CN118874567A - 一种集成化的微波-微流体芯片及其制备方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及循环肿瘤细胞检测技术领域，提供了一种集成化的微波‑微流体芯片及其制备方法和检测方法，包括自下而上设置的铜基玻璃载玻片、微波传感器和微流控芯片；所述微波传感器和微流控芯片上均设置有蛋白标记区域，且微波传感器和微流控芯片上的蛋白标记区域对齐，微流控芯片上设置有微流控通道，且蛋白标记区域的中轴线与微流控通道的中轴线对齐；所述微流控芯片和微波传感器的蛋白标记区域上均标记有特异性抗体，所述特异性抗体用于捕捉血液样本中的生物标志物。实现了无标记、无侵入性检测循环肿瘤细胞，避免了传统方法的需要精密仪器、耗时长、成本高、检测单一的缺点。

Description

一种集成化的微波-微流体芯片及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明涉及循环肿瘤细胞检测技术领域，特别涉及一种集成化的微波-微流体芯片及其制备方法和检测方法。

背景技术

本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术，并不必然构成现有技术。

循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)是一种在体内循环的肿瘤细胞，它们脱离了原发肿瘤并进入了血液或淋巴系统。虽然多数的脱落细胞可以发生凋亡或者被吞噬，但也存在少数CTCs传播到身体的其他部位，并形成新的肿瘤，CTCs是肿瘤转移的重要因素之一。在癌症早期阶段，CTC检测可以帮助医生在癌症早期阶段发现循环肿瘤细胞的存在，从而提高治疗成功的机会，减少患者的死亡率。此外，检测CTCs有助于确定癌症的类型、分期和严重程度，从而制定更精确的治疗计划。在癌症治疗过程中，监测CTCs的数量和性质可以帮助医生评估治疗的效果。因此，准确、快速地检测循环肿瘤细胞的数量有助于进行癌症早期筛查和治疗。

微流控技术是一种能将样本分离、富集、反应、检测等功能集成在一个芯片，实现对微量样本进行自动化检测的技术，具有体积小、分析速度快、自动化程度高、成本低和所需要本少的优势。在医学检测中，能够有效避免传统方法耗时长、有污染等问题。但是，传统的微流控芯片依赖于精密设备，如荧光显微镜、荧光分光光度计或者酶标仪等仪器。

目前的CTCs检测技术常采用微流控技术与免疫荧光染色法结合，免疫荧光染色法主要包括以下步骤：样本采集、细胞分离、固定细胞、多次洗涤和图像分析。其原理是使用荧光标记的抗体与CTCs上特定的蛋白质发生特异性的结合，然后采用荧光显微镜、流式细胞仪或酶标仪等仪器进行CTCs的检测和观察。免疫荧光染色检测CTCs是一种高度特异和敏感的方法，但存在样本处理复杂、成本高、灵敏度有限、自动化程度低等缺点，这在处理大量样本时会面临困难，具体地：

(1)分离困难：CTCs在血液中的含量非常稀少，通常每毫升血液只有极少数CTCs，且存在与红细胞和白细胞的混合；免疫荧光检测通常需要进行离心分离，将血浆、白细胞和红细胞分离，但这个过程繁琐且耗时；

(2)荧光标记损伤：免疫荧光检测法使用标记有荧光基团的抗体与CTCs上的蛋白质特异性结合；然而，CTCs具有稀有性，荧光标记可能会对CTCs造成不可逆的损伤，这可能影响对CTCs的后续分析；

(3)高成本和便携性不足：图像分析通常需要使用昂贵的设备，如流式细胞仪或荧光显微镜，这增加了成本；此外，这些设备通常不易携带，需要专业技术人员操作，适用性有限，不适用于即时检测，而且报告通常需要1-2天才能出来；此外，在观测过程中，荧光基团的光强随着时间的推移会逐渐减弱，需要及时观察和分析；

(4)低自动化程度和人为误差：样本采集和处理等步骤通常需要手动操作，自动化程度较低；这可能导致人为误差的引入，影响检测的准确性。

(5)检测单一：现有微波检测技术仅能实现单一区域的传感检测，双传感及多区域检测容易造成相互影响，导致传感准确性下降。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种集成化的微波-微流体芯片及其制备方法和检测方法，通过将微波检测技术和微流控技术相结合，实现无标记、无侵入性检测循环肿瘤细胞，避免了传统方法的需要精密仪器、耗时长、成本高、检测单一的缺点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种集成化的微波-微流体芯片。

一种集成化的微波-微流体芯片，包括自下而上设置的铜基玻璃载玻片、微波传感器和微流控芯片；

所述微波传感器和微流控芯片上均设置有蛋白标记区域，且微波传感器和微流控芯片上的蛋白标记区域对齐，微流控芯片上设置有微流控通道，且蛋白标记区域的中轴线与微流控通道的中轴线对齐；

所述微流控芯片和微波传感器的蛋白标记区域上均标记有特异性抗体，所述特异性抗体用于捕捉血液样本中的生物标志物。

进一步地，所述微流控通道的一端设置有血液样本入口，另一端设置有血液样本出口。

进一步地，所述微波传感器包括叉式微带线和两个带有开口的方型内环，两个带有开口的方型内环均设置于叉式微带线的两个叉头之间。

进一步地，两个方型内环的开口处均设置有蛋白标记区域，且两个蛋白标记区域的形状一致但尺寸不一致。

进一步地，所述叉式微带线连接数据连接口，所述数据连接口用于连接上位机。

本发明第二方面提供了如第一方面所述一种集成化的微波-微流体芯片的制备方法，包括如下步骤：

在铜基玻璃载玻片上设置微波传感器后，将铜基玻璃载玻片进行清洗和盐化，将活化的抗体溶液标记到所述微波传感器上后，用去离子水清洗抗体涂覆的微波传感器并风干；

将微流控芯片进行清洗和盐化后，将活化的抗体溶液标记到所述微流控芯片上后，用去离子水清洗抗体涂覆的微流控芯片并风干；

将微流控芯片的微流控通道和微波传感器上的蛋白标记区域对齐后键合。

进一步地，还包括将数据连接口焊接到所述微波传感器上。

进一步地，所述微流控芯片的制作步骤还包括：在所述微流控芯片的微流控通道的两端进行打孔，得到血液样本入口和血液样本出口。

本发明第三方面提供了采用如第一方面所述的一种集成化的微波-微流体芯片的检测方法，包括如下步骤：

向微波传感器发射出信号；

血液样本进入微流控通道，流经蛋白标记区域时，蛋白标记区域内的特异性抗体捕捉血液中的生物标志物；

当生物标志物被特异性抗体捕获，引起信号变化。

进一步地，所述信号变化量与生物标志物捕获量呈线性关系。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明所述的一种集成化的微波-微流体芯片，实现了无标记检测：采用了与微流控芯片结合的微波谐振器，实现了无标记的检测，有效避免了荧光基团等标记物对样本造成损害，保持了样本的完整性，这为进一步的分析提供了保证。

2、本发明所述的一种集成化的微波-微流体芯片，实现了自动进样：利用微流控通道的毛细现象，实现自动化进样，大幅度减少了人工操作的流程，避免了人工造成的误差。

3、本发明所述的一种集成化的微波-微流体芯片，实现了小型化和集成化：微流控芯片与微波传感器允许在一个微小的芯片中执行多个操作步骤，从而大大缩短了操作时间和减小了体积。

4、本发明所述的一种集成化的微波-微流体芯片，实现了快速检测：采用了与微流控芯片结合的微波谐振器，实现了无标记的检测，避免了标记物的制备和处理步骤，从而降低了实验的复杂性；当血液样本流入微流控通道时，CTCs会与特异性抗体结合，从而在特定区域内被固定，而白细胞和红细胞则因缺乏相应抗体而无法被捕捉，简化了CTCs分离、捕获和富集的步骤，缩短了操作时间。

5、本发明所述的一种集成化的微波-微流体芯片，实现了成本低：微流控芯片和微波传感器制作简单、价格低廉；同时，两者相结合避免大型仪器的使用和缩短了操作步骤，节约了成本。

6、本发明所述的一种集成化的微波-微流体芯片，实现了双区域协同检测，避免了传统方法的检测单一的缺点。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1的集成化的微波-微流体芯片的透视图；

图2为本发明实施例1的微波传感器结构图；

图3为本发明实施例1的集成化的微波-微流体芯片立体结构图；

图4为本发明实施例1的集成化的微波-微流体芯片的原理图；

图5为本发明实施例1的双信号频率分布图；

图6为本发明实施例1的微波传感器掩膜图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

在本发明中，术语如“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“侧”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，只是为了便于叙述本发明各部件或元件结构关系而确定的关系词，并非特指本发明中任一部件或元件，不能理解为对本发明的限制。

本发明中，术语如“固接”、“相连”、“连接”等应做广义理解，表示可以是固定连接，也可以是一体地连接或可拆卸连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的相关科研或技术人员，可以根据具体情况确定上述术语在本发明中的具体含义，不能理解为对本发明的限制。

在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

术语解释：

微带线：由支在介质基片上的单一导体带构成的微波传输线。

实施例1

本发明实施例1提供了一种集成化的微波-微流体芯片。

微波检测的原理是基于被测样品引起的场扰动，导致谐振频率和陷波幅度值的变化。不同类型的组织和体液具有不同的组成成分，这导致了介电性能的差异。通过测量介电性能的差异将可以对不同的样本进行识别和检测。不同类型的组织和体液具有不同的介电性质，这导致了介电性能的差异。通过测量介电性能的差异，可以对不同的样本进行识别和检测。微波检测装置能够直接检测样品的介电性能，具有高灵敏度、实时响应、操作简便等优点。随着微波技术的不断发展，已经开发出多种类型的微波传感器，其中微波谐振器传感器是其中一种类型，它能够将待测样品的介电性质转化为电信号，从而测量参数的谐振频率或相对振荡相位，具有高集成度、高灵敏度、非侵入性、实时响应和低成本的优势。

本实施例提供的一种集成化的微波-微流体芯片，通过将微波检测技术和微流控技术相结合，极大缩小了体积，实现了无标记、无侵入性检测循环肿瘤细胞，避免了传统方法的需要精密仪器、耗时长、成本高、检测单一的缺点。

如图1、图2和图3所示，本实施例提供的一种集成化的微波-微流体芯片，包括数据连接口6以及自下而上设置的铜基玻璃载玻片1、微波传感器(又称，微波谐振器)4和PDMS芯片(又称，微流控芯片)5。

其中，微波传感器4设置于铜基玻璃载玻片1上。PDMS芯片5设置于微波传感器4上。

如图2所示，微波传感器4包括叉式微带线和两个带有开口的方型内环，两个带有开口的方型内环均设置于叉式微带线的两个叉头之间；两个方型内环的形状一致但尺寸不一致；两个方型内环的开口尺寸不一致；两个方型内环的开口处分别设置第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9，第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9的形状一致但尺寸不一致，叉式微带线(叉柄)连接数据连接口6。

其中，PDMS芯片5的底部开设有微流控通道3。微流控通道3的一端设置有血液样本入口2，另一端设置有血液样本出口7。

其中，第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9的中轴线均与微流控通道3的中轴线对齐后，铜基玻璃载玻片1和PDMS芯片5键合。

其中，在第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9的位置，PDMS芯片5和微波传感器4上均标记有特异性抗体10，特异性抗体10用于捕捉血液样本中的生物标志物。

在本实施例中，特异性抗体10为与CTCs相匹配的抗体。如果更换特异性抗体种类，可以用于检测病毒、细菌或各种生物标志物。第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9可以标记为相同种类抗体或不同种类抗体。如果为不同抗体种类，可以用于同时检测两种CTC或生物标志物。

如图5所示，微波传感器4的信号存在不同频率下的特征信号，即两个蛋白标记区域对应的特征信号的频率可以不同。

其中，第一蛋白标记区域8对应5.29GHz的特征信号，第二蛋白标记区域9对应7.67GHz的特征信号，信号之间相互不影响。

在本实施例中，第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9可以标记为相同种类抗体或不同种类抗体。如果为不同抗体种类，可以用于同时检测两种CTC或生物标志物。如果为同一种抗体，第二蛋白标记区域9可以捕获第一蛋白标记区域8未捕获的待测物，提高检测灵敏度。

在本实施例中，信号频率与微波传感器4的结构、尺寸、开口大小等参数相关联。如果微波传感器4的结构、尺寸、开口大小等参数，特征信号将发生移动。

其中，微波传感器连接有数据连接口6，用于与上位机连接，上位机可以为矢量网络分析仪。

本实施例提供的一种集成化的微波-微流体芯片，如图4所示，其工作原理为：集成有WiFI和蓝牙模块的矢量网络分析模块实时的通过数据连接口6向微波传感器发射出信号并接受反馈信号，血液样本从样本入口2的入口进入微流控通道3，流经第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9时，第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9内的特异性抗体10捕捉血液中的循环肿瘤细胞(CTCs)11，当循环肿瘤细胞(CTCs)11被特异性抗体10捕获，将引起反馈信号变化，反馈信号变化量与循环肿瘤细胞(CTCs)11捕获量呈线性关系。

其中，血液包含有循环肿瘤细胞(CTCs)11、白细胞12和血红细胞13等。

本实施例提供的一种集成化的微波-微流体芯片，通过将与CTCs相关的特异性蛋白质固定在微流控芯片的特定区域，实现了对CTCs的特定区域捕捉和富集。当血液样本流入微流控通道时，CTCs会与特异性抗体结合，从而在特定区域内被固定，而白细胞和红细胞则因缺乏相应抗体而无法被捕捉，简化了CTC的分离和富集步骤，提高了检测的精确性和灵敏性。采用了与微流控芯片结合的微波谐振器，实现了无标记的检测，从而避免了使用成本高、便携性差的荧光显微镜或其他荧光设备，避免荧光基团等标记物对样本造成损害，保证了样本的完整性。检测结果通过集成了WiFi和蓝牙模块的矢量网络分析仪获取，并直接传输到手机或电脑端进行数据分析。

本实施例提供的一种集成化的微波-微流体芯片，有以下优点：

(1)无标记检测：采用了与微流控芯片结合的微波谐振器，实现了无标记的检测，有效避免了荧光基团等标记物对样本造成损害，保持了样本的完整性，这为进一步的分析提供了保证；

(2)自动进样：利用微流控通道的毛细现象，实现自动化进样，大幅度减少了人工操作的流程，避免了人工造成的误差；

(3)小型化和集成化：微流控芯片与微波传感器允许在一个微小的芯片中执行多个操作步骤，从而大大缩短了操作时间和减小了体积；

(4)快速检测：采用了与微流控芯片结合的微波谐振器，实现了无标记的检测，避免了标记物的制备和处理步骤，从而降低了实验的复杂性；当血液样本流入微流控通道时，CTCs会与特异性抗体结合，从而在特定区域内被固定，而白细胞和红细胞则因缺乏相应抗体而无法被捕捉，简化了CTCs分离、捕获和富集的步骤，缩短了操作时间；

(5)成本低：微流控芯片和微波传感器制作简单、价格低廉；同时，两者相结合避免大型仪器的使用和缩短了操作步骤，节约了成本。

(6)可以实现双区域协同检测。

实施例2

本发明实施例2提供了如实施例1中的一种集成化的微波-微流体芯片的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、微波传感器制作步骤如下：

(101)将光刻胶均匀地旋涂(全部涂布)到镀铜玻璃载玻片(又称，铜基玻璃载玻片)1后，进行烘烤。

(102)通过紫外线曝光，在带有掩模的镀铜玻璃载玻片(简称，载玻片)1上形成微波传感器的图案。掩模的形状如图6所示，包括叉式掩模和两个带有开口的方型内环掩模，两个带有开口的方型内环掩模均设置于叉式掩模的两个叉头之间；两个方型内环掩模的形状一致但尺寸不一致；两个方型内环掩模的开口尺寸不一致。

(103)玻璃载玻片上的微波传感器的图案利用负性光刻胶显影剂显影后，将玻璃载玻片浸入电镀溶液中电镀。

(104)电镀后，分别去除光刻胶和铜基，玻璃载玻片上留下微波传感器4。

(105)将玻璃载玻片清洗后置于APTES(γ-氨丙基三乙氧基硅烷)中进行盐化；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液以及与CTCs相匹配的抗体溶液充分混合后，得到活化的抗体溶液(其内包含特异性抗体10)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液用于激活抗体。

(106)将活化的抗体溶液标记到微波传感器4上的第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9上；然后用去离子水清洗抗体涂覆的微波传感器并风干。

步骤2、微流控芯片制作步骤如下：

(201)将聚二甲基硅氧烷(PDMS)与固化剂混合均匀，并在真空箱中脱气后，得到混合液，备用。

(202)将适量的混合液导入通过软光刻制备的模具中，固化后，得到PDMS芯片，将PDMS芯片的微流控通道3的合适位置进行打孔，微流控通道3的一端为血液样本入口2，另一端为血液样本出口7。

(203)将PDMS芯片清洗后置于APTES中进行盐化；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液以及与CTCs相匹配的抗体溶液充分混合后，得到活化的抗体溶液，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液用于激活抗体。

(204)将活化的抗体溶液标记到PDMS芯片的第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9上，然后用去离子水清洗抗体涂覆的PDMS芯片并风干。

步骤3、将PDMS芯片的微流控通道3和已经标记完成抗体的微波传感器对齐(即PDMS芯片的微流控通道3和微波传感器4上的第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9对齐)后键合。

步骤4、将信号传输口(即，数据连接口)6焊接到微波传感器上。

步骤5、将微波传感器与集成有WiFI和蓝牙模块的矢量网络分析模块连接，从而实现信号到手机或者电脑端的传输。

实施例3

本发明实施例3提供了基于如实施例1中的一种集成化的微波-微流体芯片的检测方法，可以实现双区域协同检测，包括如下步骤：

步骤1、集成有WiFI和蓝牙模块的矢量网络分析模块实时的通过数据连接口6向微波传感器发射出信号并接受反馈信号；

步骤2、血液样本从样本入口2的入口进入微流控通道3，依次流经第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9时，第一蛋白标记区域8和第二蛋白标记区域9内的特异性抗体10捕捉血液中的循环肿瘤细胞(CTCs)11；

步骤3、当循环肿瘤细胞(CTCs)11被特异性抗体10捕获，将引起反馈信号变化，反馈信号变化量与循环肿瘤细胞(CTCs)11捕获量呈线性关系。

在本实施例中，第一蛋白标记区域8对应5.29GHz的特征信号(特征峰)，如图5所示，当样品只加载在第一蛋白标记区域8，会使这个5.29GHz的信号变化(特征峰发生移动)；第二蛋白标记区域9对应7.67GHz的特征信号，信号之间相互不影响。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种集成化的微波-微流体芯片，其特征在于：包括自下而上设置的铜基玻璃载玻片、微波传感器和微流控芯片；

所述微波传感器和微流控芯片上均设置有蛋白标记区域，且微波传感器和微流控芯片上的蛋白标记区域对齐，微流控芯片上设置有微流控通道，且蛋白标记区域的中轴线与微流控通道的中轴线对齐；

所述微流控芯片和微波传感器的蛋白标记区域上均标记有特异性抗体，所述特异性抗体用于捕捉血液样本中的生物标志物。

2.如权利要求1所述的一种集成化的微波-微流体芯片，其特征在于：所述微流控通道的一端设置有血液样本入口，另一端设置有血液样本出口。

3.如权利要求1所述的一种集成化的微波-微流体芯片，其特征在于：所述微波传感器包括叉式微带线和两个带有开口的方型内环，两个带有开口的方型内环均设置于叉式微带线的两个叉头之间。

4.如权利要求3所述的一种集成化的微波-微流体芯片，其特征在于：两个方型内环的开口处均设置有蛋白标记区域，且两个蛋白标记区域的形状一致但尺寸不一致。

5.如权利要求1所述的一种集成化的微波-微流体芯片，其特征在于：所述叉式微带线连接数据连接口，所述数据连接口用于连接上位机。

6.如权利要求1-5任一项所述的一种集成化的微波-微流体芯片的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

在铜基玻璃载玻片上设置微波传感器后，将铜基玻璃载玻片进行清洗和盐化，将活化的抗体溶液标记到所述微波传感器上后，用去离子水清洗抗体涂覆的微波传感器并风干；

将微流控芯片进行清洗和盐化后，将活化的抗体溶液标记到所述微流控芯片上后，用去离子水清洗抗体涂覆的微流控芯片并风干；

将微流控芯片的微流控通道和微波传感器上的蛋白标记区域对齐后键合。

7.如权利要求6所述的一种集成化的微波-微流体芯片的制备方法，其特征在于：还包括将数据连接口焊接到所述微波传感器上。

8.如权利要求6所述的一种集成化的微波-微流体芯片的制备方法，其特征在于：所述微流控芯片的制作步骤还包括：在所述微流控芯片的微流控通道的两端进行打孔，得到血液样本入口和血液样本出口。

9.采用如权利要求1-5任一项所述的一种集成化的微波-微流体芯片的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

向微波传感器发射出信号；

血液样本进入微流控通道，流经蛋白标记区域时，蛋白标记区域内的特异性抗体捕捉血液中的生物标志物；

当生物标志物被特异性抗体捕获，引起信号变化。

10.采用如权利要求9所述的一种集成化的微波-微流体芯片的检测方法，其特征在于：所述信号变化量与生物标志物捕获量呈线性关系。