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CN118994301B - 一种中药小分子偶联化合物及其在耐药性肿瘤中的应用 - Google Patents

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CN118994301B CN202411103212.2A CN202411103212A CN118994301B CN 118994301 B CN118994301 B CN 118994301B CN 202411103212 A CN202411103212 A CN 202411103212A CN 118994301 B CN118994301 B CN 118994301B
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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种中药小分子偶联化合物及其在耐药性肿瘤中的应用。本发明利用对组织蛋白酶响应的Val‑Cit连接子以及对PH响应的linker连接子将川楝素和木犀草素偶联，得到了一种结构新颖的中药小分子偶联化合物；本发明得到的中药小分子偶联化合物具有良好的抗肿瘤效果以及肿瘤靶向性，可提高类药物在肿瘤组织中的浓度，减少药物对正常组织的毒副作用，而且，偶联的川楝素和木犀草素能够协同抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡，并具有逆转非小细胞肺癌对奥希替尼的耐药作用。

Description

一种中药小分子偶联化合物及其在耐药性肿瘤中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种中药小分子偶联化合物及其在耐药性肿瘤中的应用。
背景技术
肺癌作为全球范围内发病率和死亡率均居高不下的恶性肿瘤，严重威胁着人类的生命健康。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常见的肺癌类型，约占肺癌总数的80％。随着分子生物学和肿瘤学研究的不断深入，靶向治疗已成为肺癌治疗的重要手段之一。表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，如奥希替尼，在肺癌治疗中取得了显著的疗效。然而，EGFR-TKI类药物会不可避免地出现耐药现象，这成为制约其临床应用和患者长期生存的关键瓶颈。
EGFR-TKI耐药机制复杂多样，包括EGFR基因的二次突变、旁路激活、下游信号通路的重新激活以及肿瘤微环境的改变等。其中，EGFR基因的T790M突变是第一代和第二代EGFR-TKI耐药的常见原因，而第三代EGFR-TKI奥希替尼在初始治疗效果显著后，也逐渐出现了包括C797S突变在内的多种耐药机制。这些耐药问题的出现，使得肺癌患者的治疗陷入困境，迫切需要新的治疗策略来克服耐药，延长患者的生存时间和提高生活质量。
在探寻克服EGFR-TKI耐药的策略中，联合用药是一种常见的思路。然而，传统的联合用药方案往往存在药物相互作用、毒性叠加以及治疗依从性差等问题。因此，开发新型的药物组合或创新的药物形式成为研究的热点。
中药在我国有着悠久的应用历史和丰富的临床经验，其中许多中药小分子化合物具有潜在的抗肿瘤活性。川楝素和木犀草素就是两种具有良好生物活性的中药小分子。川楝素是从川楝皮中提取的一种四环三萜类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、调节免疫等多种生物学活性。研究表明，川楝素能够抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡，并具有一定的逆转肿瘤多药耐药的作用。木犀草素则广泛存在于多种植物中，是一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用。木犀草素能够通过调节多种信号通路，抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移，同时其还具有一定的心脏保护作用。
鉴于川楝素和木犀草素的潜在抗肿瘤活性以及它们在作用机制上的互补性，若将川楝素和木犀草素通过化学键连接起来，构建成一个中药小分子偶联化合物，有望为克服EGFR-TKI的耐药作用提供新的思路和方法。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种中药小分子偶联化合物及其在耐药性肿瘤中的应用，该中药小分子偶联化合物具有良好的抗肿瘤效果以及肿瘤靶向性，并具有逆转非小细胞肺癌对奥希替尼的耐药作用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明技术方案之一：
一种中药小分子偶联化合物，所述中药小分子偶联化合物由川楝素和木犀草素通过对组织蛋白酶响应的Val-Cit连接子以及对PH响应的linker连接子偶联得到的。
进一步地，所述中药小分子偶联化合物的结构式为：
本发明技术方案之二：
上述中药小分子偶联化合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
进一步地，所述肿瘤为非小细胞肺癌。
进一步地，所述非小细胞肺癌为对奥希替尼耐药的非小细胞肺癌。
本发明技术方案之三：
一种预防和/或治疗肿瘤的药物，所述预防和/或治疗肿瘤的药物的活性成分包括上述中药小分子偶联化合物或其药学上可接受的盐。
本发明提供的一种预防和/或治疗肿瘤的药物，包括安全有效量范围内的活性成分，即本发明所述的中药小分子偶联化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料；
其中，专业术语“安全有效量”是指：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用；
其中，专业术语“药学上可接受的辅料”是指：一种或多种相容性固体/液体填料或凝胶物质，适合于人，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性；
其中，专业术语“相容性”是指：固体/液体填料或凝胶物质能和本发明的活性成分中药小分子偶联化合物或其药学上可接受的盐相互掺和，而不显著降低活性成分中药小分子偶联化合物或其药学上可接受的盐的药效；
药学上可接受的辅料包括：纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂和无热原水等；
在施用本发明提供的一种预防和/或治疗肿瘤的药物时，是将安全有效量的活性成分中药小分子偶联化合物或其药学上可接受的盐施用于需要治疗的哺乳动物(人)体内，其中，施用剂量为药学上认为的有效给药剂量，具体施用剂量应考虑给药途径、病人健康状况等因素，属于本领域技术人员的常规技术手段；
本发明提供的一种预防和/或治疗肿瘤的药物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括但不限于：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内/皮下)；
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂；
所述用于口服给药的固体剂型由活性成分与至少一种常规惰性赋形剂或载体混合，如柠檬酸钠、磷酸二钙，或与下述成分混合：
(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；
(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；
(c)保湿剂，例如，甘油；
(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；
(e)缓溶剂，例如，石蜡；
(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；
(g)润湿剂，例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；
(h)吸附剂，例如，高岭土；
(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物；
所述用于口服给药的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣、聚合物质、蜡类物质或其他本领域公知材料，采用包衣和壳材制备的用于口服给药的固体剂型能够将活性成分中药小分子偶联化合物或其药学上可接受的盐在消化道内进行缓释，提高药效；
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂；除活性成分中药小分子偶联化合物或其药学上可接受的盐外，用于口服给药的液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等；除了这些惰性稀释剂外，液体剂型也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料；
用于肠胃外注射的药剂包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末，适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂(包括水、乙醇、多元醇)以及适宜的混合物；
本发明所述的中药小分子偶联化合物可以单独给药，还可以与已知的治疗或改进相似病状的其他药物联用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明利用对组织蛋白酶响应的Val-Cit连接子以及对PH响应的linker连接子将川楝素和木犀草素偶联，得到了一种结构新颖的中药小分子偶联化合物；
本发明得到的中药小分子偶联化合物具有良好的抗肿瘤效果以及肿瘤靶向性，可提高类药物在肿瘤组织中的浓度，减少药物对正常组织的毒副作用，而且，偶联的川楝素和木犀草素能够协同抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡，并具有逆转非小细胞肺癌对奥希替尼的耐药作用；
本发明得到的中药小分子偶联化合物中的二肽连接子Val-Cit是组织蛋白酶B的特异性识别序列，而组织蛋白酶B主要在肿瘤相微环境中高度表达；此外，在正常的人体组织中，pH值约为7.4，而肿瘤细胞所处的微环境呈微酸性，pH值可低至6.5左右，并且在肿瘤细胞的不同阶段，其内涵体/溶酶体所具有的pH值亦不相同：早期肿瘤细胞中内涵体及溶酶体的pH值约为6.0，晚期pH值则约为5.0；利用肿瘤微环境中具有高组织蛋白酶B浓度及低pH值的特性，本发明设计的具有组织蛋白酶B和酯酶肿瘤微环境双响应的中药小分子偶联化合物能够实现在肿瘤部位的精准释药，具有肿瘤响应性，减少了药物的全身毒性，可以大大降低药物的毒副作用，提高其用药安全性。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1为本发明中药小分子偶联化合物LT-19的结构式；
图2为本发明中药小分子偶联化合物LT-19的核磁共振氢谱图；
图3为本发明中药小分子偶联化合物LT-19的核磁共振碳谱图；
图4为CCK8实验LT-19对PC9/OR的IC50检测结果图；
图5为CCK8实验奥希替尼对PC9/OR的IC50检测结果图；
图6为使用Synergy Finder进行LT-19与奥希替尼的协同指数计算结果；
图7为LT-19的Transwell迁移实验检测结果，其中A为Blank组视野观察结果，B为5μM奥希替尼组视野观察结果，C为50nMLT-19组视野观察结果，D为5μM奥希替尼+50nmLT-19组视野观察结果，E为视野细胞数量对比；
图8为LT-19的流式凋亡实验检测结果，其中A为Blank组，B为5μM奥希替尼组，C为50nMLT-19组，D为5μM奥希替尼+50nmLT-19组，E为细胞凋亡百分比对比；
图9为LT-19的Edu细胞增殖实验检测结果，其中A为荧光检测结果，B为Edu细胞百分比对比；
图10为LT-19的彗星实验检测结果，其中A为Blank组，B为5μM奥希替尼组，C为50nMLT-19组，D为5μM奥希替尼+50nm LT-19组。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中，所有试剂、材料和原料均从商业途径获得。
实施例
一种中药小分子偶联化合物LT-19，其结构式如下所示：
其是由川楝素和木犀草素通过对组织蛋白酶响应的Val-Cit连接子以及对PH响应的linker连接子偶联得到的。
对实施例得到的中药小分子偶联化合物进行核磁共振氢谱扫描，核磁共振氢谱图如图2所示，氢谱数据如下所示；
1HNMR:δ7.64(5H),7.62(1H),7.37(1H),7.20(1H),6.95(4H),6.81(1H),6.74(1H),6.45(2H),6.23(1H),6.08(1H),5.82(1H),5.53(5H),5.37(5H),4.87(1H),4.30(1H),4.21(2H),4.20(2H),4.19(1H),4.00(2H),3.56(2H),3.47(2H),3.33(1H),3.15(2H),2.79(2H),2.62(1H),2.42(1H),2.06(6H),1.96(1H),1.90(4H),1.72(2H),1.63(1H),1.57(2H),1.26(3H),1.13(6H),0.87(3H),0.85(3H).
对实施例得到的中药小分子偶联化合物进行核磁共振碳谱扫描，核磁共振碳谱图如图3所示，碳谱数据如下所示；
13CNMR:δ210.70(1C),182.75(1C),173.90(1C),171.90(1C),171.00(1C),170.74(1C),170.25(1C),169.40(1C),162.53(1C),162.13(1C),161.10(1C),156.90(1C),155.30(1C),154.80(1C),146.10(1C),145.60(1C),142.70(1C),140.20(1C),138.09(1C),137.65(1C),133.00(1C),131.02(1C),129.88(4C),122.50(1C),122.00(1C),119.90(1C),117.90(4C),115.90(1C),114.00(1C),110.60(1C),107.95(1C),105.40(1C),104.38(1C),100.40(1C),98.80(1C),78.60(1C),76.80(1C),75.70(2C),72.40(1C),62.50(1C),62.10(1C),61.00(1C),58.80(1C),52.10(1C),51.50(1C),50.00(1C),45.91(1C),44.00(1C),42.50(1C),41.02(1C),40.80(2C),40.40(1C),34.50(1C),32.70(1C),30.64(1C),27.30(1C),26.70(2C),26.23(1C),25.35(1C),21.00(2C),19.00(1C),18.80(1C),13.02(1C).
由图2和图3可知，本发明成功偶联得到了川楝素-木犀草素中药小分子偶联化合物，该川楝素-木犀草素中药小分子偶联化合物记为LT-19。
效果验证
1、LT-19与奥希替尼的协同实验
利用CCK8实验验证LT-19是否与EGFR-TKI三代药物奥希替尼具有协同耐药性，其实验步骤如下：
1.1分别检测LT-19与奥希替尼对PC9/OR的I C50
(1)将对数生长期的PC9/OR细胞接种于96孔板中(100μL/孔)，每孔细胞数设定为5×103个，完全培养基，在37℃、5％ CO2的培养箱中培养12h；
(2)将LT-19 100mM母液与奥希替尼100mM母液分别配制成浓度为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM、0.78125μM、0.390μM、0.195μM、0.0977μM、0.0488μM和0.0244μM的药物稀释液，之后将药物稀释液加入到步骤(1)培养12h后的96孔板中，在37℃、5％ CO2的培养箱中培养24h；
(3)将步骤(2)培养24h后的96孔板用PBS清洗两次，之后每孔加入100μL预混好的CCK8液(完全培养基∶CCK8工作液＝9∶1)，于37℃、5％ CO2的培养箱中继续培养2h；
(4)步骤(3)继续培养2h后，利用酶标仪在450nm波长处测定各孔吸光度D(λ)，分析实验组、对照组以及调零组的D(λ)值，组别如下所示，计算细胞存活率，细胞存活率反应了药物的细胞毒性；
实验组：含有PC9/OR细胞、CCK-8、待测药物；
对照组：含有PC9/OR细胞、CCK-8，不含待测药物；
调零组：含有CCK-8，不含PC9/OR细胞、待测药物；
CCK8实验LT-19对PC9/OR的I C50检测结果图如图4所示，CCK8实验奥希替尼对PC9/OR的I C50检测结果图如图5所示；
由图4和图5可知，LT-19对PC9/OR的I C50为82.46nM，奥希替尼对PC9/OR的I C50为3.952μM，这表明LT-19与奥希替尼对PC9/OR均具有一定的抑制作用；
1.2基于LT-19与奥希替尼对PC9/OR的I C50进行LT-19与奥希替尼的协同实验，并利用Synergy Fi nder协同软件计算协同系数
(1)将对数生长期的PC9/OR细胞接种于96孔板中(100μL/孔)，每孔细胞数设定为5×103个，完全培养基，在37℃、5％ CO2的培养箱中培养12h；
(2)LT-19的I C50为82.46nM，在此基础下，选择400nM、200nM、100nM、50nM、25nM、1.25nM和0nM七个浓度进行协同实验；奥希替尼的I C50为3.952μM，在此基础下，选择20μM、10μM、5μM、2.5μM、12.5μM、6.25μM和0μM七个浓度进行协同实验；将不同浓度的LT-19与奥希替尼混合，之后将混合后的药物加入到步骤(1)培养12h后的96孔板中，在37℃、5％ CO2的培养箱中培养24h；
(3)将步骤(2)培养24h后的96孔板用PBS清洗两次，之后每孔加入100μL预混好的CCK8液(完全培养基∶CCK8工作液＝9∶1)，于37℃、5％ CO2的培养箱中继续培养2h；
(4)步骤(3)继续培养2h后，利用酶标仪在450nm波长处测定各孔吸光度D(λ)，分析实验组、对照组以及调零组的D(λ)值，组别如下所示，计算细胞存活率，细胞存活率反应了药物的细胞毒性；
实验组：含有PC9/OR细胞、CCK-8、待测药物；
对照组：含有PC9/OR细胞、CCK-8，不含待测药物；
调零组：含有CCK-8，不含PC9/OR细胞、待测药物；
将存活率计算结果输入到Synergy Finder网站中，进行协同指数的计算，使用Synergy Finder进行LT-19与奥希替尼的协同指数计算结果如图6所示；
由图6可知，LT-19与奥希替尼的协同指数(HSA)为11.95，这表明LT-19与奥希替尼之间存在着一定的协同作用(HSA值在0以下为拮抗作用、在0～10为相加作用、10以上为协同作用)；此外，当LT-19的浓度为50nM，奥希替尼的浓度为5μM时，LT-19与奥希替尼具有最佳的协同作用；
2、PC9/OR细胞的Transwell迁移实验
2.1将对数生长期的PC9/OR细胞以2×105/mL的接种密度接种于6孔板中，完全培养基，在37℃、5％ CO2的培养箱中培养至细胞密度达到90％，之后将6孔板中的完全培养基更换为不含FPS的培养基，饥饿处理24h以去除血清对实验的影响；
2.2将步骤2.1饥饿处理后的PC9/OR细胞用胰酶消化，之后用不含FPS的培养基重悬细胞，细胞计数仪计数，调整细胞浓度为5×105/mL，得到细胞悬液；
2.3将600μL含10％血清的培养基加入到Transwell嵌套24孔板的24孔板中，取100μL步骤2.2得到的细胞悬液，加入到Transwell嵌套24孔板的Transwell小室中，将加入细胞悬液后的Transwell嵌套24孔板分为四组，分别为Blank组、5μM奥希替尼组、50nMLT-19组以及5μM奥希替尼+50nmLT-19组，其中，Blank组在Transwell小室中不加入任何药物，5μM奥希替尼组在Transwell小室中加入5μM奥希替尼，50nMLT-19组在Transwell小室中加入50nMLT-19，5μM奥希替尼+50nmLT-19组在Transwell小室中加入5μM奥希替尼和50nmLT-19，之后将Transwell嵌套24孔板置于37℃、5％ CO2的培养箱中常规培养24h；
2.4步骤2.3常规培养24h后，取出Transwell小室，弃去培养基，PBS清洗两次，甲醇固定15min，适当风干，0.1％结晶紫染色20min，擦除上层未迁移细胞，PBS清洗三次，4倍显微镜下随机五个视野观察细胞，记数；
LT-19的Transwell迁移实验检测结果如图7所示，其中A为Blank组视野观察结果，B为5μM奥希替尼组视野观察结果，C为50nMLT-19组视野观察结果，D为5μM奥希替尼+50nmLT-19组视野观察结果，E为视野细胞数量对比；
由图7可知，LT-19可以逆转PC9/OR细胞出现的奥希替尼耐药作用。
3、流式凋亡实验
3.1将对数生长期的PC9/OR细胞以2×105/mL的接种密度接种于12孔板中，完全培养基，在37℃、5％ CO2的培养箱中培养24h；
3.2将步骤3.1培养24h后12孔板分为四组，分别为Blank组、5μM奥希替尼组、50nMLT-19组以及5μM奥希替尼+50nm LT-19组，其中，Blank组不加入任何药物，5μM奥希替尼组加入5μM奥希替尼，50nM LT-19组加入50nM LT-19，5μM奥希替尼+50nm LT-19组加入5μM奥希替尼和50nmLT-19，之后在37℃、5％ CO2的培养箱中培养24h；
3.3将步骤3.2培养24h后的PC9/OR细胞用胰酶消化，PBS清洗，保证将胰酶完全清洗，细胞计数仪计数，调整细胞浓度为1×105/mL，得到细胞悬液；
3.4将步骤3得到的细胞悬液加入到1.5mL的离心管中，1000g离心，去除上清液，之后加入5μL AnnexinV-FITC染液和10μL PI染液，常温避光孵育10～20min，之后利用贝克曼流式细胞仪对孵育后的细胞进行流式凋亡检测，并用Flowjo软件进行数据分析；
LT-19的流式凋亡实验检测结果如图8所示，其中A为Blank组，B为5μM奥希替尼组，C为50nM LT-19组，D为5μM奥希替尼+50nm LT-19组，E为细胞凋亡百分比对比；
由图8可知，当联用50nM LT-19时，耐药细胞恢复了对奥希替尼的敏感性。
4、Edu细胞增殖实验
4.1将对数生长期的PC9/OR细胞接种于96孔板中(100μL/孔)，每孔细胞数设定为5×103个，完全培养基，在37℃、5％ CO2的培养箱中培养12h；
4.2将步骤4.1培养24h后96孔板分为四组，分别为Blank组、5μM奥希替尼组、50nMLT-19组以及5μM奥希替尼+50nm LT-19组，其中，Blank组不加入任何药物，5μM奥希替尼组加入5μM奥希替尼，50nM LT-19组加入50nM LT-19，5μM奥希替尼+50nm LT-19组加入5μM奥希替尼和50nmLT-19，之后在37℃、5％ CO2的培养箱中培养24h；
4.3利用完全培养基将10mM EdU稀释为2×EdU工作溶液，之后预热2×EdU工作溶液，并加入等体积的步骤4.2培养24h后的含有PC9/OR细胞的完全培养基，孵育2h；
4.4待步骤4.3孵育2h后去除培养基，PBS清洗两次，之后每孔加入50mL4％的多聚甲醛，固定15min，固定结束后，弃去多聚甲醛，用含3％ BSA的PBS清洗三次，每次清洗3～5min；
4.5将43μL Click Reaction Buffer、2μL CuSO4、0.1μL Azide488和5μL ClickAdditive Solution混合，配制得到反应体系，之后将配制得到的反应体系加入到96孔板中，避光室温孵育30min，之后用含3％ BSA的PBS清洗三次，每次清洗3～5min；
4.6清洗完成后，每孔加入30μL即用型DAPI染液，避光孵育15min，用含3％ BSA的PBS清洗三次，每次清洗3～5min；
4.7清洗完成后，每孔加入50μL 50％甘油，防止荧光淬灭；
4.8利用高内涵成像系统，分别用405nm通道和488nm通道进行荧光检测；
LT-19的Edu细胞增殖实验检测结果如图9所示，其中A为荧光检测结果，B为Edu细胞百分比对比；
由图9可知，当联用50nM LT-19时，耐药细胞恢复了对奥希替尼的敏感性。
5、彗星实验
5.1将对数生长期的PC9/OR细胞以2×105/mL的接种密度接种于12孔板中，完全培养基，在37℃、5％ CO2的培养箱中培养24h；
5.2将步骤3.1培养24h后12孔板分为四组，分别为Blank组、5μM奥希替尼组、50nMLT-19组以及5μM奥希替尼+50nm LT-19组，其中，Blank组不加入任何药物，5μM奥希替尼组加入5μM奥希替尼，50nM LT-19组加入50nM LT-19，5μM奥希替尼+50nm LT-19组加入5μM奥希替尼和50nmLT-19，之后在37℃、5％ CO2的培养箱中培养24h；
5.3去除培养基，预冷的PBS清洗，离心收集细胞，再用PBS重悬，细胞计数仪计数，调整细胞浓度为1×105/mL，得到细胞悬液；
5.4制片
第一层琼脂糖：在磨砂载玻片上滴加少量正常熔点琼脂糖(1％)，盖上盖玻片使其均匀铺开，在4℃下固化5～10min；
第二层细胞琼脂糖混合液：将20μL步骤5.3得到的细胞悬液与80μL低熔点琼脂糖(1％)混合，得到细胞琼脂糖混合液，之后去除第一层的盖玻片，迅速滴加细胞琼脂糖混合液，盖上盖玻片，使其均匀铺开，在4℃下固化5～10min；
5.5去除盖玻片，将载玻片浸入预冷的裂解液中，在4℃下裂解2h；
6.6取出载玻片，用蒸馏水漂洗，之后将载玻片浸入碱性电泳缓冲液(300mM NaOH、1mM Na2EDTA，pH>13)中，在4℃下解旋20～40min；
6.7调整电泳槽，使液面高出载玻片0.25cm，控制电压为25V，电流为300mA，电泳40min；
6.8电泳结束后，取出载玻片，用中和液(0.4M Tris-HCl，pH7.5)中和三次，每次5min，之后用蒸馏水漂洗；
6.9在载玻片上滴加20μLP I染料，盖上盖玻片，避光孵育20min后在荧光显微镜下观察，随机选取多个视野进行拍照；
LT-19的彗星实验检测结果如图10所示，其中A为Blank组，B为5μM奥希替尼组，C为50nM LT-19组，D为5μM奥希替尼+50nm LT-19组；
由图10可知，当联用50nM LT-19时，奥希替尼恢复了对耐药细胞DNA的损伤能力。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (4)

1.一种中药小分子偶联化合物，其特征在于，所述中药小分子偶联化合物由川楝素和木犀草素通过对组织蛋白酶响应的Val-Cit连接子以及对PH响应的linker连接子偶联得到的；
所述中药小分子偶联化合物的结构式为：
。
2.一种如权利要求1所述的中药小分子偶联化合物在制备恢复非小细胞肺癌对奥希替尼敏感性的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述非小细胞肺癌为对奥希替尼耐药的非小细胞肺癌。
4.一种恢复非小细胞肺癌对奥希替尼敏感性的药物，其特征在于，所述恢复非小细胞肺癌对奥希替尼敏感性的药物的活性成分包括如权利要求1所述的中药小分子偶联化合物或其药学上可接受的盐。
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