CN118879871B

CN118879871B - 一种肾癌预后标志物tymp及tymp抑制剂的应用

Info

Publication number: CN118879871B
Application number: CN202411359396.9A
Authority: CN
Inventors: 黄燕; 田硕; 王闯; 魏文杰; 董宇豪; 张旭
Original assignee: Third Medical Center of PLA General Hospital
Current assignee: Third Medical Center of PLA General Hospital
Priority date: 2024-09-27
Filing date: 2024-09-27
Publication date: 2025-05-30
Anticipated expiration: 2044-09-27
Also published as: CN118879871A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肾癌预后标志物TYMP及TYMP抑制剂的应用。本发明发现了肾癌预后标志物TYMP。发明开创性地探索以FDA批准药物TAS‑102为载体，进行老药新用，发现其靶向的胸苷代谢在调控肾癌铁死亡和激活CD8+T细胞抗肿瘤免疫中的重要作用，丰富了对胸苷磷酸化酶TYMP抑制剂TAS‑102作用机理的认识，本发明首次发现TPI和TAS‑102能有效抑制肾癌小鼠模型的体内生长能力，在临床上可作为潜在治疗肾癌的药物，具有重要的科学意义和临床应用价值。本发明有助于对临床难治性肾癌提供新的治疗靶点和治疗药物。

Description

一种肾癌预后标志物TYMP及TYMP抑制剂的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肾癌预后标志物TYMP及TYMP抑制剂的应用。

背景技术

盐酸替匹嘧啶(Tipiracil/TPI)是TYMP的特异性酶活抑制剂，与5-FU类似物曲氟尿苷(Trifluridine/TFD)组合成的氟尿嘧啶类药物TAS-102，已被FDA 批准用于转移性结直肠癌和胃癌的三线治疗。但是TAS-102在肾癌发生发展中的功能和作用机制则完全不知。

现有研究主要围绕TAS-102在结直肠癌和胃癌中的治疗应用，在肾癌中的功能未见报道；TAS-102目前已知的主要机理是类似化疗药，抑制血管形成，促进细胞凋亡，并未报道其在促进铁死亡和肿瘤免疫中的作用。

HIF-VEGF通路的异常激活是促进肾透明细胞癌发生发展的关键事件，临床上针对其开发的TKI 靶向药取得了显著疗效。近年来，肾癌作为免疫细胞浸润程度较高的肿瘤PD-1/PD-L1 免疫疗法联合靶向治疗显著提高了患者的总生存率，但仍然对40%左右的晚期转移患者无效，并且初始治疗有效的患者大部分会出现继发耐药。因此，寻找肾透明细胞癌新的干预靶点和治疗策略仍然是目前该领域亟待解决和突破的瓶颈。

发明内容

本发明首先提供了一种肾癌预后标志物，所述标志物为TYMP。

在某些实施例中，所述肾癌为肾透明细胞癌。

本发明还提供了一种治疗肾癌的组合物，所述组合物包含TYMP抑制剂。

在某些实施例中，所述肾癌为肾透明细胞癌。

在某些实施例中，所述TYMP抑制剂包含敲低TYMP的shRNA。

在某些实施例中，所述shRNA的序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示。

在某些实施例中，所述SEQ ID NO.1：GCCTCCATTCTCAGTAAGAAA。

在某些实施例中，所述SEQ ID NO.2:GCTGGAGTCTATTCCTGGATT。

在某些实施例中，所述SEQ ID NO.3:CCTTGGATAAGCTGGAGTCTA。

在某些实施例中，所述TYMP抑制剂包含TPI和TAS-102。

本发明还提供了一种诊断肾癌预后的试剂盒，所述试剂盒包含检测TYMP的试剂；

在某些实施例中，所述试剂包含引物；

在某些实施例中，所述引物包含SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.5。

在某些实施例中，所述SEQ ID NO.4：GGTGTGGGTGACAAGGTCAG；

在某些实施例中，所述SEQ ID NO.5：GCAGCACTTGCATCTGCTC。

本发明最后提供了一种TYMP抑制剂在制备治疗肾癌的药物中的应用。

在某些实施例中，所述TYMP抑制剂包含TPI、TAS-102和敲低TYMP的shRNA。

本发明与现有技术相比，至少具有如下有益效果：

本发明发现了肾癌预后标志物TYMP。本发明开创性地探索以FDA批准药物TAS-102为载体，进行老药新用，发现其靶向的胸苷代谢在调控肾癌铁死亡和激活CD8+ T细胞抗肿瘤免疫中的重要作用，丰富了对胸苷磷酸化酶TYMP抑制剂TAS-102作用机理的认识，本发明首次发现TPI和TAS-102能有效抑制肾癌小鼠模型的体内生长能力，在临床上可作为潜在治疗肾癌的药物，具有重要的科学意义和临床应用价值。本发明有助于对临床难治性肾癌提供新的治疗靶点和治疗药物。

附图说明

图1（a）为WB检测4对肾癌组织中TYMP的蛋白表达；

图1（b）为对肾癌组织芯片进行TYMP免疫组化染色并对TYMP的组织评分进行统计；

图1（c）为根据TYMP的组织评分进行预后分析；

图2（a）为WB和qPCR分别检测TYMP敲低效果；

图2（b）为敲低TYMP抑制肾癌细胞增殖能力；

图2（c）为敲低TYMP抑制肾癌细胞迁移能力；

图3（a）为WB和qPCR分别检测敲低TYMP后铁死亡相关蛋白表达；

图3（b）为荧光探针检测敲低TYMP后肾癌细胞内Fe2+浓度；

图3（c）为流式检测敲低TYMP后Lipid-ROS量的变化；

图4（a）为TYMP抑制剂TPI/TAS-102处理肾癌细胞后检测生长速度；

图4（b）为透射电镜检测TYMP抑制剂TPI/TAS-102处理肾癌细胞后线粒体形态变化；

图4（c）为WB检测TYMP抑制剂TPI/TAS-102处理肾癌细胞后铁死亡相关蛋白表达；

图5（a）为针对TYMP敲低或TYMP抑制剂TPI/TAS-102处理的肾癌细胞，利用线粒体荧光指示剂mito-tracker进行染色后用共聚焦采集荧光图像；

图5（b）为针对TYMP敲低或TYMP抑制剂TPI/TAS-102处理的肾癌细胞，利用线粒体荧光指示剂mito-tracker和mtDNA染料Picogreen进行共染色后用共聚焦采集荧光图像；

图6（a）为qPCR检测TYMP敲低组、TYMP敲低联合ddC处理组中干扰素相关因子的表达；

图6（b）为qPCR检测TAS-102处理组、TAS-102联合ddC处理组中干扰素相关因子的表达。（备注：ddC处理是为了去除线粒体DNA，减少炎症刺激信号）；

图7（a）为WB检测鼠源Renca细胞中Tymp的敲低和对铁死亡发生的效果；

图7（b）为TYMP敲低抑制Renca细胞的肾脏原位成瘤能力；

图7（c）为针对TYMP敲低的小鼠肿瘤组织进行CD4和CD8免疫组化染色；

图8（a）为TAS-102腹腔给药抑制Renca细胞的肾脏原位成瘤能力；

图8（b）为针对TAS-102给药组的小鼠肿瘤组织进行CD4和CD8免疫组化染色。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

实施例1：肾癌标志物TYMP的发现

参见图1（a）、图1（b）和图1（c）的结果，WB和免疫组化染色分析，表明TYMP在肾癌组织中高表达，并且可以作为肾癌的一个独立预后因子。

具体实施步骤：

1.样本来源：

（1）免疫组化：2016年至2023年期间来我院就诊且手术的肾部分切或根治性肾切除的患者，并通过病理验证为肾透明细胞癌的肿瘤组织样本229例以及正常肾组织样本142例。

（2）2022年12月至2023年9月之间来我科室行根治性肾切除并明确病理诊断为肾透明细胞癌患者的病灶以及配对的正常肾组织样本4对。新鲜组织离体后10-15分钟内放入液氮，低温分离后部分用于蛋白提取，部分进行福尔马林浸泡24小时，行脱水和石蜡包埋流程，构建石蜡组织蜡块以及微阵列芯片。第一部分样本构建组织微阵列芯片后，进行免疫组化染色实验，分析TYMP蛋白的定位情况以及结合临床信息明确其表达差异性意义；第二部分样本用于Western Blot实验验证蛋白表达情况。

2.图1（a）：Western blot分析肿瘤和癌旁TYMP的表达差异；图1（b）-图1（c）：免疫组化分析TYMP的染色丰度，按照染色强度结合阳性细胞数乘积的计算方式进行评分；结合患者临床随访信息，统计预后差异和临床特征的相关性。

实施例2 shRNA敲低TYMP

参见图2（a）、图2（b）、图2（c）、图3（a）、图3（b）和图3（c）的结果，shRNA敲低TYMP后抑制肾癌细胞生长和迁移能力；shRNA敲低TYMP后促进肾癌细胞铁死亡。

具体实施步骤：

1.样本来源：对肾癌常见细胞系和以及正常肾小管上皮细胞293TN进行功能以及行为学验证，均购买自协和细胞库，均经STR鉴定。

2.图2（a）：在高表达的两种细胞系中干涉TYMP，Western blot和qPCR结果验证干涉TYMP的效果；图2（b）：转染shTYMP-GFP质粒，构建稳定干涉细胞系，72h后观察细胞的增殖情况；图2（c）：取1万个稳定干涉TYMP的细胞，分别铺板到transwell上层小室，添加无血清培养基，24h后观察下层细胞数，结晶紫染色后统计细胞数。

3.图3（a）：Western blot和qPCR结果分析干涉TYMP后铁死亡相关关键分子的表达情况；图3（b）：取2000个对照组和处理组的细胞，铺在共聚焦培养皿，24h后加入Fe²⁺染色试剂和hoechst，孵育30min后，超高分辨显微镜下观察亚铁离子形态；图3（c）：选10000个对照组和处理组细胞，消化后PBS重悬，并加入Lipid-ROS检测试剂，流式分析ROS比例。

实施例3 细胞实验

参见图4（a）、图4（b）、图4（c）的结果，TPI和TAS-102处理后，显著抑制肾癌细胞生长并激活铁死亡通路。

具体实施步骤：

1.添加TYMP的靶向抑制剂TPI和FDA批准的药物TAS-102，明确处理合适浓度后开展后续细胞实验。

2.图4（a）：在过表达PLKO.1-GFP的肾癌细胞中，分别加入TPI（20uM for 48h）和TAS-102（10uM for 48h）药物，观察细胞增殖情况；图4（b）：提取细胞蛋白后，验证铁死亡相关蛋白的表达情况；取1×10⁷个细胞，分别用TPI和TAS-102处理，随后电镜下观察线粒体形态。

实施例4共聚焦采集荧光图像结果

参见图5（a）和图5（b）的结果，shRNA敲低TYMP或TYMP抑制剂TPI/TAS-102处理后，导致线粒体形态异常并促进线粒体DNA释放到胞浆。

具体实施步骤：

图5（a）：稳定干涉TYMP或添加TPI和TAS-102后，细胞内添加mitotracker-GFP和hoechst，孵育30分钟后，超高分辨显微镜下观察细胞内线粒体形态；图5（b）：稳定干涉TYMP或添加TPI和TAS-102后，细胞内添加mitotracker-RFP、Picogreen和hoechst，孵育30分钟后，超高分辨显微镜下观察细胞内的线粒体形态、线粒体DNA分布情况。

实施例5 IFN炎症信号通路分析

参见图6（a）和图6（b）的结果，shRNA敲低TYMP或TYMP抑制剂TAS-102处理后激活IFN炎症信号通路。

具体实施步骤：

图6（a）和图6（b）：干涉TYMP或添加TAS-102后，通过qPCR实验明确常见I型干扰素通路的激活情况，进一步证明细胞浆线粒体DNA刺激炎症信号表型，添加ddC清除线粒体DNA，并通过qPCR实验证明炎症信号变化情况。

实施例6 动物实验

建立小鼠Renca肾脏原位成瘤模型，参见图7（a）、图7（b）、图7（c）、图8（a）和图8（b）的结果，shRNA敲低TYMP显著抑制体内原位成瘤能力；免疫组化染色表明敲低TYMP促进了肿瘤微环境中CD4+和CD8+ T细胞募集；TAS-102腹腔注射给药后，联合用药组能显著抑制体内原位成瘤能力；免疫组化染色表明TAS-102促进了肿瘤微环境中CD4+和CD8+ T细胞募集。

具体实施步骤：

1.动物实验基本流程：选取4周龄BALB/C雌性小鼠作为实验对象。小鼠采取原位成瘤的方式构建肾癌模型，随机分成两组，对照组和干涉组每组4只小鼠。Renca细胞培养至1×10⁷后，与基质胶1:1比例混匀，小鼠异氟烷麻醉后采用胰岛素针注射原位接种200ul的肿瘤细胞，建模完成后，观察小鼠状态，在第24天后将小鼠用安乐死处死。取原位肿瘤拍照并称重。固定组织后，采用免疫组化的步骤对小鼠组织进行染色。药物给药方案：成瘤3天后，TAS-102按照3mg/kg的给药剂量，每两天腹腔注射一次，对照组同频率注射同体积PBS。

2.图7（a）：Western blot实验分析renca细胞中干涉TYMP的效率和铁死亡相关蛋白的改变情况；图7（b）：在BALB/C小鼠中注射干涉TYMP或对照组的renca细胞，完成建模后24天取材，分析肿瘤大小并称重记录；图7（c）：免疫组化染色分析干涉TYMP后的CD4和CD8阳性T细胞的募集情况。

3.图8（a）：BALB/C小鼠成瘤后第三天注射TAS-102，24天后取材，观察肿瘤大小并称重记录；图8（b）：免疫组化染色分析加入TAS-102后小鼠肿瘤中CD4和CD8阳性的T细胞募集情况。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种TYMP抑制剂在制备促进肾透明细胞癌细胞铁死亡的药物中的应用，其特征在于，所述TYMP抑制剂由TPI和TAS-102组成。