CN118903367B - 中药植物类药食同源纳米活性肽制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

中药植物类药食同源纳米活性肽制剂及其制备方法，属于中药制剂领域，技术要点是配制微粉碎植物的水溶液；向水溶液中加入氢氧化钠进行碱处理；根据植物的不同种类的糖的含量比例，向碱处理后的溶液中加入对应糖的种类及比例的糖苷酶进行糖水解；向糖水解后的溶液中加入蛋白酶进行蛋白水解；向蛋白水解后的溶液中加入三聚磷酸钠、EDTA二钠，经超声处理，得到植物类纳米活性肽制剂，效果是在保留并提高中药原有质量标志物等传统活性成分的同时，将药食同源制备成纳米级的活性肽制剂，使其具有纳米物质特有的物理、化学和生物学性质，可应用于药物、食品或保健品中。

Description

中药植物类药食同源纳米活性肽制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于中药制剂领域，具体涉及一种植物类药食同源纳米活性肽制剂及其制备方法。

背景技术

药食同源中药是人类在长期生产和生活实践中逐渐发现的一类既能果腹，又能调节机体状态、预防疾病的中药资源，其兼具药食两用的特点，在世界范围内越来越受到重视。

传统中药提取制备工艺包括煎煮法、浸渍法、回流法、渗漉法、发酵法等，存在提取时间较长、杂质较多、采用水作为溶剂时容易发霉等缺陷。另一方面，采用超声法辅助提取、微波法辅助提取、超临界流体萃取、超微粉碎、超高压提取等现代提取工艺也具有如有效成分易变性损失、能耗及生产成本高、使淀粉糊化等不利于有效成分活性保留及大规模产业化制备的弊端。此外，也发现很多中药成分存在水溶性差、稳定性差、生物利用度低、不良反应较大等问题，极大限制了其应用，也对中医药的现代化发展提出了新的问题与挑战。将纳米技术引入了中药研发领域，将中药进行纳米级加工处理改变中药制剂的物理化学性质及生物活性，提高生物利用度及溶解度，为解决这类问题提供了新的思路。

同时，药食同源中药作为优质的天然活性肽库，多项先行研究表明中药来源的活性肽具有神经保护、保肝、抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、增强免疫力等重要的生物活性。例如人参中提取的神经活性调节类肽、牡蛎中抗血管紧张素转化酶(ACE)短肽等。但目前中药活性肽的基础和应用研究尚属薄弱，高品质的成型中药活性肽产品还有待开发。

发明内容

为了解决上述现有植物类中药提取制备具有的上述问题，本发明提供一种中药植物类药食同源纳米活性肽制剂及其制备方法，以同时提高中药的吸收率、利用率以及功效性成分的溶出率。

在第一方面上，根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，包括：

配制微粉碎植物的水溶液；向水溶液中加入氢氧化钠进行碱处理；

根据植物的不同种类的糖的含量比例，向碱处理后的溶液中加入对应糖的种类及比例的糖苷酶进行糖水解；向糖水解后的溶液中加入蛋白酶进行蛋白水解；

向蛋白水解后的溶液中加入三聚磷酸钠、EDTA二钠，经超声处理，得到植物类纳米活性肽制剂。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，微粉碎植物的中位径为50～100μm。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其中，加入氢氧化钠进行碱处理，pH为9.0～10.0，温度为90～100℃，碱处理时间为30～60min。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，还包括糖水解后灭酶；蛋白水解后灭酶。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，以质量计，糖苷酶约占总糖含量的1％～3％，其中，一种类型的糖含量所占总糖含量的比例与所述一种类型的糖对应的糖苷酶的用量所占总糖苷酶用量的比例基本一致。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，糖苷酶约占总糖含量的2.0％。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，糖包括纤维素类多糖、果胶类多糖及淀粉中的任一种或者组合，糖苷酶包括与维素类多糖、果胶类多糖及淀粉对应的纤维素酶、果胶酶及淀粉酶中的任一种或者组合。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，糖包括纤维素类多糖、果胶类多糖及淀粉，糖苷酶包括纤维素酶、果胶酶及淀粉酶。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，以质量计，蛋白酶的用量占植物重量的0.5％～1.5％。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，蛋白酶的用量占植物重量的1.0％。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，蛋白酶包括复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶中的任一种或者组合组成。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，蛋白水解后经离心、过滤、膜浓缩，得到固形物为20～25％的蛋白水解后的溶液。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，三聚磷酸钠与所述固形物的质量比为(1～2:100)；EDTA二钠与所述固形物的质量比为(0.5～1):100。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，加入三聚磷酸钠、EDTA二钠的溶液经搅拌后进行超声处理，超声处理后进行冷冻、干燥，得到所述植物类纳米活性肽制剂。

根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，超声处理时间为3-5min，超声功率为150-200W。

在第二方面上，根据本申请一些实施例中的植物类纳米活性肽制剂，由上述任一种所述制备方法所得。

有益效果：

(1)植物类中药细胞壁的初级细胞壁主要成分为纤维素、半纤维素及果胶，次级细胞壁则是纤维素、半纤维素，细胞壁的存在对于活性成分的释放造成了极大的阻碍。同时，植物中药细胞中含有的大量淀粉粒在提取过程中容易吸水膨胀，发生一定程度的糊化，同样大大影响后续蛋白酶解的效果。本发明通过测定不同原料中纤维素类多糖、果胶类多糖及淀粉等糖含量来制定复合糖苷酶的配比与添加量，达到良好的生物酶解破壁与淀粉降解效果。本发明采用轻度的超微物理粉碎、碱处理化学破壁以及有针对性的复合糖苷酶酶解的生物学破壁联用技术，相比传统的仅适用超微物理粉碎工艺破壁效果更加彻底，提高了人参皂苷、天麻素等作为中药制剂质量标志物的中药活性成分的溶出率。另一方面，通常将物料超微物理粉碎至10微米以下时会产生大量的热能，存在破坏中药固有活性的可能，而本发明采用方法的温度条件更为温和，有利于保留中药活性成分的结构。

(2)本发明在保留并提高药食同源中药原有质量标志物等活性成分的同时，开发利用药食同源中药中的蛋白资源，提高了药食同源中药的利用率。同时，未完全裂解的细胞壁残片等会影响到蛋白酶的酶解效果。活性肽相比蛋白具有吸收效率更高、无抗原性两个特性，而这两个特性直接与肽的分子量相关。大量研究已证明小肽(主要是＜500Da的二肽和三肽)和氨基酸的吸收，，存在两种相互独立的转运机制，体内存在两种肽载体，，具有对二、三肽的转运活性，并以转运膜上的H+梯度作为驱动力。相比游离氨基酸，具有相同氨基酸构成的小肽转运系统具有转运速度快、耗能低、不易饱和等特点。因此＜1000Da与＜500Da的肽占比是非常重要的技术指标。而本发明受益于超微物理粉碎、碱处理以及复合糖苷酶酶解联用破壁技术，相比仅超微粉碎处理后进行复合蛋白酶酶解，本发明对药食同源中药蛋白的酶解效果更好，＜1000Da与189-500Da的肽段占比更高。

(3)本发明在采用超微物理粉碎使药食同源中药达到微米级的基础之上，通过糖苷酶酶解与蛋白酶酶解使作为药食同源中药主要成分的大分子糖类与蛋白质进一步水解为纳米级分子。但许多药食同源中药都含有一定量的钙镁等元素，容易与肽类分子形成螯合导致分子团聚；另一方面纳米分子颗粒具有极高的表面能和较大的接触面，通过分子间力、氢键、静电作用会产生吸附易发生团聚；复杂的活性肽组成因氨基酸种类不同而带正负电荷，通过自组装形成团聚。上述原因导致获得的药食同源酶解产物在水溶液中的实际粒径远大于其分子粒径，从而无法形成真正的纳米级中药制剂。本发明首先通过加入EDTA对钙镁等元素进行螯合削减由于螯合作用引起的肽类分子团聚，加入三聚磷酸钠提高纳米分子表面电位的绝对值，产生强的双电层静电斥力作用与空间排斥作用，再通过超声处理进一步分散纳米分子并冷冻干燥，增加纳米分子与三聚磷酸钠的吸附作用，实现复溶后药食同源中药纳米分子的分散，以避免团聚而进一步提高吸收率。

具体实施方式

本发明提供一种超微物理粉碎、碱处理及复合糖苷酶酶解相结合的破壁方法，并在复合蛋白酶酶解后加入螯合竞争抑制及与分散剂，制备药食同源活性肽制剂。本发明所述技术可应用于多种植物类药食同源中药，获得中药质量标志物等活性成分与活性肽成分相结合的纳米级中药制剂。本发明针对上述目的，提供一种物理、化学及生物学破壁相结合的破壁方法，能够提高传统中药活性成分如天麻素、人参皂苷等的提取效率。在此基础上进行复合蛋白酶酶解，并加入螯合竞争抑制剂与分散剂制备纳米级的药食同源活性肽制剂。能够同时提高中药的吸收率、利用率以及功效性成分的溶出率。

在第一方面上上，本发明的一种植物类药食同源纳米活性肽制剂的制备方法，具体如下：

步骤1.对药食同源中药原料采用粉碎机进行初破碎，后采用超微粉碎机将粉体超微粉碎至中位径为50-100μm；

步骤2.采用比色法、高效液相色谱法等方法测定药食同源中药原料中纤维素类多糖含量X、果胶类多糖含量Y、淀粉的含量Z；

步骤3.将步骤1获得粉体与去离子水混合，加入氢氧化钠调节pH至9.0-10.0，90-100℃碱处理30-60min；

步骤4.按照步骤2得到的纤维素类多糖、果胶类多糖、淀粉的含量比例X:Y:Z，采用纤维素酶、果胶酶及淀粉酶组成的复合糖苷酶对步骤2中的中药溶液进行酶解，其中，纤维素酶、果胶酶及淀粉酶的用量比例X:Y:Z，且纤维素酶、果胶酶及淀粉酶的总用量为纤维素类多糖、果胶类多糖、淀粉总含量的1％～3％，优选2％。酶解结束后升温灭酶获得第一酶解液；

步骤5.在步骤4获得的第一酶解液中加入复合蛋白酶进行酶解，酶解结束后升温灭酶，离心过滤并经过膜浓缩后获得固形物为20-25％的第二酶解液；

在本发明的一种实例中，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的二种或三种组成；

步骤6.在步骤5获得的第二酶解液中加入三聚磷酸钠与EDTA二钠，充分搅拌后超声波处理，最后冷冻干燥获得药食同源纳米活性肽制剂。

本发明的一种实例中，三聚磷酸钠与酶解液固形物的质量比为1-2:100；

本发明的一种实例中，EDTA二钠与酶解液固形物的质量比为0.5-1:100；

本发明的一种实例中，超声处理时间3-5min，超声功率150-200W。

在本发明中，所述“药食同源纳米活性肽制剂”，指的是水溶液中粒径分布达到小于100nm水平，含有药食同源中药短肽成分的中药制剂。

测试说明：

(1-1).人参总皂苷的测定：采用香草醛-乙醇-浓硫酸显色法测定人参主根原料、人参纳米活性肽制剂G1、G2、G3的总皂苷含量，称取人参皂苷Re标准品5mg，加入无水乙醇配成质量浓度0.5mg/mL的标准溶液。分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准溶液，于80℃水浴蒸干，加入0.5mL质量分数10％香草醛溶液后，再加入5mL体积分数60％硫酸溶液，混合均匀后于60℃水浴15min，然后放入冰水中冷却10min，在室温下静置15min后于波长472nm处测定吸光度，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

(1-2).人参纳米活性肽制剂的肽分子量测定：采用HPLC-MS/MS高效液相色谱质谱测定人参纳米活性肽制剂G1、G2、G3的肽分子量分布。

(1-3).人参纳米活性肽制剂的粒径测定：本发明采用ZETASIZER NANO纳米粒度电位仪测定人参纳米活性肽制剂的水溶液平均。分别称取人参纳米活性肽制剂粉末G1、G2、G3、G4，添加1ml去离子水分别配置1％、0.1％的水溶液，注入样品池，测定平均粒径大小。

(1-4).天麻总皂苷的测定：采用紫外分光光度法测定天麻原料、天麻纳米活性肽制剂R1、R2、R3的天麻素含量，精确称取天麻素标准品5mg于10mL容量瓶中，加入适量的溶剂溶解，定容，摇匀，即得到浓度为500μg/mL的标准品母液。分别吸取0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL的标准品母液，置于10mL容量瓶中，稀释至刻度，使浓度分别为2.5、5、7.5、10、12.5、15μg/mL。在波长221nm下进行吸光度的测定。以标准品溶液浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。取天麻原料、天麻纳米活性肽制剂R1、R2、R3样品粉末1.666～1.667g，置于50ml圆底烧瓶中。加入70％浓度的乙醇25ml，用封口膜封住圆底烧瓶的瓶口，浸泡0.5h。水浴加热，回流60min。放冷至室温，减压抽滤，滤液置于50mL的容量瓶中。用适量70％的乙醇溶液洗涤圆底烧瓶3次，抽滤，合并滤液，用适量70％的乙醇溶液洗涤抽滤瓶3次，合并至50mL的容量瓶中，定容，摇匀备用。按照同样方法测定吸光度根据标准曲线计算天麻素含量。

(2-2).天麻纳米活性肽制剂的肽分子量测定：采用HPLC-MS/MS高效液相色谱质谱测定天麻纳米活性肽制剂R1、R2、R3的肽分子量分布。

(2-3).天麻纳米活性肽制剂的粒径测定：采用ZETASIZER NANO纳米粒度电位仪测定天麻纳米活性肽制剂R1、R2、R3、R4的水溶液平均。分别称取天麻纳米活性肽制剂粉末，添加1ml去离子水分别配置1％、0.1％的水溶液，注入样品池，测定平均粒径大小。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例G1.人参纳米活性肽制剂G1的制备方法如下：

步骤1.取人参主根干料1000g采用粉碎机进行初破碎，后采用超微粉碎机将粉体超微粉碎至中位径为100μm，获得人参粉975g；

步骤2.按照标准NY/T 3494-2019《农业生物质原料纤维素、半纤维素、木质素测定》所述高效液相色谱法测定人参主根干料中纤维素、半纤维素的总含量为53g；按照标准NY/T 2016-2011《水果及其制品中果胶含量的测定》所述分光光度法测定人参主根干料中果胶的含量为42g；按照标准GB/T 25219-2010《粮油检验玉米淀粉含量测定》所述近红外法测定人参主根干料中淀粉含量为340g；

步骤3.将步骤1获得人参粉与15倍体积去离子水混合，加入氢氧化钠调节pH至10.0，95℃碱处理60min；

步骤4.加入步骤2中所述3种多糖总质量2.0％的复合糖苷酶8.7g，该复合糖苷酶组成为纤维素酶：果胶酶：淀粉酶＝53:42:340，在50℃、pH5.5条件下酶解2h，酶解结束后升温80℃灭酶10min获得第一酶解液；

步骤5.在步骤4获得的第一酶解液中加入人参主根干料质量1％的复合蛋白酶9.75g，复合蛋白酶组成为碱性蛋白酶：中性蛋白酶＝1：1，在50℃、pH8.0条件下酶解4h，酶解结束后升温80℃灭酶10min，离心过滤并经过膜浓缩后获得固形物为20％的第二酶解液；

步骤6.在步骤4获得的第二酶解液中加入三聚磷酸钠4g与EDTA二钠2g，充分搅拌后超声波处理，最后冷冻干燥获得人参纳米活性肽制剂G1。

对比例G2.人参纳米活性肽制剂G2的制备方法如下：将实施例G1中的复合糖苷酶组合替换为纤维素酶：果胶酶：淀粉酶＝1:1:1，其余步骤按照实施例G1进行实施后获得人参纳米活性肽制剂G2。

对比例G3.人参纳米活性肽制剂G3的制备方法如下：

步骤1.取人参主根干料1000g采用粉碎机进行初破碎，后采用超微粉碎机将粉体超微粉碎至中位径为10μm，获得人参粉966g；

步骤2.将步骤1获得人参粉与15倍体积去离子水混合，加入氢氧化钠调节pH至10.0，95℃碱处理60min；

步骤3.加入人参主根干料质量1％的复合蛋白酶9.66g，复合蛋白酶组成为碱性蛋白酶：中性蛋白酶＝1：1，在50℃、pH8.0条件下酶解4h，酶解结束后升温80℃灭酶10min，离心过滤并经过膜浓缩后获得固形物为20％的酶解液，冷冻干燥获得人参纳米活性肽制剂G3。

对比例G4.人参纳米活性肽制剂G4的制备方法如下：按照实施例G1中步骤1-5进行实施后进行冷冻干燥获得人参纳米活性肽制剂G4。

实验例1.根据测试说明中的(1-1)对人参总皂苷测定：对人参主根原料、G1、G2、G3样品测定吸光度，根据标准曲线计算皂苷含量，结果如下表1所示：

表1总皂苷含量

组别	人参主根原料	G1	G2	G3
					皂苷含量(％)	3.74±0.24	6.11±0.36	4.89±0.22	3.03±0.10

由表1可知，经过超微粉碎、碱处理、以及针对性的糖苷酶酶解处理所制备的G1相比人参主根原料、非针对性的糖苷酶酶解处理所制备的G2、以及仅经过超微粉碎以及碱处理制备的G3的总皂苷含量上均有显著性提高(P＜0.01)，说明本发明技术中针对原料不同多糖含量特性的糖苷酶酶解步骤能够有效提高功能性成分的释放率及提取率。

实验例2.根据测试说明中的(1-2)、(1-3)对肽分子量及粒径测定：

(1)肽分子量测定结果如表2所示：

表2人参纳米活性肽制剂肽分子量分布

组别	G1	G2	G3
				＜1000Da(％)	95.84	78.25	67.37
189-500Da(％)	51.57	31.04	27.88

由表2可知，G1中分子量的＜1000Da与189-500Da的肽的占比均显著性低于非针对性糖苷酶酶解处理的G2，以及未经过糖苷酶酶解处理的G3，可知，糖苷酶酶解处理步骤明显提升了后续的蛋白酶水解效果。

(2)粒径测定结果如表3所示：

表3人参纳米活性肽制剂水溶液平均粒径(nm)

组别	平均粒径(nm)
		G1(1％)	95.1
G1(0.1％)	69.8
		G2(1％)	177.0
G2(0.1％)	130.9
		G3(1％)	827.4
G3(0.1％)	703.5
		G4(1％)	558.3
G4(0.1％)	480.3

由表3可知，G1、G2水溶液的平均粒径相比G3、G4有显著性缩小(P＜0.01)，说明EDTA和三聚磷酸钠的添加辅以超声波处理很好地改善了制剂水溶液中的分子团聚作用。而G1相比G2，G4相比G3的结果说明，针对原料多糖种类特性的糖苷酶酶解处理同样有助于缩小少人参纳米活性肽制剂的平均粒径。而活性肽制剂的平均粒径缩小，可以表明活性肽的吸收效果有所提升。

实施例R1.天麻纳米活性肽制剂R1的制备方法如下：

步骤1.取天麻干料1000g采用粉碎机进行初破碎，后采用超微粉碎机将粉体超微粉碎至中位径为100μm，获得天麻粉984g；

步骤2.按照标准NY/T 3494-2019《农业生物质原料纤维素、半纤维素、木质素测定》所述高效液相色谱法测定天麻干料中纤维素、半纤维素的总含量为36g；按照标准NY/T2016-2011《水果及其制品中果胶含量的测定》所述分光光度法测定天麻干料中果胶的含量为156g；按照标准GB/T 25219-2010《粮油检验玉米淀粉含量测定》所述近红外法测定天麻干料中淀粉含量为437g；

步骤3.将步骤1获得天麻粉与15倍体积去离子水混合，加入氢氧化钠调节pH至10.0，95℃碱处理60min；

步骤4.加入步骤2中所述3种多糖总质量2.0％的复合糖苷酶12.58g，该复合糖苷酶组成为纤维素酶：果胶酶：淀粉酶＝36:156:437，在50℃、pH5.5条件下酶解2h，酶解结束后升温80℃灭酶10min获得第一酶解液；

步骤5.在步骤4获得的第一酶解液中加入天麻干料质量1％的复合蛋白酶9.84g，复合蛋白酶组成为碱性蛋白酶：中性蛋白酶＝1：1，在50℃、pH8.0条件下酶解4h，酶解结束后升温80℃灭酶10min，离心过滤并经过膜浓缩后获得固形物为20％的第二酶解液；

步骤6.在步骤4获得的第二酶解液中加入三聚磷酸钠4g与EDTA二钠2g，充分搅拌后超声波处理，最后冷冻干燥获得天麻纳米活性肽制剂R1。

实施例6.天麻纳米活性肽制剂R2的制备方法如下：将实施例R1中的复合糖苷酶组合替换为纤维素酶：果胶酶＝1:1，其余步骤按照实施例R1进行实施后获得天麻纳米活性肽制剂R2。

实施例7.天麻纳米活性肽制剂R2的制备方法如下：

步骤1.取天麻干料1000g采用粉碎机进行初破碎，后采用超微粉碎机将粉体超微粉碎至中位径为10μm，获得天麻粉973g；

步骤2.将步骤1获得天麻粉与15倍体积去离子水混合，加入氢氧化钠调节pH至10.0，95℃碱处理60min；

步骤3.加入天麻干料质量1％的复合蛋白酶9.73g，复合蛋白酶组成为碱性蛋白酶：中性蛋白酶＝1：1，在50℃、pH8.0条件下酶解4h，酶解结束后升温80℃灭酶10min，离心过滤并经过膜浓缩后获得固形物为20％的酶解液，冷冻干燥获得天麻纳米活性肽制剂R2。

实施例8.天麻纳米活性肽制剂R3的制备方法如下：按照实施例R1中步骤1-5进行实施后进行冷冻干燥获得天麻纳米活性肽制剂R3。

实验例1.根据测试说明中的(2-1)对天麻总皂苷测定：对天麻原料、天麻纳米活性肽制剂R1、R2、R3测定吸光度，根据标准曲线计算天麻素含量，结果如下表4所示：

表4天麻素含量

组别	天麻原料	R1	R2	R3
					天麻素含量(％)	0.46±0.08	2.19±0.14	1.43±0.07	0.63±0.11

由表4可知，与人参总皂苷的结果相似，经过针对性的糖苷酶酶解步骤处理所制备的R1相比天麻原料以及非针对性糖苷酶酶解处理的R2、未经过糖苷酶酶解处理的R3在天麻素含量上都有显著性提高(P＜0.01)，说明本发明技术应用于不同种类的植物类药食同源中药都有良好的功效性成分的提取效果。

实验例2.根据测试说明中的(2-2)、(2-3)对肽分子量及粒径测定：

(1)肽分子量测定结果如表5所示：

表5天麻纳米活性肽制剂肽分子量分布

组别	G1	G2	G3
				＜1000Da(％)	92.13	70.25	50.42
189-500Da(％)	48.40	22.74	10.07

R1中的分子量＜1000Da与189-500Da的肽的占比均显著性低于R2及R3，同样说明了糖苷酶酶解处理步骤对蛋白酶水解效果的提升作用。

(2)粒径测定结果如表3所示：

表6天麻纳米活性肽制剂水溶液平均粒径(nm)

由表6可知，本发明技术制备的天麻纳米活性肽制剂G1相比G2、G3、G4大大缩小了水溶液中的平均粒径。而活性肽制剂的平均粒径缩小，可以表明活性肽的吸收效果有所提升。

结合上述实施例效果可以看到，本发明提供的植物类药食同源纳米活性肽制剂的制备方法，通过分析不同植物类药食同源中药的纤维素类多糖、果胶类多糖及淀粉的含量特性，根据该特性进行有针对性的糖苷酶酶解，结合适度的超微粉碎、碱处理进行充分的破壁，并减少大量淀粉粒对进一步活性成分提取的影响。同时，加入EDTA对钙镁等元素进行螯合削减由于螯合作用引起的肽类分子团聚，加入三聚磷酸钠改变纳米分子表面电位的绝对值，减少分子间的吸附作用，再通过超声处理进一步分散纳米分子并冷冻干燥，增加纳米分子与三聚磷酸钠的吸附作用，实现复溶后缩小药食同源中药水溶液中纳米分子的平均粒径，已达到更好的吸收效果。该技术在食品、医药等领域具有良好的应用前景。

由此，本发明的一种植物类药食同源纳米活性肽制剂的制备方法，属于中药制剂领域，技术要点是植物类药食同源原料先进行超微粉碎获得颗粒度达到微米级的中药粉，按比例加纯水与氢氧化钠进行碱处理，分析原料中纤维素类多糖、果胶类多糖、淀粉的组成并按照该比例加入纤维素酶、果胶酶、淀粉酶组成的复合糖苷酶进行第一次酶解，将物理破壁、化学破壁及生物破壁相结合进行有效破壁，增加标志物等活性成分的溶出率。在上述步骤基础上加入复合蛋白酶进行第二次酶解，酶解产物经超滤膜进行分离后，加入三聚磷酸钠与EDTA二钠充分搅拌后超声波处理，经过冷冻干燥获得药食同源纳米活性肽制剂，在保留并提高中药原有质量标志物等传统活性成分的同时，将药食同源制备成纳米级的活性肽制剂，使其具有纳米物质特有的物理、化学和生物学性质，可应用于药物、食品或保健品中。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有衍生，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (16)

1.一种植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，包括：

配制微粉碎植物的水溶液；向水溶液中加入氢氧化钠进行碱处理；

根据植物的不同种类的糖的含量比例，向碱处理后的溶液中加入对应糖的种类及比例的糖苷酶进行糖水解；向糖水解后的溶液中加入蛋白酶进行蛋白水解；

向蛋白水解后的溶液中加入三聚磷酸钠、EDTA二钠，经超声处理，得到植物类纳米活性肽制剂。

2.根据权利要求1所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，微粉碎植物的中位径为50~100μm。

3.根据权利要求1所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，其中，加入氢氧化钠进行碱处理，pH为9.0~10.0，温度为90~100℃，碱处理时间为30~60min。

4.根据权利要求1所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，还包括糖水解后灭酶；蛋白水解后灭酶。

5.根据权利要求1所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，以质量计，糖苷酶占总糖含量的1%~3%，其中，一种类型的糖含量所占总糖含量的比例与所述一种类型的糖对应的糖苷酶的用量所占总糖苷酶用量的比例一致。

6.根据权利要求5所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，糖苷酶占总糖含量的2.0%。

7.根据权利要求1所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，糖包括纤维素类多糖、果胶类多糖及淀粉中的任一种或者组合，糖苷酶包括与纤维素类多糖、果胶类多糖及淀粉对应的纤维素酶、果胶酶及淀粉酶中的任一种或者组合。

8.根据权利要求1所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，糖包括纤维素类多糖、果胶类多糖及淀粉，糖苷酶包括纤维素酶、果胶酶及淀粉酶。

9.根据权利要求1所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，以质量计，蛋白酶的用量占植物重量的0.5%~1.5%。

10.根据权利要求9所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，蛋白酶的用量占植物重量的1.0%。

11.根据权利要求1所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，蛋白酶包括复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶中的任一种或者组合组成。

12.根据权利要求1所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，蛋白水解后经离心、过滤、膜浓缩，得到固形物为20~25%的蛋白水解后的溶液。

13.根据权利要求12所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，三聚磷酸钠与所述固形物的质量比为（1~2:100）；EDTA二钠与所述固形物的质量比为（0.5~1）:100。

14.根据权利要求1所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，加入三聚磷酸钠、EDTA二钠的溶液经搅拌后进行超声处理，超声处理后进行冷冻、干燥，得到所述植物类纳米活性肽制剂。

15.根据权利要求1所述的植物类纳米活性肽制剂的制备方法，其特征在于，超声处理时间为3-5min，超声功率为150-200W。

16.一种植物类纳米活性肽制剂，其特征在于，由权利要求1-15中任一项所述制备方法制备所得。