在有义链的3’末端。
图27描绘仅由于它们的RNA序列而不同的缀合物15、16、18和19。在每种缀合物中，在反义链和有义链的5’和3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。丝氨醇-GalNAc接头通过硫代磷酸酯键缀合于有义链的3’末端和5’末端。
图28描绘仅由于它们的RNA序列而不同的参考缀合物5和参考缀合物9。在两种缀合物中，在反义链的5’和3’末端以及有义链的3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。在两种缀合物中，三聚GalNAc接头通过硫代磷酸酯键缀合于有义链的5’末端。
图29描绘仅由于它们的RNA序列而不同的参考缀合物6和参考缀合物7。在两种缀合物中，在反义链的5’和3’末端以及有义链的3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。在两种缀合物中，三聚GalNAc接头通过硫代磷酸酯键缀合于有义链的5’末端。
图30描绘参考缀合物8。在反义链的5’和3’末端以及有义链的3’末端的最后三个核苷酸在每个核苷酸之间通过硫代磷酸酯接头连接。三聚GalNAc接头通过硫代磷酸酯键缀合于有义链的5’末端。
图31说明对TTR敲低的体外测定。特别地，图31A显示相较于“Luc”(参考缀合物3)以及未处理对照“UT”，对由缀合物4、5、6和2达成的TTR敲低的体外测定；图31B显示相较于“Luc”(参考缀合物3)以及未处理对照“UT”，对由缀合物7和2达成的TTR敲低的体外测定。Luc或参考缀合物3(RC3)代表非靶向GalNAc siRNA，并且“未处理”(“UT”)代表未处理细胞。RC3与UT两者是阴性对照。mRNA水平相对于PtenII加以归一化。
图32说明对TTR敲低的体外测定。特别地，图32A显示相较于“Luc”(参考缀合物3)以及未处理对照“UT”，对由缀合物8、9、10、11和2达成的TTR敲低的体外测定；图32B显示相较于“Luc”(参考缀合物3)以及未处理对照“UT”，对由缀合物12和2达成的TTR敲低的体外测定。Luc或参考缀合物3代表非靶向GalNAc siRNA，并且“未处理”(“UT”)代表未处理细胞。RC3与UT两者是阴性对照。mRNA水平相对于PtenII加以归一化。
图33说明相较于对照，对由缀合物19达成的LPA mRNA敲低的体外测定。Ctr代表非靶向GalNAc siRNA，并且“未处理”(“UT”)代表未处理细胞。Ctr与UT两者是阴性对照。mRNA水平相对于ACTB加以归一化。
图34显示n＝6的c57BL/6小鼠群组中在用1mg/kg-缀合物15、参考缀合物(RC)6皮下处理后14、28和42天，以及模拟处理(PBS)个体的Aldh2肝mRNA水平的时间过程。mRNA水平相对于Pten加以归一化。
图35显示n＝6的c57BL/6小鼠群组中在用1mg/kg-缀合物16、参考缀合物(RC)7皮下处理后14、28和42天，以及模拟处理(PBS)个体的Aldh2肝mRNA水平的时间过程。mRNA水平相对于Pten加以归一化。
图36显示n＝6的c57BL/6小鼠群组中在用1mg/kg-缀合物18、参考缀合物(RC)8皮下处理后14、28和42天，以及模拟处理(PBS)个体的Tmprss6肝mRNA水平的时间过程。mRNA水平相对于Pten加以归一化。
图37显示缀合物4、5、6、7和2以及未处理对照(UT)在37℃下历经3天的血清稳定性。
图38显示缀合物8、9、10、11、12和2以及未处理对照(UT)在37℃下历经3天的血清稳定性。
图39显示由通过受体介导的摄取递送的不同剂量的GalNAc-L6偶联siRNA对人原代肝细胞中的LPA mRNA表达的抑制。
图40显示通过接头与配体缀合的核酸的各种实施方案的图示。
实施例
在每个实例中提及的编号为所述实例所特有。
实施例1
经修饰和缀合siRNA分子用于本文中的功能性实施例。
LPA-1038衍生物：
GalNAc-LPA-1038-L1
第一链(SEQ ID NO:119，基于SEQ ID NO 5)
OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3’
第二链(SEQ ID NO:120，基于SEQ ID NO SEQ ID NO 6)
5’[ST23(ps)]3长三倍子(ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3’
GalNAc-LPA-1038-L6
第一链(SEQ ID NO:121，基于SEQ ID NO 5)
OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-FU-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeA 3’
第二链(SEQ ID NO:122，基于SEQ ID NO 6)
5’[ST23(ps)]3ST43(ps)FU-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-O MeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3’
FN(N＝A,C,G,U)表示2’氟代2’脱氧核苷
OMeN(N＝A,C,G,U)表示2’O甲基核苷
(ps)指示硫代磷酸酯键
ST23和ST43如下。
其他实例是LPA 1041衍生物：
GalNAc-LPA-1041-L1
第一链(SEQ ID NO:123，基于SEQ ID NO 9)
5’OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-F U-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG 3’
第二链(SEQ ID NO:124，基于SEQ ID NO 10)
5’[ST23(ps)]3长三倍子(ps)FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-F U-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(ps)-FU 3’
GalNAc-LPA-1041-L6
第一链(SEQ ID NO:125，基于SEQ ID NO 9)
5’OMeA-(ps)-FU-(ps)-OMeA-FA-OMeC-FU-OMeC-FU-OMeG-F U-OMeC-FC-OMeA-FU-OMeU-FA-OMeC-(ps)-FC-(ps)-OMeG 3’
第二链(SEQ ID NO:126，基于SEQ ID NO 10)
5’[ST23(ps)]3ST43(ps)FC-OMeG-FG-OMeU-FA-OMeA-FU-OMeG-FG-OMeA-FC-OMeA-FG-OMeA-FG-OMeU-FU-(ps)-OMeA-(p s)-FU 3’
FN(N＝A,C,G,U)表示2’氟代2’脱氧核苷
OMeN(N＝A,C,G,U)表示2’O甲基核苷
(ps)指示硫代磷酸酯键
ST23和ST43如下。
ST23是GalNac C4亚磷酰胺(结构组分如下)
ST41如下：
ST43如下，并且如WO2017/174657中所述：
所有寡核苷酸都从商业寡核苷酸制造商(Biospring,Frankfurt,Germany，或RiboBio,Guangzhou,Guangdong,PRC)获得，或使用标准亚磷酰胺化学在AKTA oligopilot合成仪(内部)上合成。使用可商购获得的固体载体以及2’O-甲基RNA亚磷酰胺、2’氟代DNA亚磷酰胺(全都进行标准保护)和可商购获得的长三倍子亚磷酰胺(Glen research)。使用0.1M的亚磷酰胺的无水乙腈溶液进行合成，并且苯甲基硫基四唑(BTT)用作活化剂(0.3M乙腈溶液)。所有其他试剂都是可商购获得的标准试剂。
相应GalNac合成子(例如ST23、ST41或ST43)的缀合通过在标准亚磷酰胺偶联条件下使相应亚磷酰胺偶联于寡链的5’末端实现。使用标准可商购获得的硫醇化试剂(EDITH，Link technologies)引入硫代磷酸酯。
单链通过使用甲胺(40％水溶液)来从CPG裂解去除，并且所得粗制寡核苷酸通过离子交换色谱法(Resource Q，6mL，GE Healthcare)，使用氯化钠梯度在AKTA Pure HPLC系统上纯化。将含有产物的级分合并，在尺寸排阻柱(Zetadex，EMP Biotech)上脱盐，并且冻干。
对于退火，将等摩尔量的相应单链溶解于水中，并且加热至80℃，持续5分钟。在逐渐冷却至室温之后，将所得双链体冻干。
所得核酸(siRNA)的序列阐述于下表1中。
表1：关于对LPA mRNA表达的抑制加以测试的非缀合核酸序列。指示了序列和应用的修饰样式。
表1
表1：核苷酸修饰由以下数字(第4列)描绘，1＝2’F-dU；2＝2’F-dA；3＝2’F-dC；4＝2’F-dG；5＝2’-OMe-rU；6＝2’-OMe-rA；7＝2’-OMe-rC；8＝2’-OMe-rG。
表2：以下显示用于测量mRNA水平的LPA、APOB、β-肌动蛋白(beta-Actin)和PTENqPCR扩增子集的序列。
表2
实施例2
关于抑制人RT-4细胞中的LPA mRNA表达对非缀合siRNA分子(表1)的筛选。
在1.5μl RNAiMax(ThermoFisher)/80pmol所指示siRNA分子的比率下一式三份制备脂质体转染复合物。将复合物分别稀释至2,5nM和25nM的所指示浓度(数值成对表示为淡灰色棒条和深灰色棒条)。将内源性表达LPA的RT4人膀胱移行细胞乳头状瘤细胞在每孔125.000个细胞的密度下于24孔形式中接种在先前在所指示浓度下涂铺的转染复合物之上(反向转染)。在转染之后24小时，使用旋转细胞小型试剂盒250(Stratec)分离总RNA。相对于相应样品中的作为持家转录物的PPIB mRNA表达，通过qRT-PCR来测定LPA mRNA水平。数值相对于在未处理细胞中检测到的LPA mRNA的量加以归一化(板内)。非沉默siRNA化合物作为额外对照加以转染。显示了归一化一式三份数值的平均值和SD。结果显示于图1中。
实施例3
非缀合LPA靶向siRNA化合物关于人RT-4细胞中的LPA mRNA表达的剂量响应。
如上所述将RT4人膀胱移行细胞乳头状瘤细胞进行反向转染(实施例2)，并且用如所标记的不同非缀合siRNA化合物(表1)在所指示浓度(100nM至0.2nM的范围)下处理。在转染后24小时，使用旋转细胞小型试剂盒250(Stratec)分离总RNA。相对于相应样品中的作为持家转录物的PPIB mRNA表达，通过qRT-PCR来测定LPA mRNA水平。数值相对于在未处理细胞中检测到的LPA mRNA的量加以归一化。棒条表示每个数据点的剩余LPA mRNA表达。结果显示于图2中。
实施例4
由通过受体介导的摄取递送的不同剂量的GalNAc-L1 LPA-1038缀合siRNA分子对人和食蟹猴原代肝细胞中的LPA mRNA表达的抑制。
将原代肝细胞(ThermoFisher)在每孔45,000个细胞(食蟹猴)以及每孔30,000个细胞(人)的密度下涂铺在胶原包被的96孔板上。在涂铺之后立刻在所指示浓度(nM)下添加GalNAc-L1缀合LPA-1038。在siRNA处理之后24小时，使用InviTrap RNA细胞HTS 96孔试剂盒(Stratec)分离总RNA。相对于相应样品中的作为持家转录物的肌动蛋白(食蟹猴)或APOB(人)mRNA水平，通过qRT-PCR来测定LPA mRNA水平。数值相对于未处理细胞中的LPA表达加以归一化。剩余LPA mRNA水平的归一化一式三份数值的平均值和SD显示为黑色棒条。结果显示于图3中。
实施例5
在受体介导的递送后，在原代人肝细胞中，由不同所指示L6-GalNAc缀合siRNA对人原代肝细胞中的LPA-mRNA的敲低。
将原代人肝细胞(ThermoFisher)在每孔(96孔形式)30,000个细胞下涂铺在胶原包被的96孔板上。在细胞涂铺之后立刻在两种所指示浓度下添加包括非沉默对照的GalNAc-L6缀合siRNA。在siRNA处理之后24小时，使用InviTrap RNA细胞HTS 96孔试剂盒(Stratec)分离总RNA。相对于作为持家转录物的APOB mRNA，通过qRT-PCR来测定LPA mRNA表达水平。数值相对于未处理细胞中的LPA mRNA表达加以归一化，并且剩余LPA mRNA水平成对表示为棒条(100nM黑色棒条，20nM灰色棒条)。归一化一式三份数值的平均值和SD显示于图5中。
实施例6-缀合物的合成
实例化合物根据以下描述的方法以及为本领域技术人员所知的方法合成。寡核苷酸链和接头构建单元的组装通过应用亚磷酰胺方法的固相合成进行。GalNAc缀合通过GalNAc-羧酸构建单元与先前组装和纯化的连接有必要数目的经氨基修饰接头构建单元的寡核苷酸形成肽键来实现。
寡核苷酸合成、脱保护和纯化遵循本领域中已知的标准程序。
所有寡核苷酸都使用标准亚磷酰胺化学在AKTA oligopilot合成仪上合成。使用可商购获得的固体载体以及2’O-甲基RNA亚磷酰胺、2’氟代2’脱氧RNA亚磷酰胺(全都进行标准保护，ChemGenes，LinkTech)和可商购获得的3'-氨基修饰剂TFA氨基C-6lcaa CPG (Chemgenes)。全乙酰化半乳糖胺8可商购获得。
辅助试剂从EMP Biotech购买。使用0.1M的亚磷酰胺的无水乙腈溶液进行合成，并且苯甲基硫基四唑(BTT)用作活化剂(0.3M乙腈溶液)。偶联时间是15分钟。应用加帽/氧化/加帽或加帽/硫代/加帽循环(加帽：Ac2O/NMI/二甲基吡啶/乙腈，氧化剂：0.1M I2于吡啶/H2O中)。使用标准可商购获得的硫醇化试剂(EDITH，Link technologies)引入硫代磷酸酯。DMT裂解通过用含3％二氯乙酸的甲苯处理实现。在完成程序化合成循环后，进行二乙胺(DEA)洗涤。所有寡核苷酸都以DMT去除模式合成。
丝氨醇衍生接头部分的连接通过使用基底负载的(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯-lcaa-CPG 10或(S)-DMT-丝氨醇(TFA)亚磷酰胺7(合成如Hoevelmann等(Chem.Sci.,2016,7,128-135)中所述进行)实现。三触角GalNAc簇(ST23/C4XLT)通过相继偶联相应三倍子亚酰胺衍生物(C4XLT-phos)和GalNAc亚酰胺(ST23-phos)引入。
单链通过40％甲胺水溶液处理来从CPG裂解去除。所得粗制寡核苷酸通过离子交换色谱法(Resource Q，6mL，GE Healthcare)，使用氯化钠梯度在AKTA Pure HPLC系统上纯化。将含有产物的级分合并，在尺寸排阻柱(Zetadex，EMP Biotech)上脱盐，并且冻干。
将独个单链以60OD/mL的浓度溶解于H2O中。将两种独个寡核苷酸溶液一起添加于反应容器中。为更易于进行反应监测，进行滴定。第一链相比于第二链以过量25％添加，如通过在260nm下的紫外吸收所测定。将反应混合物加热至80℃，持续5分钟，接着缓慢冷却至室温。双链形成通过离子对反相HPLC来监测。根据残余单链的UV面积，计算第二链的需要量，并且添加至反应混合物中。再次将反应加热至80℃，并且缓慢冷却至室温。重复这个程序直至检测到小于10％的残余单链。
化合物2-10的合成
化合物2至5以及(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-亚磷酰胺7根据文献公开方法(Hoevelmann等Chem.Sci.,2016,7,128-135)合成。
(S)-4-(3-(双(4-甲氧基苯基)苯基)甲氧基)-2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)丙氧基)-4-氧代丁酸(6)。
向5的吡啶溶液中依次添加丁二酸酐和DMAP。将所得混合物在室温下搅拌过夜。如通过TLC所判断，所有起始物质都被消耗。使反应浓缩。使粗物质在硅胶中进行色谱分离，使用含0％至5％甲醇的DCM(+1％三乙胺)的梯度以提供1.33g 6(产率＝38％)。m/z(ESI-):588.2(100％),(C30H29F3NO8-的计算值：[M-H]-588.6)。1H-NMR:(400MHz,CDCl3)δ[ppm]＝7.94(d,1H,NH),7.39-7.36(m,2H,CH芳基),7.29-7.25(m,7H,CH芳基),6.82-6.79(m,4H,CH芳基),4.51–4.47(m,1H),4.31–4.24(m,2H),3.77(s,6H,2xDMTr-OMe),3.66-3.60(m,16H,HNEt3 +),3.26-3.25(m,2H),2.97–2.81(m,20H,NEt3),2.50-2.41(4H,m),1.48–1.45(m,26H,HNEt3 +),1.24-1.18(m,29H,NEt3)。
(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯-lcaa-CPG(10)
将(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯(159mg，270umol)和HBTU(113mg，299umol)溶解于CH3CN(10mL)中。将二异丙基乙胺(DIPEA，94μL，540umol)添加至溶液中，并且将混合物涡旋2分钟，随后添加天然氨基-lcaa-CPG(500A，3g，胺含量：136umol/g)。在室温下在腕动式振荡器上温和振荡混悬液16小时，接着过滤，并且用DCM和EtOH洗涤。在真空下干燥固体载体2小时。载体上的未反应胺通过与乙酸酐/二甲基吡啶/N-甲基咪唑一起在室温下搅拌来加帽。对载体的洗涤如上加以重复。在真空下干燥固体以产生固体载体10(3g，26umol/g装载量)。
GalNAc合成子(9)
对GalNAc合成子9的合成如Nair等J.Am.Chem.Soc.,2014,136(49),第16958–16961页中所述进行，历经两步具有46％产率。
表征性数据与公开数据相匹配。
寡核苷酸的合成
所有单链寡核苷酸都根据以上以及在图13和图14中所述的反应条件合成。
所有最终单链产物都通过AEX-HPLC分析以证明它们的纯度。纯度以FLP％(全长产物％)给出，所述FLP％是在对最终产物的AEX-HPLC分析的紫外迹线的情况下，所指定产物信号下UV面积的百分比。相应单链产物(非经修饰、经氨基修饰前体或GalNAc缀合寡核苷酸)的身份通过LC-MS分析来证明。
表3：单链未缀合寡核苷酸
5’1x NH2意指可用于缀合的游离丝氨醇衍生氨基的位置(5’末端)和数目(1xNH2)。举例来说，A0264上的1x3’NH2意指在链A0264的3’末端存在可与GalNAc合成子9反应的游离氨基。3'5'1xNH2意指在链的3’末端和5’末端存在一个可与GalNAc接头9反应的丝氨醇衍生游离氨基。
缀合物1-3以及参考缀合物1-2的合成
缀合物1-2以及参考缀合物1-2的缀合单链
GalNac合成子(9)的缀合通过使用肽偶联试剂，与相应寡核苷酸链11的丝氨醇-氨基官能基偶联来实现。因此，将相应经氨基修饰前体分子11溶解于H2O中(500OD/mL)，并且依次添加DMSO(DMSO/H2O，2/1，v/v)和DIPEA(总体积的2.5％)。在单独反应容器中，对GalN(Ac4)-C4酸(9)的预活化通过使2当量(根据经氨基修饰前体寡核苷酸11中的氨基官能基)的羧酸组分与2当量的HBTU在8当量DIPEA存在下在DMSO中反应来进行。在2分钟之后，将预活化的化合物9添加至相应经氨基修饰前体分子的溶液中。在30分钟之后，反应进展通过LCMS或AEX-HPLC监测。在完成缀合反应后，粗产物通过添加10x iPrOH和0.1x 2M NaCl来沉淀，并且通过离心和倾析加以收集。为释放GalNAc部分中的乙酰化羟基，将所得集结块溶解于40％ MeNH2(1mL/500OD)中，并且在室温下15分钟之后，于H2O(1:10)中稀释，并且最终通过阴离子交换和尺寸排阻色谱法再次纯化并冻干以产生最终产物12。
表4：单链GalNAc缀合寡核苷酸
双链形成
根据上述方法进行双链形成。
双链纯度以双链％给出，所述双链％是在IP-RP-HPLC分析的紫外迹线的情况下，所指定产物信号下UV面积的百分比。
表5：核酸缀合物
序列
以下序列的修饰索引：
f表示2’氟代2’脱氧核糖核苷酸或2’-氟代核糖核苷酸(所述术语是可互换的)
m表示2’O甲基核糖核苷酸
(ps)表示硫代磷酸酯键
Ser(GN)是连接于丝氨醇衍生接头部分的GalNAc-C4构建单元：
其中O---是氧原子与例如H之间的键联、磷酸二酯键或硫代磷酸酯键。
C4XLT是：
ST23是：
对C4XLT的亚磷酰胺衍生物(C4XLT-phos)以及ST23的亚磷酰胺衍生物(ST23-phos)的合成可如WO2017/174657中所述进行。
C4XLT-phos：
ST23-phos：
缀合物1
反义链-STS16001AL33(SEQ ID NO:127)
5’mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)3’
有义链-STS16001BL20(SEQ ID NO:128)
5’Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA 3’
缀合物2
反义链-STS16001A(SEQ ID NO:129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
有义链-STS16001BV1L42(SEQ ID NO:130)
Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fUmA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)
缀合物3
反义链-STS16001AL33(SEQ ID NO:127)
5'mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)3’
有义链-STS16001BV1L42(SEQ ID NO:130)
5'Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fUmA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)3'
参考缀合物1
反义链-STS16001A(SEQ ID NO:129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
有义链–STS16001BL20(SEQ ID NO:128)
Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
参考缀合物2
反义链-STS16001AL33(SEQ ID NO:127)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)
有义链-STS16001V1B(SEQ ID NO:131)
fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
参考缀合物3
反义链-STS18001A(A0130；SEQ ID NO:132)
mU(ps)fC(ps)mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA(ps)fC(ps)mG
有义链-STS18001BL4(A0131,SEQ ID NO:133)
[(ST23)(ps)]3C4XLT(ps)fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mUfC(ps)mG(ps)fA
参考缀合物4
反义链-STS16001AL33(SEQ ID NO:127)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
有义链-STS16001BL4(SEQ ID NO:134)
5'[(ST23)(ps)]3C4XLT(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fGmC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
实施例7-对各种TTR siRNA GalNAc缀合物达成的TTR敲低的体外测定
将鼠原代肝细胞在每孔30,000个细胞的细胞密度下接种至胶原预包被的96孔板(Thermo Fisher Scientific，#A1142803)中，并且用siRNA缀合物在10nM至0.0001nM的范围内的浓度下处理。在处理后24小时，使细胞溶解，并且根据制造商方案用RNA细胞HTS 96试剂盒/C24 x 96制剂(Stratec#7061300400)提取RNA。TTR和持家mRNA(PtenII)的转录物水平通过TaqMan分析进行定量。
相较于阴性对照(参见“UT”列和参考缀合物3)，在用本发明缀合物即缀合物1-3处理之后24小时，原代鼠肝细胞中的靶标基因表达显示靶标基因表达随缀合物的剂量增加而降低，如图15中所示。这指示第一链结合靶标基因，由此使基因表达降低。图15还显示在充当比较缀合物的参考缀合物1和2的情况下的靶标基因表达水平。如可由图15A和图15C、以及图15B和图15C中呈现的数据之间的比较所见，相较于参考缀合物1和2，本发明缀合物(缀合物1-3)使靶标基因表达降低。在0.01nM下最有效的缀合物似乎是缀合物2。在0.1nM、0.5nM、1nM和10nM下最有效的缀合物似乎是缀合物3。
实施例8-小鼠中的血清TTR的体内时间过程
在第0天，用1mg/kg siRNA缀合物皮下处理C57BL/6小鼠。在第7、14和27天通过眶窦放血来获取血清样品，并且在-20℃下储存直至分析。根据制造商方案(样品稀释度1:8000或1:800)，用小鼠前白蛋白ELISA(ALPCO，41-PALMS/批次22，2008003B)进行血清TTR定量。
n＝4的c57BL/6小鼠群组中在用1mg/kg缀合物1-3、参考缀合物1、2和4皮下处理后7、14和27天，以及模拟处理(PBS)个体的血清TTR的时间过程的结果显示于图16中。如由图16中的数据所指示，相较于阴性对照(PBS)和参考缀合物1、2，并且特别是相较于参考缀合物4，本发明缀合物特别有效地降低靶标基因表达。相比于参考缀合物1、2和4，缀合物2和3也是更有效的。最有效的缀合物是缀合物2。因此，可预期的是相较于参考缀合物4，对于实现相同初始敲低，缀合物3的给药水平将是约1/3低的，并且还将导致更久的敲低持续时间。
实施例9-缀合物2的合成
实例化合物根据以下描述的方法以及为本领域技术人员所知的方法合成。寡核苷酸链和接头构建单元的组装通过应用亚磷酰胺方法的固相合成进行。GalNAc缀合通过GalNAc-羧酸构建单元与先前组装和纯化的连接有必要数目的经氨基修饰接头构建单元的寡核苷酸形成肽键来实现。
寡核苷酸合成、脱保护和纯化遵循本领域中已知的标准程序。
所有寡核苷酸都使用标准亚磷酰胺化学在AKTA oligopilot合成仪上合成。使用可商购获得的固体载体以及2′O-甲基RNA亚磷酰胺、2′氟代2′脱氧RNA亚磷酰胺(全都进行标准保护，ChemGenes，LinkTech)和可商购获得的3'-氨基修饰剂TFA氨基C-6lcaa CPG (Chemgenes)。全乙酰化半乳糖胺8可商购获得。
辅助试剂从EMP Biotech购买。使用0.1M的亚磷酰胺的无水乙腈溶液进行合成，并且苯甲基硫基四唑(BTT)用作活化剂(0.3M乙腈溶液)。偶联时间是15分钟。应用加帽/氧化/加帽或加帽/硫代/加帽循环(加帽：Ac2O/NMI/二甲基吡啶/乙腈，氧化剂：0.1M I2于吡啶/H2O中)。使用标准可商购获得的硫醇化试剂(EDITH，Link technologies)引入硫代磷酸酯。DMT裂解通过用含3％二氯乙酸的甲苯处理实现。在完成程序化合成循环后，进行二乙胺(DEA)洗涤。所有寡核苷酸都以DMT去除模式合成。
丝氨醇衍生接头部分的连接通过使用基底负载的(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯-lcaa-CPG 10或(S)-DMT-丝氨醇(TFA)亚磷酰胺7(合成如文献Hoevelmann等Chem.Sci.,2016,7,128-135中所述进行)实现。三触角GalNAc簇(ST23/C4XLT或ST23/C6XLT)通过相继偶联相应三倍子亚酰胺衍生物(C4XLT-phos或C6XLT-phos)和GalNAc亚酰胺(ST23-phos)引入。
单链通过40％甲胺水溶液处理来从CPG裂解去除。所得粗制寡核苷酸通过离子交换色谱法(Resource Q，6mL，GE Healthcare)，使用氯化钠梯度在AKTA Pure HPLC系统上纯化。将含有产物的级分合并，在尺寸排阻柱(Zetadex，EMP Biotech)上脱盐，并且冻干。
将独个单链以60OD/mL的浓度溶解于H2O中。将两种独个寡核苷酸溶液一起添加于反应容器中。为更易于进行反应监测，进行滴定。第一链相比于第二链以过量25％添加，如通过在260nm下的紫外吸收所测定。将反应混合物加热至80℃，持续5分钟，接着缓慢冷却至室温。双链形成通过离子对反相HPLC来监测。根据残余单链的UV面积，计算第二链的需要量，并且添加至反应混合物中。再次将反应加热至80℃，并且缓慢冷却至室温。重复这个程序直至检测到小于10％的残余单链。
化合物2-10的合成
化合物2至5以及(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-亚磷酰胺7根据文献公开方法(Hoevelmann等Chem.Sci.,2016,7,128-135)合成。
(S)-4-(3-(双(4-甲氧基苯基)苯基)甲氧基)-2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)丙氧基)-4-氧代丁酸(6)。
向5的吡啶溶液中依次添加丁二酸酐和DMAP。将所得混合物在室温下搅拌过夜。如通过TLC所判断，所有起始物质都被消耗。使反应浓缩。使粗物质在硅胶中进行色谱分离，使用含0％至5％甲醇的DCM(+1％三乙胺)的梯度以提供1.33g 6(产率＝38％)。m/z(ESI-):588.2(100％),(C30H29F3NO8-的计算值：[M-H]-588.6)。1H-NMR:(400MHz,CDCl3)δ[ppm]＝7.94(d,1H,NH),7.39-7.36(m,2H,CH芳基),7.29-7.25(m,7H,CH芳基),6.82-6.79(m,4H,CH芳基),4.51–4.47(m,1H),4.31–4.24(m,2H),3.77(s,6H,2xDMTr-OMe),3.66-3.60(m,16H,HNEt3 +),3.26-3.25(m,2H),2.97–2.81(m,20H,NEt3),2.50-2.41(4H,m),1.48–1.45(m,26H,HNEt3 +),1.24-1.18(m,29H,NEt3)。
(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯-lcaa-CPG(10)
将(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯(159mg，270umol)和HBTU(113mg，299umol)溶解于CH3CN(10mL)中。将二异丙基乙胺(DIPEA，94μL，540umol)添加至溶液中，并且将混合物涡旋2分钟，随后添加天然氨基-lcaa-CPG(500A，3g，胺含量：136umol/g)。在室温下在腕动式振荡器上温和振荡混悬液16小时，接着过滤，并且用DCM和EtOH洗涤。在真空下干燥固体载体2小时。载体上的未反应胺通过与乙酸酐/二甲基吡啶/N-甲基咪唑一起在室温下搅拌来加帽。对载体的洗涤如上加以重复。在真空下干燥固体以产生固体载体10(3g，26umol/g装载量)。
GalNAc合成子(9)
对GalNAc合成子9的合成如Nair等J.Am.Chem.Soc.,2014,136(49),第16958–16961页中所述进行，历经两步具有46％产率。
表征性数据与公开数据相匹配。
寡核苷酸的合成
所有单链寡核苷酸都根据以上以及在图13和图14中所述的反应条件合成。
所有最终单链产物都通过AEX-HPLC分析以证明它们的纯度。纯度以FLP％(全长产物％)给出，所述FLP％是在对最终产物的AEX-HPLC分析的紫外迹线的情况下，所指定产物信号下UV面积的百分比。相应单链产物(非经修饰、经氨基修饰前体、C4XLT/ST23或C6XLT/ST23GalNAc缀合寡核苷酸)的身份通过LC-MS分析来证明。
表7：单链未缀合和柱上缀合寡核苷酸
缀合物1-3以及参考缀合物1-2的合成
缀合物1-2以及参考缀合物1-2的缀合单链
GalNac合成子(9)的缀合通过使用肽偶联试剂，与相应寡核苷酸链11的丝氨醇-氨基官能基偶联来实现。因此，将相应经氨基修饰前体分子11溶解于H2O中(500OD/mL)，并且依次添加DMSO(DMSO/H2O，2/1，v/v)和DIPEA(总体积的2.5％)。在单独反应容器中，对GalN(Ac4)-C4酸(9)的预活化通过使2当量(根据经氨基修饰前体寡核苷酸11中的氨基官能基)的羧酸组分与2当量的HBTU在8当量DIPEA存在下在DMSO中反应来进行。在2分钟之后，将预活化的化合物9添加至相应经氨基修饰前体分子的溶液中。在30分钟之后，反应进展通过LCMS或AEX-HPLC监测。在完成缀合反应后，粗产物通过添加10x iPrOH和0.1x 2M NaCl来沉淀，并且通过离心和倾析加以收集。为释放GalNAc部分中的乙酰化羟基，将所得集结块溶解于40％ MeNH2(1mL/500OD)中，并且在室温下15分钟之后，于H2O(1:10)中稀释，并且最终通过阴离子交换和尺寸排阻色谱法再次纯化并冻干以产生最终产物12。
表8：单链GalNAc缀合寡核苷酸
双链形成
根据上述方法进行双链形成。
双链纯度以双链％给出，所述双链％是在IP-RP-HPLC分析的紫外迹线的情况下，所指定产物信号下UV面积的百分比。
表9：核酸缀合物
序列
以下序列的修饰索引：
f表示2’氟代2’脱氧核糖核苷酸或2’-氟代核糖核苷酸(所述术语是可互换的)
m表示2’O甲基核糖核苷酸
(ps)表示硫代磷酸酯键
Ser(GN)是连接于丝氨醇衍生接头部分的GalNAc-C4构建单元：
其中O---是氧原子与例如H之间的键联、磷酸二酯键或硫代磷酸酯键。
C4XLT是：
C6XLT是：
ST23是：
对C4XLT的亚磷酰胺衍生物(C4XLT-phos)、C6XLT的亚磷酰胺衍生物(C6XLT-phos)以及ST23的亚磷酰胺衍生物(ST23-phos)的合成可如WO2017/174657中所述进行。
C4XLT-phos：
C6XLT-phos：
ST23-phos：
实施例10
在原代食蟹猴肝细胞中，相较于三触角GalNAc单元在第二链5’处，两个单一GalNAc单元缀合于第二链的LPA靶向siRNA达成相等敲低剂量响应。
siRNA用交替2’-OMe/2’-F加以修饰，并且各自在它们的5’和3’末端两个核苷酸间键联处含有两个硫代磷酸酯(PS)核苷酸间键联。在缀合物19中，一个丝氨醇-GalNAc单元各自通过PS键连接于第二链的5’和3’。在缀合物20中，在第二链的两个末端5’核苷酸间是磷酸二酯，并且三触角GalNAc接头通过PS键连接于这个末端。
在用100、20、4、0.8、0.16、0.032和0.006nM siRNA处理后24小时评估原代食蟹猴肝细胞中LPA敲低的剂量响应。参考对照是构建体2，非靶向对照命名为Cte。每个处理组的转录物ct值相对于持家基因ACTB的转录物ct值(Δct)以及相对于未处理肝细胞(命名为ut(ΔΔct))加以归一化。
数据显示于图18中。
材料和方法：
siRNA
图表符号
引物：
一般性方法
体外实验
使原代鼠肝细胞(Thermo Scientific：GIBCO批次：#MC798)解冻，并且将低温保藏培养基交换成补充以5％ FBS、1μM地塞米松(dexamethasone)、2mM GlutaMax、1％青霉素链霉素、4mg/ml人重组胰岛素、15mM Hepes的威廉姆斯E培养基(Williams E medium)。将细胞密度调整至每1ml 250000个细胞。将每孔100μl的这个细胞混悬液接种至胶原预包被的96孔板中。测试物品于相同培养基(5倍浓缩)中预稀释以获得每种浓度，并且将25μl的这个预稀释siRNA或仅培养基添加至细胞中。在37℃和5％ CO2下培养细胞。在处理后24小时，丢弃上清液，并且将细胞于冷PBS中洗涤并添加250μl RNA溶解缓冲液S(Stratec)。在室温下孵育15分钟之后，将板在-80℃下储存直至根据制造商方案进行RNA分离。
TaqMan分析
对于mTTR和PTEN多路TaqMan分析，使每个处理组的10μl经分离RNA与10μl含有600nM mTTR引物、400nM ApoB引物和200nM每种探针以及0.5单位Euroscript II RT聚合酶和0.2单位RNA酶抑制剂的PCR主混合物(TAKYON低Rox)混合。在384孔板中进行TaqMan分析，采用10分钟的在48℃下进行的逆转录步骤，3分钟的在95℃下进行的初始变性，以及40个循环的95℃持续10秒和60℃持续1分钟。引物含有BHQ1、FAM和YY中的两者，在序列的每个末端具有一者。
对于TMPRSS6和ApoB多路TaqMan分析，使每个处理组的10μl经分离RNA与10μl含有800nM TMPRSS6引物、100nM ApoB引物和200nM任一探针以及0.5单位Euroscript II RT聚合酶和0.2单位RNA酶抑制剂的PCR主混合物(TAKYON低Rox)混合。在384孔板中进行TaqMan分析，采用10分钟的在48℃下进行的逆转录步骤，3分钟的在95℃下进行的初始变性，以及40个循环的95℃持续10秒和60℃持续1分钟。
体内实验
为比较不同siRNA缀合物的体内效能，在c57BL/6小鼠的肩胛区域中皮下施用溶解于PBS中的1mg/kg siRNA。n＝6的群组在第1天用靶向Aldh2或Tmprss6的siRNA处理，并且在处理后的所选时间点加以处死。将肝样品在液氮中快速冷冻，并且在-80℃下储存直至根据制造商手册用InviTrap旋转组织RNA小型试剂盒(stratec)提取RNA。之后，如上所述对Aldh2、Tmprss6和Pten的转录物水平进行定量。
去污溶酶体稳定性测定
为体外探测在肝细胞的内体/溶酶体区室中的RNA酶稳定性，在Sprague Dawley大鼠肝去污溶酶体(Tebu-Bio，目录号：R0610.LT，批次：1610405，pH：7.4，2.827单位/ml)中孵育siRNA 0小时、4小时、24小时或72小时。为模拟酸化环境，使去污溶酶体与低pH缓冲液(1.5M乙酸，1.5M乙酸钠，pH 4.75)1:10混合。之后，使10μl siRNA(20μM)与30μl的这个酸化去污溶酶体混合，并且在37℃下孵育持续所指示的时间。在孵育之后，根据用于生物流体的制造商方案，用Clarity OTX起始试剂盒-柱筒(Phenomenex目录号：KSO-8494)分离RNA。将冻干RNA在30μl H2O中复原，与4x上样缓冲液混合，并且将5μl上样至20％ TBE-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以进行分离定性半定量分析。使PAGE在120V下运行2小时，并且通过溴化乙锭染色，以及用Biorad成像系统进行后续数字成像来使RNA显现。
实施例11-缀合物3的合成
实例化合物根据以下描述的方法以及为本领域技术人员所知的方法合成。寡核苷酸链和接头构建单元的组装通过应用亚磷酰胺方法的固相合成进行。GalNAc缀合通过GalNAc-羧酸构建单元与先前组装和纯化的连接有必要数目的经氨基修饰接头构建单元的寡核苷酸形成肽键来实现。
寡核苷酸合成、脱保护和纯化遵循本领域中已知的标准程序。
所有寡核苷酸都使用标准亚磷酰胺化学在AKTA oligopilot合成仪上合成。可商购获得的固体载体以及2′O-甲基RNA亚磷酰胺、2′氟代2′脱氧RNA亚磷酰胺(全都进行标准保护，ChemGenes，LinkTech)和可商购获得的3'-氨基修饰剂TFA氨基C-6lcaa CPG(Chemgenes)、Fmoc-氨基-DMT C-7CE亚磷酰胺(GlyC3Am)、3'-氨基修饰剂C-3lcaa CPG(C3Am)、Fmoc-氨基-DMT C-3CED亚磷酰胺(C3Am)和TFA-氨基C-6CED亚磷酰胺(C6Am)(Chemgenes)、3'-氨基修饰剂C7 CPG(C7Am)(Glen Research)、非核苷酸TFA氨基亚磷酰胺(Pip)、非核苷酸TFA氨基固体载体(PipAm)(AM Chemicals)。全乙酰化半乳糖胺8可商购获得。
辅助试剂从EMP Biotech购买。使用0.1M的亚磷酰胺的无水乙腈溶液进行合成，并且苯甲基硫基四唑(BTT)用作活化剂(0.3M乙腈溶液)。偶联时间是15分钟。应用加帽/氧化/加帽或加帽/硫代/加帽循环(加帽：Ac2O/NMI/二甲基吡啶/乙腈，氧化剂：0.1M I2于吡啶/H2O中)。使用标准可商购获得的硫醇化试剂(EDITH，Link technologies)引入硫代磷酸酯。DMT裂解通过用含3％二氯乙酸的甲苯处理实现。在完成程序化合成循环后，进行二乙胺(DEA)洗涤。所有寡核苷酸都以DMT去除模式合成。
丝氨醇衍生接头部分的连接通过使用基底负载的(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯-lcaa-CPG 10或(S)-DMT-丝氨醇(TFA)亚磷酰胺7(合成如Hoevelmann等(2016)中所述进行)实现。三触角GalNAc簇(ST23/C4XLT)通过相继偶联相应三倍子亚酰胺衍生物(C4XLT-phos)和GalNAc亚酰胺(ST23-phos)引入。
经氨基修饰部分(非丝氨醇衍生接头)的连接通过使用相应可商购获得的经氨基修饰构建单元CPG或亚酰胺实现。
单链通过40％甲胺水溶液处理来从CPG裂解去除。所得粗制寡核苷酸通过离子交换色谱法(Resource Q，6mL，GE Healthcare)，使用氯化钠梯度在AKTA Pure HPLC系统上纯化。将含有产物的级分合并，在尺寸排阻柱(Zetadex，EMP Biotech)上脱盐，并且冻干。
将独个单链以60OD/mL的浓度溶解于H2O中。将两种独个寡核苷酸溶液一起添加于反应容器中。为更易于进行反应监测，进行滴定。第一链相比于第二链以过量25％添加，如通过在260nm下的紫外吸收所测定。将反应混合物加热至80℃，持续5分钟，接着缓慢冷却至室温。双链形成通过离子对反相HPLC来监测。根据残余单链的UV面积，计算第二链的需要量，并且添加至反应混合物中。再次将反应加热至80℃，并且缓慢冷却至室温。重复这个程序直至检测到小于10％的残余单链。
化合物2-10的合成
化合物2至5以及(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-亚磷酰胺7根据文献公开方法(Hoevelmann等Chem.Sci.,2016,7,128-135)合成。
(S)-4-(3-(双(4-甲氧基苯基)苯基)甲氧基)-2-(2,2,2-三氟乙酰胺基)丙氧基)-4-氧代丁酸(6)。
向5的吡啶溶液中依次添加丁二酸酐和DMAP。将所得混合物在室温下搅拌过夜。如通过TLC所判断，所有起始物质都被消耗。使反应浓缩。使粗物质在硅胶中进行色谱分离，使用含0％至5％甲醇的DCM(+1％三乙胺)的梯度以提供1.33g 6(产率＝38％)。m/z(ESI-):588.2(100％),(C30H29F3NO8-的计算值：[M-H]-588.6)。1H-NMR:(400MHz,CDCl3)δ[ppm]＝7.94(d,1H,NH),7.39-7.36(m,2H,CH芳基),7.29-7.25(m,7H,CH芳基),6.82-6.79(m,4H,CH芳基),4.51–4.47(m,1H),4.31–4.24(m,2H),3.77(s,6H,2xDMTr-OMe),3.66-3.60(m,16H,HNEt3 +),3.26-3.25(m,2H),2.97–2.81(m,20H,NEt3),2.50-2.41(4H,m),1.48–1.45(m,26H,HNEt3 +),1.24-1.18(m,29H,NEt3)。
(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯-lcaa-CPG(10)
将(S)-DMT-丝氨醇(TFA)-丁二酸酯(159mg，270umol)和HBTU(113mg，299umol)溶解于CH3CN(10mL)中。将二异丙基乙胺(DIPEA，94μL，540umol)添加至溶液中，并且将混合物涡旋2分钟，随后添加天然氨基-lcaa-CPG(500A，3g，胺含量：136umol/g)。在室温下在腕动式振荡器上温和振荡混悬液16小时，接着过滤，并且用DCM和EtOH洗涤。在真空下干燥固体载体2小时。载体上的未反应胺通过与乙酸酐/二甲基吡啶/N-甲基咪唑一起在室温下搅拌来加帽。对载体的洗涤如上加以重复。在真空下干燥固体以产生固体载体10(3g，26umol/g装载量)。
GalNAc合成子(9)
对GalNAc合成子9的合成如Nair等J.Am.Chem.Soc.,2014,136(49),第16958–16961页中所述进行，历经两步具有46％产率。
表征性数据与公开数据相匹配。
寡核苷酸的合成
所有单链寡核苷酸都根据以上以及在图13和图14中所述的反应条件合成，并且概述于表10和表11中。
所有最终单链产物都通过AEX-HPLC分析以证明它们的纯度。纯度以FLP％(全长产物％)给出，所述FLP％是在对最终产物的AEX-HPLC分析的紫外迹线的情况下，所指定产物信号下UV面积的百分比。相应单链产物(非经修饰、经氨基修饰前体或GalNAc缀合寡核苷酸)的身份通过LC-MS分析来证明。
表10：单链未缀合寡核苷酸
5’1x NH2意指可用于缀合的游离丝氨醇衍生氨基的位置(5’末端)和数目(1xNH2)。举例来说，A0264上的1x3’NH2意指在链A0264的3’末端存在可与GalNAc合成子9反应的游离氨基。3'5'1xNH2意指在链的3’末端和5’末端存在一个可与GalNAc接头9反应的丝氨醇衍生游离氨基。
表11：具有5’和3’修饰的单链寡核苷酸
类似地，3’5’1x NH2是指可用于缀合的游离氨基的位置(3’和5’末端)和数目(各自1x NH2)。举例来说，A0561上的3’5’1xNH2意指在在链A0561的3’末端存在2个可与GalNAc合成子9反应的游离氨基(1个在3’末端，并且1个在5’末端)。
本发明的某些缀合物以及参考缀合物1-2的合成
GalNac合成子(9)的缀合通过使用肽偶联试剂，与相应寡核苷酸链11的丝氨醇-氨基官能基偶联来实现。因此，将相应经氨基修饰前体分子11溶解于H2O中(500OD/mL)，并且依次添加DMSO(DMSO/H2O，2/1，v/v)和DIPEA(总体积的2.5％)。在单独反应容器中，对GalN(Ac4)-C4酸(9)的预活化通过使2当量(根据经氨基修饰前体寡核苷酸11中的氨基官能基)的羧酸组分与2当量的HBTU在8当量DIPEA存在下在DMSO中反应来进行。在2分钟之后，将预活化的化合物9添加至相应经氨基修饰前体分子的溶液中。在30分钟之后，反应进展通过LCMS或AEX-HPLC监测。在完成缀合反应后，粗产物通过添加10x iPrOH和0.1x 2M NaCl来沉淀，并且通过离心和倾析加以收集。为释放GalNAc部分中的乙酰化羟基，将所得集结块溶解于40％ MeNH2(1mL/500OD)中，并且在室温下15分钟之后，于H2O(1:10)中稀释，并且最终通过阴离子交换和尺寸排阻色谱法再次纯化并冻干以产生最终产物12(表12)。
表12：单链GalNAc缀合寡核苷酸
本发明的某些缀合物的合成
GalNac合成子(9)的缀合通过使用肽偶联试剂，与相应寡核苷酸链14的氨基官能基偶联来实现。因此，将相应经氨基修饰前体分子14溶解于H2O中(500OD/mL)，并且依次添加DMSO(DMSO/H2O，2/1，v/v)和DIPEA(总体积的2.5％)。在单独反应容器中，对GalN(Ac4)-C4酸(9)的预活化通过使2当量(根据经氨基修饰前体寡核苷酸14中的氨基官能基)的羧酸组分与2当量的HBTU在8当量DIPEA存在下在DMSO中反应来进行。在2分钟之后，将预活化的化合物9添加至相应经氨基修饰前体分子的溶液中。在30分钟之后，反应进展通过LCMS或AEX-HPLC监测。在完成缀合反应后，粗产物通过添加10x iPrOH和0.1x 2M NaCl来沉淀，并且通过离心和倾析加以收集。为释放GalNAc部分中的乙酰化羟基，将所得集结块溶解于40％MeNH2(1mL/500OD)中，并且在室温下15分钟之后，于H2O(1:10)中稀释，并且最终通过阴离子交换和尺寸排阻色谱法再次纯化并冻干以产生最终产物15(表13)。
表13：单链GalNAc缀合寡核苷酸
双链形成
根据上述方法进行双链形成。
双链纯度以双链％给出，所述双链％是在IP-RP-HPLC分析的紫外迹线的情况下，所指定产物信号下UV面积的百分比(表14)。
表14：核酸缀合物
序列
以下序列的修饰索引：
f表示2’氟代2’脱氧核糖核苷酸或2’-氟代核糖核苷酸(所述术语是可互换的)
m表示2’O甲基核糖核苷酸
(ps)表示硫代磷酸酯键
FAM＝6-羧基荧光素
BHQ＝黑洞淬灭剂1(Black Hole Quencher 1)
YY＝雅吉玛黄(Yakima Yellow)
定义
Ser(GN)是连接于丝氨醇衍生接头部分的GalNAc-C4构建单元：
其中O---是氧原子与例如H之间的键联、磷酸二酯键或硫代磷酸酯键。
GN是：
C4XLT(也被称为ST41)是：
ST23是：
对C4XLT的亚磷酰胺衍生物(C4XLT-phos)以及ST23的亚磷酰胺衍生物(ST23-phos)的合成可如WO2017/174657中所述进行。
C4XLT-phos：
ST23-phos：
其中G＝H(缀合前)或G＝GN(缀合后)。
缀合物1
反义链-STS16001AL33(SEQ ID NO:127)
5’mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)3’
有义链-STS16001BL20(SEQ ID NO:128)
5’Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA 3’
缀合物2
反义链-STS16001A(SEQ ID NO:129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
有义链-STS16001BV1L42(SEQ ID NO:130)
Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fUmA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)
缀合物3
反义链-STS16001AL33(SEQ ID NO:127)
5’mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)3’
有义链-STS16001BV1L42(SEQ ID NO:130)
5’Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fUmA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)3’
缀合物4
反义链-STS16001A(SEQ ID NO:129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
有义链-STS16001BV1L75(SEQ ID NO:142)
5’Ser(GN)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mAfU(ps)mA(ps)fA Ser(GN)3’
缀合物5
反义链-STS16001A(SEQ ID NO:129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
有义链-STS16001BV16L42(SEQ ID NO:143)
5’Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fUmA fA(ps)Ser(GN)3’
缀合物6
反义链-STS16001A(SEQ ID NO:129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
有义链-STS16001BV20L75(SEQ ID NO:144)
5’Ser(GN)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU mAfA Ser(GN)3’
缀合物7
反义链-(SEQ ID NO:129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
有义链-STS16001BV1L94(SEQ ID NO:145)
5’Ser(GN)(ps)Ser(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fGmC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)Ser(GN)(ps)Ser(GN)3’
缀合物8
反义链-STS16001A(SEQ ID NO:129)
5’mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
有义链-STS16001V1BL96(SEQ ID NO:146)
5’C6Am(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mCfU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)C7Am(GN)3’
缀合物9
反义链-STS16001A(SEQ ID NO:129)
5’mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
有义链-STS16001V1BL97(SEQ ID NO:147)
5’GlyC3Am(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fUmC fU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)GlyC3Am(GN)3’
缀合物10
反义链-STS16001A(SEQ ID NO:129)
5’mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
有义链(SEQ ID NO:148)
5’PipAm(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mCfU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)PipAm(GN)3’
缀合物11
反义链-STS16001A(SEQ ID NO:129)
5’mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
有义链-STS16001V1BL88(SEQ ID NO:149)
5’C3Am(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mCfU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)C3Am(GN)3’
缀合物12
反义链-STS16001A(SEQ ID NO:129)
5’mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU 3’
有义链-STS16001V1BL87(SEQ ID NO:150)
5’C6Am(GN)(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mCfU mA fU(ps)mA(ps)fA(ps)GlyC3Am(GN)3’
缀合物15
反义链(SEQ ID NO:151)
mU(ps)fC(ps)mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU(ps)fU(ps)mC
有义链(SEQ ID NO:152)
Ser(GN)(ps)fG(ps)mA(ps)fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA(ps)mG(ps)fA(ps)Ser(GN)
缀合物16
反义链(SEQ ID NO:153)
mA(ps)fU(ps)mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU(ps)fC(ps)mU
有义链(SEQ ID NO:154)
Ser(GN)(ps)fA(ps)mG(ps)fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC(ps)mA(ps)fU(ps)Ser(GN)
缀合物18
反义链(SEQ ID NO:155)
mA(ps)fA(ps)mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU(ps)fG(ps)mA
有义链(SEQ ID NO:156)
Ser(GN)(ps)fU(ps)mC(ps)fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG(ps)mU(ps)fU(ps)Ser(GN)
缀合物19
反义链(SEQ ID NO:135)
mA(ps)fU(ps)mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC(ps)fC(ps)mG
有义链(SEQ ID NO:136)
Ser(GN)(ps)fC(ps)mG(ps)fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mU fU(ps)mA(ps)fU(ps)Ser(GN)
参考缀合物1
反义链-STS16001A(SEQ ID NO:129)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
有义链–STS16001BL20(SEQ ID NO:128)
Ser(GN)(ps)fA mA fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
参考缀合物2
反义链-STS16001AL33(SEQ ID NO:127)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU(ps)Ser(GN)
有义链-STS16001BV1(SEQ ID NO:157)
fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fG mC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
参考缀合物3–“Luc”
反义链-STS18001A(A0130,SEQ ID NO:132)
mU(ps)fC(ps)mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA(ps)fC(ps)mG
有义链-STS18001BL4(A0131,SEQ ID NO:133)
[(ST23)(ps)]3C4XLT(ps)fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mUfC(ps)mG(ps)fA
参考缀合物4
反义链-STS16001AL33(SEQ ID NO:127)
mU(ps)fU(ps)mA fU mA fG mA fG mC fA mA fG mA fA mC fA mC fU mG(ps)fU(ps)mU
有义链-STS16001BL4(SEQ ID NO:134)
5’[(ST23)(ps)]3C4XLT(ps)fA(ps)mA(ps)fC mA fG mU fG mU fU mC fU mU fGmC fU mC fU mA fU(ps)mA(ps)fA
参考缀合物5–“Ctr”
反义链(SEQ ID NO:138)
mC(ps)fU(ps)mU fA mC fU mC fU mC fG mC fC mC fA mA fG mC(ps)fG(ps)mA
有义链(SEQ ID NO:139)
[(ST23)(ps)]3(C6XLT)(ps)fU mC fG mC fU mU fG mG fG mC fG mA fG mA fGmU fA(ps)mA(ps)fG
参考缀合物6
反义链(SEQ ID NO:151)
mU(ps)fC(ps)mU fU mC fU mU fA mA fA mC fU mG fA mG fU mU(ps)fU(ps)mC
有义链(SEQ ID NO:158)
[ST23(ps)]3ltrb(ps)fG mA fA mA fC mU fC mA fG mU fU mU fA mA fG mA fA(ps)mG(ps)fA
参考缀合物7
反义链(SEQ ID NO:153)
mA(ps)fU(ps)mG fU mA fG mC fC mG fA mG fG mA fU mC fU mU(ps)fC(ps)mU
有义链(SEQ ID NO:159)
[ST23(ps)]3ltrb(ps)fA mG fA mA fG mA fU mC fC mU fC mG fG mC fU mA fC(ps)mA(ps)fU
参考缀合物8
反义链(SEQ ID NO:160)
mU(ps)fA(ps)mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU(ps)fG(ps)mA
有义链(SEQ ID NO:161)
[ST23(ps)]3ST41(ps)fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG(ps)mU(ps)fA
参考缀合物9
反义链(SEQ ID NO:135)
mA(ps)fU(ps)mA fA mC fU mC fU mG fU mC fC mA fU mU fA mC(ps)fC(ps)mG
有义链(SEQ ID NO:162)
[ST23(ps)]3C6XLT(ps)fC mG fG mU fA mA fU mG fG mA fC mA fG mA fG mUfU(ps)mA(ps)fU
实施例12-对各种TTR siRNA GalNAc缀合物达成的TTR敲低的体外测定
缀合物1至3
将鼠原代肝细胞在每孔30,000个细胞的细胞密度下接种至胶原预包被的96孔板(Thermo Fisher Scientific，#A1142803)中，并且用siRNA缀合物在10nM至0.0001nM的范围内的浓度下处理。在处理后24小时，使细胞溶解，并且根据制造商方案用RNA细胞HTS 96试剂盒/C24 x 96制剂(Stratec#7061300400)提取RNA。TTR和持家mRNA(PtenII)的转录物水平通过TaqMan分析定量。
相较于阴性对照(参见“UT”列和参考缀合物3)，在用本发明缀合物即缀合物1-3在0.01nM、0.1nM、0.5nM、1nM和10nM下处理之后24小时，原代鼠肝细胞中的靶标基因表达显示靶标基因表达随缀合物的剂量增加而降低，如图15中所示。这指示第一链结合靶标基因，由此使基因表达降低。图15还显示在充当比较缀合物的参考缀合物1和2的情况下的靶标基因表达水平。如可由图15A和图15C、以及图15B和图15C中呈现的数据之间的比较所见，相较于参考缀合物1和2，本发明缀合物(缀合物1-3)使靶标基因表达降低。在0.01nM下最有效的缀合物似乎是缀合物2。在0.1nM、0.5nM、1nM和10nM下最有效的缀合物似乎是缀合物3。
缀合物4至7
遵循以上在一般性方法章节中的“体外实验”下所述的方法。
相较于阴性对照(参见“UT”列和Luc[参考缀合物3])，在用本发明缀合物即缀合物4-7在0.01nM、0.1nM、0.5nM、1nM和10nM下处理之后24小时，原代鼠肝细胞中的靶标基因表达显示靶标基因表达随缀合物的剂量增加而降低，如图31中所示。这指示第一链结合靶标基因，由此使基因表达降低。
体外数据显示在一个或两个丝氨醇衍生接头部分被提供在缀合物4-7中的有义链的5’和3’末端的情形下，末端核苷酸与接头之间和/或有义链中的三个末端核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键的数目可变化，同时维持使靶标基因表达降低的功效。
缀合物8至12和19
遵循以上在一般性方法章节中的“体外实验”下所述的方法。
相较于阴性对照(参见“UT”列和Luc[参考缀合物3])，在用本发明缀合物即缀合物8-12在0.01nM、0.1nM、0.5nM、1nM和10nM下处理之后24小时，原代鼠肝细胞中的靶标基因表达显示靶标基因表达随缀合物的剂量增加而降低，如图32中所示。这指示第一链结合靶标基因，由此使基因表达降低。特别地，相比于先前被显示是在0.01nM下最有效的缀合物的缀合物2，缀合物8、9、10和11似乎是相当的或更好的。
相较于阴性对照(参见“UT”列和是非靶向siRNA，并且也被称为参考缀合物5的Ctr)，还显示缀合物19使靶标基因表达降低，如图33中所示。这指示第一链结合靶标基因，由此使基因表达降低。
缀合物8-12和19的体外数据显示在结构上不同，并且缀合在有义链的两个末端的许多接头有效降低靶标基因表达。相比于是参考缀合物3的“Luc”(对于缀合物8-12来说)、是参考缀合物5的“Ctr”(对于缀合物19来说)和未处理对照，缀合物8-12和19更有效使靶标基因表达降低。
实施例13-小鼠中的血清Ttr、Aldh2和Tmprss6的体内时间过程
缀合物1至3
在第0天，用1mg/kg siRNA缀合物皮下处理C57BL/6小鼠。在第7、14和27天通过眶窦放血来获取血清样品，并且在-20℃下储存直至分析。根据制造商方案(样品稀释度1:8000或1:800)，用小鼠前白蛋白ELISA(ALPCO，41-PALMS/批次22，2008003B)进行血清TTR定量。
n＝4的c57BL/6小鼠群组中在用1mg/kg缀合物1-3、参考缀合物1、2和4皮下处理后7、14和27天，以及模拟处理(PBS)个体的血清TTR的时间过程的结果显示于图16中。如由图16中的数据所指示，相较于阴性对照(PBS)和参考缀合物1、2，并且特别是相较于参考缀合物4，本发明缀合物特别有效地降低靶标基因表达。相比于参考缀合物1、2和4，缀合物2和3也是更有效的。最有效的缀合物是缀合物2。因此，可预期的是相较于参考缀合物4，对于实现相同初始敲低，缀合物2的给药水平将是约1/3低的，并且还将导致更久的敲低持续时间。
更特别地，在野生型小鼠中，相较于在等摩尔剂量下的参考缀合物4，缀合物2导致在第七天时血清中靶标蛋白质水平降低至1/3，以及在第27天时血清中靶标蛋白质水平降低至1/4。此外，相较于由等摩尔量的参考缀合物4达成的36％降低，在单次注射之后，在第27天，缀合物2导致靶标血清蛋白质水平降低85％。
缀合物15至18
遵循以上在一般性方法章节中的“体内实验”下所述的方法。
n＝6的c57BL/6小鼠群组中在用1mg/kg缀合物15和16、参考缀合物6和7皮下处理后14、28和42天，以及模拟处理(PBS)个体的血清Aldh2的时间过程的结果显示于图34和图35中。如由图34和图35中的数据所指示，相较于阴性对照(PBS)以及分别参考缀合物6和7，本发明缀合物特别有效地降低靶标基因表达。
n＝6的c57BL/6小鼠群组中在用1mg/kg缀合物18、参考缀合物8皮下处理后14、28和42天，以及模拟处理(PBS)个体的血清Tmprss6的时间过程的结果显示于图36中。如由图36中的数据所指示，相较于阴性对照(PBS)和参考缀合物8，本发明缀合物特别有效地降低靶标基因表达。
总之，体内数据显示缀合在第二链的两个末端的多种实例接头有效在体内降低靶标基因表达。相较于在第二链的5’末端的三触角GalNAc接头对照(参考缀合物6、7和8)，接头的定位会改进缀合物的体内效能。
实施例14-血清稳定性研究
遵循以上在一般性方法章节中的“去污溶酶体稳定性测定”下所述的方法。
图37显示关于缀合物2、4、5、6和7的来自血清稳定性研究的结果。图38显示缀合物2、8、9、10、11和12的血清稳定性。
相较于对照，测试的所有本发明缀合物在血清中都是更稳定的。
所有测试缀合物都各自含有在第二链的5’末端的一个GalNAc接头单元以及在第二链的3’末端的另一GalNAc接头单元。除非以不同方式陈述，否则siRNA用交替2’-OMe/2’-F加以修饰，并且各自在它们的5’和3’末端两个核苷酸间键联处含有两个硫代磷酸酯(PS)核苷酸间键联。
在缀合物4中，丝氨醇-GalNAc单元通过磷酸二酯键连接。在缀合物5中，丝氨醇-GalNAc单元通过PS缀合，而第二链中的所有核苷酸间键联都是磷酸二酯。在缀合物6中，第二链不含有PS。在缀合物7中，两个丝氨醇-GalNAc单元通过PS键连接于每个第二链末端，并且在相应末端通过PS键彼此连接。在缀合物8中，在第二链的5’末端的C6-氨基修饰剂和在第二链的3’末端的C7-氨基修饰剂被应用于配体连接。在缀合物9中，Gly-C3-氨基修饰剂，在缀合物10中，哌啶基-氨基修饰剂，在缀合物11中，C3-氨基修饰剂，以及在缀合物2中，丝氨醇-GalNAc单元，作为接头用于达成与第二链的两个末端的缀合。在缀合物2中，在两个末端核苷酸间以及核苷酸-丝氨醇键是PS。在缀合物12中，在第二链的5’末端的C6-氨基修饰剂和在第二链的3’末端的GlyC3-氨基修饰剂被应用于配体连接。“ut”指示其他样品相对于其加以归一化的未处理样品。“Luc”指示靶向荧光素酶的siRNA(参考缀合物3)，所述siRNA被用作非靶向对照，并且不使靶标mRNA水平降低。
数据显示在丝氨醇衍生接头部分被提供在有义链的5’和3’末端的情形下，末端核苷酸与接头之间和/或有义链中的三个末端核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键的数目可变化，同时维持在血清中的稳定性。
实施例15
在受体介导的递送后，在原代人肝细胞中，由不同所指示L6-GalNAc缀合siRNA对人原代肝细胞中的LPA-mRNA的敲低。
表15：关于对LPA mRNA表达的抑制加以测试的其他缀合核酸序列。指示了序列和应用的修饰样式。
表15
表15：核苷酸修饰由以下数字(第4列)描绘，1＝2’F-dU；2＝2’F-dA；3＝2’F-dC；4＝2’F-dG；5＝2’-OMe-rU；6＝2’-OMe-rA；7＝2’-OMe-rC；8＝2’-OMe-rG。
将原代人肝细胞(ThermoFisher)在每孔(96孔形式)30,000个细胞下涂铺在胶原包被的96孔板上。在细胞涂铺之后立刻在所指示浓度下添加GalNAc-L6缀合siRNA。在用siRNA处理之后24小时，使用InviTrap RNA细胞HTS 96孔试剂盒(Stratec)分离总RNA。相对于作为持家转录物的APOB mRNA，通过qRT-PCR来测定LPA mRNA表达水平。数值相对于未处理细胞中的LPA mRNA表达加以归一化。归一化一式三份数值的平均值和SD显示于图39中。使用四参数非线性回归曲线拟合估计IC50值和最大抑制。
发明声明
1.一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:9、1、3、5、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73或本文公开的任何序列。
2.如声明1所述的核酸，其中所述第二链包含SEQ ID NO:10、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、64、66、68、70、72或74的核苷酸序列或本文公开的任何序列。
3.如声明1或声明2所述的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
4.如声明1至3中任一项所述的核酸，其中所述第二链包含SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:6的核苷酸序列。
5.根据声明1至4中任一项所述的核酸，其中所述第一链和/或所述第二链的长度各自为17-35个核苷酸。
6.如声明1至5中任一项所述的核酸，其中所述至少一个双链体区域由19-25个连续核苷酸碱基对组成。
7.如任何先前声明所述的核酸，所述核酸
a)在两个末端均是钝性末端；或
b)在一个末端具有突出部分，并且在另一末端具有钝性末端；或
c)在两个末端均具有突出部分。
8.根据任何先前声明所述的核酸，其中所述第一链和/或所述第二链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成经修饰核苷酸。
9.如声明8所述的核酸，其中所述第一链的奇数编号核苷酸中的一个或多个被修饰。
10.根据声明9所述的核酸，其中所述第一链的偶数编号核苷酸中的一个或多个由至少第二修饰加以修饰，其中所述至少第二修饰不同于如声明9所述的修饰。
11.如声明10所述的核酸，其中一个或多个经修饰偶数编号核苷酸中的至少一者邻近于一个或多个经修饰奇数编号核苷酸中的至少一者。
12.如声明9至11中任一项所述的核酸，其中多个奇数编号核苷酸被修饰。
13.如声明10至12所述的核酸，其中多个偶数编号核苷酸由第二修饰加以修饰。
14.如声明8至13中任一项所述的核酸，其中所述第一链包含由共同修饰加以修饰的邻近核苷酸。
15.如声明9至14中任一项所述的核酸，其中所述第一链包含由不同于如声明9所述的修饰的第二修饰加以修饰的邻近核苷酸。
16.如声明9至15中任一项所述的核酸，其中所述第二链的奇数编号核苷酸中的一个或多个由不同于如声明9所述的修饰的修饰加以修饰。
17.根据声明9至15中任一项所述的核酸，其中所述第二链的偶数编号核苷酸中的一个或多个由如声明9所述的修饰加以修饰。
18.如声明16或17所述的核酸，其中所述第二链的一个或多个经修饰偶数编号核苷酸中的至少一者邻近于所述第二链的一个或多个经修饰奇数编号核苷酸。
19.如声明16至18中任一项所述的核酸，其中所述第二链的多个奇数编号核苷酸由共同修饰加以修饰。
20.如声明16至19中任一项所述的核酸，其中多个偶数编号核苷酸由根据声明9所述的修饰加以修饰。
21.如声明16至20中任一项所述的核酸，其中所述第二链上的多个奇数编号核苷酸由第二修饰加以修饰，其中所述第二修饰不同于如声明9所述的修饰。
22.如声明16至21中任一项所述的核酸，其中所述第二链包含由共同修饰加以修饰的邻近核苷酸。
23.如声明16至22中任一项所述的核酸，其中所述第二链包含由不同于如声明9所述的修饰的第二修饰加以修饰的邻近核苷酸。
24.根据声明8至23中任一项所述的核酸，其中所述第一链中的奇数编号核苷酸中的每一个和所述第二链中的偶数编号核苷酸中的每一个用共同修饰加以修饰。
25.如声明24所述的核酸，其中所述第一链中的偶数编号核苷酸中的每一个用第二修饰加以修饰，并且所述第二链中的奇数编号核苷酸中的每一个用第二修饰加以修饰。
26.根据声明8至25中任一项所述的核酸，其中相对于所述第二链的未修饰或以不同方式修饰的核苷酸，所述第一链的经修饰核苷酸移位至少一个核苷酸。
27.根据声明8至26中任一项所述的核酸，其中所述一个或多个修饰各自以及单独地选自由以下组成的组：3'-末端脱氧胸腺嘧啶、2'-O-甲基、2'-脱氧修饰、2'-氨基修饰、2'-烷基修饰、吗啉代基修饰、氨基磷酸酯修饰、5'-硫代磷酸酯基团修饰、5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物修饰以及胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团修饰。
28.根据声明8至27中任一项所述的核酸，其中所述修饰是锁核苷酸、无碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任一者。
29.根据声明8至28中任一项所述的核酸，其中至少一个修饰是2'-O-甲基。
30.根据声明8至29中任一项所述的核酸，其中至少一个修饰是2'-F。
31.一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:9、1、3、5、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73，其中第一链的核苷酸由在奇数编号核苷酸上的第一修饰加以修饰，并且由在偶数编号核苷酸上的第二修饰加以修饰，并且所述第二链的核苷酸由在偶数编号核苷酸上的第三修饰加以修饰，并且由在奇数编号核苷酸上的第四修饰加以修饰，其中至少所述第一修饰不同于所述第二修饰，并且所述第三修饰不同于所述第四修饰。
32.如声明31所述的核酸，其中第二序列包含SEQ ID NO:10、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、64、66、68、70、72或74的核苷酸序列。
33.如声明31或32所述的核酸，其中所述第四修饰和所述第二修饰是相同的。
34.如声明31至33中任一项所述的核酸，其中所述第一修饰和所述第三修饰是相同的。
35.如声明31至34中任一项所述的核酸，其中所述第一修饰是2’O-Me，并且所述第二修饰是2’F。
36.如声明31至35中任一项所述的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO:9或SEQID NO:5的核苷酸序列，并且所述第二链包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
37.如声明31至36中任一项所述的核酸，所述核酸包含如下所示的序列和修饰：
其中，特定修饰由数字描绘
1＝2’F-dU；
2＝2’F-dA；
3＝2’F-dC；
4＝2’F-dG；
5＝2’-OMe-rU；
6＝2’-OMe-rA；
7＝2’-OMe-rC；
8＝2’-OMe-rG。
38.根据声明1至37中任一项所述的核酸，所述核酸缀合于配体。
39.根据声明1至38中任一项所述的核酸，所述核酸在所述第一链和/或所述第二链的一个、两个或三个末端3’核苷酸和/或5’核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。
40.根据声明1至39中任一项所述的核酸，所述核酸包含在所述第一链上的三个末端3’核苷酸中的每个核苷酸之间和在所述第一链上的三个末端5’核苷酸中的每个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯键，以及在所述第二链的3’末端的三个末端核苷酸之间的两个硫代磷酸酯键。
41.一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:9、1、3、5、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73，并且其中所述核酸缀合于配体。
42.根据声明41所述的核酸，其中所述配体包含(i)一个或多个N-乙酰基半乳糖胺(GalNac)部分及其衍生物，和(ii)接头，其中所述接头使所述GalNac部分缀合于如声明41中定义的核酸。
43.根据声明41或42中任一项所述的核酸，其中接头可为二价或三价或四价分支结构。
44.如声明41至43中任一项所述的核酸，其中核苷酸如任何先前声明中所定义加以修饰。
45.如任何先前声明所述的核酸，所述核酸缀合于包括式I的配体：
[S-X1-P-X2]3-A-X3-(I)
其中：
S代表糖，其中所述糖是N-乙酰基半乳糖胺；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m是1、2或3；
P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地是硫代磷酸酯)；
X2是亚烷基或式(-CH2)n-O-CH2-亚烷基醚，其中n＝1-6；
A是分支单元；
X3代表桥接单元；
其中如声明1至40中任一项中定义的核酸通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯(优选地通过硫代磷酸酯)缀合于X3。
46.一种缀合核酸，所述缀合核酸具有以下结构中的一者
其中Z是根据声明1至40中任一项所述的核酸。
47.根据声明1至40中任一项所述的核酸，所述核酸缀合于具有以下结构的配体
48.如任何先前声明所述的核酸或缀合核酸，其中所述双链体包含单独链。
49.如任何先前声明所述的核酸或缀合核酸，其中所述双链体包含含有第一链和第二链的单一链。
50.一种组合物，所述组合物包含如任何先前声明所述的核酸或缀合核酸以及生理上可接受的赋形剂。
51.根据任何先前声明所述的核酸或缀合核酸，所述核酸或缀合核酸用于预防或治疗疾病或病理，或降低疾病或病理的风险。
52.根据任何先前声明所述的核酸或缀合核酸制造用于预防或治疗疾病、病症或综合征的药剂的用途。
53.一种预防或治疗疾病、病症或综合征的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用包含根据任何先前声明所述的核酸或缀合核酸的组合物。
54.如声明53所述的方法，其中所述核酸或缀合核酸以皮下方式、静脉内方式或使用任何其他施加途径诸如口服、经直肠或腹膜内施加途径向受试者施用。
55.根据声明52至54所述的用途或方法，其中所述疾病或病理是心血管疾病、中风、动脉粥样硬化、血栓形成或心血管疾病诸如冠心病或主动脉瓣狭窄以及与含Lp(a)粒子水平升高相关的任何其他疾病或病理。
56.根据声明55所述的用途或方法，其中所述心血管疾病是中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病或主动脉瓣狭窄以及与含Lp(a)粒子的水平升高相关的任何其他疾病或病理。
57.一种方法，所述方法用于制备如声明1至49中任一项所述的核酸或缀合核酸。
58.一种用于抑制LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中相比于在相同测试条件下，但在不存在所述核酸或缀合核酸下或在非沉默对照存在下观察到的表达水平，LPA的表达被降低至低至少15％的水平。
59.一种用于抑制LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:9、1、3、5、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73，其中相比于在相同测试条件下，但在不存在所述核酸或缀合核酸下或在非沉默对照存在下观察到的表达水平，LPA的表达被降低至低至少15％的水平。
60.一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:63、65、67和73，其中所述第一RNA链具有末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸。
本发明的其他条款包括：
1.一种用于抑制细胞中LPA基因的表达的缀合物，所述缀合物包含核酸部分和配体部分，所述核酸部分包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一RNA链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二RNA链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述LPA基因转录的RNA的至少一部分，所述配体部分包含丝氨醇衍生接头部分以及用于在体内靶向细胞，并且只缀合于一个或两个RNA链的3’和/或5’末端的靶向性配体，其中所述第一RNA链的5’末端未被缀合，其中：
(i)所述第二RNA链在5’末端缀合于所述靶向性配体，并且其中(a)所述第二RNA链还在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第一RNA链的3’末端未被缀合；或(b)所述第一RNA链在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的3’末端未被缀合；或(c)所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均还在3’末端缀合于所述靶向性配体；或
(ii)所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的5’末端未被缀合，或
一种用于抑制细胞中LPA基因的表达的缀合物，所述缀合物包含核酸部分和配体部分，所述核酸部分包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一RNA链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二RNA链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从所述LPA基因转录的RNA的至少一部分，所述配体部分包含接头部分以及用于在体内靶向细胞，并且只缀合于一个或两个RNA链的3’和/或5’末端的靶向性配体，其中所述第一RNA链的5’末端未被缀合，其中：
(i)所述第二RNA链在5’末端缀合于所述靶向性配体，并且其中(a)所述第二RNA链还在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第一RNA链的3’末端未被缀合；或(b)所述第一RNA链在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的3’末端未被缀合；或(c)所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均还在3’末端缀合于所述靶向性配体；或
(ii)所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的5’末端未被缀合，任选地
其中所述接头部分是丝氨醇衍生接头部分，或本文所述的其他接头类型中的一者。
2.根据条款1所述的缀合物，其中所述第二RNA链在5’末端缀合于所述靶向性配体，所述第二RNA链还在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第一RNA链的3’末端未被缀合。
3.根据条款1所述的缀合物，其中所述第二RNA链在5’末端缀合于所述靶向性配体，所述第一RNA链在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的3’末端未被缀合。
4.根据条款1所述的缀合物，其中所述第二RNA链在5’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均还在3’末端缀合于所述靶向性配体。
5.根据条款1所述的缀合物，其中所述第二RNA链与所述第一RNA链两者均在3’末端缀合于所述靶向性配体，并且所述第二RNA链的5’末端未被缀合。
6.根据条款1至5中任一项所述的缀合物，其中所述配体是单体配体。
7.根据条款1至6中任一项所述的缀合物，其中所述配体选自GalNAc和半乳糖部分，尤其是GalNAc部分。
8.根据条款1至7中任一项所述的缀合物，其中缀合RNA链通过包括另一接头的丝氨醇衍生接头部分缀合于靶向性配体，其中所述另一接头是或包含饱和、未分支或分支C1-15烷基链，其中任选地，一个或多个碳(例如1、2或3个碳，适合地是1或2个碳，特别是1个碳)由选自O、N、S(O)p的杂原子替换，其中p是0、1或2(例如CH2基团用O，或用NH，或用S，或用SO2替换，或在链的末端或在分支上的–CH3基团用OH或用NH2替换)，其中所述链任选地被一个或多个氧代基(例如1至3诸如1个基团)取代。
9.根据条款8所述的缀合物，其中所述另一接头包含饱和、未分支C1-15烷基链，其中一个或多个碳(例如1、2或3个碳，适合地是1或2个碳，特别是1个碳)由氧原子替换。
10.根据条款9所述的缀合物，其中所述另一接头包含PEG链。
11.根据条款8所述的缀合物，其中所述另一接头包含饱和、未分支C1-15烷基链。
12.根据条款11所述的缀合物，其中所述另一接头包含饱和、未分支C1-6烷基链。
13.根据条款12所述的缀合物，其中所述另一接头包含饱和、未分支C4或C6烷基链，例如C4烷基链。
14.根据条款1或声明1所述的缀合物，其中所述第一RNA链是式(XV)的化合物：
其中b是0或1；并且
所述第二RNA链是式(XVI)的化合物：
(XVI)；
其中c和d独立地是0或1；
其中：
Z1和Z2分别是所述第一RNA链和所述第二RNA链的RNA部分；
Y是O或S；
R1是H或甲基；
n是0、1、2或3；并且
在式(XV)和(XVI)中，L是相同的或不同的，并且选自由以下组成的组：
-(CH2)q-，其中q＝2-12；
-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s＝1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v是2-12；并且
其中如果末端C(O)存在，则其连接于NH基团；
并且其中b+c+d是2或3。
15.根据条款14所述的缀合物，其中b是0，c是1，并且d是1。
16.根据条款14所述的缀合物，其中b是1，c是0，并且d是1。
17.根据条款14所述的缀合物，其中b是1，c是1，并且d是0。
18.根据条款14所述的缀合物，其中b是1，c是1，并且d是1。
19.根据条款14-18中任一项所述的缀合物，其中Y是O。
20.根据条款14-18中任一项所述的缀合物，其中Y是S。
21.根据条款14-20中任一项所述的缀合物，其中R1是H。
22.根据条款14-20中任一项所述的缀合物，其中R1是甲基。
23.根据条款14-22中任一项所述的缀合物，其中n是0。
24.根据条款14-23中任一项所述的缀合物，其中L是-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12。
25.根据条款24所述的缀合物，其中r＝2-6。
26.根据条款25所述的缀合物，其中r＝4或6，例如4。
27.根据任何先前条款所述的缀合物，所述缀合物具有本文公开的任何特征或特征的组合。
索引1＝2'F-dU2＝2'F-dA3＝2'F-dC4＝2'F-dG5＝2'OMe-rU6＝2'OMe-rA7＝2'OMe-rC8＝2'OMe-rG
mA，mU，mC，mG，OMeA，OMeU，OMeC，OMeG–2’-OMe RNA
fA，fU，fC，fG，FA，FU，FG，FC–2’脱氧-2’-F RNA
(ps)–硫代磷酸酯
(vp)-乙烯基-(E)-膦酸酯
ivA，ivC，ivU，ivG-倒置RNA(3'-3')
单一序列可具有超过一个名称。在那些情况下，那些名称中的一者在概述序列表格中给出。
当教导在RNA序列内的特定接头和/或经修饰的键联诸如PS和[ST23(ps)]3ST41(ps)等时，这些是序列的任选部分，但为那个序列的优选实施方案。
可使用以下缩写：

Claims (22)

1.一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:9、5、1、3、7、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43。
2.如权利要求1所述的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列，并且任选地，其中所述第二链包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列；或其中所述第一链包含SEQ IDNO:5的核苷酸序列，并且任选地，其中所述第二链包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
3.一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:63、65、67、69、71或73。
4.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第一链和/或所述第二链的长度各自为17-35个核苷酸。
5.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述至少一个双链体区域由17-25个，优选地由19-25个连续核苷酸碱基对组成。
6.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸：
a)在两个末端均是钝性末端；或
b)在一个末端具有突出部分，并且在另一末端具有钝性末端；或
c)在两个末端均具有突出部分。
7.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述第一链和/或所述第二链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成经修饰核苷酸。
8.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸在所述第一链和/或所述第二链的一个或两个末端的一个、两个或三个末端3’核苷酸和/或5’核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。
9.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述核酸缀合于配体。
10.如权利要求9所述的核酸，其中所述配体包含(i)一个或多个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分或其衍生物，和(ii)接头，其中所述接头使所述至少一个GalNAc部分或其衍生物缀合于所述核酸。
11.如权利要求9至10中任一项所述的核酸，其中所述核酸缀合于包括式(I)化合物的配体：
[S-X1-P-X2]3-A-X3-(I)
其中：
S代表糖，优选地，其中所述糖是N-乙酰基半乳糖胺；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m是1、2或3；
P是磷酸酯或经修饰的磷酸酯，优选地是硫代磷酸酯；
X2是亚烷基或式(-CH2)n-O-CH2-的亚烷基醚，其中n＝1-6；
A是分支单元；
X3代表桥接单元；
其中如权利要求1至8中任一项所定义的核酸通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯，优选地通过硫代磷酸酯缀合于X3。
12.如权利要求9至10中任一项所述的核酸，其中所述第一RNA链是式(X)的化合物：
其中b是0或1；并且
所述第二RNA链是式(XI)的化合物：
其中：
c和d独立地是0或1；
Z1和Z2分别是所述第一RNA链和所述第二RNA链的RNA部分；
Y是O或S；
n是0、1、2或3；并且
L1是连接至配体的接头；并且
其中b+c+d是2或3。
13.一种用于抑制细胞中LPA的表达的核酸，所述核酸包含至少一个双链体区域，所述双链体区域包含第一链的至少一部分和至少部分地互补于所述第一链的第二链的至少一部分，其中所述第一链至少部分地互补于从LPA基因转录的RNA的至少一部分，其中所述第一链包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列，并且优选地由SEQ ID NO:9的核苷酸序列组成，并且任选地，其中所述第二链包含SEQ ID NO.10的核苷酸序列，并且优选地由SEQ ID NO.10的核苷酸序列组成。
14.如权利要求13所述的核酸，其中所述核酸缀合于配体，并且具有以下结构
其中Z是如权利要求13所述的核酸。
15.如权利要求14所述的核酸，其中所述核酸包含在所述第一链上的三个末端3’核苷酸中的每个核苷酸之间和在所述第一链上的三个末端5’核苷酸中的每个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯键，以及在所述第二链的3’末端的三个末端核苷酸之间的两个硫代磷酸酯键，并且其中所述配体缀合于所述第二链的5’末端。
16.如权利要求13所述的核酸，其中所述核酸缀合于配体，其中所述第一RNA链是式(XV)的化合物：
其中b是0或1；并且
所述第二RNA链是式(XVI)的化合物：
其中c和d独立地是0或1；
其中：
Z1和Z2分别是所述第一RNA链和所述第二RNA链的RNA部分；
Y是O或S；
R1是H或甲基；
n是0、1、2或3；并且
在式(XV)和(XVI)中，L是相同的或不同的，并且选自由以下组成的组：
-(CH2)q，其中q＝2-12；
-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s＝1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v是2-12；并且
其中如果末端C(O)存在，则其连接于NH基团；
并且其中b+c+d是2或3。
17.如权利要求13至16中任一项所述的核酸，所述核酸包含如下所示的序列和修饰：
其中，特定修饰由数字描绘
1＝2’F-dU；
2＝2’F-dA；
3＝2’F-dC；
4＝2’F-dG；
5＝2’-OMe-rU；
6＝2’-OMe-rA；
7＝2’-OMe-rC；
8＝2’-OMe-rG。
18.如权利要求13至16中任一项所述的核酸，其中所述第一链的从5’末端开始在位置2和14处的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰，并且所述第二链上对应于所述第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸用2'氟代修饰加以修饰。
19.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1至18中任一项所述的核酸，并且任选地包含递送媒介物和/或生理上可接受的赋形剂和/或载体和/或稀释剂和/或缓冲剂和/或防腐剂，所述组合物用作药剂，所述药剂优选地用于预防或治疗疾病或病理，或降低疾病或病理的风险，其中所述疾病或病理优选地是心血管疾病，其中所述心血管疾病优选地是中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病或主动脉瓣狭窄和/或与含Lp(a)粒子的水平升高相关的任何其他疾病或病理。
20.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至18中任一项所述的核酸，并且还包含递送媒介物，优选地为脂质体，和/或生理上可接受的赋形剂和/或载体和/或稀释剂。
21.如权利要求1至18中任一项所述的核酸或如权利要求20所述的药物组合物用于预防或治疗疾病或病理或者降低疾病或病理的风险的用途，其中所述疾病或病理优选地是心血管疾病，其中所述心血管疾病优选地是中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病或主动脉瓣狭窄以及与含Lp(a)粒子的水平升高相关的任何其他疾病或病理。
22.一种预防或治疗疾病、病症或综合征的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用包含如权利要求1至18中任一项所述的核酸的组合物或根据权利要求19至20所述的组合物，优选地，其中所述核酸或所述组合物以皮下方式、静脉内方式或使用任何其他施加途径诸如口服、经直肠或腹膜内施加途径向受试者施用。
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WO (1) WO2019092283A1 (zh)
ZA (1) ZA202003371B (zh)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3389862T3 (pl) 2015-12-16 2024-03-04 6K Inc. Sferoidalne metale podlegające odwodornieniu oraz cząstki stopów metali
US10987735B2 (en) 2015-12-16 2021-04-27 6K Inc. Spheroidal titanium metallic powders with custom microstructures
HUE061247T2 (hu) * 2017-04-05 2023-06-28 Silence Therapeutics Gmbh Termékek és készítmények
HRP20230127T1 (hr) 2017-11-13 2023-03-31 Silence Therapeutics Gmbh Nukleinske kiseline za inhibiranje ekspresije lpa u stanici
CN111601891A (zh) 2018-01-16 2020-08-28 迪克纳制药公司 用于抑制aldh2表达的组合物和方法
CN112654444A (zh) 2018-06-19 2021-04-13 6K有限公司 由原材料制造球化粉末的方法
RS63778B1 (sr) * 2018-11-13 2022-12-30 Silence Therapeutics Gmbh Nukleinske kiseline za inhibiranje eksprimiranja lpa u ćeliji
AU2020252560A1 (en) * 2019-04-04 2021-10-28 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene expression in the central nervous system
SG11202111576QA (en) 2019-04-30 2021-11-29 6K Inc Mechanically alloyed powder feedstock
AU2020400980A1 (en) 2019-11-18 2022-03-31 6K Inc. Unique feedstocks for spherical powders and methods of manufacturing
AU2020399636A1 (en) * 2019-12-09 2022-06-02 Amgen Inc. RNAi constructs and methods for inhibiting LPA expression
KR20230029836A (ko) 2020-06-25 2023-03-03 6케이 인크. 마이크로복합 합금 구조
KR20250077604A (ko) * 2020-08-05 2025-05-30 다이서나 파마수이티컬, 인크. Lpa 발현을 저해하기 위한 조성물 및 방법
JP7561977B2 (ja) 2020-09-24 2024-10-04 シックスケー インコーポレイテッド プラズマを始動させるためのシステム、装置、および方法
US20240035029A1 (en) 2020-10-16 2024-02-01 Sanofi Rna compositions and methods for inhibiting lipoprotein(a)
KR20230095080A (ko) 2020-10-30 2023-06-28 6케이 인크. 구상화 금속 분말을 합성하는 시스템 및 방법
AU2021373780A1 (en) * 2020-11-05 2023-06-08 Amgen Inc. METHODS FOR TREATING ATHEROSCLEROTIC CARDIOVASCULAR DISEASE WITH LPA-TARGETED RNAi CONSTRUCTS
JP2024500035A (ja) 2020-12-23 2024-01-04 アルゴノート アールエヌエー リミテッド 心血管疾患の治療
KR20230129011A9 (ko) 2021-01-11 2024-03-21 6케이 인크. 마이크로파 플라즈마 공정을 사용하여 Li-이온 캐소드 재료를 재활용하는 방법 및 시스템
CN117120182A (zh) 2021-03-31 2023-11-24 6K有限公司 用于金属氮化物陶瓷的增材制造的系统和方法
EP4402263A2 (en) 2021-09-14 2024-07-24 Argonaute Rna Limited Treatment of cardiovascular disease
MX2024005862A (es) 2021-11-16 2024-07-10 Shanghai Argo Biopharmaceutical Co Ltd Composiciones y metodos para inhibir la expresion de la proteina angiotensinogeno (agt).
CR20240200A (es) * 2021-11-18 2024-09-02 Novartis Ag Compuestos dirigidos a pmp22 para el tratamiento de la enfermedad de charcot-marie-tooth
AU2022396536A1 (en) * 2021-11-24 2024-06-06 Adarx Pharmaceuticals, Inc. Complement factor b-modulating compositions and methods of use thereof
TW202345865A (zh) * 2022-01-24 2023-12-01 大陸商上海舶望製藥有限公司 抑制LPA(Apo(a))蛋白表達的組合物和方法
CN114703184B (zh) * 2022-03-11 2024-06-18 厦门甘宝利生物医药有限公司 Lpa抑制剂及其用途
EP4522742A2 (en) 2022-05-13 2025-03-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded loop oligonucleotides
US12261023B2 (en) 2022-05-23 2025-03-25 6K Inc. Microwave plasma apparatus and methods for processing materials using an interior liner
US12040162B2 (en) 2022-06-09 2024-07-16 6K Inc. Plasma apparatus and methods for processing feed material utilizing an upstream swirl module and composite gas flows
WO2024006999A2 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cyclic-disulfide modified phosphate based oligonucleotide prodrugs
US12094688B2 (en) 2022-08-25 2024-09-17 6K Inc. Plasma apparatus and methods for processing feed material utilizing a powder ingress preventor (PIP)
CN115851723B (zh) * 2022-10-24 2023-10-03 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种抑制lpa基因表达的rna抑制剂及其应用
US12195338B2 (en) 2022-12-15 2025-01-14 6K Inc. Systems, methods, and device for pyrolysis of methane in a microwave plasma for hydrogen and structured carbon powder production
KR20250130686A (ko) * 2023-01-13 2025-09-02 일라이 릴리 앤드 캄파니 치료 올리고뉴클레오티드-함유 제약 조성물 및 그를 사용한 투여 요법
WO2024238385A2 (en) 2023-05-12 2024-11-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded loop oligonucleotides
TW202509024A (zh) 2023-05-19 2025-03-01 大陸商深圳信立泰藥業股份有限公司 一種磺醯胺類化合物及其製備方法和醫藥用途
CN119563025A (zh) 2023-07-04 2025-03-04 石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 一种抑制LP(a)基因表达的dsRNA分子及其应用
WO2025082058A1 (zh) * 2023-10-16 2025-04-24 润佳(上海)医药技术有限公司 一种抑制LPA基因表达的dsRNA及其用途
TW202540420A (zh) * 2023-11-15 2025-10-16 大陸商北京加科瑞康醫藥科技有限公司 用於抑制LPA的基因表現的siRNA，含其的組合物及其用途
CN120098993A (zh) * 2023-12-05 2025-06-06 广东东阳光药业股份有限公司 一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途
WO2026008063A1 (en) * 2024-07-05 2026-01-08 Geneditbio Limited Methods and compositions for lpa gene editing and therapy using crispr system

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
US7259150B2 (en) 2001-08-07 2007-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of apolipoprotein (a) expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
US20060160759A1 (en) * 2002-09-28 2006-07-20 Jianzhu Chen Influenza therapeutic
US20110110886A1 (en) * 2008-06-13 2011-05-12 Yale University Small molecule inhibitors of autotaxin and methods of use
DK2853597T3 (en) * 2012-05-22 2019-04-08 Olix Pharmaceuticals Inc RNA INTERFERENCE-INducing NUCLEIC ACID MOLECULES WITH CELL PENETENING EQUIPMENT AND USE THEREOF
WO2016149020A1 (en) * 2015-03-17 2016-09-22 Arrowhead Research Corporation Rna interference agents
JOP20210043A1 (ar) * 2015-10-01 2017-06-16 Arrowhead Pharmaceuticals Inc تراكيب وأساليب لتثبيط تعبير جيني للـ lpa
EP3228326A1 (en) 2016-04-05 2017-10-11 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid linked to a trivalent glycoconjugate
HUE061247T2 (hu) 2017-04-05 2023-06-28 Silence Therapeutics Gmbh Termékek és készítmények
HRP20230127T1 (hr) 2017-11-13 2023-03-31 Silence Therapeutics Gmbh Nukleinske kiseline za inhibiranje ekspresije lpa u stanici
WO2019092282A1 (en) 2017-11-13 2019-05-16 Silence Therapeutics Gmbh Nucleic acids for inhibiting expression of aldh2 in a cell
RS63778B1 (sr) 2018-11-13 2022-12-30 Silence Therapeutics Gmbh Nukleinske kiseline za inhibiranje eksprimiranja lpa u ćeliji

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Publication number Publication date
MX2020004897A (es) 2020-10-05
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