CN118910096A - StMybHv1-like基因在提高马铃薯抗寒性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及StMybHv1‑like基因在提高马铃薯抗寒性中的应用。本发明公开的一种调节马铃薯抗寒性的StMybHv1‑like基因，其核苷酸序列为（a）、（b）或（c）所示，（a）如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；（b）与SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列杂交且编码的核苷酸序列；（c）与SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且编码的核苷酸序列。本发明应用StMybHv1‑like或其转基因生物材料可以调控马铃薯植株耐冷性，为遗传转化阳性植株筛选及马铃薯低温胁迫抗性机制研究提供了重要的理论支持，具有广阔的应用前景。

Description

StMybHv1-like基因在提高马铃薯抗寒性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及StMybHv1-like基因在提高马铃薯抗寒性中的应用。

背景技术

马铃薯（Solanum tuberosumL.）是世界上最重要的块茎作物，在全世界范围内广泛种植，在保障全球粮食安全等方面起着重要作用。霜冻损害极大地影响植物的生长、发育、生产效率和地理分布。马铃薯普通栽培种几乎都不耐霜冻，一旦发生低温寒潮，农业生长会受到严重的影响。

目前被解析的冷响应基因调控机制大部分都是通过CBFs相关途径调控，ICE-CBF-COR信号传导途径被认为在植物抗冷能力中起着关键性作用。HOS1、SIZ1、OST1等基因是ICE1的上游调节因子，He 等研究发现半乳糖醇合酶基因（ScGols1）在冷胁迫后表达量上升，进而发现 ScGols1 改变了糖组成，并通过诱导乙烯信号通路和 CBF家族基因的表达，提高马铃薯抗冻性。而CBFs主要是在0℃以上的驯化过程中响应的基因，而对于马铃薯冻害胁迫下响应基因作用机制的研究还少有报道。因此，挖掘野生马铃薯的抗性基因，培育具有抗寒能力的马铃薯新品种是非常必要的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供调节马铃薯抗寒性的StMybHv1-like基因及

其所编码的蛋白质，并证明其可以显著增强马铃薯抗寒性，可应用于马铃薯抗低温育种和品种改良，为马铃薯抗性育种提供更多选择。

为实现上述目的，本发明提供一种蛋白，所述蛋白为（a）或（b）；

（a）由SEQ ID NO .2所示的氨基酸组成的蛋白；

（b）由SEQ ID NO .2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的衍生蛋白；

上述（a）或（b）之一的蛋白，其与野生型植株相比，提高马铃薯低温胁迫下的生存率。

一些具体的实施例中，本发明提供了一种蛋白，氨基酸序列与SEQ ID NO .1所示序列具有80％同一性的具有抗寒性增强的氨基酸序列；优选的具有85％同一性，更优选的具有 90％同一性，更优选的具有95％同一性，最优选的，具有99％同一性。

本发明还提供一种编码上述所述蛋白的基因，所述的基因的核苷酸序列为（a）、（b）或（c）；

（a）如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；

（b）在严格条件下与SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列杂交且编码的核苷酸序列；

（c）与SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且编码的核苷酸序列。

一些具体的实施例中，StMybHv1-like基因可以调节马铃薯抗寒性。

本领域技术人员充分了解的是，由于同一氨基酸可能有多种不同的密码子来决定，所以编码上述蛋白的核苷酸序列并不仅仅局限于一种，可以是由SEQ ID NO. 1所示突变体核苷酸序列突变一个或多个核苷酸形成同义突变得到同样可编码本发明所述突变体氨基酸序列的核苷酸序列，也可以根据密码子优化设计能够编码本发明所述突变体氨基酸序列的核苷酸序列。

一些具体的实施例中，本发明提供了一种蛋白的基因核苷酸序列与SEQ ID NO. 1所示序列具有80％同一性；优选的具有85％同一性，更优选的具有90％同一性，更优选的具有95％同一性，最优选的，具有99％同一性。

含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

含有上述任一项蛋白、基因、重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在马铃薯栽培种抗低温胁迫中的应用也属于本发明的保护范围。

进一步地，通过调高StMybHv1-like基因在所述作物中的表达量和/或活性，以提高作物抗寒性。

一种制备转基因植物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将上述蛋白的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物；与野生型植物相比，转基因植物的抗寒性提高；所述植物为马铃薯。

进一步地，所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中的；所述重组表达载体是将所述编码基因插入初始载体pH7lic9.0的多克隆位点得到的。

进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1中所示。

有益效果：本发明提供了一种具有调控马铃薯耐冷性功能的StMybHv1-like基因，应用StMybHv1-like或其转基因生物材料可以调控马铃薯植株耐冷性，为遗传转化阳性植株筛选及马铃薯低温胁迫抗性机制研究提供了重要的理论支持，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为qRT-PCR验证StMybHv1-like在DM和CMM中的表达模式；

图2为pH7lic9.0-MybHV1-like超量表达载体示意图；

图3为StMybHv1-like过表达阳性株鉴定；

其中，3A为StMybHv1-like全长cDNA的扩增图，3B为StMybHv1-like过表达植株的表达量检测图，3C为StMybHv1-like过表达植株的植株表型差异图；

图4为过表达StMybHv1-like对马铃薯抗寒性的影响；

其中，4A为低温胁迫下StMybHv1-like过表达植株表型差异图，4B为StMybHv1- like过表达植株的表达量检测图，4C为低温胁迫下StMybHv1-like过表达植株的鲜株数量测定图，4D为低温胁迫下StMybHv1-like过表达植株的植株存活率测定图，4E为低温胁迫下StMybHv1-like过表达植株的损伤值测定图；

图5为StMybHv1-like的酵母双杂互作验证鉴定图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1StMybHv1-like基因和表达模式研究

本研究中使用的植物材料为抗冻材料CMM和低温敏感材料DM，在添加3%蔗糖和0.35%琼脂的MS培养基上，20±1°C条件下生长3周，之后将3周龄的组培苗植株移植到塑料盆（10×10 cm）中，种植于植物生长气候室（22±2°C，16 h光照/8 h黑暗光周期）；将正常条件下生长的4周龄植株移入4°C冷室中冷驯化3天后，将驯化后的植株在−4°C下处理0 h、3h、6 h、12 h；分别将处理后的植株取叶片，提取RNA，并反转录为cDNA，进行qRT-PCR，扩增引物如下，以SEC为内参基因，采用2^–ΔΔCT计算基因的相对表达量（见图1），误差条表示SE（n =3, ∗P<0.05, ∗∗P<0.01, ∗∗∗P<0.001；Student’s t-test）。

反应体系如下：

反应程序为：95℃ ，30 s ；95℃，5 s；58℃，30 s；40个循环

结果表明，StMybHv1-like基因在低温敏感材料DM中受低温诱导表达量急剧下降，而在抗冻材料CMM中表达量显著上调，且在-4℃处理3 h、6 h时表达量达到较高值（图1）。因此，本发明以StMybHv1-like基因为研究对象，对其是否提高马铃薯栽培种的低温抗性进行研究。

实施例 2StMybHv1-like基因克隆及过表达载体构建

StMybHv1-like

基因克隆以马铃薯抗冻材料CMM和不抗冻材料DM叶片组织总RNA，反转录获取cDNA为模版，根据SEQ ID NO. 1的cDNA序列，设计特异性扩增引物；

StMybHv1-like-F：5'-CATTTGGAGAGAACAGAGCTCATGGCTAATTGTTGCTCTAAAAGG-3'

StMybHv1-like-R：

5'-GGTGTCGACTCTAGAGGATCC TGCAGAAGAACTTTCAGCATCAG-3'

反应体系如下：

反应程序如下：

得到的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳得到的目的条带用TIANGEN公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收。

过表达载体构建（1）将StuI酶切载体质粒pH7lic9.0，反应体系如下：

置于37°C烘箱，过夜；

（2）将 PCR产物^a和酶切后的载体质粒^b进行纯化，使用ClonExpress^®II One StepCloning Kit操作说明进行连接，具体操作如下：

冰上配置以下连接体系：

37°C，连接30 min；

（3）转化

使用唯地生物DH5αChemically Competent Cell产品说明书进行大肠杆菌转化，具体操作如下：

a. DH5α感受态细胞从−80°C拿出，迅速插入冰中，5 min后待菌块融化，加入5 μL上述连接产物并用手拨打EP管底轻轻混匀，冰中静置25 min；

b. 42°C水浴热激45s，迅速放回冰上并静置2 min（晃动会降低转化效率）；

c. 加入700 μL不含抗生素的LB，混匀后37°C，200 rpm复苏60 min；

d. 5000 rpm离心1 min收集菌体，留取100 μL左右上清轻轻吹打重悬菌体并涂布到含有Kan的LB平板；

e. 将平板倒置放于37°C培养箱过夜培养。

（4）阳性克隆鉴定

使用载体上的特异引物进行扩增，并将阳性克隆测序，将测序正确的阳性克隆提取质粒命名为pH7lic9.0-MybHV1-like备用；

特异引物如下所示

基因前引物：StMybHv1-like-F：CATTTGGAGAGAACAGAGCTCATGGCTAATTGTTGCTCTAAAAGG；

lic载体后引物：GTGATTTTTGCGGACTCTAGCAT

实施例 3 农杆菌介导的马铃薯遗传转化

农杆菌转化将质粒pH7lic9.0-MybHV1-like，使用唯地生物GV3101 ChemicallyCompetent Cell产品说明书进行农杆菌转化，具体操作如下：

（1）取−80°C保存的GV3101农杆菌感受态细胞于冰上融化；

（2）每50 μL感受态细胞中加入1 μL需要转化的质粒DNA，轻轻混匀，冰上静置5min、液氮5 min、37°C水浴5 min、冰浴5 min；

（3）加入700 μL无抗生素的LB液体培养基，于28°C震荡培养2h；

（4）吸取100 μL左右菌液，涂布于含有Kan的LB平板上，倒置平板，28°C培养2-3天。

（5）菌落PCR鉴定。

2. 农杆菌介导的马铃薯遗传转化

遗传转化受体材料为“大西洋”马铃薯品种，包含以下过程：

（1）预培养：取四周苗龄的大西洋无菌苗，切不带侧芽的茎段摆放于A1预培养培养基上，光照培养48 h；

（2）共培养：将上述pH7lic9.0-MybHv1-like载体通过冻融法转化农杆菌GV3101的农杆菌进行活化和摇菌，使菌液的最终OD₆₀₀为0.5，离心收菌后，倒入MS30液体培养基使得OD₆₀₀为0.5，加入1/1000的40 mg/L的乙酰丁香酮（Acetosyringone,AS），备用，将预培养后的茎段置于侵染液中，随后放在低转速摇床上，常温侵染10 min；

（3）再生培养：将侵染液倒出，将茎段放置于灭菌滤纸上晾干，将茎段转移到带有灭菌滤纸的A2共培养基上，暗培养48 h。暗培养结束后，将茎段平整摆放于分化培养基上继续培养，每2周更换一次分化培养基SIM，直至愈伤组织分化出芽时，将芽剪下移至生根培养基中培养，最终获得完整植株。转基因培养基见表1。

表1

3. 转基因阳性株系检测

（1）剪取转基因植株的叶片，采用CTAB法提取DNA；

（2）将提取的DNA作为模板进行PCR扩增；

基因前引物：StMybHv1-like-F：CATTTGGAGAGAACAGAGCTCATGGCTAATTGTTGCTCTAAAAGG；

lic载体后引物：GTGATTTTTGCGGACTCTAGCAT；

PCR 反应体系如下：

PCR 扩增条件如下：

用1 %的琼脂糖凝胶电泳获得阳性菌株。

（3）提取转基因植株的RNA和对照组的RNA，并反转录产生cDNA。采用TB Green®Premix Ex TaqTM II试剂盒进行实时荧光定量PCR鉴定，结果见图3。

从图3可以看到，以基因组DNA为模板，使用基因前引物StMybHv1-like-F和载体后引物lic-R进行PCR扩增，发现18个阳性转基因植株（图3A）；其中，有三个过表达转基因植株（编号为OE#4、OE#6、OE#8）中，StMybHv1-like基因表达量明显上升（图3B），而转基因植株和对照植株的生长表型没有明显差异（图3C）。

实施例4过表达StMybHv1-like增强马铃薯抗寒性

将阳性转基因植株和对照植株进行冷驯化（4°C）及低温胁迫（−2.5°C）处理，具体为：

（1）转基因植株和对照植株的浇水量一致，光照条件一致，在植物生长气候室生长3周，期间每隔3天浇一次水；

（2）待3周后，将其搬入4℃气候室中驯化一周，再将其搬入-2.5℃气候室进行低温处理6 h；

（3）恢复4℃下冷驯化24 h，共进行三次重复。

从图4可以看到，三个过表达转基因株系不论是冻住棵数和存活率，还是最终打分情况都是显著优于对照，表明StMybHv1-like过表达转基因植株抗寒能力显著增强。

实施例5 考察StMybHv1-like是否能形成同源二聚体

为了探讨StMybHv1-like是否需要形成同源二聚体来发挥功能，利用酵母双杂交进行验证，酵母点对点验证。将共转化PGADT7-StMybHv1-like和PGBKT7-StMybHv1-like质粒、空载PGADT7和PGBKT7-StMybHv1-like、PGADT7-

StMybHv1-like和空载PGBKT7、空载PGADT7和空载PGBKT7和已知的阳性对照的酵母分别在二缺（SD/-Leu-Trp）培养基和四缺（SD/-Leu-Trp-His -Ade）平板进行培育。

从图5中可以看到，共转化PGADT7-StMybHv1-like和PGBKT7-StMybHv1

-like质粒、空载PGADT7和PGBKT7-StMybHv1-like、PGADT7-StMybHv1-like和空载PGBKT7、空载PGADT7和空载PGBKT7和已知的阳性对照的酵母可以在二缺（SD/-Leu-Trp）培养基上生长，而在四缺（SD/-Leu-Trp-His-Ade）平板上，除了阳性对照其余均不能在平板上生长，表明马铃薯StMybHv1-like不能形成同源二聚体，StMybHv1-like调节马铃薯抗寒性并不需要形成同源二聚体来发挥功能。

最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种调节马铃薯抗寒性的StMybHv1-like基因1.编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

2.一种含有StMybHv1-like基因的重组载体、表达盒、转基因系或重组菌，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为（a）、（b）或（c）；

（a）如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；

（b）在严格条件下与SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列杂交且编码的核苷酸序列；

（c）与SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且编码的核苷酸序列。

3.一种StMybHv1-like基因在马铃薯栽培种抗低温胁迫中的应用，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为（a）、（b）或（c）；

（a）如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；

（b）在严格条件下与SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列杂交且编码的核苷酸序列；

（c）与SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列具有80％以上同源性且编码的核苷酸序列。

4.一种权利要求1所述的蛋白在马铃薯栽培种抗低温胁迫中的应用。

5.一种权利要求2所述的重组载体、表达盒、转基因系或重组菌在马铃薯栽培种抗低温胁迫中的应用。

6.根据权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于：通过调高StMybHv1-like基因在所述作物中的表达量和/或活性，以提高作物抗寒性。

7.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述蛋白的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物；与野生型植物相比，转基因植物的抗寒性提高；所述植物为马铃薯。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述编码基因是通过重组表达载体导入所述植物中的；所述重组表达载体是将所述编码基因插入初始载体pH7lic9.0的多克隆位点得到的。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo. 1中所示。