CN118871567A - 生物油墨及结构体的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有片段化细胞外基质的生物油墨。

Description

生物油墨及结构体的制造方法

技术领域

本发明涉及生物油墨及结构体的制造方法。

背景技术

近年来，在再生医疗、要求接近生物体的环境的药剂的分析体系等领域中，显示出了使用与在平板上生长的细胞相比立体地组织化的立体性细胞组织的优势。因此，开发了用于在生物体外构建立体性细胞组织的各种技术。

最近出现了三维(3D)生物打印技术，并且尝试了使用3D生物打印来构建复杂的组织和器官。迄今为止，提出了多种3D生物打印技术(例如专利文献1～4)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开第2014/0120192号说明书

专利文献2：国际公开第2013/040078号

专利文献3：日本特表2018-522587号公报

专利文献4：日本专利6791960号

发明内容

发明所要解决的课题

在基于3D打印的组织构建中，形成后的结构体的物理特性主要起因于打印中使用的生物油墨的特性。作为生物油墨，通常使用以纤维蛋白、胶原蛋白等RGD肽、海藻酸等水凝胶为主成分的组合物。由生物油墨形成的结构体在强度方面存在改善的余地。

本发明的目的在于提供一种能够形成具有高强度的结构体的生物油墨。

用于解决课题的手段

本发明提供以下的[1]～[8]。

[1]一种生物油墨，其含有片段化细胞外基质成分。

[2]根据[1]所述的生物油墨，其中，片段化细胞外基质成分包含片段化胶原蛋白成分。

[3]根据[1]或[2]所述的生物油墨，其进一步包含结构体形成材料。

[4]根据[3]所述的生物油墨，其中，结构体形成材料包含细胞外基质成分。

[5]根据[4]所述的生物油墨，其中，细胞外基质成分包含胶原蛋白。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的生物油墨，其中，以生物油墨的总量为基准，片段化细胞外基质成分的含量为5mg/mL以上且30mg/mL以下。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的生物油墨，其中，片段化细胞外基质成分的颗粒尺寸小于40μm。

[8]一种结构体的制造方法，其包含印刷[1]～[7]中任一项所述的生物油墨的步骤；以及使所印刷的生物油墨固化的步骤。

发明效果

根据本发明，能够提供能够形成具有高强度的结构体的生物油墨。

附图说明

图1是表示包含柠檬酸三钠(TSC)和结冷胶(GG)的溶液(GG浴)中的颗粒的粒径观察结果的显微镜照片。

图2是表示GG浴中的颗粒的平均尺寸(μm)与TSC浓度(mol/L)的关系的图表。

图3是表示使用生物油墨制作的结构体的拉伸强度的测定结果的图表。

图4是表示磷酸缓冲生理盐水(PBS)中的片段化胶原蛋白成分(CMF)的显微镜观察结果的照片。

图5(A)是表示经过滤的生物油墨中的片段化胶原蛋白成分(CMF)的显微镜观察结果的照片，图5(B)是将图5(B)放大的照片。

图6是表示使用生物油墨制作的结构体的拉伸强度的测定结果的图表。

图7是表示使用生物油墨制作的结构体的杨氏模量(Modulus)的测定结果的图表。

具体实施方式

以下，详细说明用于实施本发明的方式。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。

〔生物油墨〕

本实施方式的生物油墨含有片段化细胞外基质成分。生物油墨是可通过生物打印形成结构体的油墨组合物。具体而言，生物油墨是包含生物相容性材料、在由打印机喷出的时间点为液态、在从打印机喷出后通过刺激或时间经过等而发生固化的油墨组合物。

本说明书中的“片段化细胞外基质成分”可以通过将细胞外基质成分片段化而得到。片段化细胞外基质成分可以分散在生物油墨中。认为在生物油墨中，片段化细胞外基质成分承担作为补强填料的作用。推测通过片段化细胞外基质成分相互缠绕，在结构体中形成填料网络，由此有助于最终的结构体的强度提高。不过，结构体的强度提高机理并不限定于此。

另外，通过使生物油墨含有片段化细胞外基质成分，生物油墨从打印机的顺畅喷出成为可能，并且能够提高通过生物打印得到的结构体的强度。

细胞外基质成分是由多个细胞外基质分子形成的细胞外基质分子的集合体。细胞外基质分子可以是在多细胞生物中存在于细胞外的物质。作为细胞外基质分子，只要不对细胞的生长和细胞集合体的形成产生不良影响，就可以使用任意的物质。作为细胞外基质分子，可举出胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、波连蛋白、弹性蛋白、细胞粘合素、巢蛋白、原纤蛋白和蛋白聚糖等，但并不限定于这些。作为细胞外基质成分，这些细胞外基质分子可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。

细胞外基质分子可以是上述细胞外基质分子的修饰体和突变体，也可以是化学合成肽等多肽。细胞外基质分子可以具有胶原蛋白特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复。在此，Gly表示甘氨酸残基，X和Y各自独立地表示任意的氨基酸残基。多个Gly-X-Y可以分别相同也可以不同。通过具有由Gly-X-Y表示的序列的重复，对分子链的配置的束缚变少。在具有由Gly-X-Y表示的序列的重复的细胞外基质分子中，由Gly-X-Y表示的序列的比例在全部氨基酸序列中可以为80％以上，优选为95％以上。另外，细胞外基质分子也可以是具有RGD序列的多肽。RGD序列是指由Arg-Gly-Asp(精氨酸残基-甘氨酸残基-天冬氨酸残基)表示的序列。作为包含由Gly-X-Y表示的序列和RGD序列的细胞外基质分子，可举出胶原蛋白、纤连蛋白、波连蛋白、层粘连蛋白、钙黏着蛋白等。

作为胶原蛋白，例如可举出纤维性胶原蛋白和非纤维性胶原蛋白。纤维性胶原蛋白是指成为胶原蛋白纤维的主成分的胶原蛋白，具体而言，可举出I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白等。作为非纤维性胶原蛋白，例如可举出IV型胶原蛋白。

作为蛋白聚糖，例如可举出硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸角质素蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖，但并不限定于这些。

细胞外基质成分从本发明的效果变得更为显著的角度出发，可以包含选自由胶原蛋白、层粘连蛋白及纤连蛋白组成的组中的至少1种，优选包含胶原蛋白。胶原蛋白优选为纤维性胶原蛋白，更优选为I型胶原蛋白。纤维性胶原蛋白可以使用市售的胶原蛋白，作为其具体例，可举出日本Ham株式会社制的猪皮来源I型胶原。

细胞外基质成分可以为动物来源的细胞外基质成分。作为成为细胞外基质成分的来源的动物种类，例如可举出人、猪、牛等，但并不限定于这些。细胞外基质成分可以使用一种动物来源的成分，也可以组合使用多种动物来源的成分。

在本说明书中，“片段化”是指使细胞外基质分子的集合体成为更小的尺寸。片段化可以在切断细胞外基质分子内的键的条件下进行，也可以在不切断细胞外基质分子内的键的条件下进行。经片段化的细胞外基质成分可以包含通过施加物理性的力对上述的细胞外基质成分进行解纤而得到的成分、即经解纤的细胞外基质成分(解纤细胞外基质成分)。解纤是片段化的一个方式，例如是在不切断细胞外基质分子内的键的条件下进行的。

作为将细胞外基质成分片段化的方法，没有特别限制。作为对细胞外基质成分进行解纤的方法，例如可以通过施加超声波式均化器、搅拌式均化器、及高压式均化器等物理性的力来对细胞外基质成分进行解纤。在使用搅拌式均化器的情况下，可以将细胞外基质成分直接均化，也可以在生理盐水等水性介质中进行均化。另外，通过调整进行均化的时间、次数等，也可以得到毫米尺寸、纳米尺寸的解纤细胞外基质成分。解纤细胞外基质成分也可以通过反复进行冷冻融解进行解纤而得到。

片段化细胞外基质成分可以至少一部分地包含经解纤的细胞外基质成分。另外，片段化细胞外基质成分也可以仅由经解纤的细胞外基质成分构成。即，片段化细胞外基质成分可以是经解纤的细胞外基质成分。经解纤的细胞外基质成分优选包含经解纤的胶原蛋白成分(解纤胶原蛋白成分)。解纤胶原蛋白成分优选维持胶原来源的三重螺旋结构。解纤胶原蛋白成分可以是部分地维持胶原来源的三重螺旋结构的成分。

作为片段化细胞外基质成分的形状，例如可举出纤维状。纤维状是指由丝状的胶原蛋白成分构成的形状、或者丝状的细胞外基质成分在分子间交联而构成的形状。片段化细胞外基质成分的至少一部分可以为纤维状。在纤维状的细胞外基质成分中包括将多个丝状细胞外基质分子集合而形成的细丝状物(细纤维)、细纤维进一步集合而形成的丝状物、将这些丝状物解纤而得到的物质等。在纤维状的细胞外基质成分中，RGD序列不被破坏而得以保存。

片段化细胞外基质成分的平均长度可以为100nm以上且400μm以下，可以为100nm以上且200μm以下，可以为1μm以上且100μm以下，可以为10μm以上且50μm以下，也可以为20μm以上且小于40μm。在一个实施方式中，片段化细胞外基质成分的平均长度可以为5μm以上且400μm以下，可以为10μm以上且400μm以下，可以为22μm以上且400μm以下，也可以为100μm以上且400μm以下。在另一实施方式中，片段化细胞外基质成分的平均长度可以为100μm以下，可以为50μm以下，从生物油墨中的成分更不易发生凝聚、3D打印机的喷出变得更为顺畅的角度出发，可以为小于40μm，可以为30μm以下，可以为15μm以下，可以为10μm以下，也可以为1μm以下。在另一实施方式中，片段化细胞外基质成分的平均长度可以为100nm以上，可以为1μm以上，可以为10μm以上，可以为20μm以上，也可以为30μm以上。片段化细胞外基质成分整体中，大部分的片段化细胞外基质成分的平均长度优选在上述数值范围内。具体而言，优选片段化细胞外基质成分整体中的95％的片段化细胞外基质成分的平均长度在上述数值范围内。片段化细胞外基质成分优选为平均长度在上述范围内的片段化胶原蛋白成分，更优选平均长度在上述范围内的解纤胶原蛋白成分。

片段化细胞外基质成分的平均直径可以为10nm以上且30μm以下，可以为30nm以上且30μm以下，可以为50nm以上且30μm以下，可以为100nm以上且30μm以下，可以为1μm以上且30μm以下，可以为2μm以上且30μm以下，可以为3μm以上且30μm以下，可以为4μm以上且30μm以下，也可以为5μm以上且30μm以下。片段化细胞外基质成分优选为平均直径在上述范围内的片段化胶原蛋白成分，更优选平均直径在上述范围内的解纤胶原蛋白成分。

片段化细胞外基质成分的平均长度及平均直径可以通过利用光学显微镜测定各片段化细胞外基质成分并进行图像分析来求出。在本说明书中，“平均长度”是指所测定的试样的长度方向的长度的平均值，“平均直径”是指所测定的试样的与长度方向正交的方向的长度的平均值。

片段化细胞外基质成分的颗粒尺寸可以小于40μm。颗粒尺寸小于40μm的片段化细胞外基质成分是可通过孔径为40μm的过滤器的片段化细胞外基质成分。在片段化细胞外基质成分的颗粒尺寸小于40μm的情况下，生物油墨中的成分更不易发生凝聚且3D打印机的喷出变得更为顺畅。

片段化细胞外基质成分的至少一部分可以在分子间或分子内交联。片段化细胞外基质成分可以在构成片段化细胞外基质成分的分子内交联，也可以在构成片段化细胞外基质成分的分子间交联。

生物油墨中的片段化细胞外基质成分的含量可以根据所形成的结构体的形状等适当设定。片段化细胞外基质成分的含量以生物油墨的总体积为基准，从由生物打印形成的结构体的强度进一步提高的角度出发，可以为1.0mg/mL以上、3.0mg/mL以上、5.0mg/mL以上、10.0mg/mL以上、12.0mg/mL以上、15.0mg/mL以上、或18.0mg/mL以上，且可以为45.0mg/mL以下、40.0mg/mL以下、35.0mg/mL以下、30.0mg/mL以下、或25.0mg/mL以下。片段化细胞外基质成分的含量以生物油墨的总体积为基准，从由生物打印形成的结构体的强度进一步提高的角度出发，可以为5mg/mL以上且45mg/mL以下、5mg/mL以上且40mg/mL以下、5mg/mL以上且35mg/mL以下、5mg/mL以上且30mg/mL以下、5mg/mL以上且25mg/mL以下、10mg/mL以上且45mg/mL以下、10mg/mL以上且40mg/mL以下、10mg/mL以上且35mg/mL以下、10mg/mL以上且30mg/mL以下、10mg/mL以上且25mg/mL以下、15mg/mL以上且45mg/mL以下、15mg/mL以上且40mg/mL以下、15mg/mL以上且35mg/mL以下、15mg/mL以上且30mg/mL以下、或15mg/mL以上且25mg/mL以下。

生物油墨可以进一步包含结构体形成材料。结构体形成材料是可通过生物打印形成结构体的材料。结构体形成材料不包含属于上述片段化细胞外基质成分的成分。结构体形成材料可以溶解或分散于生物油墨中。结构体形成材料可以使用市售的生物油墨材料。结构体形成材料的种类可以根据结构体的形状、用途等来适当选择。结构体形成材料例如可以是细胞外基质成分。作为细胞外基质成分，可以是上述例示过的成分。

作为结构体形成材料，具体而言可举出胶原蛋白、纤维蛋白、壳聚糖、纳米纤维素、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、羟基磷灰石(HA)、β-磷酸三钙(β-TCP)、海藻酸、甲基丙烯酰化明胶等。

结构体形成材料的含量可以根据结构体的形状、用途等来适当设定。例如以生物油墨总质量为基准，结构体形成材料的含量可以为0.1质量％以上、0.2质量％以上、或0.5质量％以上，且可以为10质量％以下、5质量％以下、或2质量％以下。

生物油墨可以进一步包含水性介质。作为水性介质，例如可举出磷酸缓冲生理盐水(PBS)等生理盐水、灭菌水、Good’s缓冲剂等pH缓冲液。

生物油墨可以包含细胞，也可以不包含细胞。生物油墨可以进一步包含除上述成分以外的成分(其他成分)。

生物油墨的pH、粘度等各种条件可以根据生物油墨的组成、结构体的用途、所使用的打印机等来适当设定。生物油墨的pH例如可以为5～8.0、6.0～8.0或6.5～7.5。

本实施方式的生物油墨例如可以通过包含将片段化细胞外基质成分与结构体形成材料在水性介质中混合的工序的方法来得到。

〔结构体〕

本实施方式的结构体是可通过印刷上述生物油墨而得到的上述生物油墨的印刷物。

本实施方式的结构体可以是不包含细胞的结构体，也可以是包含细胞的结构体(细胞结构体)。在本说明书中，“细胞结构体”是指经由细胞外基质成分三维地配置有细胞的细胞的集合体(块状的细胞团)，是通过细胞培养而人工制作的集合体。细胞结构体可以通过印刷包含细胞的生物油墨来得到。

细胞没有特别限定，例如可以是人、猴、狗、猫、兔、猪、牛、小鼠、大鼠等哺乳类动物来源的细胞。细胞的来源部位也没有特别限定，可以是骨、肌肉、内脏、神经、脑、骨、皮肤、血液等来源的体细胞，也可以是生殖细胞。此外，细胞可以是干细胞，另外也可以是原代培养细胞、传代培养细胞和细胞株细胞等培养细胞。

结构体的形状没有特别限制，例如可举出片状、纤维状、球体状、大致球体状、椭圆体状、大致椭圆体状、半球状、大致半球状、半圆状、大致半圆状、长方体状、大致长方体状等。结构体可以与支承体粘接，也可以不与支承体粘接。

本实施方式的结构体可以通过包含印刷上述生物油墨的步骤和使所印刷的生物油墨固化的步骤的方法来制造。在所述方法中，既可以一边印刷生物油墨一边进行固化，也可以在通过印刷生物油墨而形成期望形状的结构体的前体之后，使结构体的前体固化来形成结构体。

印刷生物油墨的方法可以根据结构体的用途、生物油墨的组成等来适当选择。作为印刷生物油墨的方法的具体例，例如可举出喷墨法、材料挤出法、激光转印法、光造型法等。另外，也可以不使用特定的打印机装置，而通过注射器等手动进行印刷。

生物打印机可以是CELLINK AB公司的3D生物打印机的INKREDIBLE(商标)、INKREDIBLE+(商标)或BIO X(商标)等市售的任意型号、或具备马达、打印头、打印基板、打印结构、墨盒、注射器、平台、激光及控制装置等标准构成要素的任意的现有的机器人型生物打印机中的任一种。

印刷时的条件(例如温度、打印压力、喷嘴等)可以根据打印机、结构体的形状以及用途等来适当设定。印刷时的温度例如可以为4℃以上，且可以为40℃以下。印刷时的打印压力例如可以为1kPa以上，且可以为200kPa以下。

使所印刷的生物油墨固化的方法可以根据生物油墨的组成等来适当选择。作为使所印刷的生物油墨固化的方法，可以使用通过光、热等的刺激、时间经过、与液态介质等的接触来使其固化的方法。

所印刷的生物油墨可以通过从打印机等向液态介质喷出而在液态介质中固化。固化时的液态介质可以根据生物油墨的组成等来适当设定。液态介质的pH例如可以为5～8。

作为固化时的液态介质的一例，可举出分散有颗粒的液态介质(以下称为“颗粒分散介质”)。在固化时的液态介质为颗粒分散介质的情况下，由于所喷出的生物油墨或通过喷出形成的结构体的前体的形状因液态介质中的颗粒而得以保持，因此具有高强度的结构体的形成变得更容易。

颗粒分散介质中的颗粒可以包含生物胶。生物胶是指微生物或植物等生物体所产生的多糖类。作为生物胶，例如可举出微生物生物胶或植物性生物胶。作为微生物生物胶，例如可举出结冷胶、黄原胶、Diutan Gum、韦兰胶以及普鲁兰多糖。作为植物性生物胶，可举出金合欢树胶、他拉胶、葡甘聚糖、果胶、刺槐豆胶、瓜尔胶、卡拉胶和黄蓍胶。生物胶从特别适合形成具有高强度的结构体的角度出发，可以是结冷胶。

颗粒分散介质中的颗粒的粒径例如可以为10μm以上、20μm以上、30μm以上、或40μm以上，且可以为100μm以下、80μm以下、或60μm以下。粒径在上述范围内时，具有高强度的结构体的形成变得更容易。粒径可以通过使用了共聚焦激光扫描型显微镜(例如FV3000)的图像来测定。具体而言，可以使用共聚焦激光扫描型显微镜进行颗粒分散介质的图像的获得以及基于ImageJ的图像解析，通过手动计算出粒径来测定粒径。更详细的试验条件如后述的实施例所示。

颗粒分散介质中的颗粒的粒径可以通过在颗粒分散介质中添加柠檬酸，并且调整其添加量来控制。在颗粒分散介质含有柠檬酸的情况下，以颗粒分散介质总量为基准，柠檬酸的含量可以为超过0mol/L、0.10mol/L以上、0.20mol/L以上、或0.25mol/L以上，且可以为1.0mol/L以下、0.80mol/L以下、0.60mol/L以下、或0.40mol/L以下。

含有生物胶的颗粒分散介质例如可以通过以下方法得到。使生物胶溶解于液态介质(例如磷酸缓冲生理盐水)而得到生物胶溶液。生物胶的浓度可以根据生物胶的种类等来适当设定。在使用结冷胶作为生物胶的情况下，相对于生物胶溶液总量，生物胶的浓度例如可以为0.3～0.7质量％。通过将生物胶溶液静置规定时间等、对各物质进行凝胶化所需的规定处理来使其凝胶化，得到生物胶凝胶。通过将生物胶凝胶均质化，进行颗粒化，得到生物胶的颗粒溶液。在生物胶的颗粒溶液中加入柠檬酸缓冲液，进一步进行均质化，根据需要进行用于脱气的离心，得到颗粒分散介质。

作为固化时的液态介质的另一例，可举出含有有机溶剂的液体。在生物油墨含有胶原蛋白作为结构体形成材料的情况下，作为固化时的液态介质，例如也可以使用乙腈与水的混合物。

在本实施方式的结构体中，直径、长度和/或宽度例如可以为0.1mm以上，且可以为50cm以下。

本实施方式的结构体的杨氏模量可以为0.1MPa以上、0.2MPa以上、或0.3MPa以上，且可以为1.0MPa以下、0.6MPa以下、或0.4MPa以下。

结构体的杨氏模量可以使用小型台式试验机EZ-test(株式会社岛津制作所制)进行测定。就片状结构体而言，准备30mm×6mm×0.6mm的尺寸的片状结构体，通过试验机的测力传感器，在温度为25℃、拉伸速度为10.0mm/min、夹具间初始距离为15mm的条件下对所述结构体进行拉伸试验，得到应力应变线(Stress-Strain曲线)。可根据所得到的应力应变线中的应力上升初始的弹性变形区域的斜率来计算出杨氏模量(MPa)。

本实施方式的结构体例如可优选用作用于细胞培养或组织形成的支架材料、实验动物的替代品或移植材料。

实施例

以下，基于试验例更具体地说明本发明。但是，本发明并不限定于以下的试验例。

实验例1：结冷胶(GG)浴的制作

<材料>

·GG powder：结冷胶(GG)粉末(商品名：KELCOGEL AFT；三晶株式会社制)

<步骤>

将GG powder以0.5质量％溶解于PBS，得到GG溶液。使GG溶液在室温条件下凝胶化6h，得到GG凝胶。使用均化器，在功率grade为6、时间为6分钟的条件下，将GG凝胶均质化，进行颗粒化。向由此得到的10mL的GG颗粒溶液中加入4.2mL的柠檬酸缓冲液(浓度为0.5M、1M、1.5M或2M)。此外，将添加有柠檬酸缓冲液的GG颗粒溶液在与制作后述的CMF时相同的均化器、相同的功率(grade为6)、2分钟的条件下进一步均质化，进一步颗粒化。然后，通过离心进行脱气，制作GG-TSC颗粒浴(颗粒分散介质)。

实验例2：GG-TSC颗粒浴中的颗粒的粒径观察

<观察方法>

用共聚焦激光扫描型显微镜(FV3000)观察GG-TSC颗粒浴，通过基于Image J的图像解析手动计算出粒径(每1个条件n＝50)。图1和图2表示颗粒的观察结果及粒径的测定结果。

<结果>

如图1和图2所示，通过添加柠檬酸，GG-TSC颗粒浴中的颗粒的粒径减少至20～50μm的范围。

实验例3：生物油墨的制备及纤维状结构体的打印

<材料>

·I型胶原蛋白粉末：(株式会社Nippi、ASC-1-100)

<步骤>

胶原蛋白溶液的制备

将I型胶原蛋白粉末以胶原蛋白的含量达到1质量％的方式悬浮于10×PBS中，在与制作CMF时相同的均化器、相同的功率(grade为6)、相同的时间(6min)下进行均质化。接着，在10000rpm、10分钟的条件下进行离心，除去上清液，然后在加入1×PBS后，在4℃下静置1天，由此得到胶原蛋白溶液。

含有片段化胶原蛋白成分(CMF)的生物油墨的制备

将50mg的I型胶原蛋白粉末悬浮于5mL的PBS中，使用均化器在室温下进行6分钟均质化后，在10000rpm、10分钟、室温的条件下进行离心分离，得到含有沉淀物形式的片段化胶原蛋白成分(CMF)的CMF溶液。从所述溶液中除去上清液，加入2mL的1质量％的上述胶原蛋白溶液。然后，均质化1分钟，真空除去气泡，由此制备含有胶原蛋白和片段化胶原蛋白成分的生物油墨。生物油墨中的CMF的最终浓度为40mg/mL。

片段化胶原蛋白成分的平均长度(测定的试样的长度方向的长度的平均值)为35μm。

<纤维状(丝状)结构体的制作>

利用具备20G的针的注射器将上述生物油墨喷出(丝状)到60:40＝乙腈(ACN)：水的溶剂中，然后将溶剂替换为50％EtOH，将喷出的生物油墨静置1小时。然后，将溶剂替换为含有0.2质量％GA(戊二醛)的50％乙醇，将喷出的生物油墨静置12小时。用PBS洗涤由此得到的丝状的结构体，进行基于EZ-test的拉伸强度的试验。将结果示于图3。图3中示出结果的试验(纤维结构体)的试验条件如下。

·纤维直径：600μm

·拉伸速度：10.0mm/min

·夹具间初始距离：30mm

根据图3，使用含有CMF的生物油墨制作的实施例的结构体与使用不含CMF的生物油墨制作的比较例的结构体相比，显示出显著高的拉伸强度。由应力应变线中的应力上升初始的斜率计算出杨氏模量(MPa)，结果使用含有CMF的生物油墨制作的实施例的结构体的杨氏模量(Modulus)为1～2MPa。另一方面，使用不含CMF的生物油墨制作的比较例的结构体的杨氏模量为0.3～0.8MPa。显示了通过使用含有CMF的生物油墨，结构体的强度提高。

实验例4：CMF的过滤和观察(PBS中)

与实验例3同样地，将50mg的I型胶原蛋白粉末悬浮于5mL的PBS中，使用均化器在室温下进行6分钟均质化，准备CMF的PBS悬浮液。将CMF的PBS悬浮液用细胞滤网(CellStrainer)40μm过滤，在PBS中进行显微镜观察。将显微镜观察结果示于图4。经过滤的CMF相对于冷冻干燥后的质量的收率为85％。

实验例5：经过滤的CMF的观察(生物油墨中)

将实验例4中制备的经过滤的CMF添加到1质量％胶原蛋白溶液中，制备生物油墨(生物油墨制备步骤除了使用经过滤的CMF以外，与实验例3是同样的)。然后，进行所得到的生物油墨的显微镜观察。

如图5所示，在生物油墨中，CMF良好地分散在胶原蛋白溶液中。在生物油墨中，未确认到CMF的大的凝聚。这表示所得到的生物油墨能够更适用于打印。

推测具有微米级的长度的CMF相互缠绕，由此有助于机械强度的提高。

实验例6：含有过滤CMF的生物油墨的打印

设计片状结构体(30mm×6mm×0.6mm)。将含CMF的生物油墨或实验例5的含CMF的生物油墨(CMF浓度为10或20mg/mL)喷出至GG-0.3M TSC颗粒浴中，印刷设计的片状结构体。然后，将印刷的片状结构体静置1小时。详细的印刷条件如下所述。

(印刷条件)

浴：GG-0.3M TSC颗粒浴；

油墨：含CMF的生物油墨；

CMF浓度：1质量％在胶原蛋白溶液中为10mg/mL或20mg/mL；

喷嘴：25G(250μm)；

气动压力：20kPa；

移动速度：25mm/s；

层数：6层；

层高：0.1mm；

填充：100％；

填充纹理：直线45°；

打印装置：BIO X(Cellink公司)

PBS中的含CMF的生物油墨不会使针堵塞，能够持续挤出。所印刷的结构体具有明确的轮廓，近似于所设计的模型。

与使用纤维状结构体的拉伸试验同样地，用戊二醛将印刷生物油墨(含CMF或不含CMF的生物油墨)得到的片状结构体固定。具体而言，将得到的片状结构体中的液态介质替换为50％EtOH。然后，将50％EtOH替换为含有0.2质量％GA(戊二醛)的50％乙醇，将片状结构体在37℃下静置12小时。然后，进行2次通过将片状结构体在20mL的PBS中浸渍3小时的溶剂替换。由此得到试验用的样品。

使用Ez-test对试验用的样品实施拉伸试验。拉伸试验的结果如图6所示。图6中示出结果的试验(片结构体)的试验条件如下。

·片材直径：30mm×6mm×0.6mm

·拉伸速度：10.0mm/min

·夹具间初始距离：15mm

使用含有CMF的生物油墨制作的结构体与使用不含CMF的生物油墨制作的结构体相比，拉伸强度提高。就使用CMF含量为20mg/mL的生物油墨制作的结构体而言，与使用不含CMF的生物油墨制作的结构体相比，确认到拉伸强度的提高。

实验例7：CMF/胶原蛋白溶液的浓度优化

与实验例5同样地进行胶原蛋白的含量(除外CMF部分)以生物油墨总质量为基准为1质量％、2质量％或3质量％、CMF的含量为0mg/mL、10mg/L或20mg/mL的生物油墨及片状结构体的制作、以及试验用的样品的制作。

对于试验用样品，与实验例3及实验例6同样地实施拉伸试验。图7中表示根据应力应变线中的应力上升初始的斜率计算出杨氏模量(MPa)的结果。图7中示出结果的试验(片状结构体)的试验条件如下。

·片材直径：30mm×6mm×0.6mm

·拉伸速度：10.0mm/min

·夹具间初始距离：15mm

通过提高油墨浓度(生物油墨中的胶原蛋白含量)，有得到高杨氏模量的倾向。基于CMF的杨氏模量的提高在油墨浓度为2质量％时最为显著。油墨浓度为2质量％且含有10mg/mL的CMF的条件特别优异。

Claims (8)

1.一种生物油墨，其含有片段化细胞外基质成分。

2.根据权利要求1所述的生物油墨，其中，所述片段化细胞外基质成分包含片段化胶原蛋白成分。

3.根据权利要求1或2所述的生物油墨，其进一步包含结构体形成材料。

4.根据权利要求3所述的生物油墨，其中，所述结构体形成材料包含细胞外基质成分。

5.根据权利要求4所述的生物油墨，其中，所述细胞外基质成分包含胶原蛋白。

6.根据权利要求1或2所述的生物油墨，其中，以所述生物油墨的总量为基准，所述片段化细胞外基质成分的含量为5mg/mL以上且30mg/mL以下。

7.根据权利要求1或2所述的生物油墨，其中，所述片段化细胞外基质成分的颗粒尺寸小于40μm。

8.一种结构体的制造方法，其包含印刷权利要求1或2所述的生物油墨的步骤；以及使所印刷的生物油墨固化的步骤。