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CN118909687A - 一种微生物油脂及其应用 - Google Patents

一种微生物油脂及其应用 Download PDF

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CN118909687A
CN118909687A CN202410937666.3A CN202410937666A CN118909687A CN 118909687 A CN118909687 A CN 118909687A CN 202410937666 A CN202410937666 A CN 202410937666A CN 118909687 A CN118909687 A CN 118909687A
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oil
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microbial
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孙志杰
黄琳
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Shantou University
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Shantou University
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Abstract

本发明涉及一种微生物油脂及其应用。所述微生物油脂由重组裂殖壶菌株提取、分离获得，所述重组裂殖壶菌株经过DGAT2.3基因敲除以及DGATam基因插入，所述DGATam基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，所述DGAT2.3基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。所述微生物油脂含有的甘油三酯中omega‑3型多不饱和脂肪酸占总脂肪酸质量的40～70％，经实验证明能够在预防和治疗有机溶剂导致的白细胞减少症中起到良好的效果，起到与深海鱼油相同甚至更佳的功效。

Description

一种微生物油脂及其应用
技术领域
本发明涉及有机有效成分的组合物技术领域，特别涉及一种微生物油脂及其应用。
背景技术
Omega-3是一种多不饱和脂肪酸，它对人类健康具有许多益处。Omega-3脂肪酸主要包括三种类型：α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。
ALA是一种植物来源的Omega-3脂肪酸，主要存在于亚麻籽油、奇亚籽、核桃等食物中。
EPA主要来源于海洋生物，如深海鱼油和某些鱼类。它对人体具有抗炎、降低血脂、预防心血管疾病等多种健康益处。
DHA也是海洋生物来源的Omega-3脂肪酸，特别在大脑和眼睛中含量丰富。它对大脑发育、视力保护和认知功能等方面有着重要作用。
Omega-3脂肪酸对人体健康的影响广泛，包括降低心血管疾病风险、减轻炎症、改善认知功能、保护视力等。因此，保持足够的Omega-3摄入量对于维护健康非常重要。由于人体不能自行合成足够的Omega-3脂肪酸，因此需要通过饮食或补充剂来获取。但EPA和DHA主要源于海洋生物，内陆地区较难获取，因而导致其价格高昂。人体可以将较易获取的ALA转化为EPA和DHA，但这种转化效率不高。
发明内容
本发明目的在于公开了一种微生物油脂及其应用，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
本发明第一方面在于提供一种微生物油脂。
本发明第二方面在于提供一种制备本发明第一方面所述微生物油脂的方法。
本发明第三方面在于提供本发明第一方面所述微生物油脂在制备预防、治疗血液白细胞减少症药物中的应用。
本发明第一方面所述微生物油脂由重组裂殖壶菌株提取、分离获得，所述重组裂殖壶菌株经过DGAT2.3基因敲除以及DGATam基因插入，所述DGATam基因的核苷酸序列如SEQID No:1所示，所述DGAT2.3基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。所述重组裂殖壶菌株经过敲除处理，使得对DHA-CoA低亲和度的DGAT2.3酶低表达，并通过插入DGATam基因获得了对DHA-CoA高亲和度的DGATam酶，从而构建出高产DHA的重组裂殖壶菌株。进一步利用所得的重组裂殖壶菌株发酵、提取，即可获得富含DHA的微生物油脂。
在本发明第一方面的一些应用实施方式中，分离所得的微生物油脂包括甘油三酯和磷脂。
在本发明第一方面的一些应用实施方式中，所述甘油三酯中omega-3型多不饱和脂肪酸占总脂肪酸质量的40～70％。
在本发明第一方面的一些应用实施方式中，所述甘油三酯的omega-3型多不饱和脂肪酸位于sn-3位置的占比为30～40％，显著高于原始藻株藻油和鱼油的sn-3位置omega-3型多不饱和脂肪酸占比。
本发明第二方面所述制备方法包括以下步骤：
1)将所述重组裂殖壶菌株接种入发酵培养基培养72小时；
2)离心处理发酵液获取湿菌体；
3)对湿菌体依次进行氯仿、甲醇、水提取油脂；
4)将所得油脂通过薄层色谱法分离，保留甘油三酯，即得所述微生物油脂。
本发明第三方面所述应用是指所述微生物油脂能够预防、治疗血液白细胞减少症，可用于制备预防、治疗血液白细胞减少症的药物。所述血液白细胞减少症是由有机溶剂导致的血液白细胞减少，所述有机溶剂包括甲醛、苯以及苯系化合物的任意比例混合物。
在本发明第三方面的一些应用实施方式中，所述微生物油脂的有效剂量为3～200毫克/千克体重每天，优选剂量范围为20～150毫克/千克体重每天，最优为100毫克/千克体重每天。
在本发明第三方面的一些应用实施方式中，所述药物的剂型为膏剂、凝胶、滴剂、栓剂或胶囊剂中的一种。
与现有的检测技术相比，本发明具有以下优势：
1、经实验证明高DHA含量的油脂能够在预防和治疗有机溶剂导致的白细胞减少症中起到良好的效果。
2、由所述重组裂殖壶菌株获得的微生物油脂能够起到与深海鱼油相同甚至更佳的功效。
附图说明
图1是微生物油脂对苯中毒小鼠存活影响的柱状图；
图2是微生物油脂对苯中毒小鼠体重变化的折线图；
图3是微生物油脂投喂剂量对苯中毒小鼠存活影响的柱状图；
图4是微生物油脂投喂剂量对苯中毒小鼠体重变化的折线图；
图5是微生物油脂投喂剂量对苯中毒小鼠白细胞影响的柱状图；
图6是微生物油脂投喂剂量对苯中毒小鼠红细胞影响的柱状图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：重组裂殖壶藻油的制备
1)将裂殖壶菌中如SEQ ID No:2所示的DGAT2.3基因敲除，构建裂殖壶菌DGAT敲除子；
2)将含有如SEQ ID No:1所示的DGATam基因的过表达载体电转染至所述敲除子中，构建DGATam基因异源超表达的重组裂殖壶菌株；
3)将所述重组裂殖壶菌株接种入发酵培养基培养72小时，离心发酵液获取湿菌体，氯仿-甲醇-水提取油脂，TLC分离甘油三酯，即得所述重组裂殖壶藻油。
实施例2：重组裂殖壶藻油与现有DHA的分析对比
通过气质联用技术(GC-MS)分析深海鱼油、野生型裂殖壶藻藻油和实施例1所得重组裂殖壶藻油的差异。结果如表1所示。
表1、n-3PUFA在甘油三酯上的位置分布(％of total n-3PUFA)
可见，所述重组裂殖壶藻油sn-3位置omega-3型多不饱和脂肪酸占比远高于深海鱼油或野生型裂殖壶藻藻油。人类甘油三酯酶对于TAG具有位置异构选择性，其主要水解TAG sn-1和sn-3的酯键，将大量饱和脂肪酸转化为脂酰辅酶A进行磷脂的合成并利用，因此提高油脂TAG sn-3位的DHA含量有助于提高其营养价值作用。
实施例3：微生物油脂和鱼油在预防和治疗有机溶剂导致的白细胞减少症中的效果比较
1.1主要试剂及材料
受试动物：SPF级KM雄性小鼠，28～41日龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2021-0011。
受试油脂：重组裂殖壶菌株提取油(以下简称“藻油”)和鱼油；经氯仿-甲醇法提取、甲酯化衍生、气相色谱分析后，以上油脂脂肪酸组成和多不饱和脂肪酸如表2所示：
表2鱼油和藻油脂肪酸组成(％)
化学试剂、耗材以及仪器：苯、磷酸氢二钠七水合物，2mL离心管、10mL离心管、医用无菌1mL一次性注射器、EDTA-K2真空采血管、分析天平、血常规分析仪和量筒等。
1.2.实验方法
1.2.1.饲养和处理
8日龄的KM健康雄性小鼠(重20～25g)，共80只，实验开始前前暂养3天，使其自由采食以适应环境(饲料不含DHA)。小鼠平均分为四组，分别为：空白组(豆油)、苯处理组(豆油-苯)、藻油-苯组和鱼油-苯组。实验分为营养强化阶段(第1～14天)和苯处理阶段(15～28天)。具体处理过程如下：
(1)营养强化阶段(第1～14天)：每隔一日在相同时间点进行饲料及营养物的更新供应。空白组和苯处理组隔日定时定点饲喂100mL清水，藻油-苯组和鱼油-苯组按照100mgDHA/kgBW·d的剂量饲喂藻油和鱼油。
(2)苯处理实验阶段(第15～28天)：第十五日开始苯处理，除空白溶剂组外，其余组小鼠每两天一次腹腔内注射浓度为10％的苯溶液，注射剂量为150mg/kg·d，共注射7次。
2.2.血样获取
待小鼠完成饲养和处理流程后，于第28日进行血样的采集。将小鼠依次至于充有三氯甲烷的密闭容器中进行麻醉，观察到小鼠行动能力明显降低时取出，用镊子进行眼框取血。血样保存至EDTA抗凝采血管中，摇晃采血管以使血样与抗凝剂充分接触混匀，并于管身标签处做好标记。
2.3.血常规测定
血样采集完成后，立即送至汕头大学医学院第一附属医院进行血常规检测，以确定白细胞、红细胞等的水平，仪器型号为迈瑞全自动血液细胞分析仪BC-5000。
2.4.数据处理
采用单因素方差分析方法进行显著性分析，随后进行多重比较检验。P<0.05表示有显著性；数据用平均值±标准偏差表示。
3.实施效果
3.1.藻油及鱼油对苯中毒小鼠存活及生长的影响
由图1可见150mg/kg·d苯注射剂量即可造成50％的小鼠死亡，然而经过50mgDHA/kg·d鱼油营养强化处理后，小鼠的死亡率即下降一半，仅为25％。然而，经50mg DHA/kg·d藻油营养强化处理后，苯中毒小鼠的死亡率进一步降低至0。
由图2可见，营养强化阶段(1～14天)鱼油及藻油对小鼠生长并无显著促进作用，但二者在苯处理阶段的效果显著不同。鱼油-苯组的归一化体重显著低于藻油-苯组。藻油-苯组体重在整个苯处理阶段都大于鱼油-苯组和苯处理组。
3.2.鱼油及藻油的DHA对苯中毒小鼠外周血组成的影响
由表3可见，苯处理后，苯处理组小鼠外周血白细胞数量与空白组相比降低了几乎40％，而红细胞数量却显著上升了15％。鱼油-苯组虽然提高了白细胞数量，但是与苯处理组无显著差异，这说明，鱼油并没有成功治疗苯中毒导致的白细胞减少症。与此相反，藻油-苯组的营养强化处理显著提高了苯中毒小鼠的白细胞数量，由4.19×109个/L提高至6.25×109个/L。以上结果说明，藻油对苯造成的白细胞减少症具有显著的治疗效果，而鱼油却无治疗效果。
表3、鱼油及藻油DHA对苯中毒小鼠外周血白细胞和红细胞数量的影响
白细胞分类计数结果见表4，分析结果表明单独苯处理显著降低了白细胞中中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞的数量，鱼油营养强化并没有显著改变苯中毒小鼠白细胞的组成，但是与白细胞总数变化相同，藻油添加却显著改变了苯中毒小鼠白细胞的组成，以上结果再一次验证了藻油对白细胞减少症的治疗效果。
表4鱼油及藻油DHA对苯中毒小鼠外周血白细胞数的影响
实施例2：微生物油脂浓度对白细胞减少症预防效果的影响
2.1.动物及试剂耗材：与实施例1相同。
2.2.实施方法
2.2.1.DHA添加剂量设计
按照世界卫生组织的标准，推荐健康成人每日摄入的DHA剂量约为220mg。本实验假设成人每天摄入220mg DHA，用体表面积归一化法(BSA)将人体剂量折算成动物剂量，即根据人与小鼠间按体表面积折算的等效剂量比值0.0026，可计算出小鼠喂食DHA剂量为28.6mg/kg·d。因实验需要探究最低及最佳添加水平，故围绕由推荐每日DHA摄入量折算后的小鼠DHA摄入量进行调整，各组设定为：低剂量组10mg/kg·d，中剂量组50mg/kg·d，高剂量组100mg/kg·d。
2.2.2.动物的分组、饲养和注射
SPF雄性KM小鼠(体重18～22g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2021-0011。在适应饲料3天后，按体重将100只小鼠随机均分为5组，包括空白组、苯中毒组，10mg DHA/kg·d(低剂量组)、50mg DHA/kg·d(中剂量组)和100mg DHA/kg·d(高剂量组)。
DHA营养强化：第1～14日为DHA营养强化期，空白组和苯中毒组给予等体积的水，而各DHA剂量组经口给予DHA，每两天一次，共7次。每2天记录一次体重。
苯处理期：第15天起，除空白组外，其余组别继续营养强化的同时给予苯处理，苯中毒组、低剂量组、中剂量组和高剂量组的小鼠隔天腹腔注射一次苯溶液(剂量0.15g/kg·BW·day，以水为溶剂)。空白组隔天腹腔注射一次等量的无菌水。每2天记录一次体重，实验第28天摘眼球，收集抗凝血进行血细胞组成分析。具体方法同实施例1。
2.2.3.血常规测定
血样采集完成后，立即送至汕头大学医学院第一附属医院进行血常规检测，以确定白细胞、红细胞等的水平，仪器型号为迈瑞全自动血液细胞分析仪BC-5000。
2.2.4.数据处理
采用单因素方差分析方法进行显著性分析，随后进行多重比较检验。P<0.05表示有显著性；数据用平均值±标准偏差表示。
2.3.实施结果
图3表明低剂量组和中剂量组的DHA投喂剂量均可以显著降低苯中毒小鼠的死亡率，苯中毒小鼠的死亡率从50％(见图3)降低为0，然而高剂量组虽然也可以降低死亡率，但死亡率依然有12.5％。从死亡率可见低剂量组和中剂量组的效果优于高剂量组。藻油DHA投喂剂量对存活小鼠体重无显著影响(见图4)。
图5所示的白细胞数量变化结果表明，低剂量组和高剂量组并没有显著改善苯毒性导致的白细胞减少现象，但是中等剂量组表现出了良好的治疗效果。苯中毒红细胞数量变化也证实了中等剂量组的良好的治疗效果，其红细胞数量显著低于中毒组但与正常小鼠无显著差异(见图6)。经BSA反推可知所述藻油对人体的有效剂量为3～200毫克/千克体重每天，优选剂量范围为20～150毫克/千克体重每天，最优为100毫克/千克体重每天。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (10)

1.一种微生物油脂，其特征在于，由重组裂殖壶菌株提取、分离获得，所述重组裂殖壶菌株经过DGAT2.3基因敲除以及DGATam基因插入，所述DGATam基因的核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示，所述DGAT2.3基因的核苷酸序列如SEQ IDNo:2所示。
2.根据权利要求1所述微生物油脂，其特征在于，分离所得的微生物油脂包括甘油三酯和磷脂。
3.根据权利要求2所述微生物油脂，其特征在于，所述甘油三酯中omega-3型多不饱和脂肪酸占总脂肪酸质量的40～70％。
4.根据权利要求3所述微生物油脂，其特征在于，所述甘油三酯的omega-3型多不饱和脂肪酸位于sn-3位置的占比为30～40％。
5.权利要求1至4任一项所述微生物油脂的制备方法，其特征在于，包括步骤：
1)将所述重组裂殖壶菌株接种入发酵培养基培养72小时；
2)离心处理发酵液获取湿菌体；
3)对湿菌体依次进行氯仿、甲醇、水提取油脂；
4)将所得油脂通过薄层色谱法分离，保留甘油三酯，即得所述微生物油脂。
6.权利要求1至4任一项所述微生物油脂在制备预防、治疗血液白细胞减少症药物中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述白细胞减少症由有机溶剂导致，所述有机溶剂包括甲醛或苯系化合物。
8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述药物中含有所述微生物油脂的有效剂量为3～200mg/kg·d；优选地，所述微生物油脂的有效剂量为20～150mg/kg·d；优选地，所述药物中含有所述微生物油脂的有效剂量为100mg/kg·d。
9.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述药物还含有生理可接受的载体或辅料。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述药物的剂型为膏剂、凝胶、滴剂、栓剂或胶囊剂中的一种。
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