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CN118931811B - 一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法和应用

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CN118931811B
CN118931811B CN202411003498.7A CN202411003498A CN118931811B CN 118931811 B CN118931811 B CN 118931811B CN 202411003498 A CN202411003498 A CN 202411003498A CN 118931811 B CN118931811 B CN 118931811B
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riad
bcgw
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夏子涵
陈祥松
袁丽霞
姚建铭
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Hefei Weihe Hexagonal Biotechnology Co ltd
Hefei Zhongke Health Biotechnology Research Institute Co ltd
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Abstract

本申请涉及微生物基因工程技术领域，尤其是涉及一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法和应用。本申请提供了一种高产岩藻糖的工程菌，所述工程菌过表达wbgL、afcA、BCGW基因簇、自组装短肽RIAD‑RIDD和RGG结构域。本申请通过引入无膜细胞器形成的蛋白(RGG)序列和自组装短肽(RIAD‑RIDD)介导通路关键酶WbgL和AcfA组装结合成酶复合物，从而减少代谢中间产物的流失提高产物生产效率，提高产物岩藻糖的产量和产率。

Description

一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本申请涉及微生物基因工程技术领域，尤其是涉及一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
岩藻糖(Fucose，FUC)是一种广泛存在的天然糖，亦称6-脱氧-半乳糖，L岩藻糖是构成母乳低聚糖的五种单糖之一，是人体八种必须糖之一，广泛存在于动物、植物、藻类中，发挥重要的生理功能。L-岩藻糖可调解肠道菌群，调解肠道健康；可与病毒、细菌、毒素结合，阻止其感染细胞，从而增强机体抵抗力。L-岩藻糖具皮肤保湿功能，延缓皮肤衰老，刺激纤维母细胞增生，防止辐射、紫外线等对纤维母细胞造成的伤害。目前，FUC的商业化生产主要包括海藻酸水解提取岩藻多糖再纯化、化学方法已己糖为原料转化和酶水解产岩藻糖的细菌的胞外多糖等方法，这些L-岩藻糖生产方法存在经济效益低，对环境不友好，应用场景有限等问题，因而发明新的L-岩藻糖生产方法具有潜在的应用价值。生物合成法仅需以廉价的碳源和细胞内可再生供体为原料，且以较低的环境代价获得高经济产出，因此具有更为广阔的应用前景。
目前Fuc的微生物合成产量仍然较低，无法满足大批量工业生产的需求。根据前期研究发现，质粒型菌株合成FUC会出现质粒丢失现象，无法稳定高效合成FUC，且FUC合成的限速因素没有确定。另外，2’-FL的过多残留会影响FUC的产物纯化，因此亟需开发一种能够将2’-FL残留量以提高FUC水平的工程菌。
发明内容
本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种利用无膜细胞器提高FUC产量同时降低2’-FL的工程菌及其构建方法和应用。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
第一方面，本申请提供了一种高产岩藻糖的工程菌，所述工程菌过表达α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA、BCGW基因簇、自组装短肽RIAD-RIDD和RGG结构域。
本申请的工程菌过表达α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA、BCGW基因簇能够在体内生物合成岩藻糖。岩藻糖的生物合成过程为：果糖-6-磷酸在基因manA、manB、manC、gmd和wcaG作用下合成GDP-L-岩藻糖，胞外乳糖被β-半乳糖苷通透酶LacY转运至胞内，然后和GDP-L-岩藻糖作用合成2’-FL，2’-FL在α-L-岩藻糖苷酶的作用下分解为乳糖和岩藻糖。本申请通过引入无膜细胞器形成的蛋白(RGG)序列和自组装短肽(RIAD-RIDD)介导通路关键酶WbgL和AcfA组装结合成酶复合物，从而减少代谢中间产物的流失提高产物生产效率，提高产物岩藻糖的产量和产率。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述α-L-岩藻糖苷酶afcA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述BCGW基因簇为整合磷酸甘露糖突变酶manB、甘露糖1-1磷酸鸟苷转移酶manC、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶gmd和GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG的基因簇，所述BCGW基因簇的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述自组装短肽RIAD-RIDD中的RIAD的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述自组装短肽RIAD-RIDD中的RIDD核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；
所述RGG结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。本申请的RGG结构域来自秀丽隐杆线虫的LAF-1蛋白，能够在大肠杆菌体内形成蛋白质凝聚体，将与RGG结构域相连接的RIDD一并整合至大肠杆菌的基因组上，降低了岩藻糖合成过程中由于质粒丢失而导致岩藻糖产量下降的风险。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述自组装短肽中的RIAD位于α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL的N端和/或C端，所述自组装短肽中RIAD的位于α-L-岩藻糖苷酶afcA的C端。在实验的过程中，发明人发现将RIAD与wbgL的N端或C端相连接、与afcA的C端相连接能够有效提高岩藻糖的产量，但是当时RIAD与afcA的N端相连接时岩藻糖的产量大幅度下降。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述工程菌中的α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA和BCGW基因簇的拷贝数比例为α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL：α-L-岩藻糖苷酶afcA：BCGW基因簇＝(1-3)：(1-3)：(1-5)。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述工程菌中的α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA和BCGW基因簇的拷贝数比例为α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL：α-L-岩藻糖苷酶afcA：BCGW基因簇＝3：(2-3)：(4-5)。
本申请通过对岩藻糖合成关键蛋白α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA和BCGW基因簇的拷贝数进行优化，结果发现当wbgL、afcA和BCGW的拷贝数比例为wbgL：afcA：BCGW＝3：(2-3)：(4-5)时，所制备得到的工程菌的岩藻糖产量随着wbgL、afcA和BCGW拷贝数的增加而提高，岩藻糖产量最高可达95.88g/L。
作为本申请所述工程菌的优选实施，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA、BCGW基因簇、自组装短肽RIAD-RIDD和RGG结构域的整合位点包括caiB、lacA、hlyE、wzxC、intQ、ykgH、araA、ydeU、yjiV、yjipQ、ybeQ和rhaA中的至少一种。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述工程菌整合的基因使用的启动子为强启动子，所述强启动子为T7启动子、CaMV启动子、SV40启动子和SFFV启动子中的至少一种。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述工程菌以工程菌A为底盘菌株通过整合带有强启动子的α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA、BCGW基因簇、自组装短肽RIAD-RIDD和RGG结构域制备得到。
作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述工程菌A敲除β-半乳糖苷酶lacZ、岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶基因簇fucIK和磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶wcaj的基因。
本申请通过对底盘菌株大肠杆菌BL21(DE3)进行改造，敲除β-半乳糖苷酶lacZ、岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶基因簇fucIK和磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶wcaj的基因得到工程菌A。
第二方面，本申请提供了上述工程菌的构建方法，包括以下步骤：
S1、利用基因编辑技术将大肠杆菌BL21(DE3)中的β-半乳糖苷酶lacZ、岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶基因簇fucIK和磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶wcaj基因敲除，得到工程菌A；
S2、将α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA和BCGW基因簇整合至步骤S1所得工程菌A中，得到工程菌B；
S3、将自组装短肽中的RIAD连接至α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL N端和/或C端的片段、自组装短肽中RIAD的连接至α-L-岩藻糖苷酶afcA C端的片段和自组装短肽与RGG结构域相连接的片段整合至步骤S2所得工程菌B中，得到高产岩藻糖的工程菌。
作为本申请所述构建方法的优选实施方式，在步骤S1中，所述β-半乳糖苷酶lacZ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶基因簇fucIK的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶wcaj的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第三方面，本申请提供了上述工程菌在生产岩藻糖中的应用。
第四方面，本申请提供了一种岩藻糖的生产方法，主要由上述工程菌通过补料分批发酵得到。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
1、本申请通过对底盘菌株工程菌A进行改造，过表达α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA、BCGW基因簇，使得大肠杆菌能够体内生物合成岩藻糖。
2、本申请通过在wbgL的N端或C端连接自组装短肽RIAD以及在afcA的C端连接自组装短肽RIAD，并将来自秀丽隐杆线虫LAF-1蛋白上的RGG结构域与自组装短肽RIDD连接，能够实现WbgL和AfcA组装成无膜细胞器，在减少中间产物(2’-FL等)的流失以提高岩藻糖产量和产率，实现高产岩藻糖的目的。
3、本申请通过对岩藻糖合成关键蛋白α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA和BCGW基因簇的拷贝数进行优化，结果发现当wbgL、afcA和BCGW的拷贝数比例为wbgL：afcA：BCGW＝(1-3)：(1-3)：(1-5)时，所制备得到的工程菌的岩藻糖产量随着wbgL、afcA和BCGW拷贝数的增加而提高，岩藻糖产量最高可达95.88g/L。
具体实施方式
为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本申请作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在以下实施例中，所采用的基因信息如表1所示。
表1下述实施例中所采用的基因及其信息
下述实施例、对比例中，除特别说明外，所采用的质粒转入感受态细胞或转化的方法均为化学转化；所使用的抗性平板为卡那霉素抗性平板；所筛选得到的阳性转化子均经过PCR检测以及克隆片段测序进行鉴定。
下述实施例、对比例中，出特别说明外，所述克隆均指采用非连接酶依赖型的单片段一步法克隆试剂盒进行克隆，按照试剂盒说明书进行操作，非连接酶依赖型的单片段一步法克隆试剂盒由南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供，货号为C112-02。
微量元素溶液主要由13.74g/L次氮基三乙酸钠盐、5.6g/L柠檬酸铁铵、0.9g/LZnSO2·7H2O、0.2g/L CoCl2·6H2O、1.0g/L MnCl2·4H2O、0.10g/L CuCl2·2H2O、0.2g/LH3BO3、0.2g/L Na2MoO4·2H2O组成，用0.22μm孔径的滤膜进行过滤除菌。
分批补料发酵实验中采用的发酵培养基中包含10g/L初始甘油、4.0g/L(NH4)2SO4、9.2g/L K2HPO4、8.2g/L KH2PO4、0.3g/L柠檬酸、6.0g/L胰蛋白胨、2.0g/L酵母提取物、10mg/L硫胺素、2.0g/L MgSO4·7H2O、0.02g/L CaCl2和10mL/L微量元素溶液。
分批补料发酵实验中采用的进料溶液包括800g/L碳源和5g/LMgSO4·7H2O，所述碳源为葡萄糖和甘油，葡萄糖和甘油的质量比为葡萄糖：甘油＝4:6。
pEcCas载体、pSPIN质粒、pCDFDuet质粒、pRSF质粒、pETDuet质粒和pEcgRNA质粒均由addgene提供。
T7-BCGW、T7-wbgL和T7-afcA的表达盒片段制备方法如下：分别PCR扩增来源于大肠杆菌str.K-12substr.MG1655(GenBank：NC_000913.3)的磷酸甘露糖变位酶manB(GeneID：946574)，α-D-甘露糖1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC(GeneID：946580)，GDP-甘露糖4,6-脱氢酶gmd(GeneID：946562)和GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG(Gene ID：946563)，并通过相应的酶切位点依次插入载体(pRSFDuet-1)构建获得重组质粒pRSFDuet-manC-manB-gmd-wcaG；
根据大肠杆菌O126中α-1,2-岩藻糖基转移酶基因wbgL序列，通过密码子优化和化学合成，获得了α-1,2-岩藻糖基转移酶基因wbGL的序列；以wbgL-F/R为引物对(参见表1)，PCR扩增获得wbgL基因片段，并通过相应的酶切位点插入载体pETDuet-1上，获得重组载体pETDuet-wbgL；
通过密码子优化和化学合成，获得了afcA特异性序列，含afcA的表达盒片段克隆至pETDuet-1质粒中，得到pETD-afcA质粒；
通过PCR技术在上述质粒(pRSFDuet-manC-manB-gmd-wcaG、pETDuet-wbgL和pETD-afcA)中分别得到T7-BCGW、T7-wbgL和T7-afcA的表达盒片段，所采用的PCR引物分别为BCGW-transF/BCGW-transR、WbgL-transF/WbgL-tra nsR和AfcA-transF/AfcA-transR。
下述实施例、效果例中未详细描述的技术均为本领域常用的技术，可参考《分子生物学实验手册》(马文丽，人民军医出版社)、《分子生物学实验(第二版)》(浙江大学出版社)、《细胞生物学实验》(杨洪兵、侯丽霞、张玉喜，高等教育出版社)。
实施例1
本实施例提供了高产岩藻糖的工程菌及其构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
1.1利用改良的CRISPR-Cas9技术将大肠杆菌star BL21(DE3)中的lacZ、fucIK和wcaj基因敲除，得到菌株A；所采用的敲除载体为含有Cas9和λ-Red重组酶的pEcCas载体，使用包含sgRNA序列和N20特异序列的pEcgRNA进行靶向基因编辑；
1.2将caiB-N32特异性序列克隆到pSL1765质粒中，得到pSPIN-caiB(N32)质粒，以pRSFDuet-T7-manB-manC-Gmd-wcaG质粒为模板进行PCR得到T7-manB-manC-T7-Gmd-wcaG表达盒，将T7-manB-manC-T7-Gmd-wcaG的表达盒片段克隆至pSPIN-caiB(N32)质粒中，得到pSPIN-caiB(N32)-BCGW质粒，转化至步骤1.1所得菌株A中，通过caiB-DF/caiB-DR引物鉴定得到阳性转化子，所得阳性转化子去除质粒后得到菌株B；
1.3按照步骤1.2的操作将T7-wbgL的表达盒片段整合至步骤1.2所得菌株B的lacA位点中，得到菌株C；
1.4按照步骤1.2的操作将T7-afcA的表达盒片段整合至步骤1.3所得菌株C的hlyE位点中，得到菌株D；
1.5委托生物公司构建含有T7启动子和RGG结构域和自组装短肽RIDD的pCDFDuet质粒，并且利用连接肽连接自组装短肽RIDD与RGG结构域，所述连接肽为(GGGGS)3，得到pCDFDuet-RGG-RIDD质粒；
1.6委托生物公司将自组装短肽RIAD序列分别构建在wbgL的N端和afcA的C端并克隆至pETDuet质粒中，分别得到pETDuet-RIAD-wbgL和pETDuet-RIAD-afcA质粒；
1.7通过PCR技术于步骤1.5所得pCDFDuet-RGG-RIDD质粒中获得T7-RGG-RIDD表达盒片段，于步骤1.6所得pETDuet-RIAD-wbgL和pETDuet-RIAD-afcA质粒中分别获得T7-RIAD-wbgL和T7-afcA-RIAD表达盒片段；
1.8将步骤1.7所得T7-RGG-RIDD、T7-RIAD-wbgL和T7-afcA-RIAD表达盒片段整合至步骤所得菌株D中，其中T7-RGG-RIDD整合至nagB位点、T7-RIAD-wbgL整合至lacA位点以及T7-afcA-RIAD整合至hlyE位点，通过抗性平板筛选得到阳性转化子，所得阳性转化子去除质粒后得到工程菌FUC-R-02，此时FUC-R-02中BCGW、wbgL和afcA的拷贝数比为BCGW：wbgL：afcA＝2:1:1；
上述步骤所采用的引物序列见表2。
表2构建大肠杆菌FUC04所采用的引物
实施例2
本实施例提供了一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法，所述构建方法与实施例8的相似，不同之处为：在步骤1.6中，所述自组装短肽RIAD序列构建在wbgL的C端，得到pETDuet-wbgL-RIAD质粒，其余步骤及参数条件不变，步骤8.4所得到的工程菌命名为FUC-R-04。
实施例3
本实施例提供了一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
3.1按照实施例1步骤1.2的操作将T7-BCGW的表达盒片段整合至实施例2所得工程菌FUC-R-04的wzxC位点中，得到工程菌FUC2C-1，此时FUC2C-1中BCGW、wbgL和afcA的拷贝数比为BCGW：wbgL：afcA＝2:1:1；
上述步骤所采用的引物见表3。
表3构建工程菌FUC2C-1所采用的引物
实施例4
本实施例提供了一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
4.1按照实施例1步骤1.2的操作将T7-wbgL的表达盒片段整合至实施例3所得工程菌FUC2C-1的ydeU位点中，得到工程菌FUC2C-2，此时FUC2C-2中BCGW、wbgL和afcA的拷贝数比为BCGW：wbgL：afcA＝2:2:1；
上述步骤所采用的引物见表4。
表4构建工程菌FUC2C-2所采用的引物
实施例5
本实施例提供了一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
5.1按照实施例1步骤1.2的操作将T7-BCGW的表达盒片段整合至实施例3所得工程菌FUC2C-1的intQ位点中，得到工程菌FUC2C-3，此时FUC2C-3中BCGW、wbgL和afcA的拷贝数比为BCGW：wbgL：afcA＝3:1:1；
上述步骤所采用的引物见表5。
表5构建工程菌FUC2C-3所采用的引物
实施例6
本实施例提供了一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法，所述构建方法所述构建方法包括以下步骤：
6.1按照实施例1步骤1.2的操作将T7-wbgL的表达盒片段整合至实施例5所得工程菌FUC2C-3的yjipQ位点中，得到工程菌FUC2C-4，此时FUC2C-4中BCGW、wbgL和afcA的拷贝数比为BCGW：wbgL：afcA＝3:2:1；
上述步骤所采用的引物见表6。
表6构建工程菌FUC2C-4所采用的引物
实施例7
本实施例提供了一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
7.1按照实施例1步骤1.2的操作将T7-afcA的表达盒片段整合至实施例6所得工程菌FUC2C-4的ybeQ位点中，得到工程菌FUC2C-5，此时FUC2C-5中BCGW、wbgL和afcA的拷贝数比为BCGW：wbgL：afcA＝3:2:2；
上述步骤所采用的引物见表7。
表7构建工程菌FUC2C-5所采用的引物
实施例8
本实施例提供了一种高产岩藻糖的大肠杆菌及其构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
8.1按照实施例1步骤1.2的操作将T7-BCGW的表达盒片段整合至实施例7所得工程菌FUC2C-5的araA位点中，得到工程菌FUC2C-6，此时FUC2C-6中BCGW、wbgL和afcA的拷贝数比为BCGW：wbgL：afcA＝4:2:2；
上述步骤所采用的引物见表8。
表8构建工程菌FUC2C-6所采用的引物
实施例9
本实施例提供了一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
9.1按照实施例1步骤1.2的操作将T7-wbgL的表达盒片段整合至实施例8所得工程菌FUC2C-6的yjiV位点中，得到工程菌FUC2C-7，此时FUC2C-7中BCGW、wbgL和afcA的拷贝数比为BCGW：wbgL：afcA＝4:3:2；
上述所采用的引物见表9。
表9构建工程菌FUC2C-7所采用的引物
实施例10
本实施例提供了一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
10.1按照实施例1步骤1.2的操作将T7-afcA的表达盒片段整合至实施例9所得工程菌FUC2C-7的rhaA位点中，得到工程菌FUC2C-8，此时FUC2C-8中BCGW、wbgL和afcA的拷贝数比为BCGW：wbgL：afcA＝4:3:3；
上述所采用的引物见表10。
表10构建工程菌FUC2C-8所采用的引物
实施例11
本实施例提供了一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
11.1按照实施例1步骤1.2的操作将T7-BCGW的表达盒片段整合至实施例9所得工程菌FUC2C-7的ykgH位点中，得到工程菌FUC2C-9，此时FUC2C-9中BCGW、wbgL和afcA的拷贝数比为BCGW：wbgL：afcA＝5:3:2；
上述所采用的引物见表11。
表11构建工程菌FUC2C-9所采用的引物
对比例1
本对比例提供了一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法，所述构建方法与实施例1的相似，不同之处为：在步骤1.6中，所述自组装短肽RIAD序列构建在afcA的N端，得到pETDuet-RIAD-afcA质粒，其余步骤及参数条件不变，步骤8.4所得到的工程菌命名为FUC-R-01。
对比例2
本对比例提供了一种高产岩藻糖的工程菌及其构建方法，所述构建方法与实施例1的相似，不同之处为：在步骤1.6中，所述自组装短肽RIAD序列构建在afcA的N端，得到pETDuet-RIAD-afcA质粒，其余步骤及参数条件不变，步骤8.4所得到的工程菌命名为FUC-R-03。
效果例
一、将实施例1-11、对比例1-2的工程菌进行分批补料发酵实验，并通过高效液相色谱检测发酵液中的岩藻糖的产量。
1、分批补料发酵实验
(1)将大肠杆菌在含有150mL LB培养基的1L摇瓶中培养6h，得到二级种子液；
(2)将150mL步骤(1)所得种子液转入含有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中，自动加入28％(v/v)NH4OH将pH调节至6.8，通过自动控制搅拌速度将溶解氧维持在30-50％，培养温度为37℃，通气速率为2VVM，转速为900rpm；
(3)当发酵培养基中的初始甘油完全耗尽后，以4g/L/h的恒定速率向发酵罐中加入进料溶液，发酵温度调节为29.5℃，发酵4h；
(4)加入异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为0.2mM和40g乳糖，补充17.78g/L/h甘油溶液，培养90h后结束发酵，得到发酵液。
2、发酵液的后处理及高效液相色谱检测
取1mL发酵液沸水浴10min以杀灭菌株，然后在12000g下离心10min，所得上清液使用0.22μm的过滤器过滤，所得滤液用于检测FUC和2’-FL。
使用HPX.87H色谱柱(伯乐)、高效液相色谱仪(LC-16，日本岛津)检测待测样品中的FUC和2’-FL，按照外标法计算待测样品中的FUC和2’-FL含量。色谱条件为流动相5mM硫酸水溶液，流速0.5mL/min，柱温60℃，进样量10μL。
取0-2.0g/L梯度浓度的FUC标准品，以FUC浓度为横坐标，液相色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线；2’-FL标准曲线按照FUC的方法绘制。
将计算得到不同发酵液中FUC和2’-FL浓度换算为5L发酵罐发酵所得产量，结果见表12。
表12不同工程菌的FUC和2’-FL产量计算结果
本申请通过对底盘菌株大肠杆菌BL21(DE3)进行改造，敲除β-半乳糖苷酶lacZ、岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶基因簇fucIK和磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶wcaj的基因，整合磷酸甘露糖突变酶manB、甘露糖1-1磷酸鸟苷转移酶manC、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶gmd和GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG基因簇BCGW、α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA、BCGW基因簇，使得大肠杆菌能够体内生物合成岩藻糖。如表1所示，本申请通过在wbgL的N端或C端连接自组装短肽RIAD以及在afcA的C端连接自组装短肽RIAD，并将来自秀丽隐杆线虫LAF-1蛋白上的RGG结构域与自组装短肽RIDD连接，能够实现WbgL和AfcA组装成无膜细胞器，在减少中间产物(2’-FL等)的流失以提高岩藻糖产量和产率，实现高产岩藻糖的目的。在此基础上，本申请通过对岩藻糖合成关键蛋白α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA和BCGW基因簇的拷贝数进行优化，结果发现当wbgL、afcA和BCGW的拷贝数比例为wbgL：afcA：BCGW＝(1-3)：(1-3)：(1-5)时，所制备得到的工程菌的岩藻糖产量随着wbgL、afcA和BCGW拷贝数的增加而提高，岩藻糖产量最高可达95.88g/L。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种高产岩藻糖的工程菌，其特征在于，所述工程菌以工程菌A为底盘菌株通过整合带有强启动子的α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA、BCGW基因簇、自组装短肽RIAD-RIDD和RGG结构域制备得到；
所述工程菌A为利用基因编辑技术将大肠杆菌BL21(DE3)中的β-半乳糖苷酶lacZ、岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶基因簇fucIK和磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶wcaj基因敲除得到；
所述α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述α-L-岩藻糖苷酶afcA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述BCGW基因簇为整合磷酸甘露糖突变酶manB、甘露糖1-1磷酸鸟苷转移酶manC、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶gmd和GDP-L-岩藻糖合成酶wcaG的基因簇，所述BCGW基因簇的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述自组装短肽RIAD-RIDD中的RIAD核苷酸序列如SEQ ID NO.7，所述自组装短肽RIAD-RIDD中的RIDD核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述RGG结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述自组装短肽中的RIAD位于α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL的N端和/或C端，或所述自组装短肽中RIAD的位于α-L-岩藻糖苷酶afcA的C端；
所述工程菌中的α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA和BCGW基因簇的拷贝数比例为α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL：α-L-岩藻糖苷酶afcA：BCGW基因簇＝3：(2-3)：(4-5)；
所述β-半乳糖苷酶lacZ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶基因簇fucIK的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶wcaj的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、利用基因编辑技术将大肠杆菌BL21(DE3)中的β-半乳糖苷酶lacZ、岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶基因簇fucIK和磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶wcaj基因敲除，得到工程菌A；
S2、将α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL、α-L-岩藻糖苷酶afcA和BCGW基因簇整合至步骤S1所得工程菌A中，得到工程菌B；
S3、将自组装短肽中的RIAD连接至α-1,2-岩藻糖基转移酶wbgL N端和/或C端的片段、自组装短肽中RIAD的连接至α-L-岩藻糖苷酶afcA C端的片段和自组装短肽与RGG结构域相连接的片段整合至步骤S2所得工程菌B中，得到高产岩藻糖的工程菌。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在步骤S1中，所述β-半乳糖苷酶lacZ的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶基因簇fucIK的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶wcaj的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.如权利要求1所述的工程菌在生产岩藻糖中的应用。
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Address before: 230088 Floors 1-4, Building A3, National Health Big Data Industrial Park, Intersection of Xiyou Road and Kongquetai Road, High-tech Zone, Hefei City, Anhui Province

Applicant before: Hefei Zhongke Health Biotechnology Research Institute Co.,Ltd.

Country or region before: China

GR01 Patent grant
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