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CN118900847A - 结合b7-h3的抗体及其用途 - Google Patents

结合b7-h3的抗体及其用途 Download PDF

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CN118900847A
CN118900847A CN202280093350.XA CN202280093350A CN118900847A CN 118900847 A CN118900847 A CN 118900847A CN 202280093350 A CN202280093350 A CN 202280093350A CN 118900847 A CN118900847 A CN 118900847A
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李江美
陈云云
毛婷
郭雅南
胡稳奇
李锋
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Original Assignee
Beijing Mabworks Biotech Co Ltd
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Abstract

本申请提供一种与B7‑H3特异结合的分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分。还提供编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及用于表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞和方法。本申请还提供包含该抗体或其抗原结合部分的免疫交联物、双特异性分子、嵌合抗原受体、溶瘤病毒和药物组合物，以及使用本申请抗体或其抗原结合部分的治疗方法。

Description

结合B7-H3的抗体及其用途 技术领域
本申请涉及一种与人B7-H3特异结合的抗体、及其制备和用途，尤其是其在治疗与B7-H3相关疾病例如癌症中的用途。
背景技术
T细胞的增殖和活化依赖双信号，T细胞受体与抗原递呈细胞或肿瘤细胞表面上MHC提呈肽的相互作用提供第一信号，该信号是T细胞活化必须的，但不引起细胞增殖和细胞因子释放；第二信号，即共刺激信号，决定T细胞活化增殖、呈无反应状态或凋亡。B7-CD28共刺激途径在T细胞活化和抑制的调控中发挥着重要作用，CD28表达于T细胞，B7则一般存在于活化的抗原提呈细胞表面。迄今已发现10余种B7蛋白分子，根据其在T细胞激活过程中的转导信号和功能分为三类：I)共刺激；II)共抑制；III)共刺激/抑制。
B7-H3，又称为CD276，是B7家族的一种共刺激/抑制分子。在发现之初，其被认为是共刺激分子，可促进T细胞活化和IFN-γ产生。而近年来的一些研究则表明，B7-H3在适应性免疫中具有抑制作用，例如抑制T细胞激活、增殖和效应细胞因子(主要是IFN-γ和IL-2)的释放，抑制NK细胞的活性等(Prasad DVR.et al.,(2004)J Immunol 173(4):2500–2506；Castriconi R.et al.,(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101(34):12640-12645)。B7-H3的看似矛盾的调控作用可能是通过不同受体介导的，而目前关于B7-H3受体的研究成果非常少。
B7-H3是I型跨膜蛋白，与B7其他家族成员存在20％-27％相似性。其由染色体15q24基因编码，结构上包括胞外域、跨膜域和短胞内域，胞内结构域很短，尚无已知的信号基序。此外，由于外显子重复，人B7-H3蛋白可能包含一对或两对胞外结构域，从而形成2IgB7-H3和4IgB7-H3两种亚型，前者包含一对免疫球蛋白可变区(IgV)样和免疫球蛋白恒定区(IgC)样胞外结构域，后者包含两对相同的IgV样和IgC样胞外结构域，是人类细胞中发现的主要亚型。
B7-H3 mRNA在正常组织中表达广泛，而B7-H3蛋白分子仅在少数组织中低表达(Flem-Karlsen K.et al.,(2018)Trends Cancer 4(6):401–404)。例如在唾液腺腺泡细胞、胃上皮细胞、肾上腺细胞上发现弱细胞质染色，在胃、胆囊、前列腺、子宫颈和子宫内膜的基底侧膜有弱染色。B7-H3蛋白在多种恶性肿瘤中则有着高表达。多项研究显示，B7-H3在肾细胞癌中的表达率为33.0％，在肝细胞癌中为91.8％。值得注意的是，肾细胞癌和血液系统恶性肿瘤的B7-H3表达频率最低(分别为33.0％和36.7％，p<0.001)， 而所有其他实体癌类型的B7-H3表达频率至少为52.3％。在胃肠道肿瘤中，肝细胞癌的B7-H3表达频率最高(91.8％)，胃癌的B7-H3表达频率最低(58.0％)。在泌尿生殖系统恶性肿瘤中，肾细胞癌的B7-H3表达频率最低，而卵巢癌的B7-H3表达频率最高(88.3％)。当所有癌症被包括在内时，B7-H3阳性的累积频率为59.5％(15877/26703)。一方面，具有高肿瘤B7-H3表达量的胰腺癌患者被发现比低B7-H3表达量的患者具有显著更好的术后预后(Loos M.et al.,(2009)BMC Cancer 9:463)。而另一方面，认为B7-H3可建立免疫抑制的免疫微环境，来帮助例如鳞状细胞癌干细胞等逃脱免疫监视(Wang C.et al.,(2021)Cell Stem Cell 28(9):1597-1613；Jin MZ,Jin WL.,(2020)Signal Transduct Target Ther 5(1):166)等。且B7-H3还可通过一些非免疫的途径来促进癌症发生和发展，例如诱导结直肠癌细胞表达VEGFA，促进结直肠癌中上皮细胞间质转型，引发有氧糖酵解给肿瘤提供能量等(Wang RQ et al.,(2020)Cell Death Dis(2020)11(1):55；Jiang B.et al.,(2016)Oncotarget 7(22):31755-31771；Lim S.et al.,(2016)Cancer Res 76(8):2231-2242)。
B7-H3在体内的表达模式使得其成为一种十分具有前景的癌症治疗靶标。特别是，B7-H3还在肿瘤微环境中的基质成纤维细胞和肿瘤相关血管(TAV)上高表达，使得B7-H3靶向治疗甚至有可能消除B7-H3表达量低的癌细胞。
目前有多种形式的靶向B7-H3的药物处于临床开发阶段。依诺妥珠单抗(Enoblituzumab)是首款靶向B7-H3蛋白、具有Fc优化功能的单克隆抗体，其通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用和增强T细胞免疫反应双重机制，达到抗肿瘤作用。临床研究中，根据2018年癌症免疫治疗学会(SITC)年会上公布的数据，依诺妥珠单抗联合PD-1单抗治疗头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)患者的客观缓解率(ORR)达到33.3％；对于PD-L1低表达(＜1％)的非小细胞肺癌(NSCLC)患者ORR也达到35.7％。特别是对此前已经接受PD-1/L1抗体药物治疗患者，不仅再次对治疗产生应答(部分缓解，PR)，疾病控制也达到了PD-1/L1初治患者相同的比例。 131I标记的单克隆抗体8H9(Omburtamab，Y-mAbs)已用于转移性中枢神经系统神经母细胞瘤(NCT00089245)患者和促结缔组织增生性小圆细胞瘤(NCT01099644)患者的腹腔注射，并且耐受性良好。同样，在弥漫性脑桥胶质瘤(NCT01502917)中测试了 124I标记的单克隆抗体8H9，同样耐受性良好。其他一些靶向B7-H3的药物，包括小分子药物、单特异性抗体、双特异性抗体、抗体药物偶联物和CAR-T等，也处于多种实体瘤如黑色素癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、中枢神经细胞肿瘤、胶质母细胞瘤、促纤维增生性小圆细胞瘤、髓母细胞瘤等的临床试验中(Zhou WT,Jin WL.(2021)Front Immunol 12:701006)。
然而，尽管B7-H3的靶向治疗具有广谱的肿瘤抑制效果，但目前还处于早期临床开发阶段，且临床上只对少部分人显示出效果。而且，更加需要注意的是，部分人在开始的时候有非常不错的治疗效果，但是一段时间后会产生耐药效应。找到部分反应和产生耐药的原因，然后发展新的治疗方式和治疗手段，对癌症治疗来说至关重要。对于更 多具有不同特性和药效特点的B7-H3抗体，例如，具备不同亲和力、阻断活性、甚至不同结合表位的B7-H3抗体，在癌症治疗领域仍存在巨大的需求。
对于本申请中任何文件的引用，并不等同于承认这些文件是本申请的现有技术。
发明内容
本申请提供一种分离的单克隆抗体，例如，与B7-H3(例如，人B7-H3、猴B7-H3或小鼠B7-H3)结合的人源或嵌合的单克隆抗体，其与现有技术抗体例如依诺妥珠相比，具有相当或更高的人/猴B7-H3结合亲和力/结合活性、相当或更好的B7-H3阳性细胞结合力、相当或更佳的免疫细胞如NK细胞激活能力、相当或更佳的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)引导效应、相当或更好的体内抗肿瘤效果。本申请的单克隆抗体还能被B7-H3阳性细胞内吞，且与人B7-H3的结合特异性强于现有技术抗体如依诺妥珠。
本申请的抗体可以用于多种应用，包括治疗B7-H3相关疾病如癌症等。
因此，在一个方面，本申请涉及一种分离的单克隆抗体(例如，人源抗体)、或其抗原结合部分，其与B7-H3结合，可以含有i)重链可变区，该重链可变区含有VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区，其中，VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区可以分别包含如(1)SEQ ID NOs:1、2和3；(2)SEQ ID NOs:1、7和8；(3)SEQ ID NOs:12、13和14；(4)SEQ ID NOs:18、19和20；或(5)SEQ ID NOs:23、24和25所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或ii)轻链可变区，该轻链可变区含有VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区，其中，VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区可以分别包含如(1)SEQ ID NOs:4、5和6；(2)SEQ ID NOs:9、10和11；(3)SEQ ID NOs:15、16和17；(4)SEQ ID NOs:9、21和22；或(5)SEQ ID NOs:26、27和28所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1区、VH CDR2区、VH CDR3区、VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区可以分别包含如(1)SEQ ID NOs:1、2、3、4、5和6；(2)SEQ ID NOs:1、7、8、9、10和11；(3)SEQ ID NOs:12、13、14、15、16和17；(4)SEQ ID NOs:18、19、20、9、21和22；或(5)SEQ ID NOs:23、24、25、26、27和28所示的氨基酸序列，或与上述序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区可以包含与SEQ ID NOs:29、31、33、35或37具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链可变区可以包含与SEQ ID NOs:30、32、34、36或38具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区可以分别包含如(1)SEQ ID NOs:29和30；(2)SEQ ID NOs:31和32；(3)SEQ ID NOs:33和34；(4)SEQ ID NOs:35和36；或(5)SEQ ID NOs:37和38所示的氨基酸序列；或与上述具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，本申请涉及一种分离的单克隆抗体(例如，人源抗体)、或其抗原结合部分，其与B7-H3结合，包括i)重链可变区，该重链可变区含有VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区，其中，VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区分别与选定的VH序列的VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3具有同一性，和/或ii)轻链可变区，该轻链可变区含有VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区，其中，VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区分别与选定的VL序列的VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区具有同一性；其中所述选定的VH序列和所述选定的VL序列为下面中的一种：(1)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs:29和30；(2)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs:31和32；(3)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs:33和34；(4)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs:35和36；(5)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs:37和38。
在一个实施方式中，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链恒定区和/或轻链恒定区。其中，重链恒定区可以为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区、或其功能片段。进一步地，可以对重链恒定区进行工程化改造，例如改造成具有加强的FcR结合力，以加强对于B7-H3阳性细胞的ADCC作用。例如，重链恒定区可以引入SI突变(EU编号：S239D和I332E突变)、或VLPLL突变(EU编号：L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L)。在一个实施方式中，重链可变区可以是具有SEQ ID NO:43氨基酸序列的野生型人IgG1恒定区。在一个实施方式中，重链可变区可以是具有SEQ ID NO:44(EU编号：L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L)氨基酸序列的人IgG1恒定区。轻链恒定区可以为κ恒定区，例如具有SEQ ID NO:45氨基酸序列的人κ恒定区或其功能片段。其中，重链恒定区的N端与重链可变区的C端连接，轻链恒定区的N端与轻链可变区的C端连接。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以例如在某些哺乳动物细胞系中重组表达，以去岩藻糖化。可表达去岩藻糖化抗体或其抗原结合部分的细胞系包括但不限于，Slc35C1基因剔除细胞系、FUT8剔除细胞系、变异CHO细胞系Lec13、大鼠融合瘤细胞系YB2/0、包含特异性地针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系以及共表达β-1,4-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II。
本申请的抗体在一些实施方式中包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列和/或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列和/或CDR序列。在一些实施方式中，本申请的抗体可以是单链抗体，或由抗体片段构成，例如Fab或F(ab') 2片段。
本申请还提供含有本申请抗体或其抗原结合部分的免疫偶联物，该抗体或其抗原结合部分与治疗剂例如细胞毒素或抗癌剂相连接。本申请还提供含有本申请抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本申请抗体或其结合部分的结合特异性。在另一方面，本申请的抗体或其抗原结合部分可以是嵌合抗原受体(CAR)或基因改造T细胞受体(TCR)的一部分。本申请还提供含有上述CAR和/或TCR的免疫细胞，包括T细胞、NK细胞等。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以由溶瘤病毒编码或由溶瘤病毒承载。
本申请还包括编码本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子的核酸分子，以及包含该核酸的表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。
在一个实施方式中，本申请表达载体包括一个或多个上述核酸。在又一个实施方式中，本申请表达载体包括两种上述核酸，其分别编码能够共同结合到B7-H3上的VH和VL。在另一个实施方式中，本申请涉及一对载体，其中每个载体包括上述核酸中的一种，该成对载体共同编码能够结合到B7-H3上的VH和VL。
本申请还提供使用含有上述表达载体的宿主细胞来制备本申请抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子的方法，包括：(i)在宿主细胞中表达抗体、其抗原结合部分、或双特异性分子，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体、其抗原结合部分、或双特异性分子。
本申请还提供药物组合物，其包含本申请的抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、双特异性分子、免疫细胞、溶瘤病毒、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
一个方面，本申请提供在受试者中治疗或减缓B7-H3相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请药物组合物。B7-H3相关疾病可以为癌症或自身免疫疾病。癌症可以为实体瘤，包括但不限于，乳腺癌、黑色素癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、非小细胞肺癌、中枢神经系统神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、弥漫性脑桥胶质瘤、髓母细胞瘤、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、卵巢癌、膀胱癌、小细胞癌、子宫内膜癌、肾癌、胃癌、急性髓性白血病、肝细胞癌、下咽鳞状细胞癌、尿路上皮细胞癌。自身免疫疾病包括但不限于哮喘。在一些实施方式中，本申请抗体或其抗原结合部分可以与至少一种其他抗癌抗体一起施用，例如PD-1抗体、PD-L1抗体、4-1BB抗体等。在另一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如IL-2和/或IL-21)或共刺激抗体(例如CD137抗体和/或GITR抗体)一起施用。在另一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部 分可以与化疗剂一起施用，该化疗剂可以是细胞毒性剂。本申请的抗体可以是例如人源抗体。
一个方面，本申请提供在受试者中增强免疫应答的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本申请抗体或其抗原结合部分。增强免疫应答包括激活免疫细胞，包括NK细胞等。
在本申请中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本申请引用文件”)，在本申请引用文件中引用或提及的所有文件，以及本申请或任意本申请引用文件中提及的任何产品的制造商手册、说明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本申请，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入本申请，如同各文件通过引用的方式并入。在本文中提及的任何Genbank序列通过引用的方式并入本申请。
应当注意的是，在本申请中，特别是在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有中国专利法所赋予的意义；而术语例如“基本由……组成”具有中国专利法所赋予的意义，例如允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明的基本或新的特性的元素排除在外。
基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本申请中引用的所有文献、Genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。
附图说明
以下以示例方式给出但不意在将本发明限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。
图1示出全人源B7-H3抗体对B7-H3阳性肿瘤细胞，包括A549细胞(A)、NCI-H520细胞(B)、HepG2细胞(C)、SK-OV-3细胞(D)和MCF-7细胞(E)的结合活性。
图2示出全人源B7-H3抗体对B7-H3阴性肿瘤细胞，包括Jurkat细胞(A)、Daudi细胞(B)和Raji细胞(C)的结合活性。
图3示出全人源B7-H3抗体对B7-H3阳性正常细胞，包括人前列腺平滑肌细胞(A)、人真皮成纤维细胞(B)、人主动脉平滑肌细胞(C)以及人树突状细胞(D)的结合活性。
图4示出Fc改造前后的全人源B7-H3抗体6B5-WT、6B5-AF和6B5-Mut对HUVEC细胞(A)以及NCI-H520细胞(C)的结合活性，以及10D7-WT、10D7-AF和10D7-Mut对HUVEC细胞(B)以及NCI-H520细胞(D)的结合活性。
图5示出Fc改造前后的全人源B7-H3抗体10D7-WT、10D7-AF和10D7-Mut引发NK细胞对NCI-H520细胞的杀伤的能力(A)、以及活化NK细胞的能力(C)，以及 6B5-WT、6B5-AF和6B5-Mut引发NK细胞对NCI-H520细胞的杀伤的能力(B)、以及活化NK细胞的能力(D)。
图6示出Fc改造前后的全人源B7-H3抗体10D7-WT、10D7-AF和10D7-Mut引发PBMC细胞对NCI-H520细胞的杀伤的能力(A)，以及6B5-WT、6B5-AF和6B5-Mut引发PBMC细胞对NCI-H520细胞的杀伤的能力(B)。
图7示出去岩藻糖化的全人源B7-H3抗体10D7-AF和6B5-AF引发NK细胞(A)或PBMC(B)对HUVEC细胞的杀伤的能力(A)，以及PBMC细胞杀伤HUVEC细胞过程中IFN-γ的分泌量(C)。
图8示出去岩藻糖化的全人源B7-H3抗体10D7-AF和6B5-AF引发NK细胞对成熟树突状细胞的杀伤的能力。
图9示出全人源B7-H3抗体在NCI-H520细胞(A)和A549细胞(B)中的内吞效应。
图10示出使用平均联动聚类法推算出的全人源B7-H3抗体的B7-H3结合表位系统树状图。
图11示出通过SPR检测的6B5抗体与B7家族成员的结合性。
图12示出人源化B7-H3小鼠经全人源B7-H3抗体10F5-Mut(A)、6B5-Mut、15F11-Mut(B)处理的肿瘤体积变化。
图13示出去岩藻糖化的全人源B7-H3抗体6B5-AF的代表性组织染色结果。
具体实施方式
为更好理解本申请，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
术语“B7-H3”是指B7类似物3，又称为分化簇276(CD276)。根据胞外域结构的不同，可以分为两种亚型，即4Ig型和2Ig型。该术语包括变体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人B7-H3特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的B7-H3蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人B7-H3蛋白特异的抗体可以完全地对人B7-H3蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的B7-H3蛋白交叉反应。
术语“人B7-H3”是指具有人氨基酸序列的B7-H3蛋白，例如具有NCBI索引号为NP_001019907.1的氨基酸序列的B7-H3(4Ig)蛋白(Kanayama T.et al.,(2021)Sci Rep11(1):18802)、或具有NCBI索引号为NP_001316557.1的氨基酸序列的B7-H3(2Ig)蛋白(Fu M.et al.,(2021)J Transl Med 19(1):404)。术语“猴B7-H3”是指具有猴氨基酸序列的B7-H3蛋白，例如具有NCBI索引号为XP_015308534.1的氨基酸序列的B7-H3。术语“小鼠B7-H3”是指具有小鼠氨基酸B7-H3蛋白，例如具有NCBI索引号为NP_598744.1的氨基酸序列的B7-H3蛋白(Cheng N.et al.,(2021)Biochem Pharmacol 183:114298)。
本文中的术语“抗体”意在包括IgG、IgA、IgD、IgE和IgM全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称V H或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即C H1、C H2和C H3。各轻链由轻链可变区(简称V L或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域C L构成。V H和V L区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的骨架区(FR)区分隔开。各V H和V L由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)的结合。抗体恒定区的“功能片段”是指恒定区中保留有某些所需功能的片段，例如重链恒定区中保留有FcR/补体系统组分结合活性的片段。
本文中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，B7-H3蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由V L、V H、C L和C H1构成的单价片段；(ii)F(ab') 2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V H和C H1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂V L和V H构成的Fv片段；(v)由V H构成的dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域V L和V H由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中V L和V H区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.,(1988)Science 242:423-426；and Huston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
本文所用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与B7-H3蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合B7-H3蛋白之外抗原的抗体。但是，特异结合人B7-H3蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的B7-H3蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
术语“人源抗体”是指可变区骨架和CDR区得自人种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自人种系免疫球蛋白序列。本申请的人源抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通 过体内体细胞突变而导入的突变。然而，术语“人源抗体”不包括在人骨架序列中插入得自其他哺乳动物物种的CDR序列的抗体。
术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是指组合有一个物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。
术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
在本文中，“特异结合人B7-H3”的抗体是指与人B7-H3(以及其他非人物种的B7-H3)结合但是基本不与非B7-H3蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人B7-H3蛋白，即K D值为5.0x10 -8M以下。
术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的K D为1.0x10 -6M以上，更优选1.0x10 -5M以上，更优选1.0x10 -4M以上、1.0x10 -3M以上，更优选1.0x10 -2M以上。
术语“EC 50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
术语“IC 50”，是指半抑制浓度，即对指定的生物过程抑制一半时所需的药物或抑制剂的浓度。
术语“抗体依赖的细胞毒性”、“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的免疫防御，其中免疫系统效应细胞主动地将细胞膜表面抗原与抗体，例如本申请的B7-H3抗体，结合的靶细胞裂解。
术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状的本申请抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。
本申请的多个方面在以下更加具体地加以描述。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以与人、猴等的B7-H3特异性结合，包括B7-H3阳性细胞，且结合活性/结合亲和性与现有技术抗体例如依诺妥珠相当或更佳。此外，与现有技术抗体例如依诺妥珠相比，本申请的抗体或其抗原结合部分具有相当或更佳的免疫细胞如NK细胞激活能力、相当或更佳的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)引导效应、相当或更好的体内抗肿瘤效果。本申请的单克隆抗体或其抗原结合部分还能被B7-H3阳性细胞内吞，且与人B7-H3的结合特异性强于现有技术抗体如依诺妥珠。
优选的本申请抗体是单克隆抗体。此外，抗体可以是例如人源的、或嵌合的单克隆抗体。
本申请的示例性抗体或其抗原结合部分是结构和化学特性在以下描述的那些。
本申请抗体或其抗原结合部分的重链可变区CDR和轻链可变区CDR通过Kabat编号系统确定，且CDR区氨基酸序列的SEQ ID NO，连同重/轻链氨基酸序列的SEQ ID NO，列于表1A中。本申请抗体或其抗原结合部分的重链可变区CDR和轻链可变区CDR还可通过Chothia编号系统确定，用该系统确定的CDR区氨基酸序列的SEQ ID NO列于表1B中。
表1A.Kabat编号系统确定的重链/轻链可变区CDR以及重链/轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.
表1B.Chothia编号系统确定的重链/轻链可变区CDR以及重链/轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.
本申请抗体的重链/轻链可变区序列除了可以具有上面示例性示出的通过Kabat和Chothia编号系统确定序列的CDR区外，还可以具有通过其他编码方式以序列SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37和38序列为基础确定的CDR区。领域内熟知，重链可变区和轻链可变区CDR还可以通过例如IMGT、AbM或Contact等编号系统/方法确定。
本申请抗体可以具有重链恒定区，例如可以是IgG1恒定区，例如包含如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的人IgG1恒定区。恒定区可以经改造为具有增强的FcR结合力，例如包含如SEQ ID NO:44(EU编号：L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L)所示氨基酸序列的人IgG1恒定区。轻链恒定区可以为κ恒定区，例如人κ恒定区，其可以包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
与人B7-H3结合的其他B7-H3抗体的V H和/或V L序列(或CDR序列)可以与本申请抗体的V H和/或V L序列(或CDR序列)“混合并配对”。优选地，当V H和V L(或其中的CDR)混合并配对时，特定V H/V L配对中的V H序列可以由结构近似的V H序列取代。相似地，优选特定V H/V L配对中的V L序列由结构近似的V L序列取代。
因此，在一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包含列于表1中氨基酸序列的重链可变区；以及
(b)包含列于表1中氨基酸序列的轻链可变区，或者另一B7-H3抗体的V L，其中该抗体特异结合人B7-H3。
在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)列于表1中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)列于表1中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一B7-H3抗体的CDR，其中该抗体特异结合人B7-H3。
在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括B7-H3抗体的重链可变区CDR2以及其他结合人B7-H3的抗体的CDR，例如重链可变区CDR1和/或CDR3，和/或另一B7-H3抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。
此外，领域内公知的是，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2，可单独确定抗体对同种抗原的结合特异性，且可以预测到基于该CDR3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如Klimka et al.,British J.of Cancer 83(2):252-260(2000)；Beiboer et al.,J.Mol.Biol.296:833-849(2000)；Rader et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:8910-8915(1998)；Barbas et al.,J.Am.Chem.Soc.116:2161-2162(1994)；Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:2529-2533(1995)；Ditzel et al.,J.Immunol.157:739-749(1996)；Berezov et al.,BIAjournal 8:Scientific Review 8(2001)；Igarashi et al.,J.Biochem(Tokyo)117:452-7(1995)；Bourgeois et al.,J.Virol 72:807-10(1998)；Levi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:4374-8(1993)；Polymenis and Stoller,J.Immunol.152:5218-5329(1994)and Xu and Davis,Immunity 13:37-45(2000)；U.S.Pat.Nos.6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献均通过引用的方式全部并入本文。
在另一实施方式中，本申请的抗体包含B7-H3抗体的重链可变区的CDR2以及至少B7-H3抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一B7-H3抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体能够特异结合人B7-H3。优选这些抗体(a)竞争结合B7-H3；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本申请B7-H3抗体相似的结 合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含B7-H3抗体的轻链可变区CDR2，或者另一B7-H3抗体的轻链可变区CDR2，其中该抗体特异结合人B7-H3。在另一实施方式中，本申请的抗体可以包括B7-H3抗体的重链/轻链可变区CDR1，或另一B7-H3抗体的重链和/或轻链可变区CDR1，其中该抗体特异结合人B7-H3。
在另一实施方式中，本申请的抗体包含与本申请B7-H3抗体存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，Brummell et al.,(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildt et al.,(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov et al.,(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall et al.,(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley and O'Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy et al.,(1998)Int.Immunol.10:341-6 and Beers et al.,(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。
因此，在一个实施方式中，抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区和轻链可变区分别包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：
(a)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
(b)重链可变区CDR2包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
(c)重链可变区CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
(d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；且
(e)该抗体特异结合人B7-H3。
本申请的抗体具有一个或多个以下功能特征，例如对人B7-H3的高亲和力和高特异结合性，以及增强的FcR结合力、以及相应的增强的对于B7-H3阳性肿瘤细胞引发ADCC的能力。
在多个实施方式中，抗体或其抗原结合部分可以是例如人源或嵌合的。
本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请抗体中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。
本申请的抗体可以以具备本申请B7-H3抗体的一个或多个V H/V L序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，V H和/或V L)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，或者抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。
在某些实施方式中，CDR区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，CDR内的氨基酸残基比起CDR外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为CDR序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的CDR序列植入到不同特性的不同抗体的骨架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(Riechmann et al.,(1998)Nature 332:323-327；Jones et al.,(1986)Nature 321:522-525；Queen et al.,(1989)Proc.Natl.Acad；U.S.A.86:10029-10033；U.S.Pat.Nos.5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本申请的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3。尽管这些抗体包含本申请单克隆抗体的V H和V L CDR序列，它们可以含有不同的骨架序列。
这样的骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Vbase人种系序列数据库(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat et al.,(1991),同上；Tomlinson et al.,(1992)J.Mol.Biol.227:776-798；和Cox et al.,(1994)Eur.J.Immunol.24:827-836中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。例如，下列HCo7HuMAb小鼠中的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109,NT--024637&BC070333)、3-33(NG--0010109&NT--024637)和3-7(NG--0010109&NT--024637)。作为另一例子，以下来自Hco12HuMAb小鼠的重链种系序列的Genbank登录号为1-69(NG--0010109,NT--024637&BC070333)、5-51(NG--0010109&NT--024637)、4-34(NG--0010109&NT--024637)、3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)。
通过使用本领域公知的称为空格(gap)BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschul et al.,(1997))，将抗体蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较。
用于本申请抗体的优选骨架序列是结构上与本申请抗体所用的骨架序列相似的那些。V H CDR1、CDR2、和CDR3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者CDR序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的骨架区中。例如，在一些情况下，将骨架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性(参见例如U.S.Pat.Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一类的可变区修饰是将V H和/或V L CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。
此外，在另一实施方式中，本申请提供分离的B7-H3单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其包含：(a)V H CDR1区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)V H CDR2区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)V H CDR3区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)V L CDR1区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)V L CDR2区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)V L CDR3区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。
本申请的基因改造抗体包括在V H和/或V L的骨架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。骨架修饰包括对骨架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。
此外，作为骨架或CDR区内修饰之外的另一种选择，本申请的抗体可以基因改造成在Fc区包括基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本申请的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变抗体的一个或多个功能特性。
在一个实施方式中，C H1的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变C H1铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。
在另一个实施方式中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以增加或降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的C H2-C H3连接区，从而抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言，具有减弱的SpA结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。
在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。 这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。
此外，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。改变的糖基化形式被证明能增加抗体的ADCC活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已知，包括但不限于，Slc35c1基因剔除细胞系、FUT8剔除细胞系、变异CHO细胞系Lec13、大鼠融合瘤细胞系YB2/0、包含特异性地针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系、共表达β-1,4-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II的细胞系。它们可以用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体。Slc35c1基因剔除细胞系例如采用天广实自主研发的岩藻糖敲除平台技术，参见美国专利No.10377833B2中保藏号为CGMCC No.14287的CHO细胞系。
本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化(PEG化)。抗体可以PEG化，例如来增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体PEG化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，PEG化通过与反应性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C 1-C 10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要PEG化的抗体是去糖基化的抗体。PEG化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用到本申请的抗体。参见，例如EPO 154 316和EP 0 401 384。
本申请的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其分类。
例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pK值(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala and Morrison(2004)J Immunol 172:5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316:452-7；Mimura et al.,(2000)Mol Immunol 37:697-706)。糖基化已知发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选B7-H3抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择不在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域的残基来实现。
在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在N-G或D-G序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。
各抗体将具有独特的等电点(pI)，基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构且不稳定。因此，优选B7-H3抗 体的pI值落在正常范围内。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。
在另一方面，本申请提供编码本申请抗体或其抗原结合部分的重链/轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。
本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。
优选的本申请核酸分子包括编码B7-H3单克隆抗体的V H和V L序列或CDR的那些。一旦获得了编码V H和V L的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码V H或V L的DNA片段与编码另一蛋白的另一DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。
编码V H区的分离DNA可以通过可操作地连接V H编码DNA与编码重链恒定区(C H1、C H2和C H3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是优选为IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码V H区的DNA可以可操作地与仅编码重链C H1恒定区的另一DNA分子连接。
编码V L区的分离DNA可以通过可操作地连接V L编码DNA与编码轻链恒定区C L的另一DNA分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。
为创建scFv基因，编码V H和V L的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头的另一片段连接，从而V H和V L序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中V H和V L区域通过该柔性接头连接(参见，例如Bird et al.,(1988)Science 242:423-426；Huston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty et al.,(1990)Nature 348:552-554)。
本申请的单克隆抗体可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他实施方式包括B淋巴细胞的病 毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体也在领域内熟知。参见，例如美国专利4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。
本申请的抗体或其抗原结合部分还可以使用例如重组DNA技术结合基因转染方法，在宿主细胞转染瘤中生成(例如Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。
术语“调控序列”包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复(Takebe et al.,(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。
抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区通过插入到已经编码所需亚型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而构建全长抗体基因，从而V H与载体中的C H可操作地连接，V L与载体中的C L可操作地连接。或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除抗体链基因和调控序列外，本申请的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞(参见，例如，美国专利4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本申请抗体在理论上是可行的，优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿 主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。
优选的用于表达本申请重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括Slc35C1基因剔除细胞系、FUT8剔除细胞系、变异CHO细胞系Lec13、大鼠融合瘤细胞系YB2/0、包含特异性地针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系、共表达β-1,4-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II、中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr-CHO细胞，在Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中有过描述，DHFR可选择标记物在例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159:601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以与治疗剂偶联，形成免疫偶联物，例如抗体-药物偶联物(ADC)。合适的治疗剂包括细胞毒素、烷化剂、DNA小沟结合分子、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II的抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选地通过接头交联，该接头可切割，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可以如美国专利7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公开WO02/096910；WO 07/038,658；WO 07/051,081；WO 07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；和20060247295中描述般进行制备。
另一方面，本申请涉及包含与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体配体)相连接的一种或多种本申请抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成，称为Bs(scFv) 2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。参见，例如Kufer et al,cited supra；Cao and Suresh,Bioconjugate Chemistry,9(6),635-644(1998)；和van Spriel et al.,Immunology Today,21(8),391-397(2000)。
本申请还提供包含B7-H3单链抗体scFv的嵌合抗原受体，该scFv包含本申请中所述的重链和轻链CDR、或重链和轻链可变区。
B7-H3嵌合抗原受体可以包含(a)含有B7-H3scFv的胞外抗原结合域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号转导结构域。
溶瘤病毒偏好地侵染并杀灭癌细胞。本申请的抗体或其抗原结合部分可以与溶瘤病毒一起使用。此外，编码本申请抗体或其抗原结合部分的溶瘤病毒可以引入人体中。
在另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含本申请的一种或多种抗体或其抗原结合部分、抗体或抗原结合部分编码载体、免疫偶联物、免疫细胞、双特异抗体、和/或溶瘤病毒，与药学上可接受的载体配制在一起。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的有效成分，例如另一抗肿瘤抗体、或免疫增强抗体，或者非抗体类抗肿瘤剂、或免疫增强剂。本申请的药学组合物可以与例如另一抗癌剂、或另一免疫增强剂联合使用。
药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro,ed.,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.(Lippincott Williams & Wilkins 2003)中有教导。
优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本申请的抗体可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。
药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。
与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分。
给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。
对于抗体的施用，剂量可以为约0.001-100mg/kg宿主体重。示例性的治疗方案涉及每周施用一次。本申请B7-H3的优选给药方案包括静脉内施用。
“治疗有效量”的本申请B7-H3抗体引起疾病症状严重程度的降低、无症状期频率和持续时间的增加。例如，对于带瘤受试者的治疗，“治疗有效量”优选地，与未治疗受试者相比，将肿瘤生长抑制至少约20％、更优选抑制至少约40％，甚至更优选地抑制至少约60％，且更优选地抑制至少约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者可以是人或另一哺乳动物。
药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。
在某些实施方式中，本申请的单抗可以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本申请的治疗抗体穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685；Umezawa et al.,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038；Bloeman et al.,(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais et al.,(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180；Briscoe et al.,(1995)Am.J.Physiol.1233:134；Schreier et al.,(1994)J.Biol.Chem.269:9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；和Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
本申请的药物组合物具有多种体外和外内应用，涉及例如癌症的治疗，或者更笼统地讲，用于癌症等疾病患者的免疫增强。药物组合物可以施用至人受试者，以例如体内抑制肿瘤生长。
考虑到本申请药物组合物的抑制肿瘤细胞增殖和存活的能力，本申请提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向该受试者施用本申请的药物组合物，从而在该受试者中肿瘤生长被抑制。可以由本申请抗体治疗的肿瘤的非限制性例子包括但不限于乳腺癌、黑色素癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、非小细胞肺癌、中枢神经系统神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、弥漫性脑桥胶质瘤、髓母细胞瘤、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、卵巢癌、膀胱癌、小细胞癌、子宫内膜癌、肾癌、胃癌、急性髓性白血病、肝细胞癌、下咽鳞状细胞癌、尿路上皮细 胞癌，不管是原发还是转移的。此外，难治的或复发的恶性肿瘤也可能可以用本申请的药物组合物进行治疗。本申请的药物组合物还可以治疗自身免疫疾病，例如哮喘等。
本申请的药物组合物可以用于在受试者中增强免疫应答，例如激活免疫细胞如NK细胞、T细胞等。
本申请提供本申请药物组合物与一种或多种其他抗体或非抗体类治疗剂一起施用的联合疗法，其能有效抑制受试者中的肿瘤生长。在一个实施方式中，本申请提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用本申请药物组合物以及一种或多种其他抗体，例如PD-1抗体、PD-L1抗体和/或4-1BB抗体。在某些实施方式中，受试者是人。在另一个方面，本申请提供癌症治疗方法，其中本申请的药物组合物与化疗剂一起施用，化疗剂可以是细胞毒性剂。其他可以与本申请药物组合物联合的疗法包括但不限于免疫原性剂施用、白介素2(IL-2)施用、放疗、手术或激素去除。
本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。
此外，如果进行多次联合疗法施用，且药剂按序施用，则在各时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。
本申请还通过以下实施例进行进一步描述，实施例不应当解读为限制性的。所有附图和在本申请中通篇引用的所有参考文献、Genebank序列、专利和公开专利申请都通过引用的方式全部并入本文。
实施例
实施例1.抗人B7-H3单克隆抗体的产生
为产生抗人B7-H3的抗体，使用重组人B7-H3(4Ig)蛋白(人B7-H3(4Ig)/B7-H3b蛋白，带His标签，Cat#:B7B-H52E7，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)和/或重组人B7-H3(2Ig)蛋白(人B7-H3/CD276蛋白，带His标签(MALS验证)，Cat#:B73-H52E2，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)免疫B7-H3 RenMab KO小鼠。RenMab小鼠具有人源化重链免疫球蛋白基因座和人源化κ链免疫球蛋白基因座。重链免疫球蛋白基因座包含抗体重链基因的区域。该基因座包括IGHV(可变)、IGHD(多样性)、IGHJ(连接)和重链恒定域基因。κ链免疫球蛋白基因座包含编码抗体轻链(κ链)的基因。κ链免疫球蛋白基因座包括IGKV(可变)、IGKJ(连接)和轻链恒定域基因。关于RenMab小鼠的详细描述可以在PCT/CN2020/075698中找到，其全文以引用方式并入本文。B7-H3 RenMab KO小鼠通过敲除RenMab小鼠B7-H3基因获得，其体内不表达有功能的B7-H3蛋白。
小鼠免疫
B7-H3 RenMab KO小鼠用重组人B7-H3(4Ig)蛋白进行四轮免疫。蛋白与佐剂1:1等体积混合，然后乳化。每只动物通过脚后跟及颈部注射。第1次免疫佐剂为完全弗氏 佐剂(CFA)，第2-4次免疫佐剂为不完全弗氏佐剂(IFA)，两次注射之间至少间隔14天。
在另一组平行实验中，使用重组人B7-H3(4Ig)蛋白和重组人B7-H3(2Ig)蛋白进行交叉免疫。蛋白与佐剂1:1等体积混合，然后乳化。每只动物通过脚后跟及颈部注射。第1次免疫佐剂为完全弗氏佐剂(CFA)，第2-4次免疫佐剂为不完全弗氏佐剂(IFA)，两次注射之间至少间隔14天。
可通过收集外周血(血清)并使用荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA检测抗体效价。
在第4次免疫至少14天后进行最后一次增强免疫的程序，通过腹腔注射B7-H3(4Ig)蛋白质以及尾静脉注射表面表达B7-H3(2Ig)抗原的CHO细胞至小鼠体内。
抗体发现
最后一次免疫4天后处死小鼠，直接从免疫小鼠体内分离抗原阳性B细胞，再进一步通过单细胞技术( 光流系统，Berkeley Lights Inc.)筛选并找到分泌抗原特异性单抗的浆细胞，利用反转录和PCR测序获得抗体可变区序列，将抗体重/轻链可变区克隆到含有人IgG恒定区和人κ恒定区骨架载体上，进行抗体表达，并采用FACS方法验证所表达抗体与B7-H3结合的特异性。该方法得到的示例性全人抗体包括6B5、10D7、10F5、10F7和15F11，其重轻链可变区和CDR的序列和SEQ ID号列于表1和表9。
抗体构建、表达和纯化
通过将编码可变区和人IgG1/κ恒定区(重链恒定区和轻链恒定区的氨基酸序列分别列于SEQ ID NOs:43和45)的序列插入到pCDNA3.1(Invitrogen，美国)的限制性酶切位点XhoI/BamHI之间来构建抗体表达载体。
将上述获得的表达载体PEI转染HEK-293F细胞(Cobioer，中国)。具体而言，HEK-293F细胞在Free Style TM 293表达培养基(Cat#:12338-018，Gibco，美国)中培养，并用聚乙烯亚胺(PEI)转染的方式将各表达载体转染至细胞，DNA与PEI的比例是1:3，每毫升细胞培养液中加入DNA的量是1.5μg。转染后的HEK-293F细胞在37℃、5％CO 2的培养箱中以120rpm转速培养。10-12天后，收集细胞培养上清，3500rpm离心5分钟，并通过0.22μm滤膜过滤除去细胞碎片。单克隆抗体通过预平衡的蛋白-A亲和柱(Cat#:17040501，GE，美国)来富集纯化，后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸，pH3.0-pH3.5)进行洗脱。之后，抗体保存在PBS(pH 7.0)中，并通过NanoDrop检测抗体浓度。
实施例2.全人源B7-H3抗体亲和力检测
通过表面等离子体共振(SPR)，用装备有预先固定的蛋白A传感器芯片的Biacore(Biacore，美国)T200生物传感器测量全人源抗人B7-H3抗体对人B7-H3(4Ig)、人B7-H3(2Ig)、猴B7-H3(猴B7-H3/CD276蛋白，带His标签，Cat#:B73-C52Ha，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)和小鼠B7-H3蛋白(小鼠B7-H3/CD276蛋白，带His标签，Cat#:B73-M52H4，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)的结合亲和力。简 而言之，将抗人B7-H3抗体(1μg/mL)按照10μL/min注射到Biacore T200生物传感器中约20秒，以达到期望蛋白质密度(100±30RU)。然后将上述抗原蛋白以200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0.78125nM和0nM的浓度，按照30μL/min注射180秒，监测解离600秒。依诺妥珠单抗，MacroGenics研发的一款Fc优化的人源化B7-H3抗体(抗体序列参见US8802091B2，重/轻链可变区序列分别如SEQ ID NOs:39和40所示，重链恒定区为做了F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L五个点突变以增强ADCC效果的IgG1恒定区，轻链为κ链的恒定区，序列分别如SEQ ID NOs:44和45所示)，用作阳性对照抗体。
通过Biacore Insight评估软件V2.0.1 5.12933，对所产生的数据用1:1结合拟合方式进行分析。从而同时获得缔合速率(kon)和解离速率(koff)。由动力学速率常数的商(K D＝koff/kon)计算亲和力。
所有的本申请抗体都跟两种不同剪切形式的人B7-H3结合，也都与猴B7-H3蛋白结合，6B5抗体和15F11抗体还与小鼠B7-H3蛋白结合。表2和表3展示了本申请代表性抗体的亲和力测试结果。
表2.B7-H3抗体对人B7-H3(4Ig)和人B7-H3(2Ig)的结合亲和力
表3.B7-H3抗体对猴B7-H3和小鼠B7-H3的结合亲和力
实施例3.全人源B7-H3抗体与B7-H3阳性肿瘤细胞、B7-H3阴性肿瘤细胞以及B7-H3 阳性正常细胞的结合力
为确定本申请的全人源B7-H3抗体与不同类型B7-H3阳性肿瘤细胞、阴性肿瘤细胞以及B7-H3阳性正常细胞的结合，使用A549细胞(Cat#:CBP60084，科佰)、NCI-H520细胞(Cat#:CBP60139，科佰)、HepG2细胞(Cat#:CBP60199，科佰)、SK-OV-3细胞(Cat#:CBP60291，科佰)和MCF-7细胞(Cat#:CL-0149，普诺赛)作为B7-H3阳性肿瘤细胞代表，使用Jurkat细胞(Cat#:CBP60520，科佰)、Daudi细胞(Cat#:CBP60262，科佰)、Raji细胞(Cat#:CBP60272，科佰)作为B7-H3阴性肿瘤细胞代表(据文献报道，这三种细胞表现为B7-H3 mRNA阴性)，并使用人前列腺平滑肌细胞(Cat#:CC-2587，Lonza)、人真皮成纤维细胞(Cat#:CC-2511，Lonza)、人主动脉平滑肌细胞(Cat#:H-6080，Cell Biologics)以及人树突状细胞(人PBMC诱导成熟)作为正常细胞的代表，进行FACS细胞结合检测。
A549细胞、NCI-H520细胞、Jurkat细胞、Daudi细胞和Raji细胞的培养基均为RPMI1640培养基(Cat#:12-115F，Lonza)，且补充有10％FBS(Cat#:FND500，Excell)、和1％青霉素/链霉素(Cat#:SV30010，Hyclone)。HepG2细胞和SK-OV-3细胞分别培养在MEM培养基(Cat#:12561-056，Gibco)和McCoy’s 5A培养基(Cat#:16600-082，Hyclone)中，培养基均补充有10％FBS(Cat#:FND500，Excell)和1％青霉素/链霉素(Cat#:SV30010，Hyclone)。MCF-7细胞培养在MCF7细胞专用培养基(Cat#:CM-0149，普诺赛)中，人前列腺平滑肌细胞通过SmGM TM-2平滑肌细胞生长培养基BulletKit TM(Cat#:CC-3182，Lonza)按照说明进行培养，人真皮成纤维细胞通过FGM TM-2成纤维细胞生长培养基BulletKit TM(Cat#:CC-3132，Lonza)按照说明进行培养，人主动脉平滑肌细胞通过平滑肌细胞完全培养基(Cat#:M2268，Cell Biologics)按照说明进行培养。
人树突状细胞通过分离PBMC、并经体外诱导后得到。简单而言，将PBMC(Cat#:PB004F-C，ALLCELLS)重悬于RPMI1640培养基，37℃孵育箱中培养2小时，收集贴壁细胞，即得到分离的单核细胞。单核细胞在补充有100ng/ml重组人GM-CSF(Cat#:7954-GM，R&D)、100ng/ml重组人IL-4(Cat#:6507-IL，R&D)和10％FBS的RPMI1640培养基中培养。三天后，将一半的培养基替换为新鲜培养基。在培养的第6天，将培养基替换为含有100ng/ml重组人GM-CSF、100ng/ml重组人IL-4、10ng/ml rhTNF-α(Cat#:210-TA-100，R&D)、1000U/ml rhIL-6(Cat#:7270-IL-025，R&D)、1μg/ml PGE2(Cat#:363-24-6，TOCRIS)和10ng/ml IL-1β(Cat#:210-LB-025，R&D)的培养基。细胞再孵育2天后得到成熟的人树突状细胞。
检测B7-H3抗体与上述细胞的结合力。简单而言，将100μl培养基中的10 5个细胞在96孔板上铺板，并加入50μl梯度稀释的B7-H3抗体。4℃孵育1个小时后，96孔板用PBST清洗3遍。之后，加入500倍稀释的PE-山羊抗小鼠IgG(Cat#:PA1-86078，Invitrogen)。4℃孵育1小时后，96孔板用PBS清洗3遍，然后使用FACS检测仪(BD) 检测细胞荧光。依诺妥珠抗体用作阳性对照。本申请中的代表性B7-H3抗体的测试结果示于图1-图3。
如图1所示，6B5和10D7与多种类型的B7-H3阳性肿瘤细胞结合，且结合力均显著高于对照抗体依诺妥珠。从图2可以看出，6B5和10D7与B7-H3 mRNA阴性肿瘤细胞系基本没有结合，其结合力相比较于对照抗体依诺妥珠显著更低，显示出本申请抗体的B7-H3结合特异性更好。图3显示出，在多种人正常B7-H3阳性细胞中，6B5的结合力略高于阳性对照抗体依诺妥珠，而10D7的结合力与依诺妥珠相当。
实施例4.Fc改造不影响全人源B7-H3抗体与B7-H3阳性细胞的结合
将10D7和6B5重链/轻链可变区加上人IgG1/κ恒定区(SEQ ID NOs:43和45)克隆到pCDNA3.1(Invitrogen，美国)中，构建表达载体，分别转染到CHO-K1细胞、以及SLC35c1基因敲除的CHO-K1-AF细胞中。SLC35c1基因敲除的CHO-K1-AF细胞由北京天广实生物技术股份有限公司构建，具体构建方法参见US10377833B2，由该细胞系表达的蛋白是基本上没有岩藻糖化修饰的。在CHO-K1和CHO-K1-AF细胞中瞬时表达10D7和6B5并进行纯化，抗体命名为10D7-WT、6B5-WT、10D7-AF(去岩藻糖化)和6B5-AF(去岩藻糖化)。同时，将10D7和6B5重链/轻链可变区加上五点突变人IgG1Fc/κ恒定区(SEQ ID NOs:44(EU编号：L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L)和45)克隆到pCDNA3.1中，构建表达载体，之后转染到CHO-K1细胞中进行瞬时表达，对应的抗体命名为10D7-Mut和6B5-Mut。Fc区的点突变和去岩藻糖化用于提高ADCC效应。抗体表达和纯化参照实施例1的步骤。
使用表达人B7-H3的HUVEC细胞(Cat#:C-12200，PromoCell，德国)和NCI-H520细胞，通过FACS检测B7-H3抗体的结合力。HUVEC细胞培养在EGM TM-2内皮细胞生长培养基-2BulletKit TM(Cat#:CC-3162，Lonza)中，按照说明进行传代培养。NCI-H520细胞的培养、以及流式检测的具体方法参见实施例3。
如图4所示，Fc的改变，不管是去岩藻糖化还是点突变，都不影响B7-H3抗体与B7-H3阳性细胞的结合，10D7-AF、10D7-WT和10D7-Mut对HUVEC(B)以及NCI-H520(D)有着完全相同的结合力，6B5-AF、6B5-WT和6B5-Mut对HUVEC(A)以及NCI-H520(C)也有着完全相同的结合力。
实施例5.全人源B7-H3抗体的ADCC活性以及对免疫细胞的激活
进一步检测本申请B7-H3抗体对B7-H3阳性肿瘤细胞NCI-H520、B7-H3阳性人脐静脉内皮细胞HUVEC和成熟树突状细胞(DC)诱导抗体依赖细胞毒性(ADCC)的能力、以及对NK细胞和PBMC的免疫激活作用，其中树突状细胞由分离的PBMC诱导分化成熟得来，具体见实施例3。
简单而言，NCI-H520细胞、HUVEC细胞和DC细胞用完全RPMI培养基重悬，调整细胞密度为1.0×10 6/ml。细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Cat#:C34554I，Invitrogen)进行标记，具体地，使用2.5μM的CFSE，细胞37℃孵育10分钟。标记后，将细胞重悬于RPMI完全培养基(RPMI+10％FBS)中。NCI-H520细胞、HUVEC细胞、 DC细胞、和效应细胞NK92MI-CD16a(Huabo Bio)均以1200rpm离心5分钟。这些细胞随后混悬在ADCC检测培养基中(MEM培养基，Cat#:12561-056，Gibco；1％FBS，Cat#:FND500，EX-cell；1％BSA，Cat#:V900933-1KG，VETEC)，根据细胞计数看，细胞活力为约90％。调整靶细胞(NCI-H520细胞、HUVEC细胞或者DC细胞)的细胞密度为4×10 5/ml，NK92MI-CD16a的细胞密度调整为2×10 6/ml，两种细胞各加50μl到96孔板的各孔中(效靶比是5:1)。将待测抗体分别以不同浓度加入各孔，使得起始终浓度为50000ng/ml，其他终浓度呈5倍稀释，共10个浓度。96孔板37℃孵育4小时，板上细胞用PBS洗3遍，然后与LIVE/DEAD可固定死细胞染料于37℃孵育30分钟。板上细胞用PBS洗3遍，加入2μl PE鼠抗人CD69抗体(Cat#:555531，BD)，常温孵育30分钟后，离心，PBS洗3次。用FACS进行检测。计算出CFSE染色阳性细胞(NCI-H520细胞、HUVEC细胞或者DC细胞)的细胞死亡率，并统计CFSE染色阴性细胞(NK92MI-CD16a细胞)的平均PE染色荧光强度。依诺妥珠用作阳性对照。
对B7-H3抗体进一步分析其经人PBMC引发对NCI-H520细胞和HUVEC细胞的ADCC的能力，其中，NCI-H520细胞和HUVEC细胞通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Cat#:C34554I，Invitrogen)进行标记。人PBMC使用淋巴分离液通过密度梯度离心而获得，并在培养基(RIPM1640+10％FBS+300IU IL-2)中培养过夜。ADCC效应检测通过LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒(Thermo Fisher,USA,Cat#:L34964)进行。靶细胞和效应细胞PBMC 1200rpm离心5分钟。细胞用ADCC实验培养基(RIPM1640培养基+1％FBS)重悬，根据细胞计数，细胞活率为约90％。靶细胞密度调整成4×10 5/ml，PBMC细胞密度调整成4×10 6/ml。各取50μl(效靶比10：1)加入96孔板的各孔。在样品检测孔中加入检测抗体，使得各抗体的起始终浓度为50000ng/ml，其他终浓度呈5倍稀释，10个浓度。然后96孔板于37℃孵育24小时。取各孔中的上清，使用制造商的方法步骤，经ELISA(Cat#:SIF50，R&D)确定IFN-γ浓度。板上细胞用PBS洗3遍，然后与LIVE/DEAD可固定死细胞染料于37℃孵育30分钟。细胞用PBS洗3遍，用FACS进行检测。计算出CFSE染色阳性细胞(NCI-H520细胞或者HUVEC细胞)的细胞死亡率。依诺妥珠用作阳性对照。实验结果显示于图5-8。
如图5所示，10D7-AF和10D7-Mut引发NK92对NCI-H520肿瘤细胞的ADCC活性显著强于10D7-WT，且强于阳性对照抗体依诺妥珠(A)；且10D7-AF表现出比10D7-Mut更强的NK细胞激活能力，NK细胞表面的活化标志物CD69的诱导水平更高(C)。同样地，6B5-AF和6B5-Mut的ADCC引导效果显著强于6B5-WT，且强于阳性对照抗体依诺妥珠(B)；而且，6B5-AF体现出比6B5-Mut更强的NK细胞激活能力，CD69诱导水平更高(D)。此外，阳性对照抗体依诺妥珠在高剂量下介导的NK92对NCI-H520的杀伤表现出很强的倒钩效应，即在抗体浓度达到一定高度后，继续增加抗体浓度时检测到的杀伤效果反而减弱，而这种效应在10D7和6B5中均没有出现。
如图6所示，10D7-AF和10D7-Mut引发PBMC对NCI-H520肿瘤细胞的杀伤的能力显著强于10D7-WT，且强于阳性对照抗体依诺妥珠(A)。这种趋势也体现在6B5 的ADCC诱导效果上，即6B5-AF和6B5-Mut引发针对NCI-H520肿瘤细胞的ADCC效果显著强于6B5-WT，且强于阳性对照抗体依诺妥珠(B)。同样地，阳性对照抗体在高剂量下介导的PBMC对NCI-H520的杀伤表现出很强的倒钩效应，而这种效应在10D7和6B5中均没有体现。
图7示出，6B5-AF和10D7-AF引发NK92对HUVEC细胞的杀伤的能力，在一定程度上比阳性对照抗体依诺妥珠强(A)，而在PBMC为效应细胞的反应体系中，6B5-AF、10D7-AF和依诺妥珠都没有引发显著的HUVEC细胞杀伤效果(B)，也没有引起明显的IFN-γ释放(C)。
图8示出，6B5-AF和10D7-AF引发NK92对DC细胞的杀伤的能力，与阳性对照抗体依诺妥珠相当、或比阳性对照低。
实施例6.全人源B7-H3抗体的内吞效应检测
为了验证本申请的B7-H3抗体是否能够被内吞入细胞内，用A549细胞和NCI-H520细胞作为内吞载体进行实验，依诺妥珠-IgG1-Mut和Omburtamab-IgG1作为阳性对照。Omburtamab是Y-mAbs Therapeutics研发的一种放射性碘标记的抗人B7-H3单克隆抗体，Omburtamab-IgG1具有SEQ ID NOs:41和42所示的重轻链可变区，重链恒定区为野生型IgG1，轻链恒定区为κ恒定区序列，分别具有SEQ ID NO:43和45所示的氨基酸序列。
将待测抗人B7-H3抗体与pHAb标记的山羊抗人IgG1Fc(Cat#:SSA015，北京义翘神州科技股份有限公司，经pHAb标记)按浓度比为1:1混匀，后与10000个A549细胞混匀，B7-H3抗体与二抗的终浓度为25μg/mL，人IgG1蛋白作为空白对照。混合物放于冰上避光孵育1小时，以预冷的FACS缓冲液(90％DMEM+10％FBS)离心洗涤3次，去上清后加入预热的完全培养基，放入37℃5％CO 2细胞培养箱共孵育。分别在0、3、6、9小时取出细胞培养物，放置于冰上避光保存。待样品全部收集后，1200rmp低温离心3分钟去除上清，加入PBS缓冲液洗脱1次。读取细胞表面的荧光信号。使用流式细胞仪收集与不同抗体共同孵育后的细胞的各项流式原始数据，基于原始数据，分析并导出不同抗体与细胞表面B7-H3结合后内吞进细胞中发出荧光的MFI，绘制基于内吞B7-H3抗体量的内吞MFI曲线。
与上述方法相同，使用NCI-H520细胞检测抗人B7-H3抗体的内吞情况。
结果如图9所示，在整个检测周期中，仅细胞、细胞加二抗、以及细胞加二抗和人IgG1蛋白孵育后均不发生内吞，而与6B5、10D7、10F5、10F7、依诺妥珠以及Omburtamab-IgG1抗体共孵育的情况下，MFI随时间增加呈上升趋势，其中10D7、10F7、Omburtamab-IgG1的MFI上升明显。数据表明，6B5、10D7、10F5、10F7、依诺妥珠和Omburtamab-IgG1均可被NCI-H520和A549细胞内吞，其中10D7、10F7和Omburtamab-IgG1被内吞的速率较快。
实施例7.全人源B7-H3抗体的结合表位分析
为确定各抗人B7-H3抗体之间的结合表位关系，利用表面等离子共振技术(SPR)进行串联法检测，研究每种抗人B7-H3抗体对其他抗体的结合抑制作用。共检测4种抗人B7-H3抗体：6B5(“Ab6B5”)、10D7(“Ab10D7”)、10F5(“Ab10F5”)和依诺妥珠(简称“AbEno”)。
HBS-EP +缓冲液(10mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、150mM NaCl、3mM乙二胺四乙酸(EDTA)和0.05％P20，pH 7.4)用作运行缓冲液。抗His抗体通过氨基偶联固定在S系列传感器芯片CM5的表面，产生抗His芯片。然后，注入1M乙醇胺(pH 8.5)，以封闭芯片表面上剩余的活性羧基，然后使用HBS-EP +缓冲液平衡2小时。将带有His标签的重组人B7-H3(4Ig)蛋白(Cat#:B7B-H52E7，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)以30μL/min的速度注射到Biacore 8K生物传感器中，持续50秒，并捕获在抗His芯片上以达到约50RU的蛋白密度。
将一对抗体(浓度均为800nM)以30μL/min的速度先后连续注射到芯片中。第一次注射的抗体(分析物1)的结合时间为300秒，然后注射的第二抗体(分析物2)的结合时间为300秒。在每个分析循环中注射抗体后，芯片用甘氨酸缓冲液(pH 1.7，30μL/min，30秒)再生两次。对每对单克隆抗体进行相同的实验步骤，得到每种单克隆抗体对另一种抗体的结合抑制数据。使用Biacore Insight评估软件获得每种抗体的结合值。为了量化一种抗体对另一种抗体结合的干扰，计算结合率以比较每对抗体。使用统计软件进行聚类分析。
如图10所示，4种抗人B7-H3抗体分类为3个表位簇，其中6B5(Ab6B5)和10F5(Ab10F5)可能具有相同或重叠的表位，10D7(Ab10D7)具有单独的表位，6B5(Ab6B5)、10F5(Ab10F5)和10D7(Ab10D7)的表位与依诺妥珠(AbEno)重叠或不相同。
实施例8.抗人B7-H3抗体与B7同族蛋白的结合
通过SPR，用装备有预先固定的蛋白A传感器芯片的Biacore(Biacore，美国)T200生物传感器测量抗人B7-H3抗体与B7同族蛋白的结合情况。
具体地，在10μL/min流速条件下捕获1μg/mL的抗人B7-H3抗体，并分别将200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM和0nM的重组人蛋白CD80(人B7-1/CD80蛋白，带His标签，Cat#:B71-H5228，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)、CD86(人B7-2/CD86蛋白，带His标签，Cat#:CD6-H5223，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)、PDL2(人PD-L2/B7-DC蛋白，带His标签，Cat#:PD2-H5220，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)、PDL1(人PD-L1/B7-H1蛋白，带His标签，Cat#:PD1-H5229，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)、B7-H2(人B7-H2/ICOSLG蛋白，带His标签，Cat#:B72-H5221，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)、B7-H3(4Ig)(Cat#:B7B-H52E7，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)、B7-H4(人B7-H4蛋白，带His标签(MALS验证)，Cat#:BH7-HM174，恺佧生物科技(上海)有限公司)、B7-H5(人B7-H5/Gi24/VISTA蛋白，带His标签(MALS验证)，Cat#:B75-H52H0，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)、B7-H6(人B7-H6/NCR3LG1蛋白，带His标签，Cat#: B71-H5228，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)、以及B7-H7(人B7-H7/HHLA2蛋白，带His标签(MALS验证)，Cat#:B77-H52H5，北京百普赛斯生物科技股份有限公司)按照30μL/min注射180秒。监测解离600秒。通过Biacore 8k评估软件3.0对产生数据进行分析，获得结合响应值，绘制蛋白浓度-结合响应值相关曲线，确认抗人B7-H3抗体与B7同家族蛋白的交叉反应。
结果总结在表4中，与依诺妥珠类似，6B5、10D7和10F5抗体不与重组人CD80、CD86、PDL2、PDL1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6、B7-H7结合，而特异性地与重组人B7-H3结合。6B5与重组人蛋白结合的结果如图11所示。重组人蛋白200nM时各抗体的结合响应值，总结在下表4中。
表4.全人源B7-H3抗体与B7同族蛋白的结合
实施例9.全人源抗人B7-H3抗体的体内抗肿瘤效果
对抗体6B5、10D7、10F5和阳性对照抗体依诺妥珠的体内抗肿瘤活性进行研究。为了更好地体现出抗体可变区的生物学效应，所有抗体的Fc均选择为人IgG1，并进行5点突变(EU编号：L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L，SEQ ID NO:44)以增强ADCC效应。
在第一个实验中，B7-H3人源化小鼠(Cat#:110028，百奥赛图)在一侧腹部皮下注射2×10 5过表达人B7-H3的EL4细胞。待肿瘤长到90-120mm 3时，随机分成3组(n＝8只/组)，分别腹腔注射PBS(G1)、依诺妥珠(G2)和10F5-Mut(G3)，给药频率为每周2次，共给药6次，给药剂量为10mg/kg。分组当天设为第0天，且从这一天开始给药。
在另一个实验中，B7-H3人源化小鼠在肿瘤长到90-120mm 3时，随机分成4组(n＝8只/组)，分别腹腔注射PBS(G1)、依诺妥珠(G2)、6B5-Mut(G3)和15F11-Mut(G4)，给药频率和剂量同上。分组当天设为第0天，且从这一天开始给药。
试验周期内，对小鼠称重，且每周测量两次肿瘤体积，肿瘤体积计算为V＝(长×宽 2)/2。肿瘤生长抑制率TGI(％)＝[1-(Ti-T 0)/(Vi-V 0)]×100，其中Ti是治疗组在第i天的平均肿瘤体积，T 0是治疗组在第0天的平均肿瘤体积，Vi是对照组在第i天的平均肿瘤体积，V 0是对照组在第零天的平均肿瘤体积。
在整个试验周期内，各组动物均存活，且健康状态良好，与对照组相比，治疗组小鼠体重无明显变化(P>0.05)，分组时(第0天)各组平均体重为19.3-19.5g之间，实 验结束时(第一个实验为分组后第17天，第二个实验为分组后第20天)平均体重在19.8-20.9g之间，体重变化在103.2％-111.1％之间。结果显示，小鼠对于所检测的抗人B7-H3抗体具有很好的耐受，所有抗体对小鼠无毒。
图12示出各组小鼠的肿瘤体积变化。可以看出，与对照组相比，所有抗人B7-H3抗体均对肿瘤生长产生了不同程度的减缓或抑制作用，10F5-Mut(A)、6B5-Mut和15F11-Mut(B)的抗肿瘤效果均强于阳性对照依诺妥珠。
表5和表6列出了实验过程中的主要数据和分析结果，包括分组时和分组后7天/14天时的肿瘤体积，实验结束时的肿瘤体积、小鼠存活情况、肿瘤(体积)抑制率(TGI TV％)以及治疗组与对照组之间的统计学差异(P值)。数据显示，6B5-Mut、15F11-Mut和10F5-Mut均能显著地抑制肿瘤生长，10F5-Mut的抗肿瘤效果最好，15F11-Mut次之。
表5.全人源抗人B7-H3抗体10F5-Mut的体内抗肿瘤效果总结
表6.全人源抗人B7-H3抗体6B5-Mut和15F11-Mut的体内抗肿瘤效果总结
实施例10.全人源抗人B7-H3抗体与正常人体组织交叉染色
应用链霉菌抗生物素蛋白与生物素结合的免疫组织化学染色方法评价全人源抗人B7-H3抗体6B5-AF与35种正常人体冰冻组织(每种组织均来源于3个不同个体)的交叉反应，使用依诺妥珠作为对照抗体。人体组织见表7。
免疫组化染色方法：冰冻切片常温晾干，PBST浸洗5～10min；加入0.3％过氧化氢/无水甲醇溶液，常温反应10～15min，PBST浸洗3次；加入卵白素，常温反应10～15min，PBST浸洗3次；加入d-生物素溶液，常温反应10～15min，PBST浸洗3次；加入封闭用羊血清(工作液)，常温反应10～15min，然后弃去；加入一抗(依诺妥珠-生物素、6B5-AF-生物素、人IgG1/κ同种型对照-生物素)或PBST，常温反应10～15min，PBST浸洗3次；加入链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶常温孵育10～15min，PBST浸洗 3次；DAB显色，苏木素衬染，逐级酒精脱水然后至二甲苯；介质封片，自然风干后待镜检。
表7. 35种正常人体冰冻组织
肾上腺 主动脉 膀胱 血细胞 骨髓
乳腺 小脑 大脑 结肠 十二指肠
眼 食管 输卵管 胃 心脏
肾脏 肝脏 肺脏 淋巴结 卵巢
胰腺 甲状旁腺 垂体 胎盘 前列腺
皮肤 脊髓 脾脏 骨骼肌 睾丸
胸腺 甲状腺 输尿管 子宫颈 子宫内膜
通过显微镜观察染色结果，根据染色情况判定组织与抗体的结合水平，根据染色强度和表达细胞的百分比两个维度对染色结果进行评分(阳性细胞染色强度：0＝无细胞染色；1＝微弱或不明确染色；2＝弱阳性染色；3＝中度阳性染色；4＝强阳性染色；M＝组织缺失或者不适用。阳性细胞在同类细胞的占比：0＝无细胞染色；1＝阳性细胞占同类细胞的比例小于25％；2＝阳性细胞占同类细胞的比例为25％-50％；3＝阳性细胞占同类细胞的比例为50％-75％；4＝阳性细胞占同类细胞的比例大于75％；M＝组织缺失或者不适用)。针对所有一抗(依诺妥珠-生物素、6B5-AF-生物素、人IgG1/κ同种型对照-生物素)及PBST均没有任何阳性染色信号的组织不做统计，将有阳性染色信号的组织打分后信息汇总到表8中。
从表8的人体组织染色结果可见，全人源抗人B7-H3抗体6B5-AF与依诺妥珠的染色组织特异性分布一致，即在检测的35种正常人类组织中有24种正常人类组织染色结果是阴性，只有11种正常组织中存在较弱的结合力。同时，基于6B5-AF与依诺妥珠与抗原B7-H3的结合表位差异，在部分阳性染色组织中染色强弱情况略有不同。如表8所示，与依诺妥珠相比，6B5-AF在垂体中的染色略强，而在胸腺、子宫颈、子宫内膜中的染色略弱。
图13展示了组织染色的代表性染色结果。其中，1-1、2-1、3-1、4-1为依诺妥珠在脾脏、骨骼肌、肾上腺、膀胱中的染色情况；1-2、2-2、3-2、4-2为6B5-AF在脾脏、骨骼肌、肾上腺、膀胱中的染色情况。
表8.染色阳性的组织结果汇总
a：阳性细胞染色强度-阳性细胞在同类细胞的占比评分：阳性细胞染色强度：0＝无细胞染色；1＝微弱或不明确染色；2＝弱阳性染色；3＝中度阳性染色；4＝强阳性染色；M＝组织缺失或者不适用。阳性细胞在同类细胞的占比：0＝无细胞染色；1＝阳性细胞占同类细胞的比例小于25％；2＝阳性细胞占同类细胞的比例为25％-50％；3＝阳性细胞占同类细胞的比例为50％-75％；4＝阳性细胞占同类细胞的比例大于75％；M＝组织缺失或者不适用。
本申请中提及的序列总结在表9中。
表9.序列
***
尽管本发明已结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本发明不限于这些实施方式，且上述描述意在涵盖包括在所附权利要求的精神和范围内的所有其他可选择形式、修饰和等同物。本文引用的所有文献均通过引用的方式全部并入本文。

Claims (16)

  1. 一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其与B7-H3结合，包含
    i)重链可变区，该重链可变区含有VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区，其中，VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区分别包含与(1)SEQ ID NOs:1、2和3；(2)SEQ ID NOs:1、7和8；(3)SEQ ID NOs:12、13和14；(4)SEQ ID NOs:18、19和20；或(5)SEQ ID NOs:23、24和25具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性所示的氨基酸序列；和/或
    ii)轻链可变区，该轻链可变区含有VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区，其中，VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区分别包含与(1)SEQ ID NOs:4、5和6；(2)SEQ ID NOs:9、10和11；(3)SEQ ID NOs:15、16和17；(4)SEQ ID NOs:9、21和22；或(5)SEQ ID NOs:26、27和28具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性所示的氨基酸序列。
  2. 根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NOs:29、31、33、35或37具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性所示的氨基酸序列。
  3. 根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中，所述轻链可变区包含与SEQ ID NOs:30、32、34、36或38具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性所示的氨基酸序列。
  4. 根据权利要求2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含与(1)SEQ ID NOs:29和30；(2)SEQ ID NOs:31和32；(3)SEQ ID NOs:33和34；(4)SEQ ID NOs:35和36；或(5)SEQ ID NOs:37和38具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性所示的氨基酸序列。
  5. 一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其与B7-H3结合，包含
    i)重链可变区，该重链可变区含有VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区，其中，VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3区分别与选定的VH序列的VH CDR1区、VH CDR2区和VH CDR3具有同一性，和/或
    ii)轻链可变区，该轻链可变区含有VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区，其中，VL CDR1区、VL CDR2区和VL CDR3区分别与选定的VL序列的VL CDR1区、 VL CDR2区和VL CDR3区具有同一性；其中所述选定的VH序列和所述选定的VL序列为下面中的一种：
    (1)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs:29和30；
    (2)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs:31和32；
    (3)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs:33和34；
    (4)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs:35和36；
    (5)所述选定的VH序列和所述选定的VL序列分别为SEQ ID NOs:37和38。
  6. 根据权利要求1-5任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链恒定区和轻链恒定区，其中所述重链恒定区为人IgG1恒定区，所述轻链恒定区为人κ恒定区。
  7. 根据权利要求6所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
  8. 根据权利要求1-7任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为去岩藻糖化的单克隆抗体或其抗原结合部分。
  9. 根据权利要求1-8任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)与人B7-H3结合；(b)与猴B7-H3结合；(c)与小鼠B7-H3结合；(d)与B7-H3阳性细胞结合；(e)能够激活免疫细胞；(f)能够引发对于B7-H3阳性细胞的ADCC；和/或(g)具有体内抗肿瘤效果。
  10. 一种双特异性分子、免疫偶联物、嵌合抗原受体、基因改造T细胞受体、或溶瘤病毒，包含权利要求1-9中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。
  11. 一种核酸，编码权利要求1-9中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。
  12. 一种药物组合物，包含权利要求1-9中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。
  13. 权利要求1-9中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、或权利要求11所述的药物组合物在制备治疗B7-H3相关疾病的药物中的用途。
  14. 根据权利要求13所述的用途，其中B7-H3相关疾病为肿瘤。
  15. 根据权利要求14所述的用途，其中肿瘤选自乳腺癌、黑色素癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、非小细胞肺癌、中枢神经系统神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、弥漫性脑桥胶质瘤、髓母细胞瘤、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、卵巢癌、膀胱癌、小细胞癌、子宫内膜癌、肾癌、胃癌、急性髓性白血病、肝细胞癌、下咽鳞状细胞癌、尿路上皮细胞癌。
  16. 权利要求1-9中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、或权利要求11所述的药物组合物在制备一种用于增强免疫应答的药物中的用途。
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