CN119055829B - 一种丝素肽纳米载药微晶及其制备方法、广谱抗氧化丝素非对称水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种丝素肽纳米载药微晶及其制备方法、广谱抗氧化丝素非对称水凝胶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种丝素肽纳米载药微晶及其制备方法、广谱抗氧化丝素非对称水凝胶及其制备方法和应用，涉及复合材料技术领域。本发明提供的丝素肽纳米载药微晶，包括丝素肽纳米微晶以及负载在所述丝素肽纳米微晶内的芹菜素‑7‑O‑葡萄糖苷。本发明提供的丝素肽纳米载药微晶具有抗炎、抗氧化作用，生物安全性高，可以降解，来源广泛，可以规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及复合材料技术领域，具体涉及一种丝素肽纳米载药微晶及其制备方法、广谱抗氧化丝素非对称水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病皮肤溃疡是慢性难愈合创面，往往导致坏疽，截肢甚至增加了死亡的风险，也是全球患者残疾的重要原因。糖尿病皮肤溃疡微环境中存在大量的活性氧（ROS），过量的ROS诱导免疫细胞长期浸润，进而产生更多的ROS，使创面微环境氧化与抗氧化作用失衡，即创面微环境长期处在氧化应激状态。氧化应激反应、炎症升高（如IL-6、TNF-α等炎症因子高表达）、内皮功能障碍和血液高凝状态的综合结果造成糖尿病微血管病变和大血管病变的不可逆损伤。另外，氧化应激反应对周神经的血液供应、结构和代谢产生不利影响，这会导致周神经系统（包括雪旺细胞、有髓轴突和位于背根神经节的感觉神经元）产生严重病变。轴突富含线粒体，为神经提供直接的能量供应，同时，轴突的三磷酸腺苷（ATP）供应不足可能会失去运输能力，从而进一步促进轴突损伤，导致糖尿病神经病变恶化。在ATP供应不足的情况下，过度氧化应激解毒能力的丧失导致高血糖患者轴突氧化应激损伤，从而导致轴突变性或凋亡。血管病变和神经病变导致糖尿病皮肤溃疡愈合延迟，糖尿病不愈合的创面更容易发生感染，进一步加剧创面的不愈合。因此，亟需开发能减轻ROS不利影响，保持氧化与抗氧化作用平衡的生物材料或者药物用于治疗糖尿病皮肤溃疡。
常态时细胞内的氧化还原平衡是依赖抗氧化酶维持的。然而天然酶通常涉及蛋白质和RNA分子，它们易受环境因素影响，在病理条件下变得不活跃或者失去抗氧化的功能。目前一些抗氧化药在临床上用于治疗糖尿病患者慢性创面，例如，阿魏酸是一种源自水果和蔬菜的天然抗氧化生物材料，可抑制脂质被氧化，增加过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽酶和血清锌、铜的表达，可有效改善糖尿病溃疡的愈合过程；α-脂肪酸通过清除ROS、内源性和外源性抗氧化剂的再生、氧化蛋白的修复和基因转录调控来抑制糖尿病神经病变的发展，它在临床上被广泛应用于糖尿病微血管病的治疗。尽管这些药物在治疗糖尿病皮肤溃疡的过程中取得一些效果，但是临床上通过全身给药进行治疗，药物用量很大而且存在许多副作用。近些年来，随着纳米技术的不断发展，很多人工合成的“纳米酶”被广泛的应用到抗氧化作用的研究。研究者发现具有纳米结构的“纳米酶”可以高效稳定清除体内过高的ROS。然而，现有的纳米材料大多是不可降解材料，进入体内存在潜在的危险。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种丝素肽纳米载药微晶及其制备方法、广谱抗氧化丝素非对称水凝胶及其制备方法和应用，本发明提供的丝素肽纳米载药微晶具有抗炎、抗氧化作用，生物安全性高，可降解。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种丝素肽纳米载药微晶，包括丝素肽纳米微晶以及负载在所述丝素肽纳米微晶内的芹菜素-7-O-葡萄糖苷。
优选地，所述丝素肽纳米微晶和芹菜素-7-O-葡萄糖苷的质量比为1：0.01~0.5。
本发明提供了上述技术方案所述丝素肽纳米载药微晶的制备方法，包括以下步骤：将芹菜素-7-O-葡萄糖苷溶液与丝素肽纳米微晶溶液混合，进行自组装，得到丝素肽纳米载药微晶。
本发明提供了一种广谱抗氧化丝素非对称水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将丝素肽纳米载药微晶的溶液、丝素蛋白溶液和纳米银溶液混合，得到混合溶液；所述丝素肽纳米载药微晶为上述技术方案所述丝素肽纳米载药微晶或上述技术方案所述制备方法制备得到的丝素肽纳米载药微晶；
对所述混合溶液施加电压，得到广谱抗氧化丝素非对称水凝胶。
优选地，所述丝素肽纳米载药微晶和丝素蛋白溶液中的丝素蛋白的质量比为0.02~0.2：1。
优选地，所述丝素肽纳米载药微晶和纳米银溶液中的纳米银的质量比为2~20：1~10。
优选地，所述混合包括：将丝素肽纳米载药微晶的溶液滴加到丝素蛋白溶液中，再加入纳米银溶液。
优选地，所述电压为10~100V；所述施加电压的时间为30~300min。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶，所述广谱抗氧化丝素非对称水凝胶具有致密面和疏松面；所述致密面的孔隙率为20~40%；所述疏松面的孔隙率为50~80%。
本发明提供了上述技术方案所述广谱抗氧化丝素非对称水凝胶在制备敷料中的应用。
本发明提供的丝素肽纳米载药微晶具有抗炎、抗氧化作用，生物安全性高，可降解。
本发明通过层层自组装技术将芹菜素-7-O-葡萄糖苷（AG）用丝素肽负载起来，制备成丝素肽纳米载药微晶（β-纳米载药微晶，命名为β-crystallite/AG）。本发明提供的丝素肽纳米载药微晶的制备方法，原料来源广泛，工艺简单，操作简单，可以规模化生产，生产成本低。
本发明将β-crystallite/AG溶液、丝素蛋白溶液和纳米银溶液混合，加入匀强电场，制备成富含β-折叠结构ROS响应的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶。本发明制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶一面拓扑结构致密，一面疏松。致密结构以防止创面水分过分蒸发，阻止空气中的微生物侵入创面，从而降低了创面二次感染的风险；疏松面具有互穿孔道结构，疏松多孔结构不仅可以快速吸收了多余的体液，而且还有利于氧气和营养物质向创面输送。通过拓扑结构、力学性能、药物控制与释放功能、抗菌功能和生物相容性评价SF@β-crystallite/AG-Ag的理化性能。清除ROS三种代表性自由基(过氧化氢、羟基自由基和超氧阴离子)的能力、胞内ROS清除能力和细胞水平抗炎评价。用Ⅱ型糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型评价SF@β-crystallite /AG-Ag治疗糖尿难愈合创面修复效果。本研究为临床治疗糖尿病难愈合创面提供了新的方法和治疗策略。
本发明制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶在不干扰内源性抗氧化作用的情况下清除胞内过量ROS，重建氧化还原稳态，避免细胞受到损伤；可有效的改善糖尿病难创面微环境氧化应激反应，降低炎症反应，促进糖尿病皮肤组织中血管再生，加速糖尿病创面的愈合，具有良好的抗菌性能。所述广谱抗氧化丝素非对称水凝胶使用简单、生物安全性高、可以有效清除过量ROS，在治疗糖尿病溃疡中具有重要的潜能。
附图说明
图1为实施例1制备的含有丝素肽纳米载药微晶的胶体状白色溶液的表征图，其中，A为红外光谱图，B为原子力显微镜图，C为透射电镜图；
图2为实施例1制备的纳米银溶液的透射电镜图；
图3为实施例1制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶（SF@β-crystallite/AG-Ag）的拓扑结构表征，其中，A为疏松面，B为致密面；
图4为实施例1制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶力学性能测试；
图5为实施例1制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶药物和纱布-AG-Ag的释放曲线；
图6为实施例1制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶、SF@β-crystallite、SF和control的生物安全性检测结果图，其中，A为细胞毒性，B为皮内致敏性；
图7为实施例1制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶清除过氧化氢的能力；
图8为实施例1制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶清除羟基自由基的能力；
图9为实施例1制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶清除超氧阴离子的能力；
图10为实施例1制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶清除胞内ROS的能力，其中，A为胞内活性氧荧光图，B为胞内活性氧荧光强度统计图；
图11为实施例1制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶治疗糖尿病大鼠全层皮肤损伤实物照片；
图12为丝素肽纳米载药微晶的制备流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种丝素肽纳米载药微晶，包括丝素肽纳米微晶以及负载在所述丝素肽纳米微晶内的芹菜素-7-O-葡萄糖苷。
在本发明中，所述丝素肽纳米微晶的尺寸优选为50~400nm，更优选为150~200nm。在本发明中，所述丝素肽是特定氨基酸重复序列组成天然丝素蛋白的结晶区部分，这些重复的氨基酸序列可以组装成β-折叠，β-折叠有序排列自组装成纳米微晶，丝素肽自组装的纳米β-微晶可以被ROS氧化变成无规则卷曲结构溶解在水里，该纳米微晶可以作为ROS响应的纳米载药缓释系统，其中，丝素肽的氨基酸序列已有报道。
在本发明中，所述丝素肽纳米微晶和芹菜素-7-O-葡萄糖苷的质量比优选为1：0.01~0.5，更优选为1：0.1~0.3。
在本发明中，所述丝素肽纳米载药微晶的粒度优选为50~500nm，更优选为60~100nm。在本发明中，所述丝素肽纳米微晶优选为波纹层状，所述丝素肽纳米微晶内的芹菜素-7-O-葡萄糖苷优选负载在相邻两层丝素肽纳米微晶之间。
本发明提供了上述技术方案所述丝素肽纳米载药微晶的制备方法，包括以下步骤：将芹菜素-7-O-葡萄糖苷溶液与丝素肽纳米微晶溶液混合，进行自组装，得到丝素肽纳米载药微晶，制备流程图见图12。
若无特殊说明，本发明使用的材料和设备均为本领域市售商品。
本发明用丝素肽作自组装技术将芹菜素-7-O-葡萄糖苷负载到丝素肽纳米微晶上制备成纳米载药系统，该系统对芹菜素-7-O-葡萄糖苷具有保护作用，还具备ROS响应性。
在本发明中，所述芹菜素-7-O-葡萄糖苷溶液的制备方法优选包括：将蓝刺头粉末（干燥的）与乙醇水溶液混合，进行提取，得到提取液；将所述提取液进行浓缩，得到浸膏；将所述浸膏冻干，得到冻干粉；将所述冻干粉复溶，将所得冻干粉溶液进行高效液相色谱-串联质谱分离，得到芹菜素-7-O-葡萄糖苷。
本发明将蓝刺头粉末（干燥的）与乙醇溶液混合，进行提取，得到提取液。在本发明中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数优选为30~100%，更优选为50~75%；所述蓝刺头粉末（干重）和乙醇溶液的用量比优选为1kg：1~10L，更优选为1kg：2~5L。在本发明中，所述提取的温度优选为25~80℃，更优选为50~60℃；所述提取的时间优选为6~20 h，更优选为12~20h；所述提取优选在搅拌条件下进行。
完成所述提取后，本发明优选还包括将所得提取体系进行固液分离，得到提取液。本发明对于所述固液分离没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如过滤；所述固液分离的目的是去除残渣。
得到提取液后，本发明将所述提取液进行浓缩，得到浸膏。在本发明中，所述浓缩优选包括旋蒸；所述旋蒸的温度优选为25~80℃，更优选为60~80℃；所述旋蒸的时间优选为2~10h，更优选为4~5h。
得到浸膏后，本发明将所述浸膏冻干，得到冻干粉。在本发明中，所述冻干的温度优选为-50~25℃，更优选为-20℃；所述冻干的时间优选为48~96h，更优选为60h。
得到冻干粉后，本发明将所述冻干粉复溶，将所得冻干粉溶液进行高效液相色谱-串联质谱分离，得到芹菜素-7-O-葡萄糖苷。在本发明中，所述冻干粉溶液的浓度优选为20~100 mg/mL，更优选为50~80mg/mL；所述冻干粉溶液中的溶剂优选包括低级醇水溶液，所述低级醇水溶液中低级醇的体积分数优选为20~100%，更优选为30~90%，进一步优选为40~50%；所述低级醇优选包括甲醇和/或乙醇。在本发明中，所述高效液相色谱-串联质谱分离的条件优选包括：高效液相色谱-串联质谱分离条件：采用Vanquish UHPLC(ThermoScientific, Waltham, MA)超高效液相色谱系统结合ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm ×100 mm, 1.8 µm)色谱柱进行分离，柱温为35℃；流速为0.3 mL/min；流动相：流动相A为0.1v/v%甲酸水溶液，流动相B为0.1v/v%甲酸-乙腈；洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。采用Q-Exactive HFX质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集，Q-Exactive HFX质谱仪样品与UHPLC系统联用，电喷雾电离(ESI)正、负两种离子模式分别进行质谱采集，喷雾电压为3800V(ESI+)/3500V(ESI-)，鞘气压力为45arb，辅助气压力为20arb，离子传输管温度为320℃，雾化温度为350℃；检测方式为全扫描/数据依赖二级扫描(Full-MS/dd-MS2)模式，一级和二级分辨率分别为60000和15000，top 10 MS1离子获得MS/MS谱图，碰撞能量(CEs)。采用阶梯归一化能级20、40、60；一级质荷比扫描范围90~1300。精密吸取EC-sp溶液2 μL，LC-MS进样分析，EC-sp样品重复进样5次。
表1 梯度洗脱程序
芹菜素-7-O-葡萄糖苷（AG）是蓝刺头抗炎的主要有效成分，可以加速创伤部位快速修复。AG具有良好的抗氧化和抗炎作用，加速巨噬细胞从M1到M2的募集和极化，不仅可以减少损伤部位的炎症细胞浸润，还可以促进血管生成和加速创面修复。本发明将AG通过自组装技术制备成糖尿病皮肤溃疡敷料，通过AG调节糖尿病皮肤溃疡处微环境的炎症反应和ROS含量，加速糖尿病难愈性溃疡的损伤修复。
在本发明中，所述芹菜素-7-O-葡萄糖苷溶液的浓度优选为10μmol/L~10mmol/L，更优选为1~5mmol/L，更优选为2~3mmol/L。在本发明中，所述芹菜素-7-O-葡萄糖苷溶液中的溶剂优选为磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液）；所述PBS溶液的pH值优选为7。
在本发明中，所述丝素肽纳米微晶溶液的制备方法优选包括：将丝素肽纳米微晶溶于PBS溶液中，得到丝素肽纳米微晶溶液。在本发明中，所述PBS溶液的pH值为7。在本发明中，所述丝素肽纳米微晶溶液的浓度优选为100μmol/L~10mmol/L，更优选为1~8mmol/L，更优选为4~5mmol/L。
在本发明中，所述芹菜素-7-O-葡萄糖苷溶液与丝素肽纳米微晶溶液的体积比优选为0.02~1：1，更优选为0.5~1.5：1，进一步优选为1:1。
本发明对于所述芹菜素-7-O-葡萄糖苷溶液与丝素肽纳米微晶溶液混合没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。
在本发明中，所述自组装的温度优选为25~60℃，更优选为37~50℃；所述自组装优选在摇床上进行；所述摇床的转速优选为100~1000r/min，更优选为500~600r/min；所述自组装的时间优选为1~12h，更优选为5~8h。
在本发明中，所述将芹菜素-7-O-葡萄糖苷溶液与丝素肽纳米微晶溶液混合，进行自组装，得到丝素肽纳米载药微晶的溶液，该溶液为含有丝素肽纳米载药微晶的胶体状白色溶液。
在本发明的具体实施例中，所述芹菜素-7-O-葡萄糖苷溶液、丝素肽纳米微晶溶液和丝素肽纳米载药微晶均优选在4℃储存备用。
本发明提供了一种广谱抗氧化丝素非对称水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将丝素肽纳米载药微晶的溶液、丝素蛋白溶液和纳米银溶液混合，得到混合溶液；所述丝素肽纳米载药微晶为上述技术方案所述丝素肽纳米载药微晶或上述技术方案所述制备方法制备得到的丝素肽纳米载药微晶；
对所述混合溶液施加电压，得到广谱抗氧化丝素非对称水凝胶。
本发明将丝素肽纳米载药微晶的溶液、丝素蛋白溶液和纳米银溶液混合，得到混合溶液。
在本发明中，所述丝素肽纳米载药微晶的溶液的浓度优选为1~20mg/mL，更优选为5~10mg/mL。
在本发明中，所述丝素蛋白溶液的浓度优选为1~100mg/mL，更优选为10~60mg/mL。本发明对所述丝素蛋白溶液的具体制备方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的方法即可。
在本发明的具体实施例中，所述丝素蛋白溶液的制备方法优选包括：将天然桑蚕丝线进行脱胶，得到蚕丝；将所述蚕丝溶解在溶剂中，得到混合溶液；将所述混合溶液依次进行透析处理和纯化处理，得到丝素蛋白溶液。在本发明中，所述脱胶优选包括：将天然桑蚕丝线、碳酸钠和沸水混合煮沸。在本发明中，所述天然桑蚕丝线和碳酸钠的质量比优选为1：0.5~1.5，更优选为1：0.8~1。在本发明中，所述煮沸的时间优选为20~40min，更优选为30min；所述煮沸优选在搅拌条件下进行。所述脱胶后本发明优选还包括将所得脱胶后蚕丝进行水洗后干燥，得到蚕丝。在本发明中，所述溶剂优选包括溴化锂溶液或氯化钙三元液；所述溴化锂溶液的浓度优选为8~12mol/L，更优选为9.3mol/L；所述氯化钙三元液的组成优选包括氯化钙、乙醇和水；所述氯化钙、乙醇和水的摩尔比优选为1：2：8。在本发明中，所述溶解的温度优选为50~70℃，更优选为60℃；所述溶解的时间优选为3~5h，更优选为4h。在本发明中，所述透析处理优选包括水透析，所述透析处理采用的透析袋的截留分子量优选为3500Da；所述透析的时间优选为2~4d，更优选为3d；所述透析处理过程中，优选每隔2~4h（更优选为3h）更换一次水；所述水优选包括去离子水。在本发明中，所述纯化优选包括离心分离，上清液为蛋白溶液；所述离心分离的转速优选为8000~10000r/min，更优选为9000r/min；所述离心分离的时间优选为20~40min，更优选为30min；所述离心分离的温度优选为1~5℃，更优选为4℃。
在本发明中，所述纳米银溶液的浓度优选为1~10mg/mL，更优选为3~8mg/mL，进一步优选为5~6mg/mL。
在本发明中，所述纳米银溶液的制备方法优选包括：将硝酸银、水、异丙醇和葡萄糖混合，进行还原反应，得到纳米银溶液。在本发明中，所述葡萄糖优选为粉末状葡萄糖。在本发明中，所述硝酸银、水、异丙醇和葡萄糖混合优选包括：将硝酸银和部分水混合，得到硝酸银溶液；将葡萄糖和剩余水混合，得到葡萄糖溶液；将所述硝酸银溶液加热至还原反应的温度，依次加入异丙醇和葡萄糖溶液。在本发明中，所述硝酸银溶液的浓度优选为0.1~10wt%，更优选为0.5~5wt%。在本发明中，所述葡萄糖溶液的浓度优选为5~10wt%，更优选为6~9wt%，进一步优选为7~8wt%。在本发明中，所述硝酸银溶液和异丙醇的体积比优选为1：0.01~1，更优选为1：0.1~0.5；所述硝酸银和葡萄糖的质量比优选为1：1~2，更优选为1：1.5~2。在本发明中，所述还原反应的温度优选为25~100℃，更优选为50~80℃；所述还原反应的时间优选为30~300min，更优选为60~100min。本发明优选在所述还原反应后，将所得反应体系进行离心，去除聚集纳米银颗粒，得到纳米银溶液。在本发明中，所述离心的转速优选为1000~5000g，更优选为2000~4000g；所述离心的时间优选为1~30min，更优选为5~20min。糖尿病创面难愈合，创面微环境糖含量比较高，容易引发感染，本发明将广谱抗菌纳米银引入水凝胶敷料中，使其抗氧化和抗炎同时兼具广谱抗菌作用。
在本发明中，所述丝素肽纳米载药微晶和丝素蛋白溶液中的丝素蛋白的质量比优选为0.02~0.2：1，更优选为0.05~0.15：1，进一步优选为0.1:1。
在本发明中，所述丝素肽纳米载药微晶和纳米银溶液中的纳米银的质量比优选为2~20：1~10，更优选为5~10：5~10，进一步优选为1:1。
在本发明中，所述丝素肽纳米载药微晶的溶液、丝素蛋白溶液和纳米银溶液混合优选包括：将丝素肽纳米载药微晶的溶液滴加到丝素蛋白溶液中，再加入纳米银溶液。在本发明中，所述纳米银溶液的加入方式优选为滴加。在本发明中，所述丝素蛋白溶液在使用前优选先进行热处理，所述热处理的温度优选为50~70℃，更优选为60℃，所述加热的时间优选为10~15h，更优选为12h，经热处理后的丝素蛋白溶液为粘稠态。
得到混合溶液后，本发明对所述混合溶液施加电压，得到广谱抗氧化丝素非对称水凝胶。在本发明中，所述电压优选为10~100V，更优选为50~80V；所述施加电压的时间优选为30~300min，更优选为50~120min。本发明在所述施加电压过程中，丝素蛋白在电场中移动。
本发明优选在所述施加电压后，进行冻干，得到广谱抗氧化丝素非对称水凝胶。在本发明中，所述冻干的温度优选为-50~4℃，更优选为-20℃；所述冻干的时间优选为48~96h，更优选为50~60h。在本发明的具体实施例中，所述广谱抗氧化丝素非对称水凝胶为多孔干凝胶海绵。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶，所述广谱抗氧化丝素非对称水凝胶具有致密面和疏松面，在本发明中，所述致密面的孔隙率为20~40%，优选为25~35%，进一步优选为30%；所述疏松面的孔隙率为50~80%，优选为60~70%。
本发明提供了上述技术方案所述广谱抗氧化丝素非对称水凝胶在制备敷料中的应用，所述敷料优选包括糖尿病皮肤溃疡敷料。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下测试例中使用的PBS溶液的pH=7。
实施例1
制备芹菜素-7-O-葡萄糖苷：
将1 kg干的蓝刺头粉末与75 wt %的乙醇2 L共混，加热到60 ℃机械搅拌，提取12h，过滤，去除残渣，将所得提取液在80℃条件下旋转蒸发4h，将乙醇挥发掉，得到浸膏，-20℃冷冻12h，冻干机冻干72h，得到冻干粉。将冻干粉溶解在40v/v%甲醇水溶液中，涡旋30 s，16000 g、4℃条件下离心15 min，上清液为冻干粉溶液，将所述冻干粉溶液进行高效液相色谱-串联质谱分离，得到芹菜素-7-O-葡萄糖苷。其中，冻干粉与甲醇水溶液的固液比为20mg：0.3mL。
高效液相色谱-串联质谱分离条件：采用Vanquish UHPLC(Thermo Scientific,Waltham, MA)超高效液相色谱系统结合ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm × 100 mm, 1.8µm)色谱柱进行分离，柱温为35℃；流速为0.3 mL/min；流动相：流动相A为0.1v/v%甲酸水溶液，流动相B为0.1v/v%甲酸-乙腈；洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。采用Q-Exactive HFX质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集，Q-Exactive HFX质谱仪样品与UHPLC系统联用，电喷雾电离(ESI)正、负两种离子模式分别进行质谱采集，喷雾电压为3800V(ESI+)/3500V(ESI-)，鞘气压力为45arb，辅助气压力为20arb，离子传输管温度为320℃，雾化温度为350℃；检测方式为全扫描/数据依赖二级扫描(Full-MS/dd-MS2)模式，一级和二级分辨率分别为60000和15000，top 10 MS1离子获得MS/MS谱图，碰撞能量(CEs)。采用阶梯归一化能级20、40、60；一级质荷比扫描范围90~1300。精密吸取EC-sp溶液2 μL，LC-MS进样分析，EC-sp样品重复进样5次。
制备丝素肽纳米载药微晶：
用pH值为7的磷酸盐缓冲溶液配制2 mmol/L芹菜素-7-O-葡萄糖苷溶液5 mL，磁力搅拌30 min，加入采用pH值为7的磷酸盐缓冲溶液配制的4 mmol/L丝素肽(GAGAGS)2纳米微晶溶液5 mL，均匀混合，置于37℃、600 rpm/min的摇床上震荡8 h，得到含有丝素肽纳米载药微晶的胶体状白色溶液。
制备纳米银溶液：
称取50mg硝酸银溶于10mL去离子水中，磁力搅拌30min；加热至80℃，加入1mL异丙醇，继续搅拌10min，得到硝酸银和异丙醇的混合溶液；将100mg葡萄糖粉末溶于1mL去离子水中，充分溶解后加入硝酸银和异丙醇的混合溶液中，继续搅拌60min，离心机2000g离心5min，去除聚集纳米银颗粒，得到纳米银溶液。
制备非对称丝素基水凝胶原料溶液：
在水浴锅中加入2 L去离子水，加热至100℃后加入4.24 g无水碳酸钠与天然桑蚕丝线5 g，煮沸30 min以脱去天然蚕丝线中的丝胶，在加热过程中间隔搅拌；将脱完胶的蚕丝，用去离子水反复冲洗后，放入烘箱60℃烘干，得到蚕丝；按蚕丝与溴化锂溶液的比例为27 g:100 mL向蚕丝中加入9.3 mol/L溴化锂溶液，封上保鲜膜并刺孔，60℃继续烘4 h；将所得蚕丝溶解液装入透析袋（透析袋截留分子量为3500Da）中，封住两端，放入去离子水中透析3 d，透析过程中每3 h更换一次去离子水；透析过后的丝素蛋白溶液分装入50 mL离心管中，在离心转速为9000 r/min、时间为30 min、温度为4℃的条件下进行离心，舍弃下层沉淀，将上清液收集，得到丝素蛋白溶液，放入4℃冰箱保存；丝素蛋白溶液的浓度由BCA法测得，所得的丝素蛋白溶液浓度为60 mg/mL。
将60mg/mL丝素蛋白溶液10mL置于60℃鼓风烤箱中12h，溶液变得粘稠后，将所述含有丝素肽纳米载药微晶的胶体状白色溶液1mL滴加到丝素蛋白溶液中，磁力搅拌60min，待胶体状白色溶液充分分散到丝素蛋白溶液中，得到混合料；将1mL所述纳米银溶液滴加到所述混合料中，磁力搅拌60 min，得到非对称丝素基水凝胶原料溶液。
制备广谱抗氧化丝素非对称水凝胶：
对所述非对称丝素基水凝胶原料溶液加载电压为50V的匀强电场，反应2 h后，制备得到广谱抗氧化丝素非对称水凝胶（简写为SF@β-crystallite/AG-Ag）；用冻干机将SF@β-crystallite/AG-Ag冻干，备用。所述广谱抗氧化丝素非对称水凝胶的一面致密（孔隙率为30%），一面疏松多孔道（孔隙率为70%）。
测试例1
实施例1制备的含有丝素肽纳米载药微晶的胶体状白色溶液的表征图如图1所示，图1中A为红外光谱图，可以看出丝素肽纳米载药微晶是β-折叠和β反平行折叠结构。图1中B为原子力显微镜图，图1中C为透射电镜图，可以看出，胶体状白色溶液的拓扑结构是纳米片状结构。
实施例1制备的纳米银颗粒的透射电镜图如图2所示，可以看出纳米银颗粒的尺寸为10~20nm。
实施例1制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶的扫描电子显微镜（SEM）如图3所示，其中，A表示疏松面，B表示致密面。由广谱抗氧化丝素非对称水凝胶的拓扑结构表征可以看出，广谱抗氧化丝素非对称水凝胶的具有互穿的孔道结构，表面一面疏松，一面致密。
测试例2
实施例1制备的SF@β-crystallite/AG-Ag，在25℃，用流变仪记录SF@β-crystallite/AG-Ag的G'和G"变化，进行三个循环检测，结果见图4。可知，SF@β-crystallite/AG-Ag水凝胶的力学强度为900Pa，适合用于皮肤损伤修复。
测试例3
将实施例1制备的SF@β-crystallite/AG-Ag浸入PBS溶液中置于37℃培养箱，得到SF@β-crystallite/AG-Ag浸提液（浓度为0.1g/mL）每组3个样品。分别在孵育3h、6h、9h、12h、24h、36h、48h、60h和72h取样（对照组是纱布-AG-Ag，将芹菜素-7-O-葡萄糖苷AG和Ag分别吸附在纱布中，AG的质量占纱布质量的10%，Ag的质量占纱布质量的10%）。用紫外分光光度计测定芹菜素-7-O-葡萄糖苷的含量，并绘制蛋白缓释曲线，实验结果见图5，可知SF@β-crystallite/AG-Ag水凝胶具有良好药物缓释能力。
测试例4
将实施例1制备的SF@β-crystallite/AG-Ag浸入生理盐水中，37℃孵育72h，得到SF@β-crystallite/AG-Ag浸提液（浓度为0.1g/mL）。将L929细胞培养致对数生长期，37℃培养，在第1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天用CCK-8检测细胞活性和增殖情况，见图6中A，其中，SF@β-crystallite为丝素蛋白和丝素肽(GAGAGS)2纳米微晶的混合物，两者用量比与实施例1相同，SF为丝素蛋白。2%戊巴比妥钠经豚鼠腹腔注射进行麻醉。脱毛，皮内注射100μLSF@β-crystallite/AG-Ag的浸提液（对照组是生理盐水，control），0h、12h、24h、48h和72h拍照观察，见图6中B，其中，第1个0h无注射，第2个0h为注射SF@β-crystallite/AG-Ag的浸提液。由图6可知SF@β-crystallite/AG-Ag浸提液水凝胶无细胞毒性和无致敏性。
测试例5
将SF@β-crystallite/AG-Ag置于生理盐水中孵育72h，得到浓度分别为5μM、10μM、20μM、40μM、80μM的SF@β-crystallite/AG-Ag浸提液。
将SF@β-crystallite/AG-Ag浸提液（浓度分别为5μM、10μM、20μM、40μM、80μM，溶剂为生理盐水，孵育72h得到）200 μL与100 μL 100 mM H2O2在37℃下孵育1h。反应后，根据试剂盒说明书上的方法测定残余H2O2的量，并计算水凝胶清除H2O2清除效率，见图7，可知SF@β-crystallite/AG-Ag水凝胶具有良好清除过氧化氢的能力。
将SF@β-crystallite/AG-Ag浸提液（浓度分别为5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）200μL避光条件下与200 μL芬顿试剂和200 μL TMB分别加入24孔板中，在37℃反应30min，用酶标仪（Synergy h1，Biotek，Winooski，VT，USA）监测652 nm处溶液的吸收峰。计算出水凝胶清除羟基自由基能力，见图8，可知，SF@β-crystallite/AG-Ag浸提液水凝胶具有良好清除羟基自由基的能力。
将SF@β-crystallite/AG-Ag浸提液（浓度分别为5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）200μL加入1 mL超氧化物阴离子自由基溶液中，在加入显色剂2 mL静置10min后，550nm处检测吸光度。计算出水凝胶清除超氧化物阴离子自由基能力，见图9，可知SF@β-crystallite/AG-Ag水凝胶具有良好清除朝阳阴离子的能力。
测试例6
将SF@β-crystallite/AG-Ag置于PBS溶液中孵育72h，得到浓度为0.1g/mL的SF@β-crystallite/AG-Ag浸提液。
将NIH 3T3细胞以每孔5×105个细胞的密度接种到0.1%明胶预处理2 h的6孔板中，37℃培养12 h。将SF@β-crystallite/AG-Ag浸提液添加到每组6孔板的孔中，然后用100μM H2O2处理细胞并在37℃下孵育30min；避光条件下，将10μM的DCFH-DA无血清培养基染料1mL加入每孔细胞中（对照组细胞加入无血清培养基），37℃下孵育20min，无血清培养基清洗2遍，使用共焦显微镜（日本尼康A1）观察并成像拍照，然后使用NIS Element AR软件（5.30.03版）定量分析细胞内被染成绿色ROS荧光强度，进行统计学分析。未添加H2O2的细胞作为对照组。实验结果见图10，其中，A为胞内活性氧荧光图，B为胞内活性氧荧光强度统计图，可知SF@β-crystallite/AG-Ag水凝胶具有良好清除胞内活性氧的能力。
测试例7
雄性SD大鼠70只（280~320g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在室温（25℃）下，光/暗循环12h，在SPF环境中自由饮水和进食。1周后，大鼠饲喂高蔗糖和高脂肪饲料8周，第9周腹腔注射2%链脲佐菌素（STZ，35mg/kg，Sigma）。每周记录空腹血糖和体重。空腹血糖>11.5mmol/L并持续4周以上被判定为II型糖尿病大鼠。空腹血糖低于11.5mmol/L，需再次腹腔注射2% STZ。在诱导糖尿病模型过程中，记录糖尿病大鼠1~12周体重变化及血糖变化。
II型糖尿病SD大鼠（雄性，60只）随机分为4组，每组15只。采用腹腔注射1%戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉糖尿病SD大鼠，去除背毛，背部皮肤消毒，用眼科剪剪掉背部皮肤，造成深筋膜层皮肤损伤（直径25mm）。实验分组为：对照组：纱布治疗组；实验1：SF治疗组；实验2：SF@β-crystallite治疗组；实验3：SF@β-crystallite/AG-Ag治疗组。每周处理创面两次，进行消毒，更换敷料，伤口包扎。在第0天、3天、7天、10天、14天、17天、21天和24天拍照记录创面愈合过程。用Image J软件计算创面大小并绘制愈合率曲线。
图11为实施例1制备的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶治疗糖尿病大鼠全层皮肤损伤实物照片，可知SF@β-crystallite/AG-Ag水凝胶具有良好治疗糖尿病创面的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.丝素肽纳米载药微晶和纳米银在制备治疗糖尿病愈合创面修复药物中的应用，所述丝素肽纳米载药微晶包括丝素肽纳米微晶以及负载在所述丝素肽纳米微晶内的芹菜素-7-O-葡萄糖苷；所述丝素肽纳米载药微晶具有β-折叠和β反平行折叠结构，拓扑结构为纳米片状结构；所述丝素肽纳米微晶和芹菜素-7-O-葡萄糖苷的质量比为1：0.01~0.5。
2.一种治疗糖尿病愈合创面修复用广谱抗氧化丝素非对称水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将丝素肽纳米载药微晶的溶液、丝素蛋白溶液和纳米银溶液混合，得到混合溶液；所述丝素肽纳米载药微晶为权利要求1所述应用中的丝素肽纳米载药微晶；
对所述混合溶液施加电压，得到广谱抗氧化丝素非对称水凝胶；所述电压为10~100V；所述施加电压的时间为30~300min。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述丝素肽纳米载药微晶和丝素蛋白溶液中的丝素蛋白的质量比为0.02~0.2：1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述丝素肽纳米载药微晶和纳米银溶液中的纳米银的质量比为2~20：1~10。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述混合包括：将丝素肽纳米载药微晶的溶液滴加到丝素蛋白溶液中，再加入纳米银溶液。
6.权利要求2~5任一项所述制备方法制备得到的广谱抗氧化丝素非对称水凝胶，所述广谱抗氧化丝素非对称水凝胶具有致密面和疏松面；所述致密面的孔隙率为20~40%；所述疏松面的孔隙率为50~80%。
7.权利要求6所述广谱抗氧化丝素非对称水凝胶在制备敷料中的应用。
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