CN118903076B - 氢醌类衍生物在抑制肺炎克雷伯菌活性及制备抗肺炎克雷伯菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供本发明公开了在安全浓度下，氢醌衍生物A能显著地抑制肺炎克雷伯菌的活性，具体地，本发明以斑马鱼为模式动物，构建了类肺炎克雷伯菌的感染模型，利用FITC荧光染料的荧光强度分析证明了氢醌衍生物A能显著地抑制肺炎克雷伯菌的活性，可以应用于制备抗肺炎克雷伯菌的药物。

Description

氢醌类衍生物在抑制肺炎克雷伯菌活性及制备抗肺炎克雷伯 菌药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及氢醌类衍生物在抑制肺炎克雷伯菌活性及制备抗肺炎克雷伯菌药物中的应用。

背景技术

肺炎克雷伯菌是一种革兰氏阴性细菌，肺炎克雷伯菌可在宿主的咽部、胃肠道定居繁殖形成菌落，在机体免疫力减退、气管插管或滥用抗生素等情况下，通过吸入、吞咽、插管等方式可使致病菌进入肺部引起感染而形成肺炎。肺炎克雷伯菌肺炎可引起重症肺炎、支气管炎、婴幼儿脑膜炎、肠炎、创伤感染、泌尿系统感染及败血症等。

肺炎克雷伯菌(Kpn)是临床分离及医院感染的重要致病菌之一，随着β-内酰胺类及氨基糖苷类等广谱抗菌素的广泛使用，细菌易产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)以及氨基糖苷类修饰酶(AMEs)，对常用药物包括第三代头孢菌素和氨基糖苷类呈现出严重的多重耐药性。肺炎克雷伯菌引起的医院感染率近期逐年增高，且多耐药性菌株的不断增加常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延。肺炎克雷伯菌耐药机制主要包括产生β-内酰胺酶、生物被膜的形成、外膜孔蛋白的缺失、抗菌药物主动外排等，抗菌药物耐药基因水平播散是多药耐药菌株临床加剧的重要原因。

醌/氢醌类衍生物是一类重要的海洋天然产物。大多数天然的醌/氢醌从海洋海绵、褐藻和真菌中分离出来的，它们具有广泛的生物学活性，包括抗肿瘤、抗病毒、抗菌活性，尤其是对耐甲氧西林和多重耐药菌株的抗微生物活性。在大多数情况下，醌/氢醌类衍生物在生物体内通过可逆的氧化还原过程作为重要的电子传递介质。在发明人早期的研究中，采用邻甲基氢醌为支架，合成了3个南海红树林真菌中提取的生物活性氢醌类衍生物，并利用核磁共振光谱及高分辨质谱对其结构进行了表征，合成方法及表征结果详见文献“Li H,Jiang J,Liu Z,Lin S,Xia G,Xia X,Ding B,He L,Lu Y,She Z.Peniphenones A-Dfrom the mangrove fungus Penicillium dipodomyicola HN4-3A as inhibitors ofMycobacterium tuberculosis phosphatase MptpB.J Nat Prod.

2014；77(4):800-806”。

虽然已发现醌/氢醌类衍生物有较好的抗菌活性，但是在现有研究中，还没有过氢醌类衍生物对肺炎克雷伯菌的抑制研究，因此在肺炎克雷伯菌的感染率和耐药性逐渐增高的情况下，研究醌/氢醌类衍生物在对肺炎克雷伯菌的抑制应用中的作用具有积极的影响。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种氢醌类衍生物在抑制肺炎克雷伯菌中的应用。

本发明提供氢醌类衍生物在抑制肺炎克雷伯菌活性中的应用，所述氢醌类衍生物为：为了便于表述，将上述氢醌类衍生物简称为氢醌衍生物A。

氢醌类衍生物在抑制肺炎克雷伯菌活性中的应用，所述氢醌类衍生物还包括的衍生物，氢醌衍生物A的衍生物可为将氢醌衍生物A的一个或多个羟基被进行卤化后的化合物，如羟基被卤化为-F、-Cl、-Br或-I；氢醌衍生物A的衍生物还可以为将氢醌衍生物A进行五元杂环取代，例如吡咯，呋喃，噻吩，恶唑，噻唑，吡唑，咪唑，三氮唑和四氮唑等。

本发明还提供氢醌类衍生物在制备抗肺炎克雷伯菌药物中的应用，所述氢醌类衍生物为：

氢醌类衍生物在制备抗肺炎克雷伯菌药物中的应用，所述氢醌类衍生物还包括的衍生物，氢醌衍生物A的衍生物可为将氢醌衍生物A的一个或多个羟基被进行卤化后的化合物，如羟基被卤化为-F、-Cl、-Br或-I；氢醌衍生物A的衍生物还可以为将氢醌衍生物A进行五元杂环取代，例如吡咯，呋喃，噻吩，恶唑，噻唑，吡唑，咪唑，三氮唑和四氮唑等。

所述氢醌衍生物A可通过邻甲基氢醌作为支架合成得到，简化反应式为：

本方案的有益效果：

本发明公开了，在安全浓度下，氢醌衍生物A能显著地抑制肺炎克雷伯菌的活性，具体地，本发明以斑马鱼为模式动物，构建了类肺炎克雷伯菌的感染模型，利用FITC荧光染料的荧光强度分析证明了氢醌衍生物A能显著地抑制肺炎克雷伯菌的活性，可以应用于制备抗肺炎克雷伯菌的药物。

附图说明

通过附图中所示的本发明优选实施例更具体说明，本发明上述及其它目的、特征和优势将变得更加清晰。在全部附图中相同的附图标记指示相同的部分，且并未刻意按实际尺寸等比例缩放绘制附图，重点在于示出本的主旨。

图1为本发明提供的氢醌衍生物A对于斑马鱼幼鱼体的最大安全浓度试验结果；

图2为本发明提供氢醌衍生物A抑制肺炎克雷伯菌活性的斑马鱼模型荧光试验结果图；

图3为本发明提供氢醌衍生物A抑制肺炎克雷伯菌活性的斑马鱼模型荧光试验荧光强度示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步的详细描述，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

氢醌衍生物A是一种从南海红树林真菌中提取的生物活性氢醌类衍生物，目前已经可以通过人工合成，而对于氢醌衍生物A的具体应用还处于研究阶段，目前未有报道公开将氢醌衍生物A用于抑制肺炎克雷伯菌活性的应用中及将氢醌衍生物A用于制备抗肺炎克雷伯菌的药物的应用中。

以下实施例为验证氢醌衍生物A的安全性及药效的实验，实验结果通过统计学方法进行检验，所有试验均进行至少3次独立重复的试验，结果采用平均值和标准误差表示，所有统计分析均采用P＜0.01作为具有显著统计学差异的检验标准。

由于斑马鱼养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、体外发育、胚体透明等特性，斑马鱼已成为生命科学研究的新宠，被广泛应用于研究多种病原菌和病毒引起的哺乳动物感染过程和抗菌药物的研发。本发明以斑马鱼为模式动物，构建类肺炎克雷伯菌感染模型。

实施例1氢醌衍生物A对于斑马鱼幼鱼体的最大安全浓度试验

在探究氢醌衍生物A抗肺炎克雷伯菌感染的活性试验前，需要进行安全性评价，即需先确定氢醌衍生物A对于斑马鱼幼鱼体的最大安全浓度。生物安全性是候选药物发挥其功效特性的先决条件。首先对氢醌衍生物A在斑马鱼幼鱼体内的安全性进行研究：分别用不同浓度梯度(0.25、0.5、1、2、4μM)的氢醌衍生物A与斑马鱼幼鱼共孵育96h，统计各组在培育72h和96h后正常、畸形和死亡斑马鱼胚胎数，结果如表1和图1所示。

表1氢醌衍生物A对于斑马鱼幼鱼体的最大安全浓度试验

从表1和图1可以看出，浓度为0.25μM、0.5μM和1μM的氢醌衍生物A与斑马鱼幼鱼体共培养，不会引起斑马鱼胚胎出现畸形和死亡，而2μM和4μM的氢醌衍生物A可引起斑马鱼胚胎出现畸形和死亡现象。综上所述，在共培养96h时，氢醌衍生物A对斑马鱼的最大安全浓度为1μM，因此本发明以下试验在氢醌衍生物A的1μM安全浓度下，探究氢醌衍生物A抗肺炎克雷伯菌活性的应用。

实施例2氢醌衍生物A抑制肺炎克雷伯菌活性效果试验

1、肺炎克雷伯菌感染斑马鱼模型构建

使用FITC(异硫氰酸荧光素)荧光染料在避光条件下对肺炎克雷伯菌进行染色，在暗室孵育1h后离心吸净染色工作液，用PBS(聚丁二酸丁二醇酯)冲洗三遍后，用PBS制备菌悬液(1×10⁹CFU/mL)备用。使用0.25％胰蛋白酶对24hpf(hours-post fertilization，受精后小时数)斑马鱼胚胎进行脱膜处理，置于28℃生化培养箱中孵育至48hpf；然后使用0.02％三卡因将斑马鱼幼鱼麻醉并放置在琼脂板上，并使用显微注射仪(PV850，深圳市德诚仪器科技有限公司)将上述染色后的细菌注射2nL至斑马鱼幼鱼卵黄囊中，注射完成后用不含亚甲蓝的胚胎培养基冲洗幼鱼至少两次，去除三卡因和游离细菌。

将斑马鱼感染肺炎克雷伯菌模型置于载玻片上，逐一在荧光显微镜(NIB950-FL，宁波永新光学股份有限公司)下观察细菌分布情况，挑选肺炎克雷伯菌分布均匀、数量相近的斑马鱼模型，随机分为四组，分别为空白对照组、实验组1、实验组2和实验组3，将以上组别斑马鱼模型置于48孔板中，每个组别设置12个复孔，每孔1尾。

2、试验方法

(1)设置分组

挑选肺炎克雷伯菌分布均匀、数量相近的斑马鱼模型，随机分为四组，分别为空白对照组、实验组1、实验组2和实验组3。

配置不同浓度的氢醌衍生物A溶液：将氢醌衍生物A溶解在0.1％DMSO(二甲基亚砜)中，形成浓度为0.25μM、0.5μM以及1μM浓度的氢醌衍生物A溶液，分别对应实验组1、实验组2和实验组3。

在空白对照组中每个复孔添加等量的0.1％DMSO、在实验组1中每个复孔添加等量的0.25μM氢醌衍生物A、在实验组2中每个复孔添加等量的0.5μM氢醌衍生物A、在实验组3中每个复孔添加等量的1μM氢醌衍生物A，将添加物与斑马鱼模型培养48h。

(2)结果统计

在DMSO和氢醌衍生物A干预48h后，将斑马鱼感染肺炎克雷伯菌模型逐一置于荧光显微镜记录肺炎克雷伯菌在斑马鱼体内的分布并统计荧光强度。结果如表2、图2和图3所示。

表2肺炎克雷伯菌在斑马鱼体内的荧光强度统计

图2(a)-(d)为四组的肺炎克雷伯菌感染斑马鱼模型的卵黄囊处在试验0h和48h时的绿色荧光强度对照图。

图(a)为空白对照组的肺炎克雷伯菌感染斑马鱼模型的卵黄囊处在试验0h和48h时的绿色荧光强度对照图，可以看出在试验48h后，斑马鱼的卵黄囊出的绿色荧光强度明显比试验0h时的绿色荧光强度要强，说明在空白对照的情况下，即无药物干预的情况下，肺炎克雷伯菌在48h后进一步感染了斑马鱼，从图3也可以看出，在试验0h时，斑马鱼模型的绿色荧光强度为809au，而在试验48h后，斑马鱼模型的绿色荧光强度为1090au，绿色荧光强度明显增加。

图(b)为实验组1的肺炎克雷伯菌感染斑马鱼模型的卵黄囊处在试验0h和48h时的绿色荧光强度对照图，可以看出在试验48h后，斑马鱼的卵黄囊出的绿色荧光强度与试验0h时的绿色荧光强度接近，说明在实验组1(氢醌衍生物A浓度为0.25μM)的情况下，即在0.25μM氢醌衍生物A干预的情况下，肺炎克雷伯菌在48h后没有进一步感染了斑马鱼，相对于空白实验组来说，有一定的肺炎克雷伯菌抑制作用。从图3也可以看出，在试验0h时，斑马鱼模型的绿色荧光强度为891au，而在试验48h后，斑马鱼模型的绿色荧光强度为922au，绿色荧光强度基本持平。

图(c)为实验组2的肺炎克雷伯菌感染斑马鱼模型的卵黄囊处在试验0h和48h时的绿色荧光强度对照图，可以看出在试验48h后，斑马鱼的卵黄囊出的绿色荧光强度低于试验0h时的绿色荧光强度，说明在实验组1(氢醌衍生物A浓度为0.5μM)的情况下，即在0.5μM氢醌衍生物A干预的情况下，相对于试验0h时，肺炎克雷伯菌在48h后得到了有效的抑制；且相对于空白实验组来说，已经有了明显的肺炎克雷伯菌抑制作用。从图3也可以看出，在试验0h时，斑马鱼模型的绿色荧光强度为823au，而在试验48h后，斑马鱼模型的绿色荧光强度为781au，绿色荧光强度降低(P<0.01)。

图(d)为实验组3的肺炎克雷伯菌感染斑马鱼模型的卵黄囊处在试验0h和48h时的绿色荧光强度对照图，可以看出在试验48h后，斑马鱼的卵黄囊出的绿色荧光强度明显低于试验0h时的绿色荧光强度，说明在实验组1(氢醌衍生物A浓度为1μM)的情况下，即在1μM氢醌衍生物A干预的情况下，相对于试验0h时，肺炎克雷伯菌在48h后得到了显著的抑制；且相对于空白实验组来说，已经有了显著的肺炎克雷伯菌抑制作用。从图3也可以看出，在试验0h时，斑马鱼模型的绿色荧光强度为816au，而在试验48h后，斑马鱼模型的绿色荧光强度为419au，绿色荧光强度明显降低(P<0.001)。

综上所述，荧光强度统计分析表明，氢醌类衍生物A处理浓度≥0.5μM时，显著抑制斑马鱼体内肺炎克雷伯菌的生长(P<0.01)，能够应用于制备抗肺炎克雷伯菌药物。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.氢醌类衍生物在制备抗肺炎克雷伯菌药物中的应用，所述氢醌类衍生物为：