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CN119095878A - 特异性结合muc-1的抗体及其用途 - Google Patents

特异性结合muc-1的抗体及其用途 Download PDF

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CN119095878A
CN119095878A CN202280093062.4A CN202280093062A CN119095878A CN 119095878 A CN119095878 A CN 119095878A CN 202280093062 A CN202280093062 A CN 202280093062A CN 119095878 A CN119095878 A CN 119095878A
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文裕利
尹相淳
赵太研
金娥荣
柳素澹
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Xilong Treatment Co ltd
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Abstract

提供了用于预防和/或治疗癌症的抗MUC1抗体、抗MUC1/抗CD3双特异性抗体以及包含它们的药物组合物。

Description

特异性结合MUC-1的抗体及其用途
技术领域
提供了用于预防和/或治疗癌症的抗MUC1抗体、抗MUC1/抗CD3双特异性抗体以及包含它们的药物组合物。
背景技术
MUC1(黏蛋白-1)是一种黏蛋白糖蛋白，并且是包含多个糖基化胞外结构域的跨膜糖蛋白。MUC1在细胞表面上的长度为200nm至500nm，并且MUC1位于正常上皮细胞的顶端膜中。MUC1在许多器官如乳腺、胃、食管、胰腺、尿道、肺、肾和胆囊的腺或管腔上皮细胞中表达。黏蛋白在许多癌症类型中过表达，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等。已经对黏蛋白和癌症之间的病理关系进行了许多研究，特别是，本领域已知的几种针对MUC1的抗体。
然而，它们的治疗效果仍可得到改善，因此，本申请提供了具有改善特性的抗MUC1抗体或其抗原结合片段。
公开
技术问题
一方面提供了抗MUC1抗体或其抗原结合片段。
另一方面提供了抗MUC1/抗CD3双特异性抗体，其包含抗MUC1抗体或其抗原结合片段，以及抗CD3抗体或其抗原结合片段。
其他方面提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含(i)抗MUC1抗体或其抗原结合片段，或(ii)作为活性成分的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体。
其他方面提供了用于预防或治疗癌症的方法，包括向需要预防或治疗癌症的对象施用(i)抗MUC1抗体或其抗原结合片段，或(ii)抗MUC1/抗CD3双特异性抗体。
其他方面提供了(i)抗MUC1抗体或其抗原结合片段，或(ii)抗MUC1/抗CD3双特异性抗体用于预防或治疗癌症的用途，或其用于制备抗癌剂的用途。
其他方面提供了编码(i)抗MUC1抗体或其抗原结合片段，或(ii)抗MUC1/抗CD3双特异性抗体的多核苷酸、包含该多核苷酸的重组载体和/或包含该重组载体的重组细胞。
其他方面提供了用于制备(i)抗MUC1抗体或其抗原结合片段，或(ii)抗MUC1/抗CD3双特异性抗体的方法，包括施用表达编码(i)抗MUC1抗体或其抗原结合片段，或(ii)抗MUC1/抗CD3双特异性抗体的多核苷酸。
技术解决方案
术语的定义
当出于治疗目的将通过用所需抗原免疫被免疫动物而产生的动物源性抗体施用于人时，通常会引起免疫排斥，为了抑制这种免疫排斥，已经开发了嵌合抗体。嵌合抗体是一种引起抗同种型反应的动物源抗体的恒定区被人源抗体的恒定区取代的抗体。与动物源抗体相比，嵌合抗体显著提高了抗同种型应答，但是动物源氨基酸仍然存在于可变区，因此，具有抗独特型应答的潜在副作用。为改善这些副作用而开发的是人源化抗体。这是通过移植CDR(互补决定区)区域所制造的，其在嵌合抗体可变区中的抗原结合到人源抗体框架中起重要作用。
在一个具体实施方案中，抗MUC1抗体可以是动物源抗体(例如，鼠源抗体)、嵌合抗体(例如，人-鼠嵌合抗体)或人源化抗体。抗体或抗原结合片段可以分离自活体或为非天然存在的。抗体或抗原结合片段可以被重组产生或被合成产生。抗体或抗原结合片段可以分离自活体或为非天然存在的。抗体或抗原结合片段可以被合成产生或被重组产生。
在另一个实施方案中，抗体可以来源于(分离自)任何动物，包括人、鸟等哺乳动物。例如，抗体可以是人、小鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的抗体。在本文中，人源抗体是具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，包括从人免疫球蛋白库中分离的抗体，或从转染了至少一种人免疫球蛋白并且不表达内源性免疫球蛋白的动物中分离的抗体。
抗MUC1抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，例如，可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以根据本领域众所周知的方法制备。例如，可以使用噬菌体展示法来制备。或者，抗MUC1抗体可以制备为鼠源单克隆抗体。
在抗MUC1抗体或其抗原结合片段中，除重链CDR和轻链CDR区，或重链可变区和轻链可变区之外的其它位点可以来源于免疫球蛋白的所有亚型(例如，IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM等)，例如，它们可以来源于免疫球蛋白所有亚型的框架位点和/或轻链可变区和/或重链可变区。
完全抗体(例如，IgG型)具有2条全长轻链和2条全长重链的结构，并且每条轻链通过二硫键与重链相连。抗体的可变区分为重链可变区和轻链可变区，重链可变区有gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)和epsilon(ε)型，并有gamma1(γ1)、gamma2(γ2)、gamma3(γ3)、gamma4(γ4)、alpha1(α1)和alpha2(α2)作为亚型。轻链可变区有kappa(κ)和lambda(λ)型。
术语“重链”被解释为包括所有全长重链的含义，所述所有全长重链包含可变区结构域VH和3个恒定区结构域CH1、CH2和CH3和铰链及其片段，所述可变区结构域VH包含具有足以给予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。此外，术语“轻链”被解释为包括全长轻链的含义，所述全长轻链包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL及其片段，所述可变区结构域VL包含具有足以给予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。
术语“CDR(互补决定区)”指免疫球蛋白重链和轻链的高变区的氨基酸序列。重链和轻链可以分别包含3个CDR(CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL1、CDRL2、CDRL3)。CDR可以为抗体与抗原或表位的结合提供主要的接触残基。另一方面，在本说明书中，术语“特异性结合”或“特异性识别”与本领域众所周知的含义相同，是指抗原和抗体特异性相互作用以进行免疫反应。
术语“铰链区”是包含在抗体重链中的区域，存在于CH1和CH2区域之间，是指在抗体中为抗原结合位点提供柔性的区域。
当动物源抗体经历嵌合化过程时，动物源IgG1铰链被人IgG1铰链取代，但是动物源IgG1铰链具有比人IgG1铰链更短的长度，并且其两条重链之间的二硫键从3个减少至2个，因此，示出了彼此不同的铰链刚性效果。因此，铰链区的修饰可以增加人源化抗体的抗原结合效率。用于删除、添加或取代氨基酸以修饰铰链区氨基酸序列的方法是本领域众所周知的。
“抗原结合片段”是免疫球蛋白完整结构的片段，是指包含抗原可结合部分的多肽的一部分。例如，它可以是scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab’或F(ab’)2，但不限于此。在本发明中，抗体的抗原结合片段可以是包含至少一个互补决定区的抗原片段，例如，它可以选自scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab’和F(ab’)2。抗原结合片段可以使用蛋白酶获得(例如，Fab可以通过用木瓜蛋白酶限制性切割整个抗体获得，并且F(ab’)2片段可以通过用胃蛋白酶切割获得)，并且可以通过基因重组技术制造。
抗原结合片段的Fab具有轻链和重链可变区、轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1)的结构，并且具有一个抗原结合位点。
Fab’不同于Fab，因为它具有包含至少一个半胱氨酸残基的铰链区，该半胱氨酸残基位于重链CH1结构域的C端。F(ab’)2抗体是由于半胱氨酸残基在铰链区形成二硫键而产生的。
Fv是只有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段，产生Fv片段的重组技术是本领域众所周知的。在双链Fv中，重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接，而在单链Fv(scFv)中，通常通过肽接头，重链可变区和单链可变区通过共价键连接或直接在C端连接，因此，其可以形成与双链Fv相同的二聚体结构。肽接头可以与上文所述相同，例如，其长度可以为1个至100个氨基酸，例如，长度为2个至50个氨基酸，或长度为5个至25个氨基酸，并且对其中包含的氨基酸的类型没有限制。
抗原结合片段可以使用蛋白酶获得(例如，Fab可以通过用木瓜蛋白酶限制性切割整个抗体获得，F(ab’)2片段可以通过用胃蛋白酶切割获得)，并且可以通过基因重组技术制造。
在抗原结合片段例如scFV中，重链可变区和轻链可变区可以通过或不通过接头例如肽接头连接。肽接头可以是由1个至100个或2个至50个氨基酸组成的多肽，并且对其中包含的氨基酸类型没有限制。肽接头可包含例如Gly、Asn和/或Ser残基，也可包含中性氨基酸如Thr和/或Ala。只要不影响双特异性抗体的功能，接头的长度可以不同地确定。例如，肽接头可包含总共1个至100个、2个至50个或5个至25个选自Gly、Asn、Ser、Thr和Ala的至少一种氨基酸。在一个实施方案中，肽接头可以表示为(G4S)n(n是(G4S)的重复数，1至10的整数，例如2至5的整数)。
术语“拮抗剂”被解释为包括部分或完全阻断、抑制或中和靶点(例如MUC1)的至少一种生物活性的所有分子的概念。例如，“拮抗剂”抗体是指抑制或降低抗体结合的抗原的生物活性的抗体(例如，MUC1)。该拮抗剂可通过与配体(靶点)的受体结合来降低受体磷酸化，或使配体激活的细胞丧失能力或死亡。此外，拮抗剂可完全破坏受体-配体相互作用，与配体竞争性结合受体，或通过改变或下调受体的三级结构而显著降低受体-配体相互作用。
抗MUC1抗体或其抗原结合片段
本发明的一个实施方案提供了能够特异性识别和/或特异性结合MUC1(黏蛋白-1)的多肽。
MUC1可以是人MUC1，或猴、狗、大鼠或小鼠等的MUC1。在一个实施方案中，人MUC1可以是MUC1同种型M2(标识符：A6ZID5；NCBI参考号：ABS01294.1)、MUC1同种型1(标识符：P15941-1)、MUC1同种型2(标识符：P15941-2)、MUC1同种型3(标识符：P15941-3)、MUC1同种型4(标识符：P15941-4)、MUC1同种型5(标识符：P15941-5)、MUC1同种型6(标识符：P15941-6)、MUC1同种型Y(标识符：P15941-7)、MUC1同种型8(标识符：P15941-8)、MUC1同种型9(标识符：P15941-9)、MUC1同种型F(标识符：P15941-10)、MUC1同种型Y-LSP(标识符：P15941-11)、MUC1同种型S2(标识符：P15941-12)、MUC1同种型M6(标识符：P15941-13)、MUC1同种型ZD(标识符：P15941-14)、MUC1同种型T10(标识符：P15941-15)、MUC1同种型E2(标识符：P15941-16)或MUC1同种型J13(标识符：P15941-17)等，但不限于此。
在一个实施方案中，人MUC1可具有以下NCBI参考序列中提供的氨基酸序列：NP_001018016.1、NP_001018017.1、NP_001037855.1、NP_001037856.1、NP_001037857.1、NP_001037858.1、NP_001191214.1，NP_001191215.1，NP_001191216.1、NP_001191217.1、NP_001191218.1、NP_001191219.1、NP_001191220.1、NP_001191221.1、NP_001191222.1、NP_001191223.1、NP_001191224.1、NP_001191225.1、NP_001191226.1、NP_002447.4等，但不限于此，并且每个氨基酸序列可以由以下NCBI参考序列中提供的核苷酸序列(mRNA)编码：NM_001018016.2、NM_001018017.2、NM_001044390.2、NM_001044391.2、NM_001044392.2、NM_001044393.2、NM_001204285.1、NM_001204286.1、NM_001204287.1、NM_001204288.1、NM_001204289.1、NM_001204290.1、NM_001204291.1、NM_001204292.1、NM_001204293.1、NM_001204294.1、NM_001204295.1、NM_001204296.1、NM_001204297.1、NM_002456.5等，但不限于此。
在本说明书中，蛋白质、多肽或多核苷酸具有氨基酸序列或核苷酸序列可用于表示蛋白质、多肽或多核苷酸包含该序列，或基本上由该序列组成、或由该序列组成的所有情况。
这些多肽可用作抗MUC1抗体的互补决定区(CDR)。然后，互补性决定区可以通过所有常用方法来确定，例如，它们可以通过IMGT定义(http：//www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/)或Kabat定义(http：//www.bioinf.org.uk/abs/)来确定，但不限于此。
在其它实施方案中，提供了MUC1靶向多肽分子，其包含至少一种选自以下组的多肽。
MUC1靶向多肽分子，其可包含前述抗MUC1抗体的重链互补决定区和轻链互补决定区，或其组合；或包含重链互补决定区的重链可变区，包含轻链互补决定区的轻链可变区，或其组合。
MUC1靶向多肽分子，不限于此，但可作为抗MUC1抗体、抗体的抗原结合片段或抗MUC1抗体的类似物(具有与抗体相似的骨架和功能的结构；例如肽体、纳米抗体等)，或前体或组成部分(例如CDR)，如多重结合抗体等。
术语“肽体(肽+抗体)”是其中肽和抗体的全部或部分恒定区如Fc区等的融合蛋白，是指具有与抗体相似的骨架和功能的蛋白质。在本文中，上述至少一种肽可以充当抗原结合位点(重链和/或轻链CDR或可变区)。
术语“纳米抗体”也称为单结构域抗体，是指包含单体形式的抗体的单个可变结构域的抗体片段，并且具有与完整结构中的抗体相似的选择性结合特定抗原的特性。纳米抗体的分子量通常为约12kDa至约15kDa，与完全抗体(包含两条重链和两条轻链)的一般分子量(约150kDa至约160kDa)相比非常小，在某些情况下，其小于Fab片段或scFv片段。
具体地，本发明提供了能够特异性识别和/或特异性结合MUC1的多肽。多肽可以包含至少一个选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：33的氨基酸序列，更详细地，其可以具有至少一个选自SEQ ID NO：2至SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20至SEQID NO：26、SEQ ID NO：28至SEQ ID NO：32以及SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：38的氨基酸序列。
多肽及其适用的互补决定区总结在下表1中。在下表1中，VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3指重链互补决定区，VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3指轻链互补决定区。
[表1]
在一个实施方案中，提供了抗MUC1抗体或其抗原结合片段，其包含至少一种选自作为互补决定区的多肽。
抗MUC1抗体或其抗原结合片段可包含选自以下的至少一种
具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)，
具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)，和
具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，
作为重链互补决定区。
SEQ ID NO：1的氨基酸序列与下面通式1的氨基酸序列相同：
[通式1](SEQ ID NO：1)
X1是D或S，
X2是N、S或H。
在一个实施方案中，可用作抗MUC1抗体或其抗原结合片段的轻链CDR1的SEQ IDNO：1的多肽可具有至少一个选自例如SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：6的氨基酸序列，详细序列描述于上表1和序列表中，所述氨基酸序列中的加粗下划线部分代表经修饰的氨基酸。
SEQ ID NO：7的氨基酸序列与下面通式2的氨基酸序列相同：
[通式2](SEQ ID NO：7)
X是Q、F或V，
X4是R或K，
X5是N、S、Q或Y，
X6是P或A，
X7是N或G，
X8是Y、G或S，
X9是E或T，
X10是T或K，
X11是Y或E，
X12是S、A或V，
X13是N、Q或A。
在一个实施方案中，可用作抗MUC1抗体或其抗原结合片段的重链CDR2的SEQ IDNO：7的多肽可具有至少一个选自例如SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：15的氨基酸序列，详细的序列描述于上表1和序列表中，所述氨基酸序列中的加粗下划线部分代表经修饰的氨基酸。
SEQ ID NO：16的氨基酸序列与下面通式3的氨基酸序列相同：
[通式3](SEQ ID NO：16)
X14是M或F。
在一个实施方案中，可用作抗MUC1抗体或其抗原结合片段的重链CDR3的SEQ IDNO：16的多肽可具有至少一个选自例如SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：18的氨基酸序列，详细序列描述于上表1和序列表中，所述氨基酸序列中的加粗下划线部分代表经修饰的氨基酸。
抗MUC1抗体或其抗原结合片段可包含至少一种选自以下的
具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)，
具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)，和
具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)，
作为轻链互补决定区。
SEQ ID NO：19的氨基酸序列与下面通式4的氨基酸序列相同：
[通式4](SEQ ID NO：19)
X15是K或R，
X16是S或A，
X17是L或V，
X18是L、Y或H，
X19是N或S，
X20是Q或G，
X21是K或Y。
在一个实施方案中，可用作抗MUC1抗体或其抗原结合片段的轻链CDR1的SEQ IDNO：19的多肽可具有至少一个选自例如SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：26的氨基酸序列，详细序列描述于上表1和序列表中，所述氨基酸序列中的加粗下划线部分代表经修饰的氨基酸。
SEQ ID NO：27的氨基酸序列与下面通式5的氨基酸序列相同：
[通式5](SEQ ID NO：27)
X22是A或G，
X23是T或S，
X24是E或A，
X25是S或T。
在一个实施方案中，可用作抗MUC1抗体或其抗原结合片段的轻链CDR2的SEQ IDNO：27的多肽可具有至少一个选自例如SEQ ID NO：28至SEQ ID NO：32的氨基酸序列，详细序列描述于上表1和序列表中，所述氨基酸序列中的加粗下划线部分代表经修饰的氨基酸。
SEQ ID NO：33的氨基酸序列与下面通式6的氨基酸序列相同：
[通式6](SEQ ID NO：33)
X26是C或S，
X27是S或Q，
X28是Y、T或S，
X29是L或Y。
在一个实施方案中，可用作抗MUC1抗体或其抗原结合片段的轻链CDR3的SEQ IDNO：27的多肽可具有至少一个选自例如SEQ ID NO：34至SEQ ID NO：38的氨基酸序列，详细序列描述于上表1和序列表中，所述氨基酸序列中的加粗下划线部分代表经修饰的氨基酸。
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段可包含
至少一个重链互补决定区，其选自具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)、具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)和具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，或包含至少一个重链互补决定区的重链可变区；
至少一个轻链互补决定区，其选自具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)、具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)和具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)，或包含至少一个轻链互补决定区的轻链可变区；
重链互补决定区和轻链互补决定区的组合；或
重链可变区和轻链可变区的组合。
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段可包含
至少一个重链互补决定区，其选自具有SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)、具有SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：16的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)和具有SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，或包含至少一个重链互补决定区的重链可变区；
至少一个轻链互补决定区，其选自具有SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：26的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)、具有SEQ ID NO：28至SEQ ID NO：32的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)和具有SEQ ID NO：34至SEQ ID NO：38的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)，或包含至少一个轻链互补决定区的轻链可变区；
重链互补决定区和轻链互补决定区的组合；或
重链可变区和轻链可变区的组合。
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段可包含
重链可变区，其包含具有SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)，具有SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：16的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)，和具有SEQ IDNO：17至SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)；和
轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：26的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)，具有SEQ ID NO：28至SEQ ID NO：32的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)，和具有SEQ IDNO：34至SEQ ID NO：38的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)。
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段可包含下表2和表3中组合的重链可变区CDR序列和轻链可变区CDR序列。
[表2]
[表3]
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段可包含
至少一个重链互补决定区，其选自具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)、具有SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：14的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)和具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，或包含至少一个重链互补决定区的重链可变区；
至少一个轻链互补决定区，其选自具有SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)、具有SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)和具有SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35或SEQID NO：36的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)，或包含至少一个轻链互补决定区的轻链可变区；
重链互补决定区和轻链互补决定区的组合；或
重链可变区和轻链可变区的组合。
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段可包含
至少一个重链互补决定区，其选自具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)、具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)和具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，或包含至少一个重链互补决定区的重链可变区；
至少一个轻链互补决定区，其选自具有SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23或SEQ IDNO：24的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)、具有SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)和具有SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)，或包含至少一个轻链互补决定区的轻链可变区；
重链互补决定区和轻链互补决定区的组合；或
重链可变区和轻链可变区的组合。
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段可包含
1)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)，具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)，具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，具有SEQ IDNO：21的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)，具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)，和具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)；
2)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)，具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)，具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，具有SEQ IDNO：23的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)，具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)，和具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)；
3)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)，具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)，具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，具有SEQ IDNO：24的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)，具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)，和具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)；
4)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)，具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)，具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，具有SEQ IDNO：23的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)，具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)，和具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)；或
5)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)，具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)，具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，具有SEQ IDNO：24的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)，具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)，和具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)。
抗MUC1抗体或其抗原结合片段可包含至少一个重链可变区的框架序列、至少一个轻链可变区的框架序列、或至少一个重链可变区的框架序列和至少一个轻链可变区的框架序列。重链可变区的框架序列和轻链可变区的框架序列的一个实例示出在下表4至表7中。
[表4]
[表5]
[表6]
[表7]
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段可以是包含重链互补决定区(上表2中的VH0至VH9)的重链可变区、包含轻链互补决定区(上表3中的VL0至VL9)的轻链可变区，或其组合。例如，重链可变区可包含选自SEQ ID NO：77至SEQ ID NO：86的氨基酸序列，轻链可变区可包含选自SEQ ID NO：87至SEQ ID NO：96的氨基酸序列。例如，重链可变区可包含选自SEQ ID NO：77至SEQ ID NO：86的氨基酸序列，轻链可变区可包含选自SEQ IDNO：87至SEQ ID NO：96的氨基酸序列。
因此，抗MUC1抗体或其抗原结合片段可以包含
具有选自SEQ ID NO：77至SEQ ID NO：86的氨基酸序列的重链可变区；
具有选自SEQ ID NO：87至SEQ ID NO：96的氨基酸序列的轻链可变区；或
其组合。
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段可以包含
具有SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85的氨基酸序列的重链可变区；和
具有SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：95的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段可包含
具有SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：84的氨基酸序列的重链可变区；和
具有SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：92的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段可包含
1)具有SEQ ID NO：78的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的轻链可变区；
2)具有SEQ ID NO：78的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：91的氨基酸序列的轻链可变区；
3)具有SEQ ID NO：78的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：92的氨基酸序列的轻链可变区；
4)具有SEQ ID NO：81的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：91的氨基酸序列的轻链可变区；
5)具有SEQ ID NO：81的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：92的氨基酸序列的轻链可变区；或
6)具有SEQ ID NO：84的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：91的氨基酸序列的轻链可变区。
术语“表位”被解释为抗原决定簇，即被抗体识别的抗原的一部分。在一个具体实施方案中，表位可以是包含MUC1蛋白内的区域的多肽，例如SEQ ID NO：109的氨基酸序列。
因此，抗MUC1抗体或抗原结合片段可特异性结合包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列的表位。
多重结合抗体
本发明的一个实施方案涉及包含可特异性识别和/或特异性结合MUC1的多肽的多重结合抗体或多特异性抗体，更具体地，其可以是包含可特异性识别和/或特异性结合第二靶点的多肽以及可特异性识别和/或特异性结合MUC1的多肽的双特异性抗体。
在本说明书中，术语“多重结合抗体”是指识别和/或结合2种或多于2种不同抗原，或识别和/或结合相同抗原的彼此不同的位点的抗体，并且多重结合抗体的一个抗原结合位点可以包含上述多肽。
本发明的另一个实施方案涉及双特异性抗原结合分子，其包含特异性结合MUC1的第一抗原结合结构域和特异性结合CD3的第二抗原结合结构域。具体地，本发明的一个实施方案涉及双特异性抗体，其包含至少一个对根据本发明的MUC1抗体或其抗原结合片段特异的抗原结合位点和T细胞活化抗原。
在双特异性抗体中，T细胞活化抗原可以是CD3 T细胞协同受体(CD3；分化簇3)抗原(例如，抗CD3 epsilon(ε)抗原)，并且双特异性抗体可以包括抗CD3抗体，其包含针对CD3抗原或其抗原结合片段的抗原结合位点。
具体地，其涉及包含抗MUC1抗体或其抗原结合片段以及抗CD3抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体(换句话说，抗MUC1/抗CD3双特异性抗体)。抗MUC1/抗CD3双特异性抗体可表现出协同效应，同时保持对MUC1和CD3每种抗原的亲和力和活性。
双特异性抗体特异性结合第一抗原MUC1，并可包含抗MUC1抗体或其抗原结合片段。抗MUC1抗体或其抗原结合片段可以与上述相同。
此外，双特异性抗体特异性结合第二抗原CD3，并且具体地，其可以包含抗CD3抗体或其抗原结合片段。抗CD3抗体或抗原结合片段可以是与人、猴、小鼠等的CD3结合的抗体或其抗原结合片段。抗CD3抗体或其抗原结合片段可用于靶向表达CD3的T细胞，或刺激T细胞活化。本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段可以作为双特异性抗体的一部分，该双特异性抗体引导针对特定细胞类型的CD3介导的T细胞活化，例如肿瘤细胞或传染性病原体。
可以无限制地使用抗CD3抗体或其抗原结合片段，只要其为特异性结合CD3的抗体，例如OKT3抗体或其抗原结合片段、UCHT-1抗体或其抗原结合片段、SP34抗体或其抗原结合片段等，但不限于此。OKT3抗体可以是小鼠或人源化免疫球蛋白IgG2a同种型单克隆抗体。已知UCHT-1抗体与人T细胞受体(TCR)/CD3复合物的约20kDa CD3ε小单元反应，已知SP34抗体与CD3ε小单元结合。用于获得OKT3抗体、UCHT-1抗体或SP34抗体的方法是本领域众所周知的。
在一个具体实施方案中，抗CD3抗体或其抗原结合片段可包含至少一个CDR序列，优选6个CDR序列，选自下列多肽(参见下表8)：
具有SEQ ID NO：97的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)，
具有SEQ ID NO：98的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)，
具有SEQ ID NO：99的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，
具有SEQ ID NO：100的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)，
具有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)，和
具有SEQ ID NO：102的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)。
更具体地，抗CD3抗体或其抗原结合片段
可包含具有SEQ ID NO：103氨基酸序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105氨基酸序列的轻链可变区。
[表8]
抗CD3抗体的抗原结合片段可以选自抗CD3抗体的scFv、(scFv)2、Fab、Fab’和F(ab’)2。
根据本发明的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体可以是其中抗CD3抗体或其抗原结合片段连接到抗MUC1抗体或其抗原结合片段的C端或N端的抗体。
例如，它可以是与抗MUC1抗体或其抗原结合片段的重链N端或C端结合的抗CD3抗体scFv(抗MUC1重链N端-抗CD3 scFv或抗MUC1重链C端-抗CD3 scFv)，或与抗MUC1轻链N端或C端结合的抗CD3抗体scFv(抗MUC1轻链N端-抗CD3 scFv或抗MUC1轻链C端-抗CD3 scFv)。此外，它可以是双特异性抗体，形式为具有一个抗MUC1抗体的抗原结合位点和一个抗CD3抗体的抗原结合位点(1+1)、可以在一个双特异性抗体的3个抗原结合位点中各有两个和一个(1+2或2+1)或在4个抗原结合位点中各有2个(2+2)，包括其中抗CD3 scFv以单价或二价形式结合的双特异性抗体，但不限于此。
在一个实施方案中，抗MUC1/抗CD3双特异性抗体可包含抗MUC1抗体或其抗原结合片段，以及连接到重链或轻链的C端或N端的抗CD3抗体或其抗原结合片段，例如，抗MUC1抗体或其抗原结合片段的轻链的N端。在一个实施方案中，抗MUC1/抗CD3双特异性抗体可包含抗MUC1的完全抗体(例如，IgG型抗体)和抗CD3抗体的抗原结合片段(例如，scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab’和F(ab’)2)，其连接到抗体轻链的N端。
在抗MUC1/抗CD3双特异性抗体中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段和抗CD3抗体或其抗原结合片段可以通过或不通过接头连接，例如肽接头。此外，抗原结合片段中的重链部分和轻链部分，例如scFv片段中的重链可变区和轻链可变区也可以通过或不通过肽接头连接。连接抗MUC1抗体或抗原结合片段和抗CD3抗体或其抗原结合片段的肽接头，以及连接抗原结合片段中重链部分和轻链部分的肽接头可以相同或不同。肽接头可以是由1个至100个或2个至50个氨基酸组成的多肽，并且其中所包含的氨基酸类型没有限制。肽接头可包含例如Gly、Asn和/或Ser残基，也可包含中性氨基酸如Thr和/或Ala。适用于肽接头的氨基酸序列是本领域已知的。另一方面，接头的长度可以不同地确定，只要不影响双特异性抗体的功能。例如，肽接头可以由总共1个至100个、2个至50个或5个至25个选自Gly、Asn、Ser、Thr和Ala的至少一种氨基酸序列组成。在一个实施方案中，肽接头可以表示为(G4S)n(n是(G4S)的重复数，1至10的整数，例如2至5的整数)。
在一个实施方案中，抗MUC1/抗CD3双特异性抗体可以是抗CD3抗体的scFv形式，其与位于抗MUC1抗体或其抗原结合片段中的轻链N端结合。与其中抗CD3抗体scFv结合到位于抗MUC1抗体或其抗原结合片段中的轻链的C端的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体相比，其中抗CD3抗体scFv结合到位于抗MUC1抗体或其抗原结合片段中的轻链的N端的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体可具有更优异的抗癌细胞的细胞毒性、癌细胞增殖抑制效果和/或癌症治疗效果。
医疗用途
其他方面提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含抗MUC1抗体或抗原结合片段，或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或抗原结合片段。
其他方面提供了预防或治疗癌症的方法，包括向需要预防或治疗癌症的对象施用药学有效剂量的抗MUC1抗体或抗原结合片段，或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或抗原结合片段。用于预防和/或治疗癌症的方法还可以包括在施用前确认患者需要预防和/或治疗癌症。
抗MUC1抗体或抗原结合片段，或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或抗原结合片段可有效用于预防或治疗癌症。本说明书中提供的抗MUC1抗体或抗原结合片段、或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或抗原结合片段表现出作为MUC1激动剂的功能，因此，为了使抗MUC1抗体或抗原结合片段、或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或抗原结合片段表现出功效(例如，抗癌功效，如癌细胞死亡等)，对于所应用的癌症，表达MUC1的相应癌细胞可能是有利的，例如，它可以是表达MUC1的实体癌。具体而言，本发明的一个实施方案涉及特异性结合MUC-1的新型抗体及其用途，所述抗体具有改善的实体癌靶点向性和治疗性。在一个实施方案中，癌症可以包含至少一种选自血癌(例如，B细胞淋巴瘤等)、骨髓炎、甲状腺癌、子宫癌(例如宫颈癌)、皮肤癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和胰腺癌，或其中抗MUC1抗体或抗原结合片段特异性结合的抗原的表位表达至30％或高于30％的实体癌，但不限于此。
在药物组合物或方法中，药物有效剂量的抗MUC1抗体或其抗原结合片段或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段可与至少一种添加剂一起提供，所述添加剂选自药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂等。
药学上可接受的载体通常用于制备抗体，并且可以是选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、褐藻胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等的至少一种，但不限于此。除了上述组分之外，药物组合物还可以包含选自稀释剂、赋形剂、润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等的至少一种，其通常用于制备药物组合物。
药物组合物、抗MUC1抗体或其抗原结合片段、或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或抗原结合片段可以口服或非肠道施用。在非肠道施用的情况下，可以通过静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮内施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用和直肠内施用等方式施用。在口服施用的情况下，蛋白质或肽被消化，因此应当配制口服组合物以包裹活性药物或保护其在胃中不降解。此外，该组合物可以用任何装置施用，在该装置中活性物质可以移动到靶细胞。
药物组合物、抗MUC1抗体或抗原结合片段、或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段的适当剂量可由诸如制备方法、施用方法、患者年龄、体重、性别、疾病状况、食物、施用时间、施用途径、排泄率和反应敏感性等因素来不同地规定。例如，药物组合物、抗MUC1抗体或抗原结合片段、或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段的每日剂量可为0.001mg/kg至1000mg/kg，具体地，0.01mg/kg至100mg/kg，更具体地，0.1mg/kg至50mg/kg，但不限于此。每日剂量可以被配制成一种单位剂型的制剂，或通过适当分配来配制，或通过将其插入多剂量容器中来制备。术语“药物有效剂量”是指能够显示活性成分(即，抗MUC1抗体或抗原结合片段，或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段)的期望效果，换句话说，预防和/或治疗癌症的效果的量，并且其可以由诸如制备方法、施用方法、患者年龄、体重、性别、疾病状况、食物、施用时间、施用途径、排泄速率和反应活性的因素来不同地规定。
该药物组合物可以以单剂量形式制备，或通过将其插入多剂量容器中，通过使用药学上可接受的载体和/或赋形剂将其配制而制备。此时，制剂可以是在油或水介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳液形式，或可以是提取物、粉末、粉状剂、颗粒、片剂或胶囊形式，并且可以额外包含分散剂或稳定剂。
此外，药物组合物可以作为单独的治疗剂施用或与另一种治疗剂联合施用，并且可以与常规治疗剂先后或同时施用。
另一方面，药物组合物包括抗体或其抗原结合片段，因此它可以被配制成免疫脂质体。包含抗体的脂质体可以根据本领域众所周知的方法制备。免疫脂质体是包含磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物，，可通过逆相蒸发法制备。例如，抗体Fab’片段可以通过二硫键置换反应与脂质体结合。脂质体中还可以包含化学治疗剂，例如阿霉素。
所述药物组合物的施用对象或接受所述预防和/或治疗方法施用的患者可以是哺乳动物，例如灵长类动物如人、猴等，或啮齿类动物如大鼠、小鼠等，但不限于此，并且可以是对常规抗癌剂的拮抗剂，例如靶细胞膜蛋白(例如MUC1)，具有抗性的癌症患者。
多肽、重组载体和抗体的制备方法
本发明的其他实施方案提供了编码上述多肽的多核苷酸。在一个具体的实施方案中，多核苷酸可以编码包含至少一个选自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8至SEQID NO：15、SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28至SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：38的氨基酸序列的多肽。
在其他具体实施方案中，多核苷酸可以编码包含选自SEQ ID NO：77至SEQ ID NO：96的氨基酸序列的多肽。
其他实施方案提供了包含多核苷酸的重组载体。
其他实施方案提供了用重组载体转化的重组细胞。
术语“载体”是指在宿主细胞中表达目的基因的手段。例如，它包括病毒载体如质粒载体、黏粒载体和噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。可用作重组载体的载体可以是本领域常用的通过工程所构建的质粒(例如，pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列和pUC19等)、噬菌体(例如，λgt4λB、λ-卡隆、λΔz1和M13等)或病毒(例如，SV40等)，但不限于此。
在重组载体中，多核苷酸可以与启动子可操作地连接。术语“可操作地连接”指核苷酸表达调控序列(例如启动子序列)和另一个核苷酸序列之间的功能性结合。调节序列可以通过“可操作地连接”来调节另一个核苷酸序列的转录和/或翻译。
重组载体通常可以构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。用于表达的载体可以使用一种用于在植物、动物或微生物中表达外源蛋白的常用载体。重组载体可以通过本领域已知的各种方法构建。
重组载体可以使用原核细胞或真核细胞作为宿主来构建。例如，当使用的载体是表达载体，并使用原核细胞作为宿主时，通常包含能够进行转录的强启动子(例如，pLλ启动子、CMV启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、T7启动子等)，起始翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。当使用真核细胞作为宿主时，包含在载体中的在真核细胞中起作用的复制起点包括f1复制起点、SV40复制起点、pMB1复制起点、腺复制起点、AAV复制起点和BBV复制起点等，但不限于此。此外，可以使用来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子和HSV的tk启动子)作为转录终止序列，其通常具有多聚腺苷酸化序列。
重组细胞可以通过将重组载体导入合适的宿主细胞中来获得。作为宿主细胞，可以使用本领域已知的能够稳定和持续克隆或表达重组载体的任何宿主细胞，并且原核细胞包括例如大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21、大肠杆菌RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776、大肠杆菌W3110、芽孢杆菌菌株如枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌、以及肠杆菌菌株如鼠伤寒沙门菌、黏质沙雷菌和各种假单胞菌等，并且当其转化到真核细胞中时，作为宿主细胞，可以使用酵母(酿酒酵母)、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞，例如Sp2/0、CHO(中国仓鼠卵巢)K1、CHO DG44、PER.C6、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、Huh7、3T3、RIN、MDCK细胞系等，但不限于此。
将多核苷酸或包含其的重组载体递送(引入)到宿主细胞中，可以使用本领域众所周知的递送方法。作为递送方法，例如，当宿主细胞是原核细胞时，可以使用CaCl2方法或电穿孔方法等，当宿主细胞是真核细胞时，可以使用显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染和基因枪法等，但不限于此。
用于筛选转化的宿主细胞的方法可以根据本领域众所周知的方法，使用由选择标记表达的表型容易地进行。例如，当选择标记是特定的抗生素抗性基因时，通过在含有抗生素的培养基中培养转化体，可以容易地筛选转化体。
其它实施方案提供了用于制备多肽或抗MUC1抗体或抗原结合片段，或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括在重组细胞中表达多核苷酸。表达多核苷酸可包括在允许本文所含多核苷酸表达的条件下培养重组细胞。制备多肽或抗MUC1抗体或抗原结合片段、或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段的方法还可包括在表达或培养后分离和/或纯化多肽或抗MUC1抗体或抗原结合片段、或抗MUC1/抗CD3双特异性抗体或其抗原结合片段。
有益效果
抗MUC1抗体和抗MUC1/抗CD3双特异性抗体可有效抑制癌细胞的生长，因此，它们对预防或治疗癌症具有优异的效果。
附图简要说明
图1示出了胰腺癌特异性MP1单克隆抗体与外周血和正常胰腺上皮细胞以及胰腺癌细胞的结合反应。(粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、正常胰腺上皮细胞(H6C7)、5种胰腺癌细胞系(AsPC1、BxPC3、Capan-1、Capan-2、PANC-1))
图2A是胰腺癌组织中免疫组织化学(IHC)的结果，图2B示出了乳腺癌细胞中的IHC结果，附图中的T示出了肿瘤部位。
图3示出了MP1单克隆抗体的蛋白质印迹结果。
图4示出了通过LC-MS/MS分析并鉴定的MUC1的氨基酸序列。
图5示出了抗MUC1抗原的MP1单克隆抗体的反应性测定(ELISA)。
图6示出了抗MUC1抗原的MP1单克隆抗体的反应性测定(IP-蛋白质印迹(IB))。
图7A和图7B示出了对MP1应答的胰腺癌细胞系表面的抗原定量结果。
图7C和图7D示出了使用环肽阵列方法的MP1单克隆抗体的表位定位结果。
图8示出了MP1人源化抗体与胰腺癌细胞的结合反应，染色细胞系为Capan-2，并描述了重链和轻链抗体基因组合和细胞结合阳性(％)。
图9示出了LCC型抗MUC1/OKT3抗体的结构。
图10A和图10B示出了LCC型抗MUC1/OKT3抗体与胰腺癌细胞AsPC1的细胞表面结合的结果。
图11示出了LCC型抗MUC1/OKT3抗体对胰腺癌细胞Capan-2和AsPC1的细胞毒性的结果。
图12示出了LCN型抗MUC1/OKT3抗体的结构。
图13示出了LCN型抗MUC1/OKT3抗体对胰腺癌细胞Capan-1的细胞毒性的结果。
图14示出了LCN型抗MUC1/OKT3抗体对胰腺癌细胞AsPC1的细胞毒性的结果。
图15示出了LCN型抗MUC1/OKT3抗体对胰腺癌细胞Capan-2和AsPC1、胃癌细胞SNU-601和乳腺癌细胞T47D的细胞毒性的结果。
图16是确定在NOG小鼠动物模型中通过施用抗MUC1/OKT3抗体对癌细胞的治疗效果的结果，在所述NOG小鼠动物模型中通过注射胰腺癌细胞AsPC-1诱导了肿瘤。
发明模式
在下文中，将通过以下实施例更详细地描述本发明。然而，它们仅用于说明本发明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1：MP1单克隆抗体的开发
为了开发对胰腺癌特异的新抗体，进行了以下实验，并且所开发的抗体不仅在胰腺癌中部分表达，而且在乳腺癌和胃癌中部分表达，并作为实体癌特异性抗体被命名为MP1。
实施例1-1.用于制造MP单克隆抗体的靶位点的设计与筛选方法
为了开发抗胰腺癌中表达的特异性抗原的单克隆抗体，将各种胰腺癌细胞系AsPC1、BxPC3、Capan-1、Capan-2、PANC-1接种到小鼠中，然后通过细胞融合方法建立抗它们的单克隆抗体。此后，在杂交瘤筛选过程中，筛选对胰腺癌细胞系呈阳性而对正常胰腺细胞系H6C7和外周血呈阴性的抗体。
实施例1-2.杂交瘤制备抗体筛选
为了开发对胰腺癌特异的单克隆抗体，将5种胰腺癌细胞系(AsPC1、BxPC3、Capan-1、Capan-2、PANC-1)等量混合，并通过将它们注射到6周龄的Balb/c雌性小鼠的腹腔(IP)中来进行免疫，每只注射1x107，间隔3周，共3次。切除如上所述的免疫小鼠的脾脏，获得单细胞悬液，用RPMI1640洗涤两次，然后以1：1(v/v)混合0.4％台盼蓝(sigma)，然后使用台盼蓝染色法对细胞数量计数，该方法用显微镜测量未染色的细胞。将X63小鼠骨髓瘤细胞系(ATCC CRL-1580)用作细胞融合伴侣细胞，并以与脾细胞同样的方式洗涤，然后对细胞数量计数。将骨髓瘤细胞和脾细胞混合后，加入PEG(聚乙二醇)1500以融合细胞，然后离心细胞。将融合的杂交瘤细胞悬浮于含有1xHAT的RPMI(20％FBS，次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)中，并将其150μl等分到96孔板中，然后在37℃下5％CO2的培养箱中培养。融合后，在包含HAT的培养基中进行一段时间的筛选过程，当观察到形成集落的孔时，将其替换为HT培养基，并在37℃下5％CO2的培养箱中培养48小时，然后对于正常胰腺细胞系H6C7和用于免疫接种的5种胰腺癌细胞系AsPC1、BxPC3、Capan-1、Capan-2、PANC-1，分别进行如下荧光染色，并通过流式细胞术对它们进行分析。向制备的细胞中各加入100ul杂交瘤培养物上清液，并在4℃反应30分钟，然后加入3ml的PBS，通过以1700rpm离心3分钟洗涤未结合的抗体，为了确认结合的抗体，将二次抗体山羊抗小鼠Ig-FITC(Jackson ImmunoResearch，USA)稀释200倍并加入，然后在4℃反应15分钟，然后通过与上述相同的方法用3ml的PBS洗涤，然后使用流式细胞术测量。
实施例1-3.
为了确定与外周血的结合程度，将100μl的杂交瘤上清液加入PBMC(外周血单核细胞，Zenbio)中，并在4℃下反应30分钟，然后加入3ml PBS，通过以1700rpm离心3分钟洗涤未结合的抗体，为了确定结合的抗体，将二次抗体山羊抗小鼠Ig-FITC(JacksonImmunoResearch，USA)稀释200倍并加入，然后在4℃下反应15分钟，再用3ml PBS按上述方法洗涤，然后通过流式细胞术测定，并对结果进行描述(图1)。图1示出了胰腺癌特异性MP1单克隆抗体与外周血和正常胰腺上皮细胞(H6C7)以及各种胰腺癌细胞的反应性结果。
如图1所示，筛选对各种胰腺癌细胞系呈阳性而对所有正常胰腺上皮细胞、H6C7和外周血的粒细胞、淋巴细胞和单核细胞呈阴性的单克隆抗体(下文称为MP1)，最后，通过有限稀释，获得单菌落的MP1杂交瘤细胞。
实施例2.不同细胞系中的抗体表达分析
实施例2-1.不同细胞系中的抗体表达
通过流式细胞术确定了MP1单克隆抗体在通过KCLB(韩国细胞系库)和ATCC(美国模式培养物集存库)获得的各种癌细胞系中的结合。具体地，根据KCLB(韩国细胞系库)和ATCC(美国模式培养物集存库)建议的培养基和方法，使用RPMI1640培养基或DMEM培养基培养癌细胞系，其中使用5％CO2的培养箱在37℃下加入10％加热灭活的FBS。此外，人胰腺上皮细胞系H6C7购自kerafast公司，并使用Keratinocyte SFM(Invitrogen目录号：17005042)使用5％CO2的培养箱在37℃培养。
将本发明的MP1单克隆抗体分别加入到培养的各种癌细胞中，它们在4℃反应30分钟，然后用PBS洗涤，加入FITC标记山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，USA)，它们在4℃培养15分钟。再次用PBS洗涤，然后用FACS caliber(Becton Dickinson，USA)分析，以确定MP1抗体在各种实体癌细胞系中的反应性(表9)。
如下表9和表10所示，确定了MP1单克隆抗体高度结合胰腺癌和一些胃癌、乳腺癌、肺癌细胞系以及皮肤癌和前列腺癌细胞系，而它不结合或弱结合包括正常胰腺上皮细胞系H6C7和脑癌、胆道癌和结直肠癌细胞系的T细胞和B细胞。PBMC表示在正常血细胞中是阴性的。
MP1在各种胰腺癌细胞中显示出阳性反应，并且在正常胰腺上皮细胞中显示出阴性反应，因此，表明它可以用作胰腺癌治疗剂。
[表9]
[表10]MP1抗体阳性的实体癌类型
实体癌类型 阳性癌细胞系数量/染色癌细胞系数量
胰腺 3/6
乳腺 5/11
胃 2/10
宫颈 2/2
前列腺 1/2
肺 4/11
甲状腺 1/1
皮肤 1/1
黑色素瘤 1/3
实施例2-2.IHC(免疫组织化学)测定
通过免疫组织化学(IHC)方法确定了MP1单克隆抗体的结合抗原在人胰腺癌和乳腺癌组织中的分布。人胰腺癌和乳腺癌组织从国立忠北大学医院(Chungbuk NationalUniversity Hospital)获得，石蜡切片在国立忠北大学医院病理部制造。
使用常规方法将待染色的人乳腺癌组织固定在福尔马林中，然后包埋在石蜡中以制造微阵列切片。然后，将其放置在载玻片上，以产生用于染色读数的单个组织载玻片。随后，使用MP1抗体，通过以下方法进行免疫组织化学染色。对二甲苯进行三次脱蜡处理，每次处理10分钟，用乙醇按100％、80％、50％的顺序处理，最后用蒸馏水洗涤。用1×TBS洗涤后，将载玻片置于10mM柠檬酸(pH 6.0)抗原再生溶液中，在微波中进行抗原再生20分钟。使用自来水缓慢降低载玻片的温度，并将其储存在1×TBS中10分钟。作为初次抗体，将小鼠MP1抗体处理到组织上，并在室温下反应1小时，然后用1×TBS洗涤三次，作为二次抗体，将抗小鼠抗体-HRP缀合物在室温下反应30分钟。用1×TBS洗涤3次，进行DAB显色1分30秒，用1×TBS洗涤3次，进行反染色45秒，将载玻片放入流动的自来水中洗涤10分钟。脱水过程以脱蜡过程的相反顺序进行，将其密封并进行显微镜读数或照相。
如图2A和图2B所示，确定了由MP1单克隆抗体识别的抗原不分布在正常组织中，并且其对癌组织特异性表达。
实施例3：抗MP1单克隆抗体的抗原分析
实施例3-1.MP1单克隆抗体抗原大小的确认
为了研究由本发明的MP1单克隆抗体识别的抗原的蛋白质大小进行了蛋白质印迹。在含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，目录号：1136170001)的细胞裂解液(NP40细胞裂解缓冲液，Thermo Fisher Scientific)中裂解对MP1具有高抗原表达的胰腺癌细胞系，并且然后在SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，以转移至Immobilon-P膜(MilliporeCorporation，Billerica，MA，USA)。之后，将纯化的MP1单克隆抗体处理到膜上，然后在ECL系统(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)中显色以确认条带(图3)。如在图3中可以确定的，作为测量的结果，由MP1单克隆抗体识别的抗原的大小接近约300kDa。
实施例3-2.MP1单克隆抗原的分离分析
为了鉴定由本发明的MP1单克隆抗体所识别的抗原进行了免疫沉淀。首先，在细胞裂解液(NP40细胞裂解缓冲液，Thermo Fisher Scientific)中按照1×107个细胞/ml裂解对MP1单克隆抗体具有高反应性的细胞系Capan-2细胞系，然后通过离心去除细胞残留物，收集上清液并用作分离由MP1抗体识别的抗原的材料。将MP1单克隆抗体加入到Protein-G琼脂糖凝胶中，在4℃混合4小时，然后用1×PBS洗涤两次，然后加入先前制备的Capan-2裂解物，在4℃混合4小时，然后用1×PBS洗涤两次。对于从其获得的免疫复合物，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用考马斯亮蓝G-250对凝胶染色，然后剪切推测为抗MP1的抗原的约300kDa的条带，并要求LC-MS/MS分析以用于ProteomTech的鉴定。对于鉴定，通过LC-MS/MS分析获得的结果用MASCOT处理。当在细胞表面上表达通过上述一系列分析获得的100种蛋白质击中(protein hits)时，通过限制蛋白质大小为约300kDa的抗原进行筛选的结果是，MUC1可以被筛选作为抗MP1单克隆抗体的抗原(图4)。从MP1分离的肽序列是QGGFLGLSNIK(SEQ ID NO：107)。
实施例3-3.通过ELISA(酶联免疫吸附试验)验证MP1单克隆抗体的抗原鉴定结果
为了验证从LC-MS/MS获得的抗原鉴定结果，MUC1单克隆抗体对重组蛋白MUC1(Sino Biological，目录号：12123-HCCH)的反应性通过ELISA和蛋白质印迹测定得到确定。
将每孔100ng重组蛋白MUC1加入Maxisorp ELISA板，并在37℃下反应1小时以包被抗原，然后向每孔加入200ul 1x封闭液(sigma)，并在37℃下反应1小时以进行封闭。将MP1单克隆抗体和对照抗体，100ul的PBS分别加入到制备的平板中，然后将其在37℃反应1小时，用PBS洗涤并除去未结合的抗体。之后，稀释并加入山羊抗小鼠IgG-HRP(JacksonImmunoResearch，USA)，反应30分钟，然后用PBS洗涤，然后每孔加入50ul TMB溶液，反应10分钟，然后加入50ul硫酸，停止反应，在450nm测量吸光度。抗重组蛋白MUC1的MP1单克隆抗体显示出如图5所示的反应性。图5是通过ELISA验证抗MP1单克隆抗体的抗原是MUC1的结果。
实施例3-4.通过IP和IB验证MP1单克隆抗体的抗原鉴定结果
在上述实验中，通过蛋白质印迹再次确定了MP1单克隆抗体识别MUC1作为抗原。与实施例3-2中描述的相同，制备各种胰腺癌细胞系、BXPC3、Capan-1、Capan-2、PANC1、裂解溶液，并使用商业化MUC1抗体(BioXCell，目录号：C595(NCRC48))和MP1单克隆抗体分别与Protein-G琼脂糖凝胶在4℃混合4小时，然后用1×PBS洗涤两次，然后加入先前制备的裂解物并在4℃混合4小时，然后用1×PBS洗涤两次。将由此获得的免疫复合物煮沸10分钟，然后在8％SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，并转移至Immobilon P膜(Millipore Corporation，Billerica，MA，USA)。之后，将纯化的MP1单克隆抗体处理到膜上，然后在ECL系统(GEHealthcare，Buckinghamshire，UK)中显色以确认条带。对于用MP1抗体对通过使商业化MUC1抗体和胰腺癌细胞系反应而获得的免疫复合物进行蛋白质印迹的结果，可以在300kDa位置确认条带，与单独是Capan-2裂解物以及MP1和胰腺癌细胞系裂解物的免疫复合物样品相同。图6是通过蛋白质印迹确定抗MP1单克隆抗体的抗原是MUC1的结果。
实施例4：细胞表面抗原的定量
使用用于测量细胞表面抗原的定量流式细胞术试剂盒QIFIKIT(Dako，目录号：K0078)。细胞系的抗体结合亲和力(ABC)可以通过计算图比较珠的平均荧光强度(MFI)来计算。图7A示出了使用针对MP1单克隆抗体的QIFIKIT在各种胰腺癌细胞系(AsPC1、BxPC3、Capan-1、Capan-2、PANC1)的细胞表面上检测到的与MP1反应的抗原的表达水平的结果。
实施例5：表位定位
以下是用于表位定位的MUC-1抗原的部分序列(氨基酸序列第895位至第1264位氨基酸)(表11)。通过筛选包含用于抗原鉴定验证的重组MUC-1抗原的氨基酸序列的区域，使用环状肽阵列进行表位定位。
如在图7B中可以确定的，MP1抗体以剂量依赖性方式与包含PAHGVTS序列的肽结合，因此，MP1的抗原结合位点，即表位被鉴定为PAHGVTS(SEQ ID NO：109)。
[表11]
实施例6：MP1抗体可变区序列和同种型分析
实施例6-1.同种型测定
为了确定实施例1中制备的MP1单克隆抗体的同种型，使用小鼠免疫球蛋白同种型ELISA试剂盒(BD Biosciences，USA)对其进行分析。结果，MP1单克隆抗体被鉴定为小鼠IgG2a/κ轻链。
实施例6-2.MP1抗体可变区序列分析
使用Mouse Ig-Primer Set(Merck Millipore，目录号：69831)克隆MP1抗体基因。使用Mouse Ig-Primer Set对从MP1杂交瘤中分离的RNA进行PCR，并将其插入pGEM-T载体(Promega，目录号：A3600)，然后通过测序确认DNA碱基序列，通过IMGT位点(www.imgt.org)确认小鼠抗体基因。表12示出了MP1抗体重链和轻链可变区的分析序列。下文描述的氨基酸序列中的粗下划线部分代表互补决定区。在下面的表12中，序列位置是根据Kabat编号体系写的。
[表12]
实施例7：MP1人源化抗体的开发
在制备双特异性抗体之前，当将鼠源抗体施用到人体中时，制备其中MP1可变区和其它部分被人Fc取代的人源化抗体，以降低由人抗小鼠抗体(HAMA)反应显示的免疫原性，并确保抗体具有高的成药性。确定了所筛选的人源化抗体与原始鼠源MP1抗体具有相似的抗原特异性和亲和力。
实施例7.1通过计算机人源化筛选重组抗体序列
小鼠抗体MP1的重链和轻链各自的CDR区序列(重链氨基酸序列：SEQ ID NO：77；轻链氨基酸序列：SEQ ID NO：87)是VH-CDR1：SEQ ID NO：2(DYWMN)；VH-CDR2：SEQ ID NO：8(QIRNKPYNYETYYSNSVKG)；VH-CDR3：SEQ ID NO：17(AMITSDGYAMDY)；VL-CDR1：SEQ ID NO：20(KSSQSLLLSSNQKNYLA)；VL-CDR2：SEQ ID NO：28(WASTRES)；VL-CDR3：SEQ ID NO：34(QQCFSYPLT)。基于编码人源抗体基因的种系序列，通过计算机方法重组框架区的序列区域，筛选具有相同或优异抗原结合亲和力同时尽可能相似地保持小鼠抗体MP1重链和轻链氨基酸序列的人源化抗体。由于与小鼠抗体MP1的重链和轻链的每个序列具有最高的相似性，用作人源化重组抗体序列的骨架的人源抗体种系基因如下表13所示。
所选人源化抗体的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列的氨基酸序列示出在下表14中。下文描述的氨基酸序列中的粗下划线部分代表互补决定区。
[表13]
[表14]
实施例7.2人源化重组抗体的表达与分析
将上表14的9种重链(包括VH1至VH9)和9种轻链(VL1至VL9)的表达基因对应的氨基酸序列进行密码子优化以合成DNA序列，并且使用合成的DNA，通过重叠PCR将它们与人Fc区基因(重链的人IgG1 Fc基因，轻链的人Igκ恒定基因)连接，以将它们克隆到ExpiCHO-S表达系统试剂盒(Gibco，美国)中包含的pcDNA3.4载体中。使用ExpiCHO-S表达系统试剂盒(Invitrogen/Life technologies)将表达制造的人源化MP1抗体的轻链和重链的质粒转染到ExpiCHO-S细胞系中，以产生48孔规模的瞬时表达。
使用表达的人源化抗体培养液，1)通过对胰腺癌细胞系Capan-2染色来确认细胞表面结合的存在与否，以及2)通过抗人Ig抗体夹心ELISA来确认人源化抗体表达的存在与否。在总共81种重链和轻链组合中(即，包含重链和轻链的抗体组合，所述重链包含选自表14所示的9种重链可变区中的任意一种重链可变区，以及所述轻链包含选自表14所示的9种轻链可变区中的任意一种轻链可变区)，可以确定人源化抗体组合显示出与原始小鼠抗体或嵌合抗体的细胞表面结合的相似模式，并且可以基于确定瞬时表达的人源化抗体的表达水平的夹心ELISA结果，确定抗体被整体表达(表15)。
[表15]
在上表15中，细胞表面结合(％)表示与阴性对照组相比，抗体与细胞表面结合的阳性率％，表达(夹心ELISA)是夹心ELISA的450nm OD值。
在上表15中制备的81种抗体中，示出了20种具有高Capan-2细胞表面结合(％)的抗体。如可在表12中确定的，VH8/VL3(包含含有表14的重链可变区VH8的重链和含有表14的轻链可变区VL3的轻链的抗体；下文同上)，VH1/VL5、VH4/VL4、VH4/VL5、VH1/VL4、VH8/VL4、VH1/VL2、VH7/VL4、VH7/VL3、VH8/VL2、VH4/VL8和VH4/VL7抗体显示出优异的Capan-2细胞表面结合。
在初次瞬时表达中具有高阳性的人源化抗体重链和轻链组合的抗体基因从48孔扩大到6孔规模，从而再次进行瞬时表达，然后再次确认与Capan-2胰腺癌细胞系的结合能力(图8)。
如图8所示，在VH1/VL5、VH4/VL4、VH4/VL5、VH1/VL4、VH1/VL2和VH7/VL4抗体中，Capan-2细胞表面结合极好。
实施例8.体外功效：T细胞结合双特异性抗体/形式优化
实施例8-1.使用人源化MP1抗体表达T细胞结合双特异性抗体
在各种双特异性抗体形式中，表达了四价双特异性抗体，其显示T细胞活性和高抗癌功能，同时具有Fc区，因此保持接近原始抗体的半衰期。用于T细胞活性的抗CD3抗体使用显示T细胞活性的OKT3抗体的人源化抗体可变区。人源化OKT3抗体的序列是从美国专利20090202532 A1中引用和使用的，它是对应于下表13中SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105和SEQ ID NO：106的序列。SEQ ID NO：103是人源化OKT3抗体重链可变区的氨基酸序列，SEQID NO：104是人源化OKT3抗体轻链可变区的氨基酸序列，SEQ ID NO：105代表人源化OKT3抗体scFv抗体的氨基酸序列。人源化OKT3抗体由在重链可变区序列和轻链可变区序列之间用[GGGS]n＝5接头连接的单链Fv(scFv)组成，并且用[GGGS]n＝3接头连接到人源化MP1抗体的轻链N端(LCN型)或C端(LCC型)。
对于人源化OKT3 scFv，为了通过诱导结构域间二硫键来增加稳定性，重链可变区的第44位甘氨酸和轻链可变区的第100位甘氨酸被替换为半胱氨酸(ProteinEngineering，Design&Selection vol.25 no.7pp.321-329，2012)。
为了将其表达为双特异性抗体，将人源化MP1重链基因(编码上表11中VH1至VH9的任一重链的基因)质粒和LCN或LCC型人源化MP1轻链-OKT3scFv基因(编码包含上表11中VL4或VL5的轻链互补决定区的轻链序列的基因-OKT3scFv基因)质粒以1：1.7的比例转染到ExpiCHO-S细胞中。7天或10天后，使用转染的双特异性抗体培养液，进行抗体表达(使用抗人Ig的夹心ELISA)、细胞系结合(细胞表面染色和流式细胞术分析)和细胞毒性测定，并通过蛋白A亲和层析法纯化活性得到确定的双特异性抗体培养液。
上面制备的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体的序列(抗MU1抗体的轻链序列和抗CD3抗体的scFv序列)如下表13所示。将抗CD3抗体(OFT3-scFv)结合到抗MUC1抗体轻链的C端的形式表示为LCC，并将其结合到轻链的N端的形式表示为LCN。
在下表16中，LCC型的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体(见图9)，LCC型人源化MP1轻链#4-OKT3scFv代表抗MUC1/抗CD3双特异性抗体的轻链序列(SEQ ID NO：112)，其中人源化OKT3scFv抗体(SEQ ID NO：106)与包含表14的轻链4号(VL4)的轻链可变区(SEQ ID NO：91)的轻链序列(SEQ ID NO：110)的C端结合。LCC型人源化MP1轻链#5-OKT3scFv代表抗MUC1/抗CD3双特异性抗体的轻链序列(SEQ ID NO：113)，其中人源化OKT3scFv抗体(SEQ ID NO：106)与包含表14的轻链5号(VL5)的轻链可变区(SEQ ID NO：92)的轻链序列(SEQ ID NO：111)的C端结合。
在下表16中，LCN型抗MUC1/抗CD3双特异性抗体(见图12)，LCN型人源化MP1轻链#4-OKT3scFv代表抗MUC1/抗CD3双特异性抗体的轻链序列(SEQ ID NO：114)，其中人源化OKT3scFv抗体(SEQ ID NO：106)与包含表14的轻链4号(VL4)的轻链可变区(SEQ ID NO：91)的轻链序列(SEQ ID NO：110)的N端结合。LCN型人源化MP1轻链#4-OKT3scFv代表抗MUC1/抗CD3双特异性抗体的轻链序列(SEQ ID NO：115)，其中OKT3scFv抗体(SEQ ID NO：106)与包含表14的轻链5号(VL5)的轻链可变区(SEQ ID NO：92)的轻链序列(SEQ ID NO：111)的C端结合。
在抗MUC1/抗CD3双特异性抗体的4种轻链序列中，抗MUC1抗体和人源化OKT3scFv抗体的轻链用[GGGS]n＝3接头连接。对于抗MUC1/抗CD3双特异性抗体的重链，其使用包含表14的重链1号至重链9号的重链可变区(SEQ ID NO：78至SEQ ID NO：86)的重链序列。
[表16]
实施例8-2.LCC型人源化MP1双特异性抗体的功能分析
对于实施例8-1中制备的LCC型抗MUC1/抗CD3双特异性抗体，对MUC1抗原阳性的AsPC1胰腺癌细胞进行表面结合亲和力和细胞毒性测定。通过使用抗人Ig/抗人Ig-HRP的夹心ELISA，确定抗MUC1/抗CD3双特异性抗体在蛋白质水平上表达(表17)，并且通过细胞表面染色和流式细胞术确定这些双特异性抗体与MUC1抗原AsPC1阳性的胰腺癌细胞结合(图10)。
作为对照组，使用抗间皮素/OKTscFv人源化双特异性抗体(MSTN-OKT3)。MSTN-OKT3是LCC类型的双特异性抗体，其中使用国际公开出版物(WO 2012/087962)中描述的h7D9.v3抗体的序列，将人源化OKT3 scFv序列(SEQ ID NO：106)结合到h7D9.v3抗体的轻链的C端。
[表17]
抗体 表达 抗体 表达
VH1/VL5 2.4501 VH1/VL4 1.8550
VH2/VL5 1.4389 VH2/VL4 1.2238
VH3/VL5 1.5525 VH3/VL4 1.2721
VH4/VL5 2.2260 VH4/VL4 1.5691
VH5/VL5 1.2155 VH5/VL4 0.7501
VH6/VL5 1.3825 VH6/VL4 0.9205
VH7/VL5 2.1425 VH7/VL4 1.5371
VH8/VL5 1.7722 VH8/VL4 1.6626
VH9/VL5 1.2984 VH9/VL4 1.0687
在上表17中，表达(夹心ELISA)是夹心ELISA的450nm OD值，在一个实施方案中，抗体“VH1/VL5”是指包含重链和轻链的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体，所述重链包含表14中的1号重链(VH1)的重链可变区(SEQ ID NO：78)，并且所述轻链(SEQ ID NO：113)其中的人源化OKT3 scFv抗体(SEQ ID NO：106)结合到表14中的5号轻链(VL5)的轻链可变区(SEQ ID NO：92)的C端。
尽管在上表17中，抗体已表达，但它们在图10的流式细胞仪中显示为阴性，这是因为原始抗体的亲和力在人源化抗体结合过程中丧失了。此外，如可在图10中确定的，在双特异性抗体组合中，同时表达4号轻链-OKT3 scFv抗体的双特异性抗体组合(即，包含重链和轻链的双特异性抗体，所述重链包含表14的1号重链至9号重链中的任何一个重链可变区，并且人源化OKT3 scFv抗体结合到4号轻链的轻链可变区的C端)显示全部细胞表面结合，但是在一起表达5号轻链-OKT3 scFv抗体的双特异性抗体组合中，只有1号重链/5号轻链、2号重链/5号轻链和7号重链/5号轻链的组合显示细胞表面结合。
对于表达的双特异性抗体，使用Capan-2和AsPC-1细胞系作为靶细胞，并使用人T细胞作为效应细胞进行细胞毒性测定。靶细胞和效应细胞的比例设定为1：10，双特异性抗体的输入量相同，为1ug/ml。48小时后，使用EZ-Cytox(DogenBio，目录号：EZ-1000)测量靶细胞的死亡，并使用以下公式计算细胞毒性％，如图11所示。
％细胞毒性＝(1-(抗体施用孔测量值/靶细胞和效应细胞孔测量值))×100
如在图11中可以确定的，作用没有很好地显示，因为在实施例8-2中制备的LCC型抗MUC1/抗CD3双特异性抗体比对照抗体(MSTN-OKT3)具有更低的作用，并且细胞毒性小于30％。
实施例8-3.LCN型人源化MP1双特异性抗体的功能分析(1)
对于实施例8-1中制备的LCN型抗MUC1/抗CD3双特异性抗体，对MUC1抗原阳性的胰腺癌细胞Capan-1、AsPC1进行了表面结合能力和细胞毒性测定。
通过使用抗人Ig/抗人Ig-HRP的夹心ELISA，确定了如上表16所示的LCN型抗MUC1/抗CD3双特异性抗体在蛋白质水平上表达，并且通过染色和流式细胞术确定了这些双特异性抗体与MUC1抗原阳性的胰腺癌细胞Capan-1和AsPC1的结合。
这样的结果如图13和图14所示。作为对照组，使用包含重链和轻链的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体(chi/4)，所述重链包含表12的小鼠MUC1抗体的重链可变区(SEQ ID NO：77)，所述轻链中人源化OKT3 scFv抗体结合到包含表14的4号轻链(VL4)的轻链可变区(SEQID NO：91)的轻链序列(SEQ ID NO：110)的N端。
如图13和图14所示，确定了1号重链/4号轻链组合的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体(“1/4”，即包含重链和轻链的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体，所述重链包含表14的1号重链(VH1)的重链可变区(SEQ ID NO：78)，以及轻链(SEQ ID NO：114)，并且所述轻链(SEQ IDNO：114)其中的人源化OKT3 scFv抗体(SEQ ID NO：106)结合到表14中的4号轻链(VL4)的轻链可变区(SEQ ID NO：91)的N端；下同。)，与对照组相比，4号重链/4号轻链(“4/4”)、7号重链/4号轻链(“7/4”)对癌细胞具有优异的毒性作用。
该结果表明，LCN型双特异性抗体(实施例8-3)可以通过维持癌细胞和T细胞之间更紧密的微距而结合，这比LCC型双特异性抗体(实施例8-2)更容易表现出细胞毒性，并且通过这一点，它可以表现出更高的细胞毒性。
实施例8-4.LCN型人源化MP1双特异性抗体的功能分析(2)
对于在实施例8-1中制备的LCN型抗MUC1/抗CD3双特异性抗体，对于对MUC1抗原呈阳性的AsPC-1和Capan-2(胰腺癌细胞系)、SNU-601(胃癌细胞系)和T47D(乳腺癌细胞系)细胞系进行细胞毒性测定，并且确定了体外细胞毒性作用，结果示出在图15中。
对于抗MUC1/抗CD3双特异性抗体，使用了具有更高人源化比例的1号重链/5号轻链的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体，即包含含有表14的1号重链(VH1)的重链可变区(SEQ IDNO：78)的重链以及其中人源化OKT3 scFv抗体(SEQ ID NO：106)连接表14中的5号轻链(VL5)的轻链可变区(SEQ ID NO：92)的N端的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体。
如图15所示，确定了所示的抗癌细胞的细胞毒性作用与所施用的LCN型抗MUC1/抗CD3双特异性抗体的浓度成比例。
实施例9：利用胰腺癌小鼠实验模型评价人源化双特异性抗体的治疗效果
为了确定抗MUC1/抗CD3双特异性抗体的体内免疫抗癌效果，对移植了人源胰腺癌细胞系AsPC-1的NOG小鼠动物模型，评价肿瘤的大小是否通过施用抗MUC1/抗CD3双特异性抗体而被减小。对于抗MUC1/抗CD3双特异性抗体，使用与实施例8-4中使用的抗体相同的抗体(LCN型1号重链/5号轻链组合的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体)。
小鼠模型制备
为了通过大量人免疫细胞来评价抗体的抗癌效果，对于小鼠，使用了缺失T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞以及树突状细胞功能的NOG小鼠(NOD/Shi-scid、IL-2RγKO小鼠、Koatech)。将5×106的胰腺癌细胞系AsPC-1经皮下注射(经腹膜内注射)至8周龄的NOG小鼠的侧腹，1周至2周后，在每组中选择5只形成了100mm3至150mm3肿瘤体积的小鼠并将其用于实验。
人PBMC制备
在注射抗体前10天，将包含10％FBS的RPMI1640(GeneDireX，目录号：CC112-0500)与购自Zenbio公司的冷冻保存的人外周血单核细胞(PBMC)解冻，然后在第1天，用250ng/ml的IFN-r(jw creagene，目录号：HIFNG-100)处理，在第2天，加入30ng/ml的IL-2(jwcreagene，JW-H031-0100)、50ng/ml的OKT3抗体(Miltenyi Biotec，目录号：130-093-387)，然后放置5天。此后，通过在RPMI1640培养基(其中从培养的第6至第16天添加了10％FBS)中培养30ng/ml的IL-2、50ng/ml的IFN-r以扩增PBMC的数量。
人源化MP1双特异性抗体抗癌效果的评价
将形成肿瘤的NOG小鼠分成6组，在第0天，将200μl的PBS经腹膜内注射到一组中，将5×106个细胞的PBMC经腹膜内注射到5组小鼠中的每只小鼠(换句话说，用1×PBS制备悬浮液，使得其为5×106个细胞/0.2mL并经腹膜内注射)。然后，将抗MUC1/抗CD3双特异性抗体与PBMC分别以1mg/kg、3mg/kg注射到4组小鼠中，在第3天、第7天、第10天和第14天总共4次静脉注射(I.V.)后，观察并测量经皮下注射的癌细胞的大小。
图16示出了在人源化条件下使用注射了PBMC的抗MUC1/抗CD3双特异性抗体在小鼠胰腺癌动物模型中的体内抗癌功效的结果。与仅施用PBMC的组(对照-PBMC)相比，施用抗体的组(MP1-1mg/kg和MP1-3mg/kg)显示出了更高的抗癌效果(肿瘤生长抑制；TGI)。根据以上所述，本发明所属领域的技术人员将理解，本发明可以以其他特定形式实施，而不改变其技术精神或基本特征。
在这点上，上述实施例应该被理解为在所有方面都是说明性，而不是非限制性的。本发明的范围应该被解释为从下文所述的权利要求的含义和范围衍生出的所有改变或修改的形式，并且其等效概念也包含在本发明的保护范围内。

Claims (19)

1.一种抗MUC1(黏蛋白-1)抗体或其抗原结合片段，包含
具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)，
具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)，
具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，
具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)，
具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)，和
具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)。
2.根据权利要求1所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，包含
具有选自SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)，
具有选自SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：15的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)，
具有选自SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，
具有选自SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：26的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)，
具有选自SEQ ID NO：28至SEQ ID NO：32的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)，和
具有选自SEQ ID NO：34至SEQ ID NO：38的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)。
3.根据权利要求1所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，包含
包含选自SEQ ID NO：77至SEQ ID NO：86的氨基酸序列的重链可变区；和
包含选自SEQ ID NO：87至SEQ ID NO：96的氨基酸序列的轻链可变区。
4.根据权利要求1所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗MUC1抗体或抗原结合片段具有诱导表达MUC1的癌细胞凋亡的活性。
5.根据权利要求1所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗MUC1抗体是单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，其特异性识别包含SEQ IDNO：109的氨基酸序列的肽。
7.根据权利要求1所述的抗MUC1抗体生物片段或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自抗MUC1抗体的scFv、(scFv)2、Fab、Fab’和F(ab’)2。
8.根据权利要求1所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗MUC1抗体是鼠源抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体或人源抗体。
9.一种双特异性抗体，其包含权利要求1至8中任一项所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，以及对T细胞活化抗原特异的至少一个抗原结合位点。
10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述T细胞活化抗原是CD3 T细胞协同受体(CD3)抗原。
11.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含抗CD3抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段包含针对CD3抗原的抗原结合位点，
其中抗CD3抗体或其抗原结合片段为
OKT3抗体或其抗原结合片段、UCHT-1抗体或其抗原结合片段或SP34抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求11所述的双特异性抗体，其中所述抗CD3抗体或其抗原结合片段与抗MUC1抗体或其抗原结合片段的C端或N端相连。
13.根据权利要求11所述的双特异性抗体，其中抗CD3抗体的抗原结合片段选自抗CD3抗体的scFv、(scFv)2、Fab、Fab'和F(ab’)2。
14.根据权利要求11所述的双特异性抗体，其中所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含
具有SEQ ID NO：97的氨基酸序列的多肽(VH-CDR1)，
具有SEQ ID NO：98的氨基酸序列的多肽(VH-CDR2)，
具有SEQ ID NO：99的氨基酸序列的多肽(VH-CDR3)，
具有SEQ ID NO：100的氨基酸序列的多肽(VL-CDR1)，
具有SEQ ID NO：101的氨基酸序列的多肽(VL-CDR2)，和
具有SEQ ID NO：102的氨基酸序列的多肽(VL-CDR3)。
15.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求9至14中任一项所述的双特异性抗体。
16.根据权利要求15所述的用于预防或治疗癌症的药物组合物，其中所述癌症为选自血癌、骨髓癌、甲状腺癌、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和胰腺癌的至少一种癌症。
17.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至8中任一项所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求9至14中任一项所述的双特异性抗体。
18.一种重组载体，其包含根据权利要求17所述的多核苷酸。
19.一种重组细胞，其包含根据权利要求18所述的重组载体。
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