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CN119032163A - 制备乳酸菌培养物的方法、其产品及培养基 - Google Patents

制备乳酸菌培养物的方法、其产品及培养基 Download PDF

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CN119032163A CN202380025405.8A CN202380025405A CN119032163A CN 119032163 A CN119032163 A CN 119032163A CN 202380025405 A CN202380025405 A CN 202380025405A CN 119032163 A CN119032163 A CN 119032163A
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M·托斯卡诺
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Abstract

本发明涉及微生物发酵剂培养物。更具体地，一种用于制备微生物培养物例如乳酸菌(LAB)发酵剂培养物的方法，其中将至少一种微生物菌株例如乳酸菌和至少一种血红素蛋白接种在培养基中。

Description

制备乳酸菌培养物的方法、其产品及培养基
技术领域
本发明涉及微生物起子培养物的领域。更具体地，本发明提供了一种用于在通气下制备微生物起子培养物的方法。微生物起子培养物可以是乳酸菌(LAB)起子培养物，其中乳酸菌接种在培养基中，并且其中培养基包含至少一种血红素蛋白。这种新方法采用符合素食法规要求的原料。因此，通过新方法获得的起子培养物可用于制备素食食品、饲料和药品。
技术背景
微生物培养物在食物、饲料和制药工业中广泛用于制造发酵产物，包括大多数乳制品，如奶酪、酸奶和黄油，也用于肉类、烘焙食品、酒或蔬菜产品。此外，微生物培养物也用于生产包括酶的蛋白和各种有用化合物。此类微生物培养物通常被称为起子培养物，由工业繁殖工厂生产并分发到发酵行业，例如乳制品厂，其中起子培养物用于其生产工艺中。特别地，乳酸菌的培养物被广泛用作起子培养物。
乳酸菌(LAB)起子培养物的产生涉及在特定发酵培养基中接种LAB细胞，并在适当的发酵条件下繁殖适当数量的细胞。在工业环境中，需要投入大量精力来在发酵工艺结束时获得高浓度的繁殖细胞。发酵条件和发酵培养基必须支持细胞的生长，以便获得所需的高生物量产率。
目前应用于生产乳酸菌(例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)起子培养物)的起子培养物的方法在发酵培养基中施加非素食合规来源作为原料。非素食合规来源是作为外源施用的。外源来源可以是血红素来源，并且其被添加以支持乳酸菌的呼吸过程。由于使用非素食合规的血红素来源，通过已知方法获得的这种起子培养物不能应用于素食食品、饲料和药品。因此，本领域需要开发一种用于生产例如乳酸菌的微生物起子培养物的呼吸方法，其具有与本领域已知的方法类似的产率，并且其中该方法应用素食合规的血红素来源。
酵母细胞已被用作素食合规的血红素来源，如WO2021/116311A1中所公开的。然而，酵母细胞难以生产、处理和纯化，这可能导致增加的成本。除LAB生物质外，酵母细胞增加干物质。以酵母提取物的形式使用酵母细胞基材料将会为含有血红素蛋白的材料的制备增加额外的加工步骤。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种微生物培养物，例如适用于制造素食、饲料和药品的乳酸菌培养物。
因此，本发明的第一方面涉及一种用于获得微生物培养物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在通气下在培养基中培养至少一种微生物菌株并获得发酵物，
(ii)从发酵物收获所述至少一种微生物菌株以获得微生物培养物，
其中所述培养基包含至少一种血红素蛋白。
在第二方面，本发明涉及可通过本发明的方法获得的培养物。
在第三方面，本发明涉及包含至少一种血红素蛋白的培养物。
本发明的第四方面涉及包含至少一种血红素蛋白的培养基。
本发明的第五方面涉及一种制备食品、饲料产品、药品、乳制品调味剂和奶酪调味剂产品的方法，所述方法包括将有效量的本发明的培养物添加到食物、饲料或药品起始原料中，并将接种的培养物保持在至少一种微生物菌株具有代谢活性的条件下。
本发明的第六方面涉及可通过本发明的方法获得的发酵食物、饲料或药品。
本发明的第七方面涉及至少一种血红素蛋白在发酵方法和/或发酵工艺中的用途。
本发明的第八方面涉及包括根据第二或第三方面的培养物的食品、饲料产品、药品、乳制品调味剂或奶酪调味产品。
具体实施方式
本发明人已经开发了一种用于获得微生物培养物(例如微生物菌株(例如，乳酸菌)的起子培养物)的方法，其中将血红素蛋白用作素食合规的替代性血红素来源而不是非素食合规的血红素来源。应用作为外源血红素来源的血红素蛋白出人意料地显示支持微生物菌株(例如乳酸菌)的呼吸。纯化的血红素蛋白是素食合规的原料。该方法提供与本领域已知的方法相当的产率。
在讨论本发明的详细实施方案之前，提供了本文使用的所选术语的进一步定义。
如本文所用，术语“发酵”是指在需氧或厌氧条件下繁殖或培养微生物细胞的过程。
术语“起子培养物”是指包含微生物细胞的制剂，所述微生物细胞旨在接种在待发酵的培养基中。
在本上下文中，术语“产率”是指在给定体积的发酵中产生的生物质的量。可以以各种方式测量产率；在本文中以两种不同方式测量产率。1)以发酵结束时发酵培养基1cm光程在600nm处的光密度(OD600)测量(减去背景)的单位体积生物量；2)按照Pearce试验测定的“酸化活性”或酸化能力为4.8-5.2，以发酵结束时F-DVS培养物的kg表示；3)通过细胞压积(PCV)测试，或；4)细胞计数。
术语“F-DVS”是指在实施例中描述的所谓的冷冻直投型培养物。
欧洲关于素食声明的法律框架目前正在修订中，目前尚无统一的规则。欧洲食品立法下的所有声明、纯素食和素食声明均为任何信息或陈述，欧盟或国家立法不强制要求，包括任何形式的图画、图形或符号表示，其表明、提示或暗示食品具有特定特征(NeliSochirca(2018),EFFL,6,第514页)。因此，在本文中，术语“素食合规血红素来源”是指不是从动物和/或多细胞生物体获得或衍生的血红素来源。相反，术语“非素食合规血红素来源”是指从动物和/或多细胞结构获得或衍生的血红素来源。
在本发明的一个实施方案中，一种或多种微生物菌株是在不补充呼吸链的组分/替代组分的情况下不能呼吸生长的微生物菌株。应当理解，呼吸链的组分/替代组分的补充可以是外源血红素来源的补充。
该至少一种微生物菌株可以选自由以下组成的组：乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus，现称为联合乳杆菌属(Ligilactobacillus))、霍尔扎普菲尔氏菌属((Holzapfelia)、淀粉乳杆菌属(Amylolactobacillus)、蜂乳杆菌属(Bombilactobacillus)、伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)、石墙乳杆菌属(Lapidilactobacillus)、农田乳杆菌属(Agrilactobacillus)、施莱弗乳杆菌属(Schleiferilactobacillus)、腐败乳杆菌属(Loigolactobacilus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、广泛乳杆菌属(Latilactobacillus)、德拉格里奥氏菌属(Dellaglioa)、液体乳酸杆菌属(Liquorilactobacillus)、乳植物杆菌属(Lactiplantibacillus)、糠乳杆菌属(Furfurilactobacillus)、寡食乳杆菌属(Paucilactobacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、果实乳杆菌属(Fructilactobacillus)、醋酸乳杆菌属(Acetilactobacillus)、蜜蜂乳杆菌属(Apilactobacillus)、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)、次乳杆菌属(Secundilactobacillus)和迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)(如Zheng等人,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.DOI 10.1099/ijsem.0.004107中描述)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)及其组合。该组中的大多数属都是“乳酸菌”，然而，工业上重要的属是双歧杆菌属，尽管在系统发育上不相关，但有时也包含在乳酸菌组中，因为乳酸是其主要发酵产物终产物之一。该列表还包括未包括在属于短杆菌属和丙酸杆菌属的乳酸菌属中的其他工业上重要的起子培养物。
如本文所用，术语“乳酸菌”(LAB)指革兰氏阳性、微需氧或厌氧细菌，其发酵糖并产生酸，包括乳酸(作为主要产生的酸)和乙酸。工业上最有用的乳酸菌存在于以下属中：乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus，现称为联合乳杆菌属(Ligilactobacillus))、霍尔扎普菲尔氏菌属(Holzapfelia)、淀粉乳杆菌属(Amylolactobacillus)、蜂乳杆菌属(Bombilactobacillus)、伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)、石墙乳杆菌属(Lapidilactobacillus)、农田乳杆菌属(Agrilactobacillus)、施莱弗乳杆菌属(Schleiferilactobacillus)、腐败乳杆菌属(Loigolactobacilus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、广泛乳杆菌属(Latilactobacillus)、德拉格里奥氏菌属(Dellaglioa)、液体乳酸杆菌属(Liquorilactobacillus)、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)、乳植物杆菌属(Lactiplantibacillus)、糠乳杆菌属(Furfurilactobacillus)、寡食乳杆菌属(Paucilactobacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、果实乳杆菌属(Fructilactobacillus)、醋酸乳杆菌属(Acetilactobacillus)、蜜蜂乳杆菌属(Apilactobacillus)、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)、次乳杆菌属(Secundilactobacillus)和迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)(如Zheng等人,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.DOI 10.1099/ijsem.0.004107中描述)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、以及肠球菌属(Enterococcus)。如上所述，另一个工业上重要的属是双歧杆菌属，尽管在系统发育上不相关，但它有时也包含在乳酸菌组中，因为乳酸是其主要发酵产物终产物之一。
因此，在一个实施方案中，至少一种微生物菌株是乳酸菌，其选自由以下组成的组：乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus，现称为联合乳杆菌属(Ligilactobacillus))、霍尔扎普菲尔氏菌属(Holzapfelia)、淀粉乳杆菌属(Amylolactobacillus)、蜂乳杆菌属(Bombilactobacillus)、伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)、石墙乳杆菌属(Lapidilactobacillus)、农田乳杆菌属(Agrilactobacillus)、施莱弗乳杆菌属(Schleiferilactobacillus)、腐败乳杆菌属(Loigolactobacilus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、广泛乳杆菌属(Latilactobacillus)、德拉格里奥氏菌属(Dellaglioa)、液体乳酸杆菌属(Liquorilactobacillus)、乳植物杆菌属(Lactiplantibacillus)、糠乳杆菌属(Furfurilactobacillus)、寡食乳杆菌属(Paucilactobacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、果实乳杆菌属(Fructilactobacillus)、醋酸乳杆菌属(Acetilactobacillus)、蜜蜂乳杆菌属(Apilactobacillus)、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)、次乳杆菌属(Secundilactobacillus)和迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)(如Zheng等人,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.DOI 10.1099/ijsem.0.004107中描述)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)及其组合。
常用的乳酸菌起子培养物菌株一般分为最适生长温度约30℃的嗜常温生物体和最适生长温度在约40至约45℃范围内的嗜热生物体。
应当理解，乳杆菌属分类学于2020年更新。新的分类法在Zheng等人2020年中公开以及对本发明重要者总结如下：
典型的生物体属于包括以下的组：乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、乳酸乳球菌乳亚种双乙酰型乳酸生物变种(Lactococcus lactissubsp.lactis biovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(干酪乳酸酪杆菌)和副干酪乳杆菌副干酪亚种(副干酪乳酪杆菌副干酪亚种和副干酪乳酪杆菌耐受亚种)。嗜热乳酸菌物种包括例如嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
由于培养基中血红素蛋白、乳酸菌、血红素蛋白或任何其他营养物的量和浓度可能随时间而变化，例如，由于掺入微生物细胞中，有必要参考必须测量或确定血红素蛋白浓度的特定时间点。因此，当与培养基中的血红素蛋白、乳酸菌、血红素蛋白或任何其他营养物的浓度结合使用时，术语“最初”或“发酵前”(在本文中也可互换使用)是在将要培养的微生物细胞加入培养基之前，培养基中存在的血红素蛋白、乳酸菌、血红素蛋白或任何其他营养物质的浓度。
然而，对于整个发酵工艺，也可以在收获前的任何时间添加血红素蛋白。血红素蛋白的添加可以分批或连续进行。因此，一个重要的衡量标准是整个发酵工艺中的“添加总量”。
根据本发明的起子培养物的重要应用是作为所谓的益生菌。在本文中，术语“益生菌”应理解为微生物培养物，当其以活细胞形式被人类或动物摄取时，可改善健康状况，例如通过抑制胃肠道中的有害微生物、增强免疫系统或有助于营养物质的消化。这种益生菌活性产品的典型实例是“甜嗜酸乳(sweet acidophilus milk)”。
本说明书中显然先前公开的文档的列出或讨论不一定被视为承认该文档是现有技术的一部分或者是公知常识。
除非上下文另有说明，本发明的给定方面、特征或参数的实施方案、优选项和选项应当被视为已与本发明的所有其他方面、实施方案、特征和参数的任何和所有实施方案、优选项和选项组合公开。例如，与可通过本发明的方法获得的乳酸菌培养物相关的实施方案可同样适用于乳酸菌起子培养物。而且，与本发明的方法相关的所述实施方案可以与本发明的产物相关，反之亦然。
下面仅通过示例的方式描述本发明的实施方案。
本发明的一个方面涉及一种获得微生物培养物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在通气下在培养基中培养至少一种微生物菌株并获得发酵物，
(ii)从发酵物收获所述微生物菌株以获得微生物培养物，
其中所述培养基包含至少一种血红素蛋白。
在实施方案中，本发明涉及一种获得乳酸菌培养物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在通气下在培养基中培养至少一种乳酸菌培养物并获得发酵物，
(ii)从发酵物收获所述微生物菌株以获得微生物培养物，
其中所述培养基包含至少一种血红素蛋白。
在一个实施方案中，本发明的方法可以进一步包括以下步骤：
(iii)浓缩微生物培养物，以获得浓缩的微生物培养物。
在一个实施方案中，本发明的方法可以进一步包括以下步骤：
(iii)浓缩乳酸菌培养物，得到浓缩的乳酸菌。
浓缩可以使用本领域已知的方法进行，例如但不限于离心或超滤。为了在步骤(iii)中获得的浓缩物中获得增加数量的微生物(例如乳酸菌)，可以预期步骤(iv)中的浓缩因子在2至20的范围内，例如在6-19的范围内，例如在7-18的范围内，例如8-17，例如9-16，例如10-15，例如11-14，例如12-13，例如2-4，例如3-6。
商业起子培养物通常可以冷冻培养物的形式分发。在通常维持这种冷冻培养物的低温下，细胞中的大多数代谢活动停止，并且细胞可以长时间维持在这种悬浮但存活的状态。
浓缩冷冻培养物在商业上非常有吸引力，因为这种培养物可以直接接种到生产容器中。通过使用这种浓缩的冷冻培养物，最终用户避免了原本必须的、耗时的中间发酵步骤，在此期间发酵剂被扩增；并且最终用户还大大降低了污染的风险。这种浓缩培养物可称为DVS直投型TM培养物。
作为浓缩冷冻培养物的替代，可以制备浓缩冷冻干燥直直投型TM培养物，FD-DVSTM。此类培养物还有一个额外的优点，即无需冷藏即可运输。
因此，在实施方案中，本发明的方法可以进一步包括以下步骤：
(iv)冷冻步骤(ii)中的所述微生物细菌培养物或步骤(iii)中的浓缩微生物培养物，得到冷冻微生物培养物。
因此，在实施方案中，本发明的方法可以进一步包括以下步骤：
(iv)冷冻步骤(ii)中的所述乳酸菌培养物或步骤(iii)中的浓缩乳酸菌，得到冷冻乳酸菌培养物。
为了从冷冻微生物细菌培养物中去除液体，本发明的方法可以进一步包括以下步骤：
(v)从所述冷冻微生物培养物中升华水以获得干燥的微生物培养物。
为了从冷冻乳酸菌培养物中去除液体，本发明的方法可以进一步包括以下步骤：
(v)从所述冷冻乳酸菌培养物中升华水以获得干燥乳酸菌培养物。
步骤(v)可以通过选自由喷雾干燥、喷雾冷冻、真空干燥、风干、冷冻干燥、盘式干燥和真空盘式干燥的技术来进行。
在另一个实施方案中，本发明的方法进一步包括以下步骤：
(vii)将步骤(iv)中获得的所述冷冻微生物培养物或步骤(v)中获得的冻干微生物培养物进行包装。
可以理解的是，本发明的方法进一步包括以下步骤：
(vii)将步骤(iv)中获得的所述冷冻乳酸菌培养物或步骤(v)中获得的干燥乳酸菌培养物进行包装。
人们经常观察到冷冻和解冻对活细胞活力的破坏作用。一般来说，它们归因于冷冻过程中细胞脱水和细胞胞质溶胶中冰晶的形成。
然而，已发现多种冷冻保护剂可以确保冷冻以可控且伤害最小的方式进行，例如通过确保在冷冻过程中阻止或最小化细胞胞质溶胶中的冰结晶。
优选地，将至少一种冷冻保护剂添加到步骤(ii)中获得的收获的微生物培养物或收获的乳酸菌培养物中，或者添加到步骤(iii)中获得的浓缩的微生物培养物或浓缩的乳酸菌培养物中。
优选地，冷冻保护剂选自由以下组成的组：一种或多种参与核酸生物合成的化合物或任何此类化合物的一种或多种衍生物。适合添加到收获的微生物中的优选的一种或多种冷冻保护剂的实例基本上对应于本文所述的优选的一种或多种血红素蛋白。在较早提交的申请号为PCT/DK2004/000477的专利申请中描述了向收获的微生物中添加此类一种或多种冷冻保护剂。PCT/DK2004/000477中描述的优选的一种或多种冷冻保护剂也是本发明优选的一种或多种冷冻保护剂。PCT/DK2004/000477的完整描述通过引用并入本文。在本发明的另一优选实施方案中，一种或多种冷冻保护剂选自核苷一磷酸。在优选的实施方案中，至少一种或唯一的冷冻保护剂是IMP。一般而言，碳水化合物或蛋白型冷冻保护剂并未被描述为增加解冻或重构培养物的代谢活性。当将培养物接种到待发酵、加工或转化的培养基中时，本发明的冷冻保护剂除了其冷冻保护活性之外还可以赋予培养物增加的代谢活性(增强效应)。因此，本发明的一个实施方案是冷冻或干燥的培养物，其中冷冻保护剂是试剂或试剂的混合物，其除了其冷冻保护性之外还具有增强效应。表述“增强效应”用于描述这样的情况，其中当将解冻或重构的培养物接种到待发酵或转化的培养基中时，冷冻保护剂赋予解冻或重构的培养物增加的代谢活性(增强效应)。活力和代谢活性不是同义词。商业冷冻或干燥(例如冻干)培养物可以保留其活力，尽管它们可能已经失去了很大一部分代谢活性，例如即使保存时间较短，培养物也可能会失去产酸(酸化)活性。因此，必须通过不同的测定来评估活力和增强效应。虽然活力是通过活力测定(例如确定集落形成单位)来评估的，但增强效应是通过量化解冻或重构培养物相对于培养物活力的相关代谢活性来评估的。
下面描述的酸化活性测定是量化解冻或重构培养物的相关代谢活性的测定的一个实例。
尽管本文举例说明了产酸活性，但本发明旨在涵盖培养物任何类型的代谢活性的稳定化。因此，术语“代谢活性”指的是培养物的除氧活性、其产酸活性(即产生例如乳酸、乙酸、甲酸和/或丙酸)或其代谢物产生活性(例如产生芳香化合物，例如乙醛(α-乙酰乳酸、乙偶姻、二乙酰和2,3-丁二醇(丁二醇))。
在本发明的实施方案中，冷冻培养物含有或包含0.2％至20％的冷冻保护剂或试剂混合物，以冷冻材料的％w/w测量。然而，优选添加的冷冻保护剂或试剂混合物的量在0.2％至15％的范围内，更优选在0.2％至10％的范围内，更优选在0.5％至7％的范围内，更优选在1％至6％的范围内(包括以冷冻材料重量的％w/w测量的2％至5％的冷冻保护剂或试剂混合物的范围内)。在优选的实施方案中，培养物包含约3％的冷冻保护剂或试剂混合物，以冷冻材料的重量％w/w测量。大约3％的冷冻保护剂的优选量对应于100mM范围内的浓度。应当认识到，对于本发明实施方案的每个方面，这些范围可以是所描述的范围的增量。
在培养物是干燥培养物(例如冷冻干燥)的情况下，优选添加的冷冻保护剂或试剂混合物的量为干燥培养物的0.8重量％至60重量％范围内，或在0.8重量％至55重量％范围内，或在1.3重量％至40重量％范围内，或在3重量％至30重量％范围内，或在6重量％至25重量％范围内，包括10重量％至24重量％的范围。在优选的实施方案中，干燥(例如冷冻干燥)的培养物包含约16％的冷冻保护剂或试剂混合物，以干燥培养物的％w/w测量。
另外，冷冻或干燥的培养物可以进一步含有常规添加剂，包括营养物，例如酵母提取物、糖、抗氧化剂、惰性气体和维生素等。包括化合物的表面活性剂也可用作根据本发明的培养物的进一步添加剂。另外可添加至根据本发明的培养物中的此类常规添加剂的其他实例可选自蛋白、蛋白水解产物和氨基酸。其中这些的优选的合适实例包括选自由以下组成的组的那些：谷氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、酪蛋白酸钠、麦芽提取物、脱脂奶粉、乳清粉、酵母提取物、麸质、胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、角蛋白、和白蛋白或其混合物。
更优选地，常规添加剂是碳水化合物。这些的合适的实例包括选自由以下组成的组的那些：戊糖(例如核糖、木糖)、己糖(例如果糖、甘露糖、山梨糖)、二糖(例如蔗糖、海藻糖、蜜二糖、乳果糖)、低聚糖(例如棉子糖)、低聚果糖(例如Actilight、Fribroloses)、多糖(例如麦芽糖糊精、黄原胶、果胶、藻酸盐、微晶纤维素、葡聚糖、PEG)和糖醇(山梨醇、甘露糖醇和肌醇)。
目前优选的是，至少一种冷冻保护剂与浓缩微生物培养物或浓缩乳酸菌培养物的比率(wt％/wt％)在1:0.5至1:5的范围内，例如1:1至1:4或1:11/2至1:3。
本发明的一个替代实施方案是以增加的产率制备本文所述的微生物培养物的方法，并且该方法进一步包括将步骤(iii)中获得的浓缩微生物培养物或浓缩乳酸菌培养物通过冷冻干燥、盘式干燥、喷雾干燥、喷雾冷冻、真空干燥、风干或任何适用于细菌培养物干燥的干燥工艺进行干燥。
至少一种血红素蛋白可存在于培养基中或在将至少一种微生物菌株和/或乳酸菌添加至培养基之前添加至培养基，或者可替代地，可以在将至少一种微生物菌株和/或乳酸菌添加到培养基之后立即添加至少一种血红素蛋白。
在一个实施方案中，至少一种血红素蛋白是具有天然生物催化活性的蛋白。在优选的实施方案中，血红素蛋白是酶，例如过氧化氢酶或过氧化物酶。在特别优选的实施方案中，血红素蛋白是过氧化氢酶，例如但不限于
在一个实施方案中，至少一种具有天然生物催化活性的血红素蛋白已被灭活。可以采用多种灭活方法来达到灭活天然生物催化活性的目的，例如pH(碱)灭活、酶消化或热灭活。在优选的实施方案中，灭活是热灭活。热灭活可以通过本领域已知的任何方法进行，例如但不限于高压灭菌和/或UHT。
发明人出人意料地发现，添加热稳定化合物能够实现血红素蛋白的工业加工，同时能够实现高生长产率。在一个实施方案中，培养基进一步包含选自由多元醇、糖、生物聚合物、氨基酸、盐、聚合物和非离子洗涤剂组成的组的热稳定化合物。热稳定化合物可以选自由以下组成的组：山梨糖醇、甘油、丙二醇、甘露糖醇、木糖醇、丙二醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果聚糖(果糖同多糖)、葡聚糖、硫酸葡聚糖、明胶(A型和B型)、羟乙基淀粉、聚-L-谷氨酸、聚-L-赖氨酸、岩藻多糖、戊聚糖聚硫酸盐、硫酸角质素、聚天冬氨酸盐、聚谷氨酸盐、羟乙基纤维素、羟丙基-β-环糊精、甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙酸盐、柠檬酸盐、氯化钠、磷酸盐、抗坏血酸盐、用正辛胺和异丙胺随机改性的聚丙烯酸(A8-35)、聚乙二醇(PEG)、聚硫酸乙烯酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Triton X-100、Pluronic F68、Pluronic F88、Pluoronic F-127、Brij 35(聚氧乙烯烷基醚)。在优选的实施方案中，热稳定化合物是山梨糖醇。
在一个实施方案中，血红素蛋白是不具有天然生物活性的蛋白。
在一个实施方案中，血红素蛋白是微生物产生的。在一个实施方案中，血红素蛋白间接衍生自黑曲霉或由黑曲霉直接产生。在一个实施方案中，血红素蛋白间接衍生自毕赤酵母或直接由毕赤酵母产生。在一个实施方案中，血红素蛋白间接衍生自大肠杆菌或直接由大肠杆菌产生。在一个实施方案中，血红素蛋白间接衍生自芽孢杆菌或由芽孢杆菌直接产生。
将至少一种血红素蛋白作为旨在辅助发酵的原料添加至或存在于培养基中。本发明人出人意料地发现，培养基中非素食来源的应用可以用至少一种血红素蛋白替代，而不会降低产率。
因此，本发明的一个方面涉及至少一种血红素蛋白在发酵方法和/或发酵工艺中的用途。
培养基可以是复合发酵培养基。
复合发酵培养基可以是本领域已知的任何复合发酵培养基，然而复合发酵培养基可以包含选自由乳糖、营养素、维生素胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母提取物、抗坏血酸、硫酸镁、乳及其组合组成的组的化合物。
在一个实施方案中，血红素蛋白以允许呼吸高于细胞能够支持的自然耗氧水平的水平添加。血红素蛋白以剂量依赖性方式刺激需氧微生物生长，使得作为微生物生长量度的耗氧量与没有所述血红素蛋白的培养相比更早且以更快的速率达到峰值。
因此，在一个实施方案中，发酵物中的耗氧量在小于12小时内达到其最大值，例如小于10小时或小于8小时。
在一个实施方案中，发酵物中的耗氧量在小于10小时或小于8小时内达到0.04molO2/L/h。
耗氧量可以使用本领域技术人员已知的任何方法来测量。
在一个实施方案中，步骤(i)中的培养基在发酵前(即，在添加至少一种微生物菌株之前)包含占培养基重量(即在添加至少一种微生物菌株之前)至少0.5％w/w的至少一种血红素蛋白，例如1％w/w，例如2％w/w，例如3％w/w，例如4％w/w，例如在0.5-4％w/w范围内，例如1-3.5％w/w，例如1.5-3％w/w，例如2-2.5％w/w的至少一种血红素蛋白菌株。
在另一个实施方案中，步骤(i)中的培养基在发酵前(即，在添加至少一种微生物菌株之前)包含占培养基重量至少0.5％w/w的微生物接种培养物(如乳酸菌接种培养物)，例如发酵前的至少1％w/w，例如1.5％w/w，例如2％w/w，例如2.5％w/w，例如3％w/w，例如3.5％w/w，例如4％w/w，例如在0.5-4％w/w范围内，例如1-3.5％w/w，例如1.5-3％w/w，例如2-2.5％w/w的乳酸菌接种培养物。接种培养可按照实施例1中规定的方法进行。
在一个优选的实施方案中，添加血红素蛋白至约0.1g/kg发酵物-约10g/kg发酵物的浓度。
出人意料的是，通过本发明的方法，有时可以获得足够浓缩的微生物培养物，例如乳酸菌培养物，以用于在不浓缩培养物的情况下生产F-DVS。然而，即使当应用本方法时，大多数培养物也需要浓缩以获得具有商业利益的起子培养物。优选通过离心或超滤收获和浓缩此类培养物。
此外，一个优选的实施方案是其中在包含5L至100.000L培养基、优选300L至20.000L培养基的大型发酵罐中进行培养。
一个优选的实施方案是其中培养包括控制温度和/或pH。
在一个实施方案中，步骤(i)和/或步骤(ii)中的培养基包含一种或多种微生物菌株，其是在不补充呼吸链的组分/替代组分的情况下不能呼吸生长的微生物菌株。
在一个实施方案中，步骤(i)和/或步骤(ii)中的培养基包含至少一种选自由以下组成的组的微生物菌株：乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus，现称为联合乳杆菌属(Ligilactobacillus))、霍尔扎普菲尔氏菌属((Holzapfelia)、淀粉乳杆菌属(Amylolactobacillus)、蜂乳杆菌属(Bombilactobacillus)、伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)、石墙乳杆菌属(Lapidilactobacillus)、农田乳杆菌属(Agrilactobacillus)、施莱弗乳杆菌属(Schleiferilactobacillus)、腐败乳杆菌属(Loigolactobacilus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、广泛乳杆菌属(Latilactobacillus)、德拉格里奥氏菌属(Dellaglioa)、液体乳酸杆菌属(Liquorilactobacillus)、乳植物杆菌属(Lactiplantibacillus)、糠乳杆菌属(Furfurilactobacillus)、寡食乳杆菌属(Paucilactobacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、果实乳杆菌属(Fructilactobacillus)、醋酸乳杆菌属(Acetilactobacillus)、蜜蜂乳杆菌属(Apilactobacillus)、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)、次乳杆菌属(Secundilactobacillus)和迟缓乳杆菌属(如Zheng等人,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.DOI 10.1099/ijsem.0.004107中描述)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)及其组合。
在实施方案中，步骤(i)和/或步骤(ii)中的培养基包含至少一种选自由以下组成的组的乳酸菌：乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus，现称为联合乳杆菌属(Ligilactobacillus))、霍尔扎普菲尔氏菌属(Holzapfelia)、淀粉乳杆菌属(Amylolactobacillus)、蜂乳杆菌属(Bombilactobacillus)、伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)、石墙乳杆菌属(Lapidilactobacillus)、农田乳杆菌属(Agrilactobacillus)、施莱弗乳杆菌属(Schleiferilactobacillus)、腐败乳杆菌属(Loigolactobacilus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、广泛乳杆菌属(Latilactobacillus)、德拉格里奥氏菌属(Dellaglioa)、液体乳酸杆菌属(Liquorilactobacillus)、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)、乳植物杆菌属(Lactiplantibacillus)、糠乳杆菌属(Furfurilactobacillus)、寡食乳杆菌属(Paucilactobacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、果实乳杆菌属(Fructilactobacillus)、醋酸乳杆菌属(Acetilactobacillus)、蜜蜂乳杆菌属(Apilactobacillus)、促生乳杆菌属(Levilactobacillus)、次乳杆菌属(Secundilactobacillus)和迟缓乳杆菌属(Lentilactobacillus)(如Zheng等人,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.DOI 10.1099/ijsem.0.004107中描述)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、以及肠球菌属(Enterococcus)。
在实施方案中，步骤(i)和/或步骤(ii)中的培养基包含一种或多种嗜常温生物体，其选自包含以下的组：乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostocmesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰乳酸生物变种(Lactococcus lactis subsp.lactisbiovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)(新名称干酪乳酸酪杆菌(Lacticaseibacillus casei))、副干酪乳杆菌副干酪亚种(副干酪乳酸酪杆菌副干酪亚种和副干酪乳酸酪杆菌耐受亚种)和酒类酒球菌(Oenococcus oeni)。
在进一步的实施方案中，步骤(i)和/或步骤(ii)中的培养基包含一种或多种具有约40℃至约45℃的最佳生长温度的嗜热生物体。
在又一个实施方案中，步骤(i)和/或步骤(ii)中的培养基包含一种或多种嗜热生物体，其选自包含以下的组：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)。
在实施例中，步骤(i)和/或步骤(ii)中的培养基是LD-培养物，其包含一种或多种选自包含以下的组中的生物体：乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰乳酸生物变种(Lactococcus lactis subsp.lactisbiovar.diacetylactis)和肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroidessubsp.cremoris)。在本文中，术语“LD-培养物”应理解为物种乳酸乳球菌和物种明串珠菌的组合。
可以理解，步骤(i)和/或步骤(ii)中的培养基是O-培养物，其包含一种或多种选自包含乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌奶油亚种的组的生物体。在本文中，“O-培养物”应理解为包含乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌奶油亚种的培养基。O-培养物通常用于制作无孔奶酪(切达奶酪、Chesh-ire、Feta)。这种特定的培养物可以从丹麦科汉森公司以R604的名称购买(目录号200113)。
在优选的实施方案中，步骤(i)和/或步骤(ii)中的培养基是包含乳酸乳球菌的培养物。
为了获得最大产率，可能优选在培养开始后5和24小时进行步骤(ii)中的收获。
本发明的方法可以进一步包括保存步骤(ii)中获得的收获的微生物培养物或乳酸菌培养物或者步骤(iii)中获得的浓缩微生物培养物或乳酸菌培养物。
由于该方法的高产率，步骤(i)中获得的发酵物中的微生物培养物可以包含2.0E+10-5.0E+10个活性微生物细胞/g微生物培养物的范围，例如2.5E+10-4.5E+10，例如3.0E+10–4.0E+10个活性微生物细胞/g微生物培养物。同样地，步骤(i)中获得的发酵物中的微生物培养物可包含2.0E+10-5.0E+10个总微生物细胞/g微生物培养物的范围，例如2.5E+10-4.5E+10，例如3.0E+10–4.0E+10个总微生物细胞/g微生物培养物。从实验部分的表2可以看出，活性乳酸菌细胞数与乳酸菌细胞总数几乎相同，说明通过本发明得到的乳酸菌培养物和乳酸菌起子培养物具有很高的活力。
由于该方法的高产率，步骤(i)中获得的发酵物中的乳酸菌培养物可以包含2.0E+10-5.0E+11个活性乳酸菌细胞/g乳酸菌培养物的范围，如2.5E+10–4.5E+10，例如3.0E+10–4.0E+10个活性乳酸菌细胞/g乳酸菌培养物。同样，步骤(i)中获得的发酵物中的乳酸菌培养物可包含2.0E+10-5.0E+10个总乳酸菌细胞/g酸性细菌培养物，例如2.5E+10–4.5E+10，例如3.0E+10–4.0E+10个总乳酸菌细胞/g酸性细菌培养物。从实验部分的表2可以看出，活性乳酸菌细胞数与乳酸菌细胞总数几乎相同，说明通过本发明得到的乳酸菌培养物和乳酸菌起子培养物具有很高的活力。
使用中文本领域技术人员已知的技术的流式细胞术测定活性细胞和/或总细胞的数量。
在优选的实施方案中，其中与不包括血红素源工艺的厌氧工艺相比，该方法收获的一种或多种微生物菌株(例如乳酸菌)或微生物培养物(例如乳酸菌培养物)的所述增加产率增加了至少1.2倍，优选至少1.3倍，更优选至少1.4倍，甚至更优选至少1.5倍，最优选至少1.6倍。
在第二方面，本发明涉及可通过本发明第一方面的方法获得的微生物培养物，例如起子培养物。微生物培养物例如起子培养物可以作为培养物浓缩物例如起子培养物浓缩物提供。
在第三方面，本发明涉及微生物培养物，例如包含至少一种血红素蛋白的起子培养物。
第四方面涉及包含至少一种血红素蛋白的培养基。
本发明的第五方面涉及一种制备食品、饲料产品、药品、乳制品调味剂和奶酪调味剂产品的方法，所述方法包括将有效量的根据第二或第三方面的培养物添加到食物、饲料或药品起始原料中，并将接种的培养物保持在至少一种微生物菌株具有代谢活性的条件下。
优选地，本发明第五方面的食品选自由以下组成的组：乳基产品、蔬菜产品、肉产品、饮料、果汁、酒、烘焙产品、乳制品调味剂和奶酪调味剂。
优选地，乳基产品选自由以下组成的组：奶酪、酸奶、黄油、接种的甜乳和液体发酵乳产品。
在第六方面，本发明涉及可通过第一方面的方法获得的发酵食物、饲料或药品。
本发明的第七方面涉及至少一种血红素蛋白在发酵方法和/或发酵工艺中的用途。
微生物产生的化合物包括但不限于酶、蛋白、代谢物、糖脂、抗生素、细菌素、氨基酸、调味剂、挥发物。此类化合物可以通过重组DNA技术或通过常规方法产生。
第八方面涉及包括根据第二或第三方面的培养物的食品、饲料产品、药品、乳制品调味剂或奶酪调味产品。
在以下非限制性实施例和附图中进一步说明本发明。
附图说明
图1.显示根据本发明实施方案的氧转移速率的图。
实施例
实施例1：在科汉森(Chr.Hansen A/S)的复合发酵培养基中使用过氧化氢酶作为血红素蛋白进行的发酵
在水中制备浓度为24％-55％(w/w)的过氧化氢酶(购自NovoZymes)储备溶液。
然后将过氧化氢酶溶液在141℃的超高温(UHT)下处理8-10秒，以对材料进行灭菌并完全灭活酶。
产品含有9％w/w过氧化氢酶和42％w/w山梨醇。出人意料地发现山梨醇充当蛋白稳定剂。当UHT处理浓度低于24％w/w的溶液时，血红素分子在高温下降解，并且不再能够支持乳酸乳球菌的呼吸。(数据未显示)。
因此，山梨醇充当蛋白稳定剂和血红素保护剂。
培养物
本实验使用市售的乳酸乳球菌培养物进行，该乳酸乳球菌的保藏号为DSM 24648，由科汉森公司(赫斯霍尔斯霍姆,丹麦)在2011年3月15日保藏于布伦瑞克因霍芬街7B D-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心。
发酵培养基
使用的发酵培养基是科汉森公司的专有的素食友好型复合发酵培养基。
阴性对照
使用厌氧复合发酵培养基作为阴性对照培养基。该培养基是科汉森公司的专有的不含血红素来源的素食友好型复合发酵培养基。
阳性对照
使用需氧复合发酵培养基作为阳性对照培养基。该培养基是科汉森公司的专有的包括非素食血红素来源的素食友好型复合发酵培养基。
通过UHT处理(141℃，8-10秒)对培养基进行灭菌。成品培养基的pH值为6.5。
培养物的发酵条件
使用1％(w/w)的上述培养物作为接种物以及上述血红素蛋白之一作为血红素来源，在30℃下通气下在2L实验室规模发酵罐中进行发酵。对于作为阳性对照的需氧发酵，在通气下在科汉森公司专有的包括非素食血红素源的素食友好型复合发酵培养基中应用与需氧发酵相同的条件。对于作为阴性对照的厌氧发酵，应用了与需氧发酵相同的条件，但在科汉森公司的专有的不包括血红素来源的素食友好型复合发酵培养基中不通气。将培养物酸化至pH 6.0。随后通过受控添加27％NH4OH将pH值维持在6.0。
当没有检测到进一步的基础消耗时，将相应的培养物冷却至约10℃。
冷却后，通过离心将培养基中的细菌浓缩6-18倍，随后在液氮中在一个大气压下冷冻成颗粒，以产生所谓的冷冻直投型培养物(F-DVS)。F-DVS颗粒储存于–50℃直至进一步分析。
工艺参数评估
乳酸乳球菌从厌氧生长到呼吸生长时会深刻改变代谢。与厌氧生长相比，生物量大约增加一倍，并且呼吸生长期间产酸减少。呼吸生长的关键特征是溶解氧(DO％)的减少(图1)。与需氧阳性对照相比，使用(血红素蛋白，9％w/w)的呼吸发酵工艺显示出相似的溶解氧(DO％)。
总之，根据图1中的工艺曲线，使用作为血红素蛋白的呼吸发酵过程与需氧阳性对照(图1，非素食血红素来源)一样好，以支持呼吸生长。
下游工艺评估
发酵后，对发酵物进行细胞压积(PCV)测试(在特殊离心管中对发酵物进行离心)。这是生物量的第一个指征。PCV测试表明，使用发酵在PCV中产生的细菌细胞水平与需氧阳性对照过程大致相同，而厌氧阴性对照则导致较低PCV水平(数据未显示)。
由受理局填写
由国际局填写

Claims (27)

1.一种获得微生物培养物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在通气下在培养基中培养至少一种微生物菌株并获得发酵物，
(ii)从所述发酵物收获所述微生物菌株以获得所述微生物培养物，
其中所述培养基包含至少一种血红素蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述血红素蛋白是具有天然生物催化活性的蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述血红素蛋白是酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述血红素蛋白是不具有天然生物催化活性的蛋白。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵物中的耗氧量在小于10小时或小于8小时内达到0.04mol O2/L/h。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述血红素蛋白是微生物产生的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述血红素蛋白由曲霉属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)或埃希氏菌属(Escherichia)的表达而产生。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述血红素蛋白是过氧化氢酶或过氧化物酶。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述血红素蛋白被添加为约0.1g/kg发酵物至约10g/kg发酵物的浓度。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：
(iii)浓缩所述微生物培养物以获得浓缩的微生物培养物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：
(iv)冷冻或干燥所述微生物培养物以获得冷冻的微生物培养物或干燥的微生物培养物。
12.根据权利要求10或11所述的方法，所述方法进一步包括：
(v)包装步骤(iv)中获得的所述冷冻的微生物培养物或所述干燥的微生物培养物。
13.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述血红素蛋白是灭活的血红素蛋白。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述热灭活的血红素蛋白是热灭活的。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基不包含非素食合规血红素蛋白。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述血红素蛋白是过氧化氢酶，例如
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基进一步包含选自由多元醇、糖、生物聚合物、氨基酸、盐、聚合物和非离子洗涤剂组成的组的热稳定化合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述热稳定化合物选自由以下组成的组：山梨糖醇、甘油、丙二醇、甘露糖醇、木糖醇、丙二醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果聚糖(果糖同多糖)、葡聚糖、硫酸葡聚糖、明胶(A型和B型)、羟乙基淀粉、聚-L-谷氨酸、聚-L-赖氨酸、岩藻多糖、戊聚糖聚硫酸盐、角质素硫酸盐、聚天冬氨酸盐、聚谷氨酸盐、羟乙基纤维素、羟丙基-β-环糊精、甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙酸盐、柠檬酸盐、氯化钠、磷酸盐、抗坏血酸盐、用正辛胺和异丙胺随机改性的聚丙烯酸(A8-35)、聚乙二醇(PEG)、聚硫酸乙烯酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、TritonX-100、Pluronic F68、Pluronic F88、Pluoronic F-127、Brij 35(聚氧乙烯烷基醚)。
19.一种培养物，其能够通过根据权利要求1-18中任一项所述的方法获得。
20.一种培养物或培养基，其包含至少一种血红素蛋白。
21.根据权利要求20所述的培养物或培养基，其中所述血红素蛋白是过氧化氢酶。
22.根据权利要求21所述的培养物或培养基，其进一步包含选自由多元醇、糖、生物聚合物、氨基酸、盐、聚合物和非离子洗涤剂组成的组的热稳定化合物。
23.根据权利要求22所述的培养物或培养基，其中所述热稳定化合物选自由以下组成的组：山梨糖醇、甘油、丙二醇、甘露糖醇、木糖醇、丙二醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果聚糖(果糖同多糖)、葡聚糖、硫酸葡聚糖、明胶(A型和B型)、羟乙基淀粉、聚-L-谷氨酸、聚-L-赖氨酸、岩藻多糖、戊聚糖聚硫酸盐、角质素硫酸盐、聚天冬氨酸盐、聚谷氨酸盐、羟乙基纤维素、羟丙基-β-环糊精、甘氨酸、L-精氨酸盐酸盐、精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙酸盐、柠檬酸盐、氯化钠、磷酸盐、抗坏血酸盐、用正辛胺和异丙胺随机改性的聚丙烯酸(A8-35)、聚乙二醇(PEG)、聚硫酸乙烯酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、Triton X-100、Pluronic F68、Pluronic F88、Pluoronic F-127、Brij 35(聚氧乙烯烷基醚)。
24.一种制备食品、饲料产品、药品、乳制品调味剂和奶酪调味产品的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求19至23中任一项所述的培养物添加至食品、饲料产品或药品的起始材料并将接种的培养物保持在所述至少一种微生物菌株具有代谢活性的条件下。
25.一种发酵食品、饲料产品或药品，其能够通过根据权利要求1-18中任一项所述的方法获得。
26.至少一种血红素蛋白在发酵方法和/或发酵工艺中的用途。
27.一种食品、饲料产品、药品、乳制品调味剂或奶酪调味产品，其包含根据权利要求19至23中任一项所述的培养物。
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