CN118909118A

CN118909118A - 程序性细胞死亡蛋白1抗体

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Publication number: CN118909118A
Application number: CN202411092492.1A
Authority: CN
Inventors: S·卡赫里夫; M·马克里提齐安
Original assignee: Augusta University Research Institute Inc
Current assignee: Augusta University Research Institute Inc
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2024-11-08
Also published as: IL272911A; CO2020003165A2; RU2020112511A; US20220135681A1; US20210032341A1; JP7795860B2; BR112020004458A2; JP2020532991A; US11021540B2; WO2019051164A1; US11780921B2; US20250154256A1; EP3679070A1; KR20200045520A; AU2018330180B2; CL2020000576A1; AU2018330180A1; US12209127B2; CA3074647A1; CN111133005A

Abstract

本发明提供了与PD‑1、优选人或小鼠PD‑1免疫特异性结合并诱导或促进激活免疫细胞增殖或活性的免疫应答的抗体及其抗原结合片段。与现有的PD‑1专门促进抑制性免疫应答的范例相反，所述所公开的抗体及其抗原结合片段与PD‑1免疫特异性结合，并且引起激活所述免疫细胞而不是抑制所述免疫细胞的激活信号被递送至所述免疫细胞。在一个实施方案中，所述所公开的抗体及其抗原结合片段与免疫细胞上表达的PD‑1特异性结合。所述所公开的抗体及其抗原结合片段与免疫细胞上的PD‑1的结合导致激活信号(例如增强或促进细胞因子产生和/或免疫细胞增殖激活的信号)被传递到所述免疫细胞中。表达PD‑1的免疫细胞包括但不限于B细胞和T细胞以及髓源性细胞。在一个实施方案中，所述免疫细胞是T细胞，优选CD8+T细胞。

Description

程序性细胞死亡蛋白1抗体

相关申请的交叉引用

本申请是申请号为201880058085.5、申请日为2018年9月7日、发明名称为“程序性细胞死亡蛋白1抗体”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2018/049854的国家阶段申请，该国际申请要求2017年9月7日提交的美国临时专利申请62/555,156、2018年2月1日提交的美国临时专利申请62/624,843和2018年4月13日提交的美国临时专利申请62/657,323的权益和优先权，其内容在此以引用方式全文并入本文。

技术领域

本发明整体涉及免疫调节和与PD-1特异性结合的抗体及其使用方法。

背景技术

程序性细胞死亡受体蛋白(PD-1)/程序性细胞死亡受体蛋白配体1(PD-L1)途径作为癌症免疫疗法靶点已显示出有希望的临床成功。目前靶向PD-1或PD-L1的抗体可阻断这种相互作用并增强针对癌细胞的免疫应答。PD-1单克隆抗体和其他免疫检查点抑制剂的成功临床试验为癌症免疫学开辟了新途径。然而，大部分癌症患者对新的免疫疗法没有反应导致对联合疗法和预测性生物标志物的研究日趋深入(Iwai,Y.等人，Journal ofBiomedical Science，第24卷，第26页(2017))。

因此，本发明的目的是提供用于调节PD-1信号传导的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供与PD-1特异性结合并调节PD-1信号传导的抗体及其抗原结合片段。

本发明的另一个目的是提供用于治疗癌症的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供用于治疗感染的组合物和方法。

发明内容

提供了与PD-1、优选人或小鼠PD-1免疫特异性结合并诱导或促进激活免疫细胞增殖或活性的免疫应答的抗体及其抗原结合片段。在一个实施方案中，所公开的抗体及其抗原结合片段与免疫细胞上表达的PD-1特异性结合。所公开的抗体及其抗原结合片段与免疫细胞上的PD-1的结合导致激活信号(例如增强或促进细胞因子产生和/或免疫细胞增殖激活的信号)被传递到免疫细胞中。表达PD-1的免疫细胞包括但不限于B细胞和T细胞以及髓源性细胞(Riley,J.，Immunol Rev.，第229卷第1期，第114–125页(2009))。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞，优选CD8+T细胞。

另一个实施方案提供了在有此需要的受试者中刺激、促进或增强适应性免疫应答的方法，该方法通过向该受试者施用有效量的所公开的抗PD-1抗体或其抗原结合片段以在受试者中诱导、增强或促进适应性免疫应答。

一个实施方案提供了具有重链互补决定区(CDR)和轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，该重链CDR具有根据SEQ ID NO:6、7和8的氨基酸序列，该轻链CDR具有根据SEQ IDNO:12、13和14的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合PD-1。

一个实施方案提供了具有重链的抗体或其抗原结合片段，该重链与SEQ ID NO:4或5具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了具有轻链的抗体或其抗原结合片段，该轻链与SEQ ID NO:10或11具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了具有重链和轻链的抗体或其任何抗原结合片段，该重链与SEQ ID NO:4或5具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性，该轻链与SEQ ID NO:10或11具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了经工程改造以表达所公开的抗体或其抗原结合片段中的任一种的转基因动物。在一个实施方案中，该动物是小鼠。

一个实施方案提供了编码重链的核酸，该重链与SEQ ID NO:4或5具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了编码轻链的核酸，该轻链与SEQ ID NO:10或11具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了具有重链CDR和轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，该重链CDR具有根据SEQ ID NO:18、19和20的氨基酸序列，该轻链CDR具有根据SEQ ID NO:24、13和25的氨基酸序列。

一个实施方案提供了具有重链的抗体或其抗原结合片段，该重链与SEQ ID NO:16或17具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了具有轻链的抗体或其抗原结合片段，该轻链与SEQ ID NO:22或23具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了具有重链和轻链的抗体或其抗原结合片段，该重链具有与SEQ ID NO:16或17具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性，该轻链与SEQ ID NO:22或23具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了编码重链的核酸，该重链与SEQ ID NO:16或17具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了编码轻链的核酸，该轻链与SEQ ID NO:22或23具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了具有重链CDR和轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，该重链CDR具有根据SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列，该轻链CDR具有根据SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列。

一个实施方案提供了具有重链的抗体或其抗原结合片段，该重链与SEQ ID NO:27或28具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了具有轻链的抗体或其抗原结合片段，该轻链与SEQ ID NO:33或34具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了具有重链和轻链的抗体或其抗原结合片段，该重链具有与SEQ ID NO:27或28具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性，该轻链与SEQ ID NO:33或34具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了编码重链的核酸，该重链与SEQ ID NO:27或28具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了编码轻链的核酸，该轻链与SEQ ID NO:33或34具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

一个实施方案提供了包含三个轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，该三个轻链CDR具有选自由下列组成的组：SEQ ID NO:12、13、14、24、25、35、36或37的氨基酸序列。

另一个实施方案提供了包含三个重链CDR的抗体或其抗原结合片段，该三个重链CDR具有选自由下列组成的组：SEQ ID NO:6、7、8、18、19、20、29、30或31的氨基酸序列。

另一个实施方案提供了包含三个轻链CDR和三个重链CDR的抗体或其抗原结合片段，该三个轻链CDR具有选自由下列组成的组：SEQ ID NO:12、13、14、24、25、35、36或37的氨基酸序列，该三个重链CDR具有选自由下列组成的组：SEQ ID NO:6、7、8、18、19、20、29、30或31的氨基酸序列。

一个实施方案提供了免疫特异性结合SEQ ID NO:38的抗体或其表位结合片段或融合蛋白。在一个实施方案中，该抗体与PD-1上的SEQ ID NO:38结合。在一个实施方案中，该抗体与免疫细胞表面上表达的PD-1结合，并通过PD-1诱导或促进激活或刺激免疫细胞的信号。在一个实施方案中，被激活或刺激的免疫细胞是T细胞，例如CD8⁺T细胞。

在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段是人、小鼠、嵌合、人源化、单克隆、双特异性、三特异性或多特异性的。

一个实施方案提供了包括所公开的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种的药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物包括第二治疗剂和/或药学上可接受的赋形剂。示例性第二治疗剂包括环磷酰胺。

一个实施方案提供了在有此需要的受试者中诱导、促进或增强免疫应答的方法，该方法通过向受试者施用有效量的所公开的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种以在受试者中诱导、促进或增强免疫应答。

一个实施方案提供了用于治疗有此需要的受试者的癌症的方法，该方法通过向受试者施用有效量的所公开的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种来治疗受试者的癌症。

一个实施方案提供了用于减轻有此需要的受试者的肿瘤负担的方法，该方法通过向受试者施用有效量的所公开的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种来减少受试者的肿瘤负担。

一个实施方案提供了用于治疗有此需要的受试者的感染的方法，该方法通过向受试者施用有效量的所公开的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种来治疗受试者的感染。

附图说明

图1是示出单克隆抗体4G9和人PD-1之间的相互作用动力学随时间变化的曲线图。该曲线图示出了人PD-1在0nM、125nM、250nM、500nM、500nM和1000nM的浓度下的迹线。

图2是示出单克隆抗体4G9和小鼠PD-1之间的相互作用动力学随时间变化的曲线图。该曲线图示出了小鼠PD-1在0nM、62.5nM、125nM、500nM、500nM和1000nM的浓度下的迹线。

图3是示出单克隆抗体4C12和人PD-1之间的相互作用动力学随时间变化的曲线图。该曲线图示出了人PD-1在0nM、125nM、250nM、500nM、500nM和1000nM的浓度下的迹线。

图4是示出单克隆抗体5C2和人PD-1之间的相互作用动力学随时间变化的曲线图。该曲线图示出了小鼠PD-1在0nM和1000nM的浓度下的迹线。

图5是示出单克隆抗体5C2和小鼠PD-1之间的相互作用动力学随时间变化的曲线图。该曲线图示出了人PD-1在0nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM、500nM和1000nM的浓度下的迹线。

图6A是用同种型对照抗体或市售抗PD-1抗体J43染色的EL4细胞的流式细胞术直方图。图6B是仅用第二抗体或用抗体4G9、5C2和4C12染色的EL4细胞的流式细胞术直方图。图6C是仅用第二抗体或用抗体4G9染色的EL4细胞的流式细胞术直方图。图6D是仅用第二抗体或用抗体5C2染色的EL4细胞的流式细胞术直方图。图6E是仅用第二抗体或用抗体4C12染色的EL4细胞的流式细胞术直方图。图6F是示出各种纯化的小鼠PD-1抗体与EL4细胞结合的条形图。

图7A和图7B是示出来自用各种抗体处理的CD4 T细胞的上清液中IFNγ(图7A)或IL-2的浓度的条形图。X轴为治疗组，并且Y轴为浓度(ng/ml)。图7C是示出来自用4G9或5C2抗体处理的人CD4 T细胞的上清液中IFNγ的浓度的条形图。X轴代表治疗组，并且Y轴代表浓度(ng/mL)。

图8是示出在用各种抗体处理的小鼠CD4 T细胞中pAKT的细胞内染色水平的条形图。X轴代表治疗组，并且Y轴代表pAKT(S473)MFI。

图9是示出各种抗体中IgG重链和轻链的蛋白质印记。

图10是示出4G9和5C2抗体与人PD-1-Fc结合的条形图。X轴代表抗体浓度，并且Y轴代表OD450。

图11A和图11B是示出4G9和5C2抗体与来自PD-1KO小鼠(图11A)或PD-1WT小鼠(图11B)的CD4 T细胞中的PD-1结合的流式细胞术直方图。

图12是示出pS6在用4G9、5C2、市售Ab-1、市售Ab-2处理或未处理的CD4 T细胞中的表达的线形图。X轴代表总蛋白的浓度(μg/ml)，并且Y轴代表OD450。

图13A是示出用于TC-1肿瘤实验的实验设计的示意图。图13B是示出用E7 Vax、4G9、RMP 1-14、E7 Vax+RMP 1-14、E7 Vax+4G9处理或未处理的TC-1荷瘤小鼠的平均肿瘤体积(cm³)随时间(天)推移变化的线形图。X轴代表时间(天)，并且Y轴代表平均肿瘤体积(cm³)。图13C是示出用E7 Vax、4G9、RMP 1-14、E7 Vax+RMP 1-14、E7 Vax+4G9处理或未处理的TC-1荷瘤小鼠的存活百分比随时间推移变化的线形图。图13D是示出用E7 Vax、4C12、5C2、RMP 1-14、E7 Vax+RMP 1-14、E7 Vax+4C12、E7 Vax+5C2处理或未处理的TC-1荷瘤小鼠的平均肿瘤体积(cm³)随时间(天)推移变化的线形图。

图14A是用于TC-1肿瘤实验的实验设计的示意图。图14B是示出用E7Vax、4G9、RMP1-14、J43、E7 Vax+4G9、E7 Vax+RMP 1-14、E7 Vax+J43处理或未处理的TC-1荷瘤小鼠的平均肿瘤体积(cm³)随时间(天)推移变化的线形图。X轴代表时间(天)，并且Y轴代表平均肿瘤体积(cm³)。图14C是示出用E7 Vax、4G9、4C12、5C2、RMP 1-14、J43、E7 Vax+4G9、E7Vax+4C12、E7 Vax+5C2、E7 Vax+RMP 1-14、E7 Vax+J43处理或未处理的TC-1荷瘤小鼠的存活百分比随时间推移变化的线形图。X轴代表时间(天)，并且Y轴代表存活百分比。

具体实施方式

I.定义

如本文所用，如果一种分子与第二分子的结合表现出抗体对其同源抗原的特异性和亲和力，则认为这种分子能够“免疫特异性结合”第二分子。如果此类结合涉及免疫球蛋白分子的抗原识别位点，则认为抗体能够免疫特异性结合抗原的靶区域或构象(“表位”)。如果其他抗原具有由抗原识别位点识别的某些序列或构象相似性，如通过例如免疫测定、测定或本领域已知的其他测定所测定的，则免疫特异性结合特定抗原的抗体可以较低亲和力结合该其他抗原，但不结合完全无关的抗原。然而，优选地，抗体(及其抗原结合片段)将不与其他抗原交叉反应。抗体还可通过分子的不涉及抗原识别位点的其他区域/结构域中的结合结构域(诸如Fc区)以非免疫特异性的方式与其他分子(诸如FcR受体)结合。

如本文所用，如果此类结合表现出受体对其同源结合配体的特异性和亲和力，则认为这种分子“生理特异性结合”第二分子。一种分子可能能够与多于一种其他分子生理特异性结合。

如本文所用，术语“抗体”旨在表示具有“可变区”抗原识别位点的免疫球蛋白分子。术语“可变区”旨在将免疫球蛋白的这种结构域与抗体广泛共享的结构域(诸如抗体Fc结构域)区分开。可变区包括“高变区”，其残基负责抗原结合。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，通常为轻链可变结构域中的大约第24-34位残基(L1)、第50-56位残基(L2)和第89-97位残基(L3)以及为重链可变结构域中的大约第27-35位残基(H1)、第50-65位残基(H2)和第95-102位残基(H3)；Kabat等人，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域中的第26-32位残基(L1)、第50-52位残基(L2)和第91-96位残基(L3)以及重链可变结构域中的第26-32位残基(H1)、第53-55位残基(H2)和第96-101位残基(H3)；Chothia和Lesk，1987年，J.Mol.Biol.，第196卷，第901-917页)。“框架区”或“FR”残基是除本文所定义的高变区残基以外的那些可变结构域残基。术语抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体(参见例如，Muyldermans等人，2001年，TrendsBiochem.Sci.，第26卷，第230页；Nuttall等人，2000年，Cur.Pharm.Biotech.，第1卷，第253页；Reichmann和Muyldermans，1999年，J.Immunol.Meth.，第231卷，第25页；国际公布WO94/04678和WO 94/25591；美国专利6,005,079)、单链Fv(scFv)(参见，例如，参见Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994))、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，抗Id抗体和抗抗Id抗体的抗体)。具体地，此类抗体包括任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个部分，该一个或多个部分包含抗体的互补决定区(“CDR”)以及任选地包括抗体的“可变区”抗原识别位点的框架残基，并且表现出免疫特异性结合抗原的能力。此类片段包括Fab'、F(ab')2、Fv、单链(ScFv)及其突变体、天然存在的变体和包括抗体的“可变区”抗原识别位点的融合蛋白以及异源蛋白(例如，毒素、用于不同抗原的抗原识别位点、酶、受体或受体配体等)。

如本文所用，术语“片段”是指包括至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。

如本文所用，术语“结合分子”旨在指与特定靶标特异性相互作用并与之结合的分子。靶标可包含生物或小(化学)分子。靶分子可限定抗原或抗原部分。结合分子的示例包括但不限于抗体(包括单克隆抗体、双特异性抗体以及抗体片段)、融合蛋白和本领域技术人员已知的其他抗原结合分子。

如本文所用，术语“调节”涉及改变作用、结果或活动(例如，信号传导)的能力。此类调节可以是激动性的或拮抗性的。拮抗性调节可以是部分的(即，减弱但不消除)，或者可完全消除此类活性(例如，中和)。调节可包括抗体结合后受体的内化或靶细胞上受体表达的减少。激动性调节可增强或以其他方式增加或增强活性(例如，信号传导)。在又一个实施方案中，此类调节可改变配体与其同源受体之间相互作用的性质，从而改变所引发的信号传导的性质。例如，分子可通过与配体或受体结合而改变此类分子与其他配体或受体结合的能力，从而改变其总体活性。优选地，此类调节将提供可测量的免疫系统活性的至少10％的变化、更优选地此类活性的至少50％的变化、或此类活性的至少2倍、5倍、10倍或仍更优选地至少100倍的变化。

如在结合或表现出作用的情况下使用的术语“基本上”旨在表示所观察到的作用是生理上或治疗上相关的。因此，例如，如果阻断的程度是生理上或治疗上相关的(例如，如果该阻断程度相比于完全阻断大于60％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于97％)，则分子能够基本上阻断配体或受体的活性。类似地，如果一个分子与另一分子的免疫特异性和特征相似度大于60％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于97％，则认为此类免疫特异性和/或特征基本上相同)。

如本文所用，“共刺激”信号包括正共刺激信号(例如，导致活性增强的信号)和负共刺激信号(例如，导致活性抑制的信号)。

如本文所用，术语“衍生物”是指免疫特异性结合亲本或参考抗体的相同靶标但在氨基酸序列上与亲本或参考抗体或其抗原结合片段的差异在于相对于亲本或参考抗体或其抗原结合片段包括一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代、添加、缺失或修饰的抗体或其抗原结合片段。优选地，此类衍生物将具有与亲本或参考抗体或其抗原结合片段基本上相同的免疫特异性和/或特征、或相同的免疫特异性和特征。此类衍生物的氨基酸取代或添加可包括天然存在的(即，DNA编码的)或非天然存在的氨基酸残基。术语“衍生物”包括例如嵌合或人源化变体以及具有改变的CH1区、铰链区、CH2区、CH3区或CH4区的变体，从而形成例如具有表现出增强或受损的效应子或结合特征的Fc区变体的抗体等。

如本文所用，“嵌合抗体”是其中抗体的不同部分源自不同免疫球蛋白分子的分子，诸如具有源自非人抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指包括人框架区和来自非人(通常为小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”，而提供框架的人免疫球蛋白被称为“受体”。恒定区不必存在，但如果存在，则它们应与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即，至少约85％-99％、优选约95％或更高的同一性。因此，除可能的CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然人免疫球蛋白序列的对应部分基本上相同。人源化抗体是包括人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如，人源化抗体将不涵盖典型的嵌合抗体，因为例如嵌合抗体的整个可变区是非人的。

如本文所用，术语“内源浓度”是指分子被细胞(该细胞可以是正常细胞、癌细胞或感染细胞)天然表达(即，在没有表达载体或重组启动子的情况下)的水平。

如本文所用，术语“治疗(treat、treating、treatment)”和“治疗用途”指消除、减轻或改善由抗PD-1抗体或其抗原片段加剧的疾病或病症的一种或多种症状。

如本文所用，“治疗有效量”是指足以介导此类症状的临床相关消除、减轻或改善的治疗剂的量。如果作用的大小足以影响接收受试者的健康或预后，则该作用是临床上相关的。治疗有效量可指足以延迟或最小化疾病发作(例如，延迟或最小化癌症扩散)的治疗剂的量。治疗有效量也可指在疾病的治疗或管理中提供治疗益处的治疗剂的量。

如本文所用，术语“预防剂”是指可在检测出病症或疾病的任何症状之前用于预防此类病症或疾病的药剂。“预防有效”量是足以介导这种保护的预防剂的量。预防有效量还可指在疾病预防中提供预防益处的预防剂的量。

如本文所用，术语“癌症”是指由细胞异常失控生长导致的肿瘤。如本文所用，癌症明确包括白血病和淋巴瘤。术语“癌症”是指涉及可能转移到远侧位点并表现出与非癌细胞不同的表型性状(例如，在三维底物(诸如软琼脂)中形成菌落或在三维基底膜或细胞外基质制剂中形成管状网络或网状基质)的细胞的疾病。非癌细胞在软琼脂中不形成菌落，并且在三维基底膜或细胞外基质制剂中形成不同的球状结构。

如本文所用，“免疫细胞”是指来自造血起源的任何细胞，包括但不限于T细胞、B细胞、单核细胞、树突细胞和巨噬细胞。

如本文所用，“化合价”是指每个分子可用的结合位点的数目。

如本文所用，术语“免疫的”、“免疫学”或“免疫”应答是接收患者体内针对肽发生的有益体液(抗体介导的)和/或细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)应答。此类应答可以是由施用免疫原诱导的主动应答，也可以是由施用抗体或初免T细胞诱导的被动应答。与I类或II类MHC分子缔合的多肽表位的呈递激活抗原特异性CD4⁺T辅助细胞和/或CD8⁺细胞毒性T细胞，从而引发细胞免疫应答。这种应答还可涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、嗜酸性粒细胞的活化，嗜中性粒细胞或先天免疫的其他成分的活化或募集。细胞介导的免疫应答的存在可通过增殖测定(CD4⁺T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定。体液和细胞应答对免疫原的保护或治疗作用的相对贡献可通过从免疫同系动物中分离抗体和T细胞并在第二受试者中测量保护或治疗作用来区分。

如本文所用，“免疫原性试剂”或“免疫原”能够在向哺乳动物(任选地与佐剂结合)施用时诱导针对自身的免疫应答。

如本文所用，术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文可互换使用，并且是指哺乳动物，包括但不限于人、啮齿动物(诸如小鼠和大鼠)以及其他实验动物。

如本文所用，术语“多肽”是指任何长度的氨基酸链，而与是否修饰(例如，磷酸化或糖基化)无关。术语多肽包括蛋白质及其片段。多肽可以是“外源的”，意指它们是“异源的”，即对于所利用的宿主细胞是外来的，诸如由细菌细胞产生的人多肽。多肽在本文中作为氨基酸残基序列公开。这些序列以从氨基到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列由三字母或单字母代码命名，如下所示：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。

如本文所用，术语“变体”是指与参考多肽或多核苷酸不同但保留必要特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体在氨基酸序列上与另一参考多肽不同。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常相似并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽可通过一个或多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)而在氨基酸序列上不同。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是遗传密码编码的氨基酸残基。多肽的变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或者可以是未知天然存在的变体。

可对本公开的多肽结构进行修饰和改变，并且仍获得具有与该多肽相似特征的分子(例如，保守氨基酸取代)。例如，某些氨基酸可在不明显丧失活性的情况下取代序列中的其他氨基酸。因为多肽的相互作用能力和性质决定了多肽的生物功能活性，所以可在多肽序列中进行某些氨基酸序列取代，但仍获得具有类似特性的多肽。

在进行此类改变时，可考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在为多肽赋予相互作用的生物功能方面的重要性是本领域中普遍理解的。已知某些氨基酸可被具有类似亲水性指数或评分的其他氨基酸取代，并且仍然产生具有类似生物活性的多肽。根据其疏水性和电荷特性，已为每个氨基酸指定了亲水性指数。这些指数是：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。

据信，氨基酸的相对亲水性决定了所得多肽的二级结构，其继而限定了该多肽与其他分子诸如酶、底物、受体、抗体、抗原和辅因子的相互作用。本领域已知氨基酸可被具有相似亲水性指数的另一氨基酸取代并且仍得到功能上等效的多肽。在此类变化中，亲水性指数在±2内的氨基酸的取代是优选的，亲水性指数在±1内的那些是尤其优选的，并且亲水性指数在±0.5内的那些甚至更是尤其优选的。

类似氨基酸的取代也可在亲水性的基础上进行，特别是在由此产生的生物功能等效多肽或肽旨在用于免疫学实施方案的情况下。已为氨基酸残基分配以下亲水性值：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、脯氨酸(-0.5±1)、苏氨酸(-0.4)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。应当理解，一种氨基酸可取代具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然得到生物学上等效、特别是免疫学上等效的多肽。在此类变化中，亲水性值在±2内的氨基酸的取代是优选的，亲水性值在±1内的那些是尤其优选的，并且亲水性值在±0.5内的那些甚至更是尤其优选的。

如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员众所周知的，并且包括(原始残基：示例性取代)：(Ala：Gly，Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：Gln，His)、(Asp：Glu，Cys，Ser)、(Gln：Asn)、(Glu：Asp)、(Gly：Ala)、(His：Asn，Gln)、(Ile：Leu，Val)、(Leu：Ile，Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu，Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Tip：Tyr)、(Tyr：Trp，Phe)和(Val：Ile，Leu)。因此，本公开的实施方案设想了如上所述的多肽的功能或生物学等效物。具体地，多肽的实施方案可包括与感兴趣的多肽具有约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的变体。

术语“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并引入间隙(如果需要)以实现最大序列同一性百分比之后候选序列中的核苷酸或氨基酸与参考核酸序列中的核苷酸或氨基酸相同的百分比。出于确定序列同一性百分比目的的比对可以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。可通过已知方法确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

出于本文的目的，给定核苷酸或氨基酸序列C相对于、与或针对给定核酸序列D的序列同一性％(其可另选地被表述为给定序列C相对于、与或针对给定序列D具有或包括一定的序列同一性％)的计算如下：

100乘以分数W/Z，

其中W是由序列比对程序在该程序的C和D的比对中评分为相同匹配的核苷酸或氨基酸数目，并且其中Z是D中核苷酸或氨基酸的总数。应当理解，在序列C的长度不等于序列D的长度的情况下，C相对于D的序列同一性％将不等于D相对于C的序列同一性％。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”涵盖标准药物载体中的任一者，诸如磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳剂(诸如油/水或水/油乳剂)以及各种类型的润湿剂。

如本文所用，术语“抗原决定簇”和“表位”可互换使用，并且是指由抗体识别的结构。

如本文所用，“构象表位”是包括抗原的氨基酸序列的不连续部分的表位。抗体基于抗原的3维表面特征、形状或三级结构结合构象表位。

如本文所用，“线性表位”是由来自抗原的氨基酸的连续序列形成的表位。线性表位通常包括约5至约10个连续氨基酸残基。抗体基于抗原的一级序列结合线性表位。

如本文所用，“互补位”，也称为“抗原结合位点”，是抗体的识别并结合抗原的部分。

II.组成

提供了与PD-1免疫特异性结合的抗体及其抗原结合片段。与现有的PD-1专门促进抑制性免疫应答的范例(Riley，J.,Immunol Rev.，第229卷第1期，第114–125页，2009年)相反，所公开的抗体及其抗原结合片段与PD-1免疫特异性结合，并且引起激活免疫细胞而不是抑制免疫细胞的激活信号被递送至免疫细胞。

A.程序性死亡受体蛋白1(PD-1)

所公开的抗体及其抗原结合片段与PD-1免疫特异性结合。该抗体及其抗原结合片段可与具有例如下面提供的氨基酸序列的PD-1结合。

人PD-1和小鼠PD-1的氨基酸序列在本领域中是已知的，并且包括例如，

人PD-1

MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDN

ATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQL

PNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEV

PTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGA

RRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL(SEQ ID NO:1)，登录号：AJS10360，并且其全文明确以引用方式并入本文。

小鼠PD-1

MWVRQVPWSFTWAVLQLSWQSGWLLEVPNGPWRSLTFYPAWLTVSEGA

NATFTCSLSNWSEDLMLNWNRLSPSNQTEKQAAFCNGLSQPVQDARFQIIQ

LPNRHDFHMNILDTRRNDSGIYLCGAISLHPKAKIEESPGAELVVTERILETS

TRYPSPSPKPEGRFQGMVIGIMSALVGIPVLLLLAWALAVFCSTSMSEARGA

GSKDDTLKEEPSAAPVPSVAYEELDFQGREKTPELPTACVHTEYATIVFTEGLGASAMGRRGSADGLQGPRPPRHEDGHCSWPL(SEQ ID NO:2)UniProtKB-Q02242(PDCD1_MOUSE)，并且其全文明确以引用方式并入本文。

B.抗体组成

所公开的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包括任何类别的完整免疫球蛋白(即，完整抗体)、其片段以及至少包含抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白。在一些实施方案中，所公开的抗体包含抗体轻链以及抗体重链的至少可变结构域两者。在其他实施方案中，此类分子可还包括重链的CH1区、铰链区、CH2区、CH3区和CH4区中的一者或多者(尤其是CH1区和铰链区，或CH1区、铰链区和CH2区，或CH1区、铰链区、CH2区和CH3区)。该抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。在一些实施方案中，恒定结构域是补体固定恒定结构域，其中期望抗体表现出细胞毒性活性，并且类别通常是IgG₁。在其他实施方案中，在不需要此类细胞毒性活性的情况下，恒定结构域可以是IgG₂或IgG₄类。抗体可包括来自超过一种类别或同种型的序列，并且选择特定的恒定结构域以优化期望的效应子功能是在本领域普通技术人员的范围内。

抗体之间的可变结构域序列不同，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性通常不是均匀地分布在抗体的可变结构域中。它通常集中在轻链和重链可变结构域中称为互补决定区(CDR)或高变区的三个链段中。可变结构域中更高度保守的部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采取β-折叠构型并通过三个CDR连接的四个FR区，该三个CDR形成环，这些环连接并在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。

一些实施方案提供了具有生物活性的抗PD-1抗体的片段。这些片段，无论是否与其他序列连接，可包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他所选择的修饰，条件是与未修饰的抗体或抗体片段相比，该片段的活性没有显著改变或受损。

另一个实施方案提供了对PD-1具有特异性的单链抗体。产生单链抗体的方法是本领域技术人员众所周知的。通过使用短肽接头将重链和轻链的可变结构域融合在一起，从而在单个分子上重建抗原结合位点，可形成单链抗体。在不显著破坏抗原结合或结合特异性的情况下，已经开发出单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C端经由15至25个氨基酸肽或接头与另一可变结构域的N端相连。选择接头以允许重链和轻链以其适当的构象取向结合在一起。

另一个实施方案提供了可通过连接两个scFv而工程改造的二价单链可变片段(di-scFv)。这可通过产生具有两个VH区和两个VL区的单肽链，从而产生串联scFv来完成。ScFv还可被设计为具有接头肽，该接头肽对于两个可变区来说太短而不能折叠在一起(约五个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。这种类型被称为双抗体。双抗体已显示具有比对应的scFv低高达40倍的解离常数，这意味着它们对其靶标具有高得多的亲和力。还更短的接头(一个或两个氨基酸)导致三聚体(三抗体)的形成。也已产生了四抗体。它们对其靶标的亲和力甚至比双抗体更高。

另一个实施方案提供了诱导针对免疫细胞的激活信号的PD-1特异性单克隆抗体。单克隆抗体可从基本上同质的抗体群体获得，即除了可能存在于抗体分子的小子集中的可能的天然存在的突变之外，群体内的各个抗体是相同的。单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而该一条或多条链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出期望的拮抗活性即可。

1.嵌合和人源化抗体

另一个实施方案提供了包括所公开序列中的一者或多者的嵌合的抗PD-1抗体及其抗原结合片段，并且还提供了与PD-1结合并引起激活信号被传递至表达PD-1的免疫细胞的其功能变体。

用于产生嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。参见例如，Morrison，1985年，Science，第229卷，第1202页；Oi等人，1986年，BioTechniques，第4卷，第214页；Gillies等人，1989年，J.Immunol.Methods，第125卷，第191-202页；美国专利6,311,415、5,807,715、4,816,567和4,816,397。包括来自非人物种的一个或多个CDR和来自人免疫球蛋白分子的框架区的嵌合抗体可使用本领域已知的多种技术来生产，包括例如CDR-接枝(EP 239,400；国际公布WO 91/09967；以及美国专利5,225,539、5,530,101和5,585,089)、饰面或表面重建(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，1991年，Molecular Immunology，第28卷第4/5期，第489-498页；Studnicka等人，1994年，Protein Engineering，第7卷，第805页；以及Roguska等人，1994年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第91卷，第969页)和链改组(美国专利5,565,332)。

所公开的抗PD-1抗体或其抗原结合片段可以是人或人源化抗体或其抗原结合片段。许多非人抗体(例如，源自小鼠、大鼠或兔子的非人抗体)在人体中具有天然抗原性，因此当施用于人时会引起不良免疫应答。因此，在这些方法中使用人或人源化抗体有助于减少抗体施用于人时将引起不良免疫应答的机会。

可采用在不产生内源免疫球蛋白的情况下能够在免疫时产生完整的人类抗体库的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J(H))基因的纯合缺失会导致内源性抗体产生的完全抑制。人种系免疫球蛋白基因阵列在此类种系突变小鼠中的转移将导致在抗原攻击时产生人抗体。

任选地，抗体在其他物种中产生并“人源化”以在人体中施用。非人(例如，小鼠)抗体的人源化形式是含有最少的源自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体的互补决定区(CDR)的残基被非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔子)的具有期望特异性、亲和力和能力的CDR残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人残基取代。人源化抗体也可包含既不存在于受体抗体中也不存在于导入的CDR或框架序列中的残基。通常，人源化抗体将包含至少一个可变结构域的基本上全部，并且通常包含两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。最佳地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。

用于人源化非人抗体的方法在本领域中是众所周知的，参见例如，欧洲专利EP239,400、EP 592,106和EP 519,596；国际公布WO 91/09967和WO 93/17105；美国专利5,225,539、5,530,101、5,565,332、5,585,089、5,766,886和6,407,213；以及Padlan，1991年，Molecular Immunology，第28卷第4/5期，第489-498页；Studnicka等人，1994年，ProteinEngineering，第7卷第6期，第805-814页；Roguska等人，1994年，PNAS，第91卷，第969-973页；Tan等人，2002年，J.Immunol，第169卷，第1119-1125页；Caldas等人，2000年，ProteinEng.，第13卷，第353-360页；Morea等人，2000年，Methods，第20卷，第267-279页；Baca等人，1997年，J.Biol.Chem.，第272卷，第10678-10684页；Roguska等人，1996年，Protein Eng.，第9卷，第895-904页；Couto等人，1995年，Cancer Res.，第55卷增刊第23期，第5973s-5977s页；Couto等人，1995年，Cancer Res.，第55卷，第1717-1722页；Sandhu，1994年，Gene，第150卷，第409-410页；Pedersen等人，1994年，J.Mol.Biol.，第235卷，第959-973页；Jones等人，1986年，Nature，第321卷，第522-525页；Reichmann等人，1988年，Nature，第332卷，第323-329页；以及Presta，1992年，Curr.Op.Struct.Biol.，第2卷，第593-596页)。

一般来讲，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“导入”残基，其通常取自“导入”可变结构域。抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一条或多条多肽链的DNA序列。人源化基本上可通过用啮齿动物的CDR或CDR序列取代人抗体的对应序列来执行。因此，非人抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或片段，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的对应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的某些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代的人抗体。

为了降低抗原性，可选择用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链两者)可能非常重要。根据“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体可变结构域的序列。然后，将最接近啮齿动物序列的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)接受。另一种方法使用源自轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体。

进一步重要的是在保留对抗原高亲和力和其他有利生物学特性的情况下将抗体人源化。为了实现这一目标，可通过使用亲代和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念性人源化产品的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是普遍可获得的并且为本领域技术人员所熟悉。可用计算机程序来说明并显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些展示的检测使得能分析在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中残基的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可从共有序列和导入序列中选择并组合FR残基，从而获得期望的抗体特征，诸如对一种或多种靶抗原增加的亲和力。通常，CDR残基直接且主要基本上参与影响抗原结合。

人、人源化或嵌合抗体衍生物可包括至少一个并且通常两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的CDR区并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的CDR区。此类抗体还可包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。可根据抗体的预期功能(特别是可能需要的效应子功能)来选择此类抗体的恒定结构域。在一些实施方案中，此类抗体的恒定结构域是或可包括人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。在一个具体实施方案中，当人源化抗体衍生物旨在用于治疗用途并且需要抗体效应子功能诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性时，使用人IgG恒定结构域，尤其是IgG1和IgG3同种型的恒定结构域。在另选的实施方案中，当抗体旨在用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能时，使用IgG2和IgG4同种型。包括改变抗体效应子功能的一个或多个氨基酸修饰的Fc恒定结构域诸如在美国专利申请公布2005/0037000和2005/0064514中公开的那些。

人源化抗体的框架区和CDR区不需要精确地对应于亲本序列，例如，供体CDR或共有框架可通过至少一个残基的取代、插入或缺失而被诱变，使得CDR或框架残基在该位点既不与共有抗体也不与供体抗体对应。在一些实施方案中，此类突变是不广泛的。通常，至少75％、更通常90％或大于95％的人源化抗体残基将对应于亲本框架区(FR)和CDR序列的残基。人源化抗体可使用本领域已知的多种技术来产生，包括但不限于CDR-接枝(欧洲专利EP239,400；国际公布WO 91/09967；以及美国专利5,225,539、5,530,101和5,585,089)、饰面或表面重建(欧洲专利EP 592,106和EP 519,596；Padlan，1991年，Molecular Immunology，第28卷第4/5期，第489-498页；Studnicka等人，1994年，Protein Engineering，第7卷第6期，第805-814页；以及Roguska等人，1994年，Proc.Natl.Acad.Sci.，第91卷，第969-973页)、链改组(美国专利5,565,332)以及在以下文献中的公开的技术：例如，美国专利6,407,213、5,766,886、5,585,089，国际公布WO 9317105，Tan等人，2002年，J.Immunol.，第169卷，第1119-1125页，Caldas等人，2000年，Protein Eng.，第13卷，第353-360页，Morea等人，2000年，Methods，第20卷，第267-279页，Baca等人，1997年，J.Biol.Chem.，第272卷，第10678-10684页，Roguska等人，1996年，Protein Eng.，第9卷，第895-904页，Couto等人，1995年，Cancer Res.，第55卷增刊第23期，第5973s-5977s页，Couto等人，1995年，CancerRes.，第55卷，第1717-1722页，Sandhu，1994年，Gene，第150卷，第409-410页，Pedersen等人，1994年，J.Mol.Biol.，第235卷，第959-973页，Jones等人，1986年，Nature，第321卷，第522-525页，Riechmann等人，1988年，Nature，第332卷，第323页，以及Presta，1992年，Curr.Op.Struct.Biol.，第2卷，第593-596页。

通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的对应残基取代，以改变(例如改善)抗原结合。这些框架取代通过本领域众所周知的方法来鉴定，例如通过对CDR和框架残基的相互作用进行建模以鉴定对于抗原结合重要的框架残基，以及通过序列比较以鉴定在特定位置的不常见框架残基。(参见例如，Queen等人，美国专利5,585,089；美国公布2004/0049014和2003/0229208；美国专利6,350,861、6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089和5,530,101以及Riechmann等人，1988年，Nature，第332卷，第323页)。

所公开的小鼠抗人Siglec-15抗体的人、嵌合或人源化衍生物可用于人的体内方法。小鼠抗体或其他物种的抗体可有利地用于许多用途(例如，体外或原位检测测定、急性体内用途等)。此类人或人源化抗体可在一个或多个非人CDR₅中包括氨基酸残基取代、缺失或添加。当与非衍生的人源化抗体相比时，人源化抗体衍生物可具有基本上相同的结合、更强的结合或更弱的结合。在特定的实施方案中，CDR的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基已被取代、缺失或添加(即，突变)。完全人抗体特别适用于人受试者的治疗处理。

此类人抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法(参见美国专利4,444,887和4,716,111；以及国际公布WO98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741)。可使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生此类人抗体。

例如，可将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机引入或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。另选地，除了人重链和轻链基因之外，还可将人可变区、恒定区和多变区引入小鼠胚胎干细胞。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可与通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座分开地或者同时丧失功能。具体地，JH区的纯合缺失阻止了内源抗体的产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后培育嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合子代。使用常规方法并用所选择的抗原(例如，多肽的全部或一部分)免疫转基因小鼠。使用常规杂交瘤技术(参见例如美国专利5,916,771)，可从免疫的转基因小鼠获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，有可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。有关产生人抗体的这项技术的概述，参见Lonberg和Huszar(1995年，Int.Rev.Immunol.，第13卷，第65-93页，其全文以引用方式并入本文)。有关产生人抗体和人单克隆抗体的技术以及产生这种抗体的方案的详细讨论，参见例如，国际公布WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；以及美国专利5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，这些文献全文以引用方式并入本文。另外，可聘请公司使用类似上述的技术来提供针对所选抗原的人抗体。

编码人受体框架序列的DNA序列包括但不限于来自人种系VH链段VH1-18和JH6以及人种系VL链段VK-A26和JK4的FR链段。在一个具体实施方案中，使用常规重组DNA技术将一个或多个CDR插入框架区内。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，以及人框架区(对于人框架区列表，参见例如Chothia等人，1998年，“Structural Determinants In TheSequences Of Immunoglobulin Variable Domain”，J.Mol.Biol.，第278卷，第457-479页)。

C.抗体序列

1.4C12重链序列

一个实施方案提供了从杂交瘤4C12分离的小鼠单克隆抗体或其抗原结合片段。

另一个实施方案提供了具有由与以下序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸编码的重链的抗体或其抗原结合片段：

带下划线的序列对应于互补决定区(CDR)。带双下划线的序列对应于恒定区。带虚线下划线的序列对应于前导序列。

该核酸可在载体(例如表达载体)中。该核酸在插入宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞的染色体上)时可以是染色体外的。

一个实施方案提供了具有重链的抗体或其抗原结合片段，该重链的氨基酸序列与以下序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性：

单下划线对应于前导序列。双下划线对应于CDR，并且虚线下划线对应于恒定区。

另一个实施方案提供了具有重链而没有前导序列的抗体或其抗原结合片段，该重链的氨基酸序列与以下序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性：

双下划线对应于CDR，并且虚线下划线对应于恒定区。

4C12重链的CDR1的氨基酸序列为SYWMH(SEQ ID NO:6)。

4C12重链的CDR2的氨基酸序列为RIHPSDSDTNYNQKFKG(SEQ ID NO:7)。

4C12重链的CDR3的氨基酸序列为YGNYASGFAY(SEQ ID NO:8)。

一个实施方案提供了具有根据SEQ ID NO:4或5的重链的抗体或其抗原结合片段。

另一个实施方案提供了具有由与SEQ ID NO:3具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸编码的重链的抗体或其抗原结合片段。

一个实施方案提供了具有三个不同CDR的抗体，该三个不同的CDR选自由下列组成的组：SEQ ID NO:6、7和8。

2.4C12轻链序列

另一个实施方案提供了具有由与以下序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸编码的轻链的抗体或其抗原结合片段：

虚线下划线代表前导序列。单下划线代表CDR。双下划线代表恒定区。

另一个实施方案提供了具有轻链的抗体或其抗原结合片段，该轻链的氨基酸序列与以下序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性：

下划线代表前导序列。双下划线代表CDR。虚线下划线代表恒定区。

另一个实施方案提供了具有轻链而没有前导序列的抗体或其抗原结合片段，该轻链与以下序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性：

双下划线代表CDR。虚线下划线代表恒定区。

4C12轻链的CDR1的氨基酸序列为KASQDVSTAVA(SEQ ID NO:12)。

4C12轻链的CDR2的氨基酸序列为WASTRHT(SEQ ID NO:13)。

4C12轻链的CDR3的氨基酸序列为QQHYSTPWT(SEQ ID NO:14)。

另一个实施方案提供了具有由与SEQ ID NO:9具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸编码的轻链的抗体或其抗原结合片段。

一个实施方案提供了具有三个不同CDR的抗体，该三个不同的CDR选自由下列组成的组：SEQ ID NO:12、13和14。

另一个实施方案提供了具有重链和轻链或其轻链和重链组合的抗体或其抗原结合片段，该重链的氨基酸序列与SEQ ID NO:4或5具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性，该轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO:10或11具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

另一个实施方案提供了具有三个不同的重链CDR和三个不同的轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，该三个不同的重链CDR的氨基酸选自由下列组成的组：SEQ ID NO:6、7和8，该三个不同的轻链CDR的氨基酸选自由下列组成的组：SEQ ID NO:12、13和14。

3.2B5重链序列

一个实施方案提供了从杂交瘤2B5分离的小鼠单克隆抗体或其抗原结合片段。

双下划线对应于CDR，并且虚线下划线对应于恒定区。

2B5重链的CDR1的氨基酸序列为NYLIE(SEQ ID NO:18)。

2B5重链的CDR2的氨基酸序列为VINPGSGGTNYNEKFKG(SEQ ID NO:19)。

2B5重链的CDR3的氨基酸序列为SAQAPDY(SEQ ID NO:20)。

一个实施方案提供了具有根据SEQ ID NO:16或17的重链的抗体或其抗原结合片段。

另一个实施方案提供了具有由与SEQ ID NO:15具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸编码的重链的抗体或其抗原结合片段。

一个实施方案提供了具有三个不同CDR的抗体，该三个不同的CDR选自由下列组成的组：SEQ ID NO:18、19和20。

4.2B5轻链序列

双下划线代表CDR。虚线下划线代表恒定区。

2B5轻链的CDR1的氨基酸序列为KASQDVSTAVA(SEQ ID NO:24)。

2B5轻链的CDR2的氨基酸序列为WASTRHT(SEQ ID NO:13)。

2B5轻链的CDR3的氨基酸序列为QQHYSTPWT(SEQ ID NO:25)。

另一个实施方案提供了具有由与SEQ ID NO:21具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸编码的轻链的抗体或其抗原结合片段。

一个实施方案提供了具有三个不同CDR的抗体，该三个不同的CDR选自由下列组成的组：SEQ ID NO:24、13和25。

另一个实施方案提供了具有重链和轻链或其轻链和重链组合的抗体或其抗原结合片段，该重链的氨基酸序列与SEQ ID NO:16或17具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性，该轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO:22或23具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

另一个实施方案提供了具有三个不同的重链CDR和三个不同的轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，该三个不同的重链CDR的氨基酸选自由下列组成的组：SEQ ID NO:18、19和20，该三个不同的轻链CDR的氨基酸选自由下列组成的组：SEQ ID NO:24、13和25。

6.4G9重链序列

一个实施方案提供了从杂交瘤4G9分离的小鼠单克隆抗体或其抗原结合片段。

双下划线对应于CDR，并且虚线下划线对应于恒定区。

4G9重链的CDR1的氨基酸序列为TYGMT(SEQ ID NO:29)。

4G9重链的CDR2的氨基酸序列为WINTYSGVPTYADDFKG(SEQ ID NO:30)。

4G9重链的CDR3的氨基酸序列为GGRGFAY(SEQ ID NO:31)。

一个实施方案提供了具有根据SEQ ID NO:27或28的重链的4G9抗体或其抗原结合片段。

另一个实施方案提供了具有由与SEQ ID NO:26具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸编码的重链的4G9抗体或其抗原结合片段。

一个实施方案提供了具有三个不同CDR的4G9抗体，该三个不同的CDR选自由下列组成的组：SEQ ID NO:29、30和31。

7.4G9轻链序列

双下划线代表CDR。虚线下划线代表恒定区。

4G9轻链的CDR1的氨基酸序列为RASQSIGTSIH(SEQ ID NO:35)。

4G9轻链的CDR2的氨基酸序列为YASESIS(SEQ ID NO:36)。

4G9轻链的CDR3的氨基酸序列为QQSNSWPYT(SEQ ID NO:37)。

一个实施方案提供了具有轻链的4G9抗体或其抗原结合片段，该轻链与SEQ IDNO:33或34具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

另一个实施方案提供了具有由与SEQ ID NO:32具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸编码的轻链的4G9抗体或其抗原结合片段。

一个实施方案提供了具有三个不同CDR的4G9抗体，该三个不同的CDR选自由下列组成的组：SEQ ID NO:35、36和37。

另一个实施方案提供了具有重链和轻链或其轻链和重链组合的抗体或其抗原结合片段，该重链的氨基酸序列与SEQ ID NO:27或28具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性，该轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO:33或34具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

另一个实施方案提供了具有三个不同的重链CDR和三个不同的轻链CDR的4G9抗体或其抗原结合片段，该三个不同的重链CDR的氨基酸选自由下列组成的组：SEQ ID NO:29、30和31，该三个不同的轻链CDR的氨基酸选自由下列组成的组：SEQ ID NO:35、36和37。

D.PD-1活化表位

本文公开了表位特异性PD-1结合部分。在一个实施方案中，所公开的结合部分与PD-1免疫特异性地结合，并激活PD-1介导的信号传导。

所公开的PD-1表位由SEQ ID NO:1的第96-110位氨基酸形成，并且具有如下氨基酸序列：

TYLCGAISLAPKAQI(SEQ ID NO:38)。

1.抗体

一个实施方案提供了免疫特异性结合免疫细胞表面上的SEQ ID NO:38并激活免疫细胞的抗体或其表位结合片段。在一个实施方案中，优选的免疫细胞是T细胞，更具体地为CD8⁺T细胞。在另一个实施方案中，该抗体或其表位结合片段免疫特异性结合免疫细胞表面上的PD-1的SEQ ID NO:38，并通过PD-1促进或诱导激活信号以激活免疫细胞。

表位特异性抗体可以是单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、小鼠抗体、嵌合抗体或其片段。示例性抗体及其产生方法在下面讨论。

2.融合蛋白

在一个实施方案中，表位特异性PD-1结合部分是融合蛋白。以上公开的PD-1表位抗体或表位结合片段中的一种或多种的全部或部分可与其他多肽偶联以形成融合蛋白。融合多肽具有第一融合伴侣，该第一融合伴侣包括直接与第二多肽融合或通过与融合至第二多肽的接头肽序列与第二多肽融合的所公开的PD-1表位抗体或表位结合片段中的一种或多种的全部或部分。融合蛋白任选地含有用于使两个或更多个融合蛋白二聚化或多聚化的结构域。肽/多肽接头结构域可以是单独的结构域，或者可包含在融合蛋白的其他结构域(第一多肽或第二多肽)中的一者内。类似地，用于使融合蛋白二聚化或多聚化的结构域可以是单独的结构域，或者可包含在融合蛋白的其他结构域(第一多肽、第二多肽或肽/多肽接头结构域)中的一者内。在一个实施方案中，二聚化/多聚化结构域和肽/多肽接头结构域是相同的。

本文所公开的融合蛋白具有式I：

N-R1-R2-R3-C

其中“N”代表融合蛋白的N末端，“C”代表融合蛋白的C末端，“R1”是所公开的PD-1表位抗体或表位结合片段中的一者的全部或部分，或其功能变体或片段，“R2”是任选的肽/多肽接头结构域，并且“R3”是第二多肽。另选地，R3是所公开的PD-1表位抗体或表位结合片段中的一者的全部或部分，或其功能变体或片段，并且R1是第二多肽。

二聚化或多聚化可通过二聚化或多聚化结构域在两个或更多个融合蛋白之间或之中发生。另选地，融合蛋白的二聚化或多聚化可通过化学交联发生。形成的二聚体或多聚体可以是同二聚体/同多聚体或异二聚体/异多聚体。

3.适体

在一些实施方案中，表位特异性结合部分是适体。适体是优选以特定方式与靶分子相互作用的分子。在一个实施方案中，适体与免疫细胞表面上的SEQ ID NO:38结合，并通过PD-1促进或诱导激活信号以激活免疫细胞。通常，适体是长度范围为15-50个碱基的小核酸，其折叠成确定的二级和三级结构，诸如茎-环或G-四链体。适体可结合蛋白质、细胞、有机小分子或肽。适体可结合小分子诸如ATP和嗜碱茶氨酸以及大分子诸如逆转录酶和凝血酶。适体可与靶分子以小于10-12M的Kd非常紧密地结合。优选的是，适体与靶分子以小于10-6、10-8、10-10或10-12的Kd结合。适体可以非常高程度的特异性结合靶分子。例如，已分离了在靶分子和仅在分子上的单个位置不同的另一分子之间的结合亲和力相差大于10,000倍的适体。优选的是，适体与靶分子的Kd比其与背景结合分子的Kd低至少10、100、1000、10,000或100,000倍。例如，进行多肽比较时，背景分子优选是不同的多肽。如何制备和使用适体以结合多种不同靶分子的代表性示例在本领域中是已知的。

4.小分子

在一些实施方案中，表位特异性结合部分可以是小分子。术语“小分子”通常是指分子量大于约100至小于约2,500道尔顿、优选在100至2000之间、更优选在约100至约1250之间、更优选在约100至约1000之间、更优选在约100至约750之间、更优选在约200至约500道尔顿之间的小有机化合物。PD-1的活化表位的小分子激动剂可使用常规筛选方法来鉴定。在一些实施方案中，筛选测定可包括测试化合物大文库的随机筛选。测定可包括确定PD-1诱导的免疫应答或T细胞的活化。

E.药物组合物

提供了包括所公开的抗体及其抗原结合片段的药物组合物。含有抗体及其抗原结合片段的药物组合物可用于通过肠胃外(肌肉内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)施用。

在一些体内方法中，本文所公开的组合物以治疗有效量施用于受试者。如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻所治疗疾病的一种或多种症状或以其他方式提供期望药理和/或生理作用的剂量。精确剂量将根据多种因素而变化，诸如受试者依赖性变量(例如年龄、免疫系统健康等)、疾病和所进行的治疗。

对于所公开的抗体及其抗原结合片段，随着进一步研究的进行，将出现关于用于治疗各种患者的各种病症的合适剂量水平的信息，并且普通技术人员考虑到治疗背景、接受者的年龄和总体健康状况将能够确定正确的剂量。所选择的剂量取决于期望的治疗效果、施用途径和期望的治疗持续时间。对于公开的抗体及其抗原结合片段，通常每天以0.001至20mg/kg体重的剂量水平向哺乳动物施用。通常，对于静脉内注射或输注，剂量可以更低。

在某些实施方案中，局部施用抗体及其抗原结合片段，例如通过直接注射到待治疗的部位。通常，注射引起免疫调节剂组合物局部浓度的增加，该浓度高于全身施用所能达到的浓度。可将免疫调节剂组合物与如上所述的基质组合，以通过减少多肽从待治疗部位的被动扩散而有助于增加多肽组合物的局部浓度。

1.肠胃外施用制剂

在一些实施方案中，含有所公开的抗体和抗原结合片段的组合物通过肠胃外注射以水溶液施用。该制剂也可以是悬浮液或乳液的形式。通常，提供了包括有效量的抗体或其抗原结合片段并且任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体的药物组合物。此类组合物任选地包括以下中的一者或多者：稀释剂、无菌水、各种缓冲剂内容(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的缓冲盐水；以及添加剂，诸如洗涤剂和增溶剂(例如TWEEN 20(聚山梨醇酯-20)、TWEEN 80(聚山梨醇酯-80))、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)和防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和填充物质(例如乳糖、甘露醇)。非水溶剂或媒介物的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。可在使用前将制剂冻干并重新溶解/重悬。该制剂可通过例如穿过细菌保留过滤器进行过滤、通过将灭菌剂掺入组合物中、通过辐照组合物或通过加热组合物来进行灭菌。

2.口服施用制剂

在一些实施方案中，抗体组合物被配制用于口服递送。该口服剂型的抗体抗蛋白水解，并且可在胃肠道局部递送更大比例的免疫反应性抗体以治疗感染，或允许抗体吸收以治疗或预防全身性疾病(Reilly,RM等人，Clin Pharmacokinet.，第32卷第4期，第313-323页(1997)；Victoria S Jasion和Bruce P Burnett，Nutr J.，第14卷，第22页(2015)；以及Philippart,M.等人，Drug Res(Stuttg)，第66卷第03期，第113-120页(2016))。

口服固体剂型在Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，1990年(MackPublishing Co.Easton Pa.18042)第89章中进行了一般性描述。固体剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、锭剂或含片、扁囊剂、丸剂、粉剂或颗粒剂，或将材料掺入聚合物化合物诸如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂或脂质体中。此类组合物可影响所公开的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，(1990,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.18042)第1435-1712页，其以引用方式并入本文。组合物可以液体形式制备，或者可为干燥粉末(例如冻干)形式。可使用脂质体或类蛋白包封配制组合物。可使用脂质体包封，并且脂质体可用各种聚合物衍生化(例如，美国专利5,013,556)。另请参见Marshall,K.，G.S.Banker和C.T.Rhodes编辑的ModernPharmaceutics，第10章，1979年。通常，制剂将包括肽(或其化学修饰形式)和惰性成分，该惰性成分在胃环境中保护肽并在肠中释放生物活性物质。

可对抗体及其抗原结合片段进行化学修饰，从而使衍生物的口服递送有效。通常，所设想的化学修饰是至少一个部分附着于组分分子本身，其中该部分允许从胃或肠吸收到血流中或直接吸收到肠粘膜中。还期望增加一种或多种组分的整体稳定性并增加体内循环时间。PEG化是用于药物用途的示例性化学修饰。可使用的其他部分包括：丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸、聚-1,3-二氧戊环和聚-1,3,6-三氧六环[参见，例如Abuchowski和Davis(1981)“Soluble Polymer-Enzyme Adducts”，发表于Enzymes as Drugs，Hocenberg和Roberts编辑，(Wiley-Interscience:New York,N.Y.)第367-383页；和Newmark等人(1982)J.Appl.Biochem.，第4卷，第185-189页]。

另一个实施方案提供了用于口服施用的液体剂型，包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂和糖浆剂，其可包含其他组分，包括惰性稀释剂、佐剂(诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂)以及甜味剂、调味剂和加香剂。

对于口服制剂，释放的位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。在一些实施方案中，通过保护试剂(或衍生物)或通过在胃环境之外(诸如在肠中)释放试剂(或衍生物)来进行释放将避免胃环境的有害作用。为了确保完全的胃抵抗力，在至少pH 5.0下不可渗透的包衣是必不可少的。用作肠溶衣的较常见惰性成分的示例有：偏苯三甲酸醋酸纤维素(CAT)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、邻苯二甲酸乙酸乙烯酯(PVAP)、Eudragit L30D^TM、Aquateric^TM、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、EudragitL^TM、Eudragit S^TM和Shellac^TM。这些包衣可用作混合膜。

3.受控递送聚合物基质

本文所公开的抗体及其抗原结合片段也可以控释制剂的形式施用。可将抗体及其抗原结合片段掺入到允许通过扩散或浸出机制释放的惰性基质例如胶中。也可将缓慢降解的基质掺入到制剂中。控释的另一种形式是基于Oros治疗系统(Alza Corp.)，即抗体及其抗原结合片段被包封在半透膜中，该膜由于渗透作用允许水进入并通过单个小开口将药物推出。

控释聚合物装置可被制成用于在植入聚合物装置(棒、柱、膜、盘)或注射剂(微粒)后全身长期释放。基质可以是微粒的形式诸如微球，其中试剂分散在固体聚合物基质或微胶囊中，其中芯的材料与聚合物壳的材料不同，并且肽分散或悬浮在芯中，芯本质上可以是液体或固体。除非本文具体定义，否则微粒、微球和微胶囊可互换使用。另选地，聚合物可被铸成薄片或薄膜(范围从纳米到四厘米不等)，可以是通过研磨或其他标准技术产生的粉末，甚至可以是凝胶，诸如水凝胶。

不可生物降解或可生物降解的基质均可用于递送融合多肽或编码融合多肽的核酸，但在一些实施方案中优选可生物降解的基质。这些可以是天然或合成聚合物，但在一些实施方案中由于降解和释放特性的更好表征而优选合成聚合物。聚合物基于需要释放的时间段来选择。在某些情况下，线性释放可能是最有用的，但在另一些情况下，脉冲释放或“批量释放”可提供更有效的结果。聚合物可以是水凝胶的形式(通常吸收高达约90重量％的水)，并且可任选地与多价离子或聚合物交联。

这些基质可通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取和其他技术人员熟知的方法来形成。可生物消化的微球可使用开发用于制备药物递送微球的任何方法来制备，例如，如Mathiowitz和Langer，J.Controlled Release，第5卷，第13-22页(1987)；Mathiowitz等人，Reactive Polymers，第6卷，第275-283页(1987)；以及Mathiowitz等人，J.Appl.PolymerSci.，第35卷，第755-774页(1988)中所述。

这些装置可被配制成局部释放以治疗植入或注射区域(通常所提供的剂量比全身治疗所需的剂量要小得多)或全身递送。这些可植入或皮下注射到肌肉、脂肪中，或被吞咽。

III.制造方法

A.制备抗体的方法

所公开的抗体可在细胞培养物中、在噬菌体中或在各种动物中产生，所述动物包括但不限于牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猫、猴、黑猩猩、猿。在一个实施方案中，各种动物可以是经遗传工程改造以产生人或人源化抗体的转基因动物。因此，在一个实施方案中，抗体是哺乳动物抗体。噬菌体技术可用于分离初始抗体或产生具有改变的特异性或亲和力特征的变体。此类技术是常规的并且在本领域中是众所周知的。在一个实施方案中，通过本领域已知的重组方式产生抗体。例如，重组抗体可通过用包含编码该抗体的DNA序列的载体转染宿主细胞来产生。可使用一种或多种载体转染在宿主细胞中表达至少一个VL和一个VH区的DNA序列。抗体生成和产生的重组方式的示例性描述包括Delves，AntibodyProduction:EssentialTechniques(Wiley，1997年)；Shephard等人，Monoclonal Antibodies(Oxford University Press，2000年)；Goding，Monoclonal Antibodies: PrinciplesAndPractice(Academic Press，1993年)；Current Protocols In Immunology(John Wiley&Sons，最新版)。

所公开的抗体可通过重组方式进行修饰，以增加抗体在介导期望功能方面的更大功效。因此，可使用重组方式通过取代修饰抗体也在本发明的范围内。通常，该取代是保守取代。例如，抗体恒定区中的至少一个氨基酸可用不同的残基置换。参见例如美国专利5,624,821、美国专利6,194,551、申请WO 9958572；以及Angal等人，Mol.Immunol.，第30卷，第105-108页(1993)。氨基酸的修饰包括氨基酸的缺失、添加和取代。在一些情况下，进行此类改变以降低不期望的活性，例如补体依赖性细胞毒性。通常，通过共价或非共价连接的提供可检测信号的物质来标记抗体。多种标记和缀合技术是已知的，并且在科学和专利文献中都有广泛报道。可筛选这些抗体与蛋白质、多肽的结合。参见例如Antibody Engineering:A Practical Approach(Oxford University Press，1996年)。

例如，具有期望生物活性的合适抗体可使用体外测定来鉴定，包括但不限于：增殖、迁移、粘附、软琼脂生长、血管生成、细胞间通讯、细胞凋亡、转运、信号传导和体内测定(诸如抑制肿瘤生长)。本文提供的抗体还可用于诊断应用。作为捕获或非中和抗体，可筛选它们与特定抗原结合而不抑制抗原的受体结合或生物活性的能力。作为中和抗体，该抗体可用于竞争性结合测定。

可用于所公开的组合物和方法中的抗体包括任何类别的完整免疫球蛋白(即，完整抗体)、其片段以及至少包含抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白。抗体之间的可变结构域序列不同，并用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性通常不是均匀地分布在抗体的可变结构域中。它通常集中在轻链和重链可变结构域中称为互补决定区(CDR)或高变区的三个链段中。可变结构域中更高度保守的部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采取β-折叠构型并通过三个CDR连接的四个FR区，该三个CDR形成环，这些环连接并在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。

还公开了具有生物活性的抗体的片段。这些片段，无论是否与其他序列连接，包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他所选择的修饰，条件是与未修饰的抗体或抗体片段相比，该片段的活性没有显著改变或受损。

技术也可适用于基于所公开的抗体及其抗原结合片段产生单链抗体。产生单链抗体的方法是本领域技术人员众所周知的。通过使用短肽接头将重链和轻链的可变结构域融合在一起，从而在单个分子上重建抗原结合位点，可形成单链抗体。在不显著破坏抗原结合或结合特异性的情况下，已经开发出单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变结构域的C端经由15至25个氨基酸肽或接头与另一可变结构域的N端相连。选择接头以允许重链和轻链以其适当的构象取向结合在一起。

一个实施方案提供了可通过连接两个scFv而工程改造的二价单链可变片段(di-scFv)。这可通过产生具有两个VH区和两个VL区的单肽链，从而产生串联scFv来完成。ScFv还可被设计为具有接头肽，该接头肽对于两个可变区来说太短而不能折叠在一起(约五个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。这种类型被称为双抗体。双抗体已显示具有比对应的scFv低高达40倍的解离常数，这意味着它们对其靶标具有高得多的亲和力。还更短的接头(一个或两个氨基酸)导致三聚体(三抗体)的形成。也已产生了四抗体。它们对其靶标的亲和力甚至比双抗体更高。

另一个实施方案提供了从基本上同质的抗体群体获得的单克隆抗体，即除了可能存在于抗体分子的小子集中的可能的天然存在的突变之外，群体内的各个抗体是相同的。单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而该一条或多条链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出期望的拮抗活性即可。

单克隆抗体可使用产生单克隆抗体的任何程序来制备。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂免疫小鼠或其他合适的宿主动物，以引发产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。另选地，可在体外免疫淋巴细胞。

所公开的抗体也可通过重组DNA方法制备。编码所公开的抗体的DNA可使用常规方法容易地分离和测序(例如，通过使用能够与编码小鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。还可使用噬菌体展示技术产生和筛选抗体或活性抗体片段的文库。

使用蛋白质化学制备抗体的方法在本领域中也是已知的。一种生产包含抗体的蛋白质的方法是通过蛋白质化学技术将两个或更多个肽或多肽连接在一起。例如，肽或多肽可使用目前可获得的实验室设备，使用Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化学来化学合成。(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)。本领域技术人员可容易地理解，例如，可通过标准化学反应来合成对应于抗体的肽或多肽。例如，可合成肽或多肽且不将其从其合成树脂上裂解，而可合成抗体的另一片段且随后将其从树脂上裂解，从而暴露在该另一片段上被功能阻断的末端基团。通过肽缩合反应，这两个片段可分别在其羧基和氨基末端通过肽键共价连接，以形成抗体或其片段。另选地，肽或多肽如上所述在体内独立地合成。一旦分离，这些独立的肽或多肽可经由相似的肽缩合反应连接以形成抗体或其抗原结合片段。

例如，克隆的或合成的肽段的酶促连接允许将相对短的肽片段连接以产生更大的肽片段、多肽或完整的蛋白质结构域。另选地，合成肽的天然化学连接可用于从较短的肽片段合成地构建大肽或多肽。该方法由两步化学反应组成。第一步是未保护的合成肽-α-硫酯与另一个含有氨基末端Cys残基的未保护的肽段的化学选择性反应，以得到硫酯连接的中间体作为初始共价产物。在不改变反应条件的情况下，该中间体经历自发、快速的分子内反应，以在连接位点形成天然的肽键。

B.制备分离的核酸分子的方法

一个实施方案提供了编码所公开的抗体或其抗原结合片段的核酸。该核酸可编码整个抗体或其抗原结合片段或轻链、重链、其组合或其CDR。

分离的核酸分子可通过标准技术产生，包括但不限于普通分子克隆和化学核酸合成技术。例如，可使用聚合酶链反应(PCR)技术来获得编码变体多肽的分离的核酸。PCR是一种其中靶核酸被酶促扩增的技术。通常，可使用来自感兴趣区域末端或其以外的序列信息来设计在序列上与待扩增模板的相反链相同的寡核苷酸引物。PCR可用于从DNA以及RNA扩增特定序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。引物的长度通常为14至40个核苷酸，但长度范围可为10个核苷酸至数百个核苷酸。常规PCR技术在例如PCR Primer:A Laboratory Manual，Dieffenbach和Dveksler编辑，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1995年中有所描述。当使用RNA作为模板来源时，可使用逆转录酶来合成互补DNA(cDNA)链。连接酶链式反应、链置换扩增、自持序列复制或基于核酸序列的扩增也可用于获得分离的核酸。参见例如，Lewis(1992)Genetic Engineering News，第12卷，第1页；Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第87卷，第1874-1878页；以及Weiss(1991)Science，第254卷，第1292-1293页。

分离的核酸可作为单个核酸分子或一系列寡核苷酸化学合成(例如，使用亚磷酰胺技术在3'至5'方向上自动化合成DNA)。例如，可合成包含期望序列的一对或多对长寡核苷酸(例如，>100个核苷酸)，其中每对包含互补的短链段(例如，约15个核苷酸)，使得当该寡核苷酸对被退火时形成双链体。DNA聚合酶可用于延伸寡核苷酸，从而每个寡核苷酸对产生单个双链核酸分子，然后可将其连接到载体中。也可通过诱变获得分离的核酸。编码蛋白质的核酸可使用标准技术来突变，包括通过PCR进行寡核苷酸定向诱变和/或定点诱变。参见，Short Protocols in Molecular Biology，第8章，Green Publishing Associates andJohn Wiley&Sons，Ausubel等人编辑，1992年。

IV.使用方法

所公开的抗体及其抗原结合片段可用于在有此需要的受试者中调节免疫应答。一个实施方案提供了通过施用所公开的抗体及其抗原片段(任选地包括第二治疗剂)来激活表达PD-1的免疫细胞(例如T细胞)以增殖或增强表达PD-1的免疫细胞的生物活性的方法。

A.免疫应答刺激

1.治疗策略

提供了在受试者中诱导或增强免疫应答的方法。通常，该方法包括向受试者施用有效量的所公开的抗体及其抗原结合片段中的一种或多种以免疫特异性结合PD-1并通过PD-1诱导、促进或增强刺激或激活信号以激活免疫细胞。免疫应答可以是例如诱导、促进或增强T细胞活化，免疫细胞对细胞因子的分泌，T细胞增殖。可向有此需要的受试者施用有效量的所公开的抗体或其抗原结合片段，以克服T细胞耗竭和/或T细胞无能。克服T细胞耗竭或T细胞无能可通过使用已知技术测量T细胞功能来确定。

这些方法可体内或体外使用以诱导、促进或增强刺激免疫应答。

在一些实施方案中，将抗体或其抗原结合片段或编码该抗体或其抗原结合片段的核酸直接施用于受试者。在一些实施方案中，在体外将抗体或其抗原结合片段与细胞(例如，免疫细胞)接触，并且将该处理细胞施用于受试者(例如，过继转移)。该抗体或其抗原结合片段可使更强的免疫应答成为可能。所公开的组合物可用于刺激或增强涉及T细胞的免疫应答，从而通过免疫细胞上的PD-1引起激活信号。

2.待治疗的受试者

a.癌症的治疗

所公开的抗体及其组合物和方法可用于治疗癌症。通常，通过向受试者施用一定量的所公开的通过PD-1诱导、促进或增强激活信号的抗体或其抗原结合片段，将该试剂用于刺激或增强受试者对癌症的免疫应答。该方法可减轻癌症的一种或多种症状。

由所公开的抗体或其片段激活的免疫细胞可杀伤癌细胞并减少受试者的肿瘤负担。术语“癌细胞”意在涵盖癌前细胞和恶性癌细胞。在一些实施方案中，癌症是指保持局部化的良性肿瘤。在其他实施方案中，癌症是指已侵入和破坏邻近身体结构并扩散到远侧部位的恶性肿瘤。在其他实施方案中，癌症与特定的癌抗原(例如，泛癌抗原(KS1/4)、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、HER2/neu等)相关。

本文所公开的方法和抗体组合物可用于治疗或预防多种癌症或其他异常增殖性疾病，包括(但不限于)以下疾病：癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；淋巴系造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特(Berketts)淋巴瘤；髓系造血肿瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病和前髓细胞性白血病；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病(xenoderma pegmentosum)、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌。

由细胞凋亡异常引起的癌症也可通过所公开的方法和组合物进行治疗。此类癌症可包括但不限于滤泡性淋巴瘤，具有p53突变的癌，乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤，以及癌前病变诸如家族性腺瘤性息肉病和骨髓增生异常综合症。在特定的实施方案中，通过该方法和组合物治疗或预防卵巢、膀胱、乳腺、结肠、肺、皮肤、胰腺或子宫中的恶性或增生异常改变(例如化生和不典型增生)或过度增生性疾病。在其他特定的实施方案中，通过该方法和组合物治疗或预防肉瘤、黑色素瘤或白血病。

可通过本文所公开的方法和组合物治疗或预防的特定癌症和相关疾病包括但不限于：白血病，包括但不限于急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞白血病(诸如成髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病)、单核细胞性白血病、红血球性白血病和骨髓增生异常综合症，慢性白血病诸如但不限于慢性髓细胞性(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞性白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病或非霍奇金病淋巴瘤(例如弥漫性间变性淋巴瘤激酶(ALK)阴性、大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；弥漫性间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性、大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性、ALK+间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、急性骨髓性淋巴瘤(AML))；多发性骨髓瘤，诸如但不限于郁积型多发性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；意义不明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨和结缔组织肉瘤，诸如但不限于骨肉瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤，包括但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、少突胶质细胞瘤、非神经胶质瘤、听觉神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤、原发性脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、髓样乳腺癌、粘液性乳腺癌、管状乳腺癌、乳头状乳腺癌、佩吉特氏病和炎性乳腺癌；肾上腺癌，包括但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，诸如但不限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、甲状腺髓样癌和未分化甲状腺癌；胰腺癌，包括但不限于胰岛瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、舒血管肠肽瘤、生长抑素分泌肿瘤和类癌或胰岛细胞瘤；垂体癌，包括但不限于库欣氏病、催乳素分泌瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，包括但不限于眼黑色素瘤，诸如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤和睫状体黑色素瘤和成视网膜细胞瘤；阴道癌，包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌和黑色素瘤；外阴癌，包括但不限于鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和佩吉特氏病；宫颈癌，包括但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，包括但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，包括但不限于卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞瘤和间质瘤；食道癌，包括但不限于鳞状癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌，包括但不限于腺癌、蕈样(息肉样)癌、溃疡癌、浅表扩散癌、弥漫扩散性癌、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，包括但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤；胆囊癌，包括但不限于腺癌；胆管癌，包括但不限于乳头状癌、结节性癌和弥漫性癌；肺癌，包括但不限于非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；睾丸癌，包括但不限于生殖肿瘤、精原细胞瘤、间变性肿瘤、经典(常型)肿瘤、精原细胞癌、非精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)；前列腺癌，包括但不限于腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；阴茎癌；口腔癌，包括但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，包括但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，包括但不限于鳞状细胞癌和疣状癌；皮肤癌，包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、恶性雀斑样黑色素瘤、肢端着色斑性黑色素瘤；肾癌，包括但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或子宫)；维尔姆斯瘤；膀胱癌，包括但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌症包括粘液肉瘤、骨源性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(对于此类疾病的综述，参见Fishman等人，1985年，Medicine，第2版，J.B.LippincottCo.,Philadelphia以及Murphy等人，1997年，“Informed Decisions:The Complete Bookof Cancer Diagnosis,Treatment,and Recovery”，Viking Penguin,Penguin BooksU.S.A.,Inc.,United States of America)。

b.感染的治疗

所公开的抗体组合物和方法可用于治疗感染和感染性疾病。通常，通过向受试者施用一定量的所公开的通过PD-1发送激活或刺激信号的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，将该试剂用于刺激或增强受试者对感染的免疫应答。该方法可减轻感染的一种或多种症状。

感染或疾病可由细菌、病毒、原生动物、蠕虫或其他微生物病原体引起，这些病原体进入细胞内并被攻击，即受到细胞毒性T淋巴细胞的攻击。

感染或疾病可以是急性或慢性的。急性感染通常是短期感染。在急性微生物感染期间，免疫细胞开始表达免疫调节受体。因此，在一些实施方案中，该方法包括增加针对急性感染的免疫刺激反应。

感染可由例如但不限于白色念珠菌(Candida albicans)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或分枝杆菌(Mycobacterium)引起。

在一些实施方案中，所公开的抗体组合物用于治疗慢性感染，例如其中已发生T细胞耗竭或T细胞无能从而导致感染在宿主内保持延长的时间段的感染。

待治疗的示例性感染是由肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T淋巴营养性病毒(HTLV)、疱疹病毒、EB病毒或人乳头瘤状病毒引起的慢性感染。

因为病毒感染主要是由T细胞清除的，所以在更快速或彻底清除感染性病毒剂对动物或人类受试者有益的情况下，增加T细胞活性将是治疗有用的。因此，所公开的组合物可被施用用于治疗局部或全身性病毒感染，包括但不限于免疫缺陷(例如，HIV)、乳头状瘤(例如，HPV)、疱疹(例如，HSV)、脑炎、流感(例如，人流感病毒A)和普通感冒(例如，人鼻病毒)以及由例如HTLV、肝炎病毒、呼吸道合胞体病毒、痘苗病毒和狂犬病病毒引起的其他病毒感染。该分子可局部施用以治疗病毒性皮肤疾病，诸如疱疹损伤或带状疱疹或生殖器疣。该分子也可全身性施用以治疗全身性病毒性疾病，包括但不限于AIDS、流感、普通感冒或脑炎。

可治疗的代表性感染包括但不限于由微生物引起的感染，该微生物包括但不限于放线菌(Actinomyces)、鱼腥藻属(Anabaena)、芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、博代氏杆菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、茎菌属(Caulobacter)、衣原体属(Chlamydia)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、噬细胞菌属(Cytophaga)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、弗朗西丝菌属(Francisella)、盐杆菌属(Halobacterium)、螺杆菌属(Heliobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、乙型流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)(HIB)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体菌属(Leptspirosis)、李斯特菌属(Listeria)、脑膜炎球菌(Meningococcus)A型、B型和C型、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Myobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、粘球菌属(Myxococcus)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、硝化杆菌属(Nitrobacter)、颤藻属(Oscillatoria)、原绿藻菌属(Prochloron)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红螺菌属(Phodospirillum)、立克次体(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、螺菌属(Spirillum)、螺旋体属(Spirochaeta)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、热原体属(Thermoplasma)、硫杆菌属(Thiobacillus)以及密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、立克次氏立克次体(Rickettsia ricketsii)、伤寒立克次体(Rickettsia typhi)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydial psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydial trachomatis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)。

可使用所公开的组合物和方法治疗的其他微生物包括，细菌，诸如克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、巴斯德菌属(Pasteurella)的那些；与霍乱、破伤风、肉毒中毒、炭疽、鼠疫和莱姆病相关的病原体；或真菌或寄生病原体，诸如念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、隐球菌属(Cryptococcus)、曲霉属(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉菌属(Genus Mucorales)(毛霉(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉(rhizophus))、孢子丝菌属(Sporothrix)(申克氏孢子丝菌(schenkii))、芽生菌属(Blastomyces)(皮炎芽生菌(dermatitidis))、副球孢子菌属(Paracoccidioides)(巴西副球孢子菌(brasiliensis))、球孢子菌属(Coccidioides)(粗球孢子菌(immitis))和组织胞浆菌属(Histoplasma)(荚膜组织胞浆菌(capsulatuma))、内阿米巴属(Entamoeba)、溶组织(histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystiscarinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、弓形虫(Toxoplasma gondi)等)、孢子丝菌(Sporothrix)、芽生菌(Blastomyces)、副球孢子菌属(Paracoccidioides)、球孢子菌属(Coccidioides)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、内阿米巴属(Entamoeba)、溶组织(histolytica)、肠袋虫属(Balantidium)、耐格里属(Naegleria)、棘阿米巴属(Acanthamoeba)、贾第虫属(Giardia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、肺囊虫属(Pneumocystis)、疟原虫属(Plasmodium)、巴贝虫属(Babesia)或锥体虫属(Trypanosoma)等。

V.用于增强免疫应答的联合疗法

所公开的抗体及其抗原结合片段和其组合物可单独或与一种或多种另外的治疗剂组合施用于有此需要的受试者。在一些实施方案中，抗体及其抗原结合片段和另外的治疗剂分开但同时施用。抗体及其抗原结合片段和另外的治疗剂也可作为同一组合物的一部分施用。在其他实施方案中，抗体及其抗原结合片段和第二治疗剂分开且在不同时间但作为相同治疗方案的一部分施用。可在施用所公开的抗体及其抗原结合片段之前、之后或与之交替地施用另外的治疗剂。

可在施用第二治疗剂之前1、2、3、4、5、6或更多小时，或1、2、3、4、5、6、7或更多天向受试者施用第一治疗剂。在一些实施方案中，可在第二药剂的第一次施用之前每1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35或48天向受试者施用一种或多种剂量的第一药剂。抗体及其抗原结合片段可以是第一治疗剂或第二治疗剂。

抗体及其抗原结合片段和另外的治疗剂可作为治疗方案的一部分施用。例如，如果可每隔四天将第一治疗剂施用于受试者，则第二治疗剂可在第一天、第二天、第三天或第四天施用，或其组合。第一治疗剂或第二治疗剂可在整个治疗方案中重复施用。

示例性的另外的治疗剂包括但不限于细胞因子、化疗剂、放射性核素、其他免疫治疗剂、酶、抗生素、抗病毒剂(尤其是单独的蛋白酶抑制剂或与用于治疗HIV或乙型肝炎或丙型肝炎的核苷组合的蛋白酶抑制剂)、抗寄生虫(蠕虫、原生动物)、生长因子、生长抑制剂、激素、激素拮抗剂、抗体及其生物活性片段(包括人源化、单链和嵌合抗体)、抗原和疫苗制剂(包括佐剂)、肽类药物、抗炎剂、结合Toll样受体(包括但不限于CpG寡核苷酸)以激活先天免疫系统的配体、动员和优化适应性免疫系统的分子、激活或上调细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤细胞和辅助性T细胞的作用的其他分子，以及灭活或下调抑制性或调节性T细胞的其他分子。

根据待治疗的病症、障碍或疾病选择另外的治疗剂。例如，可将免疫调节剂与一种或多种另外的试剂共同施用，该一种或多种另外的试剂的功能是增强或促进免疫应答或减少或抑制免疫应答。

A.抗微生物剂

在一个实施方案中，抗体及其抗原结合片段可与抗微生物剂诸如抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂或精油组合施用于受试者。在另一个实施方案中，所公开的抗体及其抗原结合片段可在疾病的治疗和预防中以及在严重创伤性损伤如大面积烧伤、开放性骨折、意外截肢或其他伤口的背景下以预防或预防性作用使用。

在一些实施方案中，在入院时向受试者施用抗体及其抗原结合片段和/或抗微生物剂，以防止进一步的细菌、真菌或病毒并发症。抗生素可靶向病原体，并且抗体及其抗原结合片段可刺激免疫系统以提供增强的反应来治疗或预防进一步的感染或疾病。

1.化疗剂

抗体及其抗原结合片段可与一种或多种化疗剂和促凋亡剂组合。代表性的化疗剂包括但不限于安吖啶、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、克立他酶(crisantaspase)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、甲酰四氢叶酸、脂质体多柔比星、脂质体柔红霉素、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、沙铂、链脲霉素、替加氟尿嘧啶、替莫唑胺、替尼泊苷、噻替哌、硫鸟嘌呤、拓扑替康、苏消安、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨或其组合。代表性的促凋亡剂包括但不限于氟达拉滨牛磺孢子素(fludarabinetaurosporine)、环己酰亚胺、放线菌素D、乳糖基神经酰胺、15d-PGJ(2)及其组合。

2.其他免疫调节剂

a.PD-1拮抗剂

在一些实施方案中，抗体及其抗原结合片段与PD-1拮抗剂共同施用。程序性死亡1(PD-1)是CD28受体家族的成员，当在T细胞上诱导时其产生负免疫应答。PD-1及其配体中的一者(B7-H1或B7-DC)之间的接触会诱导抑制性反应，该反应降低T细胞增殖和/或T细胞应答的强度和/或持续时间。合适的PD-1拮抗剂描述于美国专利8,114,845、8,609,089和8,709,416(所有这些全文以引用方式明确并入本文)中，并且包括结合并阻断PD-1的配体以干扰或抑制配体与PD-1受体结合，或直接结合并阻断PD-1受体而不诱导通过PD-1受体的抑制性信号传导的化合物或试剂。

在一些实施方案中，PD-1受体拮抗剂直接结合PD-1受体而不触发抑制性信号传导，并且还结合PD-1受体的配体以减少或抑制该配体通过PD-1受体触发信号传导。通过减少结合PD-1受体并触发抑制性信号传导的配体的数量和/或量，更少的细胞被PD-1信号传导递送的负信号减弱，并且可实现更强的免疫应答。

据信PD-1信号传导是通过与PD-1配体(诸如B7-H1或B7-DC)结合而驱动的，所述配体与主要组织相容性复合物(MHC)呈递的肽抗原紧密接近(参见例如，Freeman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，第105卷，第10275-10276页(2008))。因此，防止PD-1和TCR在T细胞膜上共连接的蛋白质、抗体或小分子也是有用的PD-1拮抗剂。

在一些实施方案中，PD-1受体拮抗剂是小分子拮抗剂或抗体，其通过与PD-1的配体或与PD-1本身结合来减少或干扰PD-1受体信号传导，尤其是其中PD-1与TCR的共连接不遵循此类结合，从而不触发通过PD-1受体的抑制性信号传导。

通过本发明的方法设想的其他PD-1拮抗剂包括与PD-1或PD-1的配体结合的抗体，以及其他抗体。

合适的抗PD-1抗体包括但不限于以下美国专利号中所述的那些：7332582、7488802、7521051、7524498、7563869、7981416、8088905、8287856、8580247、8728474、8779105、9067999、9073994、9084776、9205148、9358289、9387247、9492539、9492540，所有这些专利全文以引用方式并入本文。

还参见Berger等人，Clin.Cancer Res.，第14卷，第30443051页(2008)。

示例性抗PD-L1抗体包括但不限于以下美国专利号中描述的那些：8383796、9102725、9273135、9393301和9580507，所有这些全文以引用方式明确并入本文。

对于抗B7-DC(也称为抗PD-L2)抗体，参见美国专利号：7,411,051、7,052,694、7,390,888、8188238和9255147。

其他示例性PD-1受体拮抗剂包括但不限于PD-L2多肽(包括它们的同源物和变体)以及任何前述的活性片段以及掺入任何这些的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包括与抗体(诸如人IgG)的Fc部分偶联的B7-DC的可溶部分，并且不包含人B7-DC的跨膜部分的全部或部分。

PD-1拮抗剂也可以是哺乳动物PD-L1的片段，例如来自小鼠或灵长类动物诸如人的片段，其中该片段结合并阻断PD-1，但不导致通过PD-1的抑制性信号传导。该片段也可以是融合蛋白(例如Ig融合蛋白)的一部分。

其他有用的多肽PD-1拮抗剂包括与PD-1受体的配体结合的那些。这些包括PD-1受体蛋白或其可溶性片段，它们可与PD-1配体(诸如PD-L1或B7-DC)结合并防止与内源PD-1受体结合，从而防止抑制性信号传导。还已经显示PD-L1结合蛋白B7.1(Butte等人，Immunity，第27卷，第111-122页(2007))。此类片段还包括PD-1蛋白的可溶性ECD部分，其包括增强与天然配体的结合的突变诸如A99L突变(Molnar等人，PNAS，第105卷，第10483-10488页(2008))。可与PD-L1配体结合并防止与内源PD-1受体结合从而防止抑制性信号传导的B7-1或其可溶性片段也是有用的。

PD-1和PD-L1反义核酸(DNA和RNA两者)以及siRNA分子也可以是PD-1拮抗剂。此类反义分子防止PD-1在T细胞上的表达以及T细胞配体诸如PD-L1和/或PD-L2的产生。例如，与载体诸如聚乙烯亚胺复合的siRNA(例如，长度约21个核苷酸，其对编码PD-1或编码PD-1配体的基因具有特异性，并且该寡核苷酸可容易地商购获得)(参见Cubillos-Ruiz等人，J.Clin.Invest.，第119卷第8期，第2231-2244页(2009))容易地被表达PD-1以及PD-1配体的细胞摄取，并降低这些受体和配体的表达，以实现T细胞中抑制性信号传导的降低，从而激活T细胞。

b.CTLA4拮抗剂

还可设想其他用于介导T细胞在免疫应答中的作用的分子作为另外的治疗剂。在一些实施方案中，该分子是CTLA4的拮抗剂，例如拮抗的抗CTLA4抗体。设想用于本发明方法的抗CTLA4抗体的示例包括如PCT/US2006/043690(Fischkoff等人，WO/2007/056539)中所述的抗体。

抗PD-1、抗B7-H1和抗CTLA4抗体的剂量在本领域中是已知的，并且可在例如0.1至100mg/kg的范围内，或在1至50mg/kg或10至20mg/kg的更窄范围内。对于人类受试者的合适剂量可在5至15mg/kg之间，其中10mg/kg的抗体(例如，人抗PD-1抗体)是特定的实施方案。

用于本发明的方法中的抗CTLA4抗体的具体示例是以例如约10mg/kg的剂量施用的伊匹木单抗(Ipilimumab)(一种人抗CTLA4抗体)和以例如约15mg/kg的剂量施用的曲美木单抗(Tremelimumab)(一种人抗CTLA4抗体)。还参见Sammartino等人，Clinical KidneyJournal，第3卷第2期，第135-137页(2010)，2009年12月在线出版。

在其他实施方案中，拮抗剂是小分子。已经显示出一系列小的有机化合物与B7-1配体结合，以防止与CTLA4结合(参见Erbe等人，J.Biol.Chem.，第277卷，第7363-7368页(2002))。此类小的有机物可单独或与抗CTLA4抗体一起施用，以减少T细胞的抑制性信号传导。

3.增强剂

在一些实施方案中，另外的治疗剂包括增强剂。增强剂的作用可能是通过一种以上的机制来提高免疫应答上调剂的功效，但确切的作用机制对于本发明的广泛实践而言并不重要。

在一些实施方案中，增强剂是环磷酰胺。环磷酰胺(CTX、或)是一种氧氮磷杂环己烷(oxazaphosphorine)药物，并且类似物包括异环磷酰胺(IFO、Ifex)、培磷酰胺、氯乙环磷酰胺(曲磷酰胺、Ixoten)及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药及其代谢物(美国专利申请20070202077，该申请全文并入本文)。异环磷酰胺是环磷酰胺的结构类似物，并且其作用机制被认为与环磷酰胺的作用机制相同或基本上相似。培磷酰胺(4-过氧羟基环磷酰胺)和氯乙环磷酰胺也是烷基化剂，其在结构上与环磷酰胺相关。例如，过磷酰胺使DNA烷基化，从而抑制DNA复制以及RNA和蛋白质合成。已经设计并评估了新的氧氮磷杂环己烷衍生物，试图改善选择性和反应同时降低宿主毒性(Liang J,Huang M,Duan W,Yu XQ,Zhou S.，“Design of new oxazaphosphorine anticancerdrugs.”，Curr Pharm Des.，2007年，第13卷第9期，第963-978页，综述)。这些包括马磷酰胺(NSC 345842)、葡磷酰胺(D19575，β-D-葡萄糖基异磷酰胺氮芥)、S-(-)-溴异环磷酰胺(CBM-11)、NSC 612567(醛磷酰胺全氢化噻嗪)和NSC 613060(醛磷酰胺噻唑烷)。马磷酰胺是一种氧氮磷杂环己烷类似物，是一种化学稳定的4-羟基-CPA的4-硫代乙烷磺酸盐。葡膦酰胺是IFO衍生物，其中IFO的烷基化代谢物异磷酰胺氮芥通过糖苷键连接到β-D-葡萄糖分子上。另外的环磷酰胺类似物在题为“Cyclophosphamide analogs useful as anti-tumoragents”的美国专利5,190,929中有所描述，该专利全文以引用方式并入本文。

尽管CTX本身是无毒的，但其某些代谢物是细胞毒性烷基化剂，这些烷基化剂诱导DNA交联并在较高剂量时引起链断裂。许多细胞对CTX具有抗性，因为它们表达高水平的解毒酶醛脱氢酶(ALDH)。CTX靶向增殖性淋巴细胞，因为淋巴细胞(而非造血干细胞)仅表达低水平的ALDH，并且循环细胞对DNA烷基化剂最敏感。

在一个实施方案中，低剂量的CTX与所公开的抗体及其抗原结合片段组合使用。低剂量的CTX(<200mg/kg)可具有免疫刺激作用，包括在人和小鼠癌症模型中刺激抗肿瘤免疫应答(Brode&Cooke Crit Rev.Immunol.，第28卷，第109-126页(2008))。这些低剂量是亚治疗性的，并且不具有直接的抗肿瘤活性。相反，高剂量的CTX抑制抗肿瘤反应。几种机制可解释CTX在增强抗肿瘤免疫应答中的作用：(a)耗尽CD4+CD25+FoxP3+Treg(和特异性增殖的Treg，其可能是特别抑制性的)，(b)耗尽B淋巴细胞；(c)诱导一氧化氮(NO)，从而导致肿瘤细胞生长的抑制；(d)动员和扩增CD11b+Gr-1+MDSC。这些主要影响具有许多次要影响；例如在Treg耗尽后巨噬细胞产生更多的IFN-γ和更少的IL-10。CTX也显示诱导I型IFN表达并促进淋巴细胞的稳态增殖。

Treg耗尽最常被引用为CTX增强抗肿瘤免疫应答的机制。该结论部分基于过继转移实验的结果。在AB1-HA肿瘤模型中，CTX治疗在第9天给出75％的治愈率。在第12天，纯化Treg的转移几乎完全抑制了CTX反应(van der Most等人，Cancer Immunol.Immunother.，第58卷，第1219-1228页(2009))。在HHD2肿瘤模型中观察到了类似的结果：CTX预处理后CD4+CD25+Treg的过继转移消除了对疫苗的治疗反应(Taieb,J.，J.Immunol.，第176卷，第2722-2729页(2006))。

大量人类临床试验已经证明，低剂量CTX是一种安全、耐受性好且有效的促进抗肿瘤免疫应答的试剂(Bas,&Mastrangelo，Cancer Immunol.Immunother.，第47卷，第1-12页(1998))。

在一个实施方案中，CTX增强抗肿瘤免疫应答的最佳剂量是通过将Treg水平降低至正常范围以下而降低总T细胞计数但为亚治疗的剂量(参见Machiels等人，Cancer Res.，第61卷，第3689-3697页(2001))。

在一些实施方案中，CTX以300mg/m2的剂量用作免疫增强剂。在另一个实施方案中，对于平均男性(6英尺，170磅(78kg)，体表面积为1.98m2)，300mg/m2，CTX的剂量为8mg/kg或624mg总蛋白。在癌症小鼠模型中，在15-150mg/kg的剂量范围内观察到功效，这与30g小鼠中0.45-4.5mg的总蛋白有关(Machiels等人，Cancer Res.，第61卷，第3689-3697页(2001)；Hengst等人，Cancer Res.，第41卷，第2163-2167页(1981)；Hengst，Cancer Res.，第40卷，第2135-2141页(1980))。

对于较大的哺乳动物，诸如灵长类动物(诸如人、患者)，可使用此类mg/m2剂量，但也可使用在有限的时间间隔内施用的单位剂量。此类单位剂量可在有限的时间段内每天施用，例如最多3天、最多5天、最多7天、最多10天、最多15天、或最多20天或最多25天，都是本发明特别设想的。相同的方案可应用于本文所述的其他增强剂。

在其他实施方案中，增强剂是降低调节性T淋巴细胞(T-reg)诸如舒尼替尼抗TGFβ或伊马替尼的活性和/或数量的试剂。所述的治疗方案还可包括施用佐剂。

有用的增强剂还包括有丝分裂抑制剂，诸如紫杉醇、芳香酶抑制剂(例如，来曲唑)和血管生成抑制剂(VEGF抑制剂，例如阿瓦斯汀、VEGF-Trap)(参见，例如Li等人，“Vascularendothelial growth factor blockade reduces intratumoral regulatory T cellsand enhances the efficacy of a GM-CSF-secreting cancer immunotherapy.”，ClinCancer Res.，2006年11月15日，第12卷第22期，第6808-6816页)、蒽环类、奥沙利铂、多柔比星、TLR4拮抗剂和IL-18拮抗剂。

VI.转基因动物

一个实施方案提供了产生具有重链CDR和轻链CDR的抗体或其抗原结合片段的转基因动物，该重链CDR具有根据SEQ ID NO:6、7和8的氨基酸序列，该轻链CDR具有根据SEQID NO:12、13和14的氨基酸序列。在一个实施方案中，该转基因动物是啮齿动物，例如小鼠。

另一个实施方案提供了产生具有重链CDR和三个不同的轻链CDR的抗体或其抗原结合片段的转基因动物，该重链CDR具有根据SEQ ID NO:18、19和20的氨基酸序列，该三个不同的轻链CDR具有选自由下列组成的组：SEQ ID NO:24、13和25的氨基酸序列。在一个实施方案中，该转基因动物是啮齿动物，例如小鼠。

另一个实施方案提供了产生具有重链CDR和轻链CDR的抗体或其抗原结合片段的转基因动物，该重链CDR具有根据SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列，该轻链CDR具有根据SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列。在一个实施方案中，该转基因动物是啮齿动物，例如小鼠。

制备产生抗体的转基因动物的方法在本领域中是已知的。参见例如A.Jakobovits，Curr Opin Biotechnol.，第6卷第5期，第561-566页，1995年和Brüggemann,M.等人，Arch Immunol Ther Exp(Warsz).，第63卷第2期，第101–108页(2015)；Jakobovits,A.等人，“From XenoMouse technology to panitumumab,the first fullyhuman antibody product from transgenic mice.”，Nat Biotechnol.，第25卷第10期，第1134-1143页(2007)；Lonberg N.(2005)，“Human antibodies from transgenicanimals.”，Nat Biotechnol.，第23卷第9期，第1117-1125页，以及美国专利9,708,635、9,686,970、9,499,838、9,445,581、9,388,446、8,835,712、8,703,485、8,232,449、7,795,494和5,939,598。

本发明提供的各个方面的实施方案也通过以下任意一个段落进行了描述。

实施方案1.一种包含重链互补决定区(CDR)和轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR具有根据SEQ ID NO:6、7和8的氨基酸序列，且所述轻链CDR具有根据SEQ IDNO:12、13和14的氨基酸序列。

实施方案2.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:4或5具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的重链。

实施方案3.根据实施方案1或2所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:10或11具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的轻链。

实施方案4.一种包含重链和轻链的抗体或其任何抗原结合片段，所述重链与SEQID NO:4或5具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性，所述轻链与SEQ ID NO:10或11具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

实施方案5.一种经工程改造以表达根据实施方案1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的转基因动物。

实施方案6.根据实施方案5所述的转基因动物，其中所述动物是啮齿动物。

实施方案7.根据实施方案6所述的转基因动物，其中所述啮齿动物是小鼠。

实施方案8.一种编码与SEQ ID NO:4或5具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的重链的核酸。

实施方案9.一种编码与SEQ ID NO:10或11具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的轻链的核酸。

实施方案10.一种包含重链CDR和轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR具有根据SEQ ID NO:18、19和20的氨基酸序列，且所述轻链CDR具有根据SEQ ID NO:24、13和25的氨基酸序列。

实施方案11.根据实施方案10所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:16或17具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的重链。

实施方案12.根据实施方案10或11所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:22或23具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的轻链。

实施方案13.一种包含重链和轻链的抗体或其抗原结合片段，所述重链与SEQ IDNO:16或17具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性，且所述轻链与SEQ ID NO:22或23具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

实施方案14.一种经工程改造以表达根据实施方案10至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的转基因动物。

实施方案15.根据实施方案14所述的转基因动物，其中所述动物是啮齿动物。

实施方案16.根据实施方案15所述的转基因动物，其中所述啮齿动物是小鼠。

实施方案17.一种编码与SEQ ID NO:16或17具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的重链的核酸。

实施方案18.一种编码与SEQ ID NO:22或23具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的轻链的核酸。

实施方案19.一种包含重链CDR和轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR具有根据SEQ ID NO:29、30和31的氨基酸序列，且所述轻链CDR具有根据SEQ ID NO:35、36和37的氨基酸序列。

实施方案20.根据实施方案19所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:27或28具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的重链。

实施方案21.根据实施方案19或20所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:33或34具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的轻链。

实施方案22.一种包含重链和轻链的抗体或其抗原结合片段，所述重链与SEQ IDNO:27或28具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性，且所述轻链与SEQ ID NO:33或34具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

实施方案23.一种经工程改造以表达根据实施方案19至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的转基因动物。

实施方案24.根据实施方案23所述的转基因动物，其中所述动物是啮齿动物。

实施方案25.根据实施方案24所述的转基因动物，其中所述啮齿动物是小鼠。

实施方案26.一种编码与SEQ ID NO:27或28具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的重链的核酸。

实施方案27.一种编码与SEQ ID NO:33或34具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的轻链的核酸。

实施方案28.根据实施方案1至4、10至13或19至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人、小鼠、嵌合、人源化、单克隆、双特异性、三特异性或多特异性的。

实施方案29.一种包含三个轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，所述三个轻链CDR具有选自由下列组成的组：SEQ ID NO:12、13、14、24、25、35、36或37的氨基酸序列。

实施方案30.一种包含三个重链CDR的抗体或其抗原结合片段，所述三个重链CDR具有选自由下列组成的组：SEQ ID NO:6、7、8、18、19、20、29、30或31的氨基酸序列。

实施方案31.一种包含三个轻链CDR和三个重链CDR的抗体或其抗原结合片段，所述三个轻链CDR具有选自由下列组成的组：SEQ ID NO:12、13、14、24、25、35、36或37的氨基酸序列，所述三个重链CDR具有选自由下列组成的组：SEQ ID NO:6、7、8、18、19、20、29、30或31的氨基酸序列。

实施方案32.一种免疫特异性结合SEQ ID NO:38的抗体或其表位结合片段或融合蛋白。

实施方案33.根据实施方案32所述的抗体或其表位结合片段或融合蛋白，其中免疫细胞是T细胞。

实施方案34.根据实施方案33所述的抗体或其表位结合片段或融合蛋白，其中所述T细胞是CD8+T细胞。

实施方案35.根据实施方案32所述的抗体或其表位结合片段或融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段或融合蛋白结合PD-1。

实施方案36.一种抗体或其表位结合片段或融合蛋白，所述抗体或其表位结合片段或融合蛋白免疫特异性结合在免疫细胞表面上表达的PD-1上的SEQ ID NO:38并且通过PD-1诱导或促进激活或刺激所述免疫细胞的信号。

实施方案37.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1至4、10至13、19至22或29至36中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

实施方案38.根据实施方案37所述的药物组合物，所述药物组合物还包含第二治疗剂。

实施方案39.根据实施方案37或38所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

实施方案40.根据实施方案38所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂包含环磷酰胺。

实施方案41.一种诱导、促进或增强有此需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用有效量的根据实施方案1至4、10至13、19至22或29至36中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据实施方案37至40中任一项所述的药物组合物，以诱导、促进或增强所述受试者的免疫应答。

实施方案42.一种用于治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用有效量的根据实施方案1至4、10至13、19至22或29至36中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据实施方案37至40中任一项所述的药物组合物，以治疗所述受试者的癌症。

实施方案43.一种用于降低有此需要的受试者的肿瘤负担的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用有效量的根据实施方案1至4、10至13、19至22或29至36中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据实施方案37至40中任一项所述的药物组合物，以降低所述受试者的肿瘤负担。

实施方案44.一种治疗有此需要的受试者的感染的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用有效量的根据实施方案1至4、10至13、19至22或29至36中任一项所述的抗体或抗原结合片段或根据实施方案37至40中任一项所述的药物组合物，以治疗所述受试者的所述感染。

实施例

实施例1：抗PD-1抗体生产

结果

抗PD-1抗体的生产产生被选择用于表征的克隆4G9、4C12和5C2。

实施例2：抗PD-1抗体与PD-1之间的相互作用动力学

材料和方法

来自克隆4G9、4C12和5C2的抗体使用得自GE的BiocoreTM系统进行表征。分析物是小鼠或人PD-1，并且配体是抗PD-1抗体。指示的分析物浓度为0nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM和1000nM。

结果

图1和表1示出了4G9与人PD-1的相互作用分析。平衡缔合常数(KA)为9.52×10⁵(1/M)。平衡解离常数(KD)为1.05×10^-6(M)。

表1.4G9与人PD-1的相互作用分析。

图2和表2示出了4G9与小鼠PD-1的相互作用分析。平衡缔合常数(KA)为1.94×10⁵(1/M)。平衡解离常数(KD)为5.15×10^-6(M)。

表2.4G9与小鼠PD-1的相互作用分析。

图3和表3示出了4C12与人PD-1的相互作用分析。平衡缔合常数(KA)为3.14×10⁶(1/M)。平衡解离常数(KD)为3.19×10^-7(M)。

表3.4C12与人PD-1的相互作用分析。

图4和表4示出了5C2与人PD-1的相互作用分析。平衡缔合常数(K_A)为2.02×10⁵(1/M)。平衡解离常数(K_D)为4.95×10^-6(M)。

表4.5C2与人PD-1的相互作用分析。

图5和表5示出了5C2与小鼠PD-1的相互作用分析。平衡缔合常数(K_A)为1.18×10⁶(1/M)。平衡解离常数(K_D)为8.50×10^-7(M)。

表5.5C2与小鼠PD-1的相互作用分析。

实施例3：抗PD-1抗体与EL4细胞的结合

材料和方法

将组成型表达PD-1的小鼠EL4细胞用于荧光激活细胞分选仪中，以评估4G9、5C2和4C12与细胞的结合。

结果

图6A是示出市售抗PD-1与EL4细胞结合而对照同型抗体不与EL4细胞结合的流式细胞术直方图。图6B是示出4G9、5C2和4C12与EL4细胞结合而单独的第二抗体不结合的流式细胞术直方图。图6C是示出4G9抗PD-1抗体与EL4细胞结合而单独的第二抗体不结合的流式细胞术直方图。图6D是示出5C2抗PD-1抗体与EL4细胞结合而单独的第二抗体不结合的流式细胞术直方图。图6E是示出4C12抗PD-1抗体与EL4细胞结合而单独的第二抗体不结合的流式细胞术直方图。

实施例4：抗PD-1抗体的激动活性

材料和方法

小鼠CD4 T细胞

用抗CD3/抗CD28 Ab刺激纯化的小鼠CD4 T细胞48小时，然后将抗PD-1Ab(10μg/ml)与蛋白A珠一起添加到培养物中再培养48小时。在一些样品中，添加抗PD-L1 Ab阻断PD-1/PD-L1相互作用，以剖析测试Ab的激动剂作用。使用CBA测定检测上清液中的IFNγ和IL-2浓度。

人CD4 T细胞

用抗CD3/抗CD28 Ab刺激纯化的人CD4 T细胞48小时，然后将抗PD-1Ab(1或10μg/ml)与蛋白A珠一起添加到培养物中再培养48小时。使用CBA测定检测上清液中的IFNγ浓度。

结果

图7A和图7B显示，与未处理的细胞或用抗PD-L1抗体处理的细胞相比，用抗PD-1抗体5C2、4C12和4G9处理的受刺激的CD4 T细胞的上清液中的IFNγ和IL-2浓度更高。图7C显示，与未处理的细胞或用同型对照抗体处理的细胞相比，用抗PD-1抗体4G9和5C2处理的受刺激的人CD4 T细胞具有更高的IFNγ上清液浓度。

实施例5：杂交瘤增强Akt磷酸化

材料和方法

使用pAKT(S473)的细胞内染色作为T细胞活化的标记。

结果

来自用肽E免疫的小鼠的杂交瘤增强了小鼠CD4 T细胞中Akt(S473)的磷酸化(图8)。

实施例6：三种抗PD-1抗体的表征

材料和方法

表征了来自杂交瘤5C2、4C12和4G9的纯化抗体。

结果

确定了三种抗PD-1抗体中每一种的同种型。5C2和4C12均为IgG1同种型，并且发现4G9为IgG2b同种型(图9)。杂交瘤测序显示5C2和4C12抗体具有100％的序列同一性。

实施例7：4G9和5C2与人PD-1特异性结合

材料和方法：

使用ELISA测定确定4G9和5C2与人PD-1-Fc的结合。

结果：

图10示出了评估4G9和5C2抗体与人PD-1-Fc结合的ELISA测定结果。4G9和5C2均与人PD-1特异性结合。图11A是示出4G9和5C2不结合PD-1KO CD4 T细胞的流式细胞术直方图，但它们却结合来自野生型小鼠的CD4 T细胞(图11B)。

实施例8：信号传导

材料和方法：

预刺激小鼠CD4 T细胞48小时以确保PD-1表达，然后用纯化的4G9和5C2抗体处理。使用ELISA试剂盒(Cell Signaling Tech)确定pS6的浓度。

结果：

与阻断抗体(RMP1-14和J43)相反，4G9和5C2通过S6途径激活T细胞。用纯化的4G9和5C2抗体处理48h预刺激(以确保PD-1表达)的小鼠CD4 T细胞导致线性范围内pS6显著增加(ELISA试剂盒Cell Signaling Tech，与未处理相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。这种现象是由于直接激活而不是PD-1/PD-L1阻断引起的，因为用阻断PD-1/PD-L1相互作用的市售Ab-1(RMP1-14)和Ab-2(J43)处理不导致pS6增加。

实施例8：体内功效评估

材料和方法：

图13A是该实验中使用的TC-1肿瘤模型的示意图。简而言之，在第0天对小鼠皮下注射TC-1肿瘤细胞。肿瘤注射后第10天(D10)、第17天(D17)和第24天(D24))，用疫苗(E7+PADRE+Quil A)处理小鼠。在第10天、第14天、第17天、第21天、第24天和第28天，用抗PD-1抗体处理小鼠。

结果：

与E7疫苗联合使用时，抗PD-1抗体4G9、4C12和5C2减小了肿瘤体积并提高了存活率(图13B至图13D)。

实施例9：体内功效评估—抗EpE抗体

材料和方法：

如上文实施例8和图14A中所述，在TC-1肿瘤模型中产生并测试针对表位E的抗体。

结果：

与传统的检查点抑制剂即抗PD1阻断抗体RMP1-14和J43相比，用4G9(一种针对表位E生成的抗体)处理的小鼠表现出明显更低的肿瘤体积和更高的存活率(图14B至图14C)。

Claims

1.一种包含重链互补决定区(CDR)和轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR具有根据SEQ ID NO:6、7和8的氨基酸序列，且所述轻链CDR具有根据SEQ ID NO:12、13和14的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:4或5具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的重链。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQ ID NO:10或11具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的轻链。

4.一种包含重链和轻链的抗体或其任何抗原结合片段，所述重链与SEQ ID NO:4或5具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性，所述轻链与SEQ ID NO:10或11具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列同一性。

5.一种经工程改造以表达根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的转基因动物。

6.根据权利要求5所述的转基因动物，其中所述动物是啮齿动物。

7.根据权利要求6所述的转基因动物，其中所述啮齿动物是小鼠。

8.一种编码与SEQ ID NO:4或5具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的重链的核酸。

9.一种编码与SEQ ID NO:10或11具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的轻链的核酸。

10.一种包含重链CDR和轻链CDR的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR具有根据SEQID NO:18、19和20的氨基酸序列，且所述轻链CDR具有根据SEQ ID NO:24、13和25的氨基酸序列。