CN119020405A - 一种橡胶树HbSPL16基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种与乳管发育相关的基因，命名为橡胶树HbSPL16基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1，本发明还提供了所述基因编码的蛋白质。本发明从橡胶树中克隆获得橡胶树HbSPL16基因，研究显示该基因与橡胶树乳管发育相关，而且其表达受冠菌素诱导显著上调表达，将该基因转化蒲公英可以显著增加蒲公英乳管细胞和乳管数量，在今后转基因改良产胶植物橡胶树和蒲公英的乳管数量及天然橡胶产量等方面具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种橡胶树HbSPL16基因及其应用。
背景技术
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.，简称橡胶树）为大戟科橡胶树属乔木，原产于南美洲的亚马逊河流域，主要分布于热带地区。世界上98%以上的天然橡胶主要来源于橡胶树。乳管是天然橡胶合成和储存的场所。树干树皮中的乳管数量与天然橡胶产量显著正相关（Hao B Z, Wu J L. Biology of laticifers in Hevea and latexproduction. Chinese Journal Trop Crops, 2004, 25(4): 1-7）。因此，乳管发育的调控机制是橡胶树生物育种中迫切需要解决的科学问题，对于提高天然橡胶的产量至关重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种橡胶树HbSPL16基因及其应用。
本发明的第一个方面是提供一种与乳管发育相关的基因，命名为橡胶树HbSPL16基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面基因编码的蛋白质。
本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述基因的重组载体。
其中，所述重组载体原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pB7WG2D载体等，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。
本发明的第四个方面是提供含有本发明第一个方面基因的宿主菌或转基因细胞系或重组菌。
本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白质、或者本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌或转基因细胞系或重组菌在增加植物乳管细胞和/或乳管数量中的应用。
优选地，所述植物为蒲公英。
其中，本发明第一个方面所述的基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白质、或者本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌或转基因细胞系或重组菌增加植物乳管细胞和/或乳管数量但不改变植物表型。
本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白质在响应受冠菌素中的应用。
其中，本发明第一个方面所述的基因、或者本发明第二个方面所述的蛋白质受冠菌素诱导显著上调表达。
本发明的第七个方面是提供一种引物对，所述引物对为：pB7WG2D-HbSPL16-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGGCTATAATCTTAAGACATCTT -3’ 和pB7WG2D-HbSPL16-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTACTCCCAAGAGAAGGAAAGTG-3’ ；或者所述引物对为HbSPL16-F：5’- ATGGGCTATAATCTTAAGACATCTT -3’和 HbSPL16-R：5’-TTACTCCCAAGAGAAGGAAAGTG -3’；或者所述引物对为HbSPL16-qF：5’-CGGTGCAAACCAAGTCCCTA -3’ 和HbSPL16-qR：5’- CCCTCGTCAAACTCCACCAA -3’。
本发明从橡胶树中克隆获得橡胶树HbSPL16基因，研究显示该基因与橡胶树乳管发育相关，而且其表达受冠菌素诱导显著上调表达，将该基因转化蒲公英可以显著增加蒲公英乳管细胞和乳管数量，在今后转基因改良产胶植物橡胶树和蒲公英的乳管数量及天然橡胶产量等方面具有重要的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中橡胶树HbSPL16基因在冠菌素（COR）处理下的树皮中的表达模式，HbSPL16基因受COR诱导表达上调。
图2为橡胶树HbSPL16基因转化蒲公英植株的抗性基因Bar及HbSPL16基因的PCR检测，A图为抗性基因Bar的PCR检测结果，B图为HbSPL16基因的PCR检测结果。
图3为野生型蒲公英（WT）和过表达HbSPL16基因的蒲公英（HbSPL16-OE）中HbSPL16基因荧光定量表达检测结果。
图4为野生型蒲公英（WT）和过表达HbSPL16基因的蒲公英（HbSPL16-OE）植株根部显微结构图。A图是野生型蒲公英，B图、C图、D图分别为过表达蒲公英株系。红色箭头表示乳管细胞。标尺Bar=500 μm。
图5为野生型蒲公英（WT）和过表达HbSPL16基因的蒲公英（HbSPL16-OE）根部乳管细胞指数统计。
图6为野生型蒲公英（WT）和过表达HbSPL16基因的蒲公英植株。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：HbSPL16基因的克隆
以橡胶树热研7-33-97内层树皮为材料，采用TIANGEN公司DNAsecure 新型植物基因组 DNA 提取试剂盒（DP320）进行基因组DNA的提取，以基因组DNA为模板，采用TaKaRa公司PrimeSTAR® Max DNA Polymerase Ver.2，以特异引物序列对HbSPL16基因进行PCR扩增。所用的正向引物pB7WG2D-HbSPL16-F为：5’- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGGCTATAATCTTAAGACATCTT -3’ ；反向引物pB7WG2D-HbSPL16-R为：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTACTCCCAAGAGAAGGAAAGTG-3’ 。PCR扩增体系为50ul：PrimeSTAR Max Ver.2Premix (2X) 25 μL，正、反向引物（10 μM）各2.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O为18 μL。PCR扩增程序为：95 °C预变性2 min；98 °C变性10 s，60 °C退火15 s，68 °C延伸20 s，共设置30个循环；72 °C延伸7 min。
PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的条带，将目的条带经过Gateway方法连接到植物过表达载体pB7WG2D中，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆进行测序（上海生物工程有限公司），获得HbSPL16基因的编码区序列如SEQ ID No:1所示，其编码的蛋白质如SEQ ID No:2所示。
实施例2：橡胶树HbSPL16在冠菌素（COR）处理下的树皮中的表达分析
采用20 μM的COR处理橡胶树热研7-33-97萌条第二伸长单位，于处理1小时（1 h），2 h，4 h，8h，1天（d），2 d，3 d后采集内层树皮采用TIANGEN公司的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)进行总RNA的提取，对照为水处理。将COR处理的早期响应的1小时（1 h），2 h，4 h的RNA混合后建库进行转录组测序，命名为COR-A，对照为Control-A。将COR处理的晚期响应的8小时（8 h），1 d，2 d，3 d的RNA混合后建库进行转录组测序，命名为COR-B，对照为Control-B。通过转录组测序，以热研7-33-97基因组为内参基因进行转录组注释和差异分析，结果表明，与对照相比，橡胶树萌条内层树皮中的HbSPL16表达受COR处理上调表达（图 1）。
实施例3：HbSPL16基因转化蒲公英
1、转基因蒲公英的获得和鉴定
将实施例1获得的测序正确菌株扩大培养，根据质粒DNA小量纯化试剂盒（宝日医生物技术(北京)有限公司）说明书进行质粒提取，利用热激发将带有HbSPL16基因的pB7WG2D质粒转化到农杆菌AGL1菌株，得到含有pB7WG2D-35S::HbSPL16的根癌农杆菌AGL1。
将含pB7WG2D-35S::HbSPL16的根癌农杆菌AGL1侵染蒲公英根段进行遗传转化，采用Basta进行抗性筛选，获得抗性苗。通过PCR鉴定Basta抗性基因BAR和HbSPL16基因从抗性苗中筛选转基因阳性植株。具体方法：提取蒲公英叶片的基因组DNA，采用BAR和HbSPL16基因的引物进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，BAR基因和HbSPL16基因的PCR产物片段长度分别为509 bp和1149 bp；如果BAR基因和HbSPL16基因的PCR产物均具有特异性条带，则该植株为转基因植株(又称为过表达植株)。将重组质粒pB7WG2D-35S:: HbSPL16作为阳性对照，水和野生型蒲公英的基因组DNA作为阴性对照，部分植株的电泳图见图2。引物序列为BAR-F：5’- GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC -3’，BAR-R：5’- CTACCATGAGCCCAGAACGA -3’ ;HbSPL16-F：5’- ATGGGCTATAATCTTAAGACATCTT -3’， HbSPL16-R：5’- TTACTCCCAAGAGAAGGAAA GTG -3’ 。
2、转pB7WG2D-35S:: HbSPL16阳性植株表达量检测及表型分析
取野生型和转基因阳性植株根段，根据TIANGEN公司的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)的说明书进行总RNA的提取。通过thermoscientific公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit进行RNA的反转录。以反转录的cDNA为模板，采用TaKaRa公司的TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) 进行定量表达分析。反应体系：TB Green Premix Ex Taq II (2X) (Tli RNaseH Plus) 10μl，HbSPL16-qF 引物 (10 μM) 0.4μl，HbSPL16-qR 引物 (10μM) 0.4μl，cDNA 1μl，加ddH2O补足至20μl。 反应程序： 95℃ 2min；94℃ 10s，60℃ 20s, 72℃ 30s, 45个循环；溶解曲线分析。引物序列为TkGAPDH-qF：5’-AGTTGGTTTCGTGGTATGAC -3’ ，TkGAPDH-qR：5’-ACATGTCAGTGAACAGGTAGAC -3’ ; HbSPL16-qF：5’- CGGTGCAAACCAAGTCCCTA -3’ ，HbSPL16-qR：5’- CCCTCGTCAAACTCCACCAA -3’。以TkGAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt计算野生型和转基因植株根部HbSPL16基因的相对表达量。荧光定量结果分析表明，HbSPL16基因过表达株系HbSPL16-OE1, HbSPL16-OE2, HbSPL16-OE3与野生型植株相比，表达量显著上调（图 3）。
对这3个转基因株系与野生型（WT）的根部进行石蜡切片，用于根部显微结构分析。具体方法为：将切下来的根部材料置于80%乙醇中固定24h，参照橡胶树乳管的显示方法（田维敏，史敏晶，谭海燕，吴继林，郝秉中 著，《橡胶树树皮结构与发育》，北京：科学出版社），通过梯度脱水，碘溴染色，石蜡包埋进行切片，然后置于光学显微镜下观察。乳管细胞指数用ImageJ软件进行统计，表示乳管面积占整个根面积的比例。结果显示，转基因植株中的乳管细胞明显增多（图 4），统计结果表明，野生型WT平均乳管指数为0.213，而三个转基因株系HbSPL16-OE1, HbSPL16-OE2, HbSPL16-OE3平均乳管指数分别为0.661、0.759、1.211，均与对照之间有显著性差异（p<0.05）（图5），而转基因植株与野生型植株表型并无明显差异（图6）。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (5)
1.橡胶树HbSPL16基因、或者橡胶树HbSPL16基因编码的蛋白质、或者含有橡胶树HbSPL16基因的重组载体、或者含有橡胶树HbSPL16基因的宿主菌或转基因细胞系或重组菌在增加蒲公英乳管细胞和/或乳管数量中的应用；所述的橡胶树HbSPL16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的橡胶树HbSPL16基因、或者橡胶树HbSPL16基因编码的蛋白质、或者含有橡胶树HbSPL16基因的重组载体、或者含有橡胶树HbSPL16基因的宿主菌或转基因细胞系或重组菌增加蒲公英乳管细胞和/或乳管数量但不改变蒲公英表型。
3.橡胶树HbSPL16基因、或者橡胶树HbSPL16基因编码的蛋白质在响应受冠菌素中的应用；所述的橡胶树HbSPL16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，橡胶树HbSPL16基因、或者橡胶树HbSPL16基因编码的蛋白质受冠菌素诱导显著上调表达。
5.一种引物对，其特征在于，所述引物对为pB7WG2D-HbSPL16-F：5’- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGGCTATAATCTTAAGACATCTT -3’ 和pB7WG2D-HbSPL16-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTTACTCCCAAGAGAAGGAAAGTG-3’ ；或者
所述引物对为HbSPL16-F：5’- ATGGGCTATAATCTTAAGACATCTT -3’和 HbSPL16-R：5’-TTACTCCCAAGAGAAGGAAAGTG -3’；或者
所述引物对为HbSPL16-qF：5’- CGGTGCAAACCAAGTCCCTA -3’ 和HbSPL16-qR：5’-CCCTCGTCAAACTCCACCAA -3’。
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