CN118852286A - 化合物、缀合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及小核酸药物递送技术领域，具体公开了化合物、缀合物及其用途。本发明提供了一种核酸类药物靶向递送单体和缀合物及其制备方法，该单体以及由该单体所形成的特定设计结构的缀合物能够特异性地靶向递送活性药物(或小核酸)到细胞受体(或表面)，并与受体结合。连接了活性药物(或小核酸)的缀合物利用其结构特性能提高核酸类药物的细胞穿透的能力，并增强其在细胞内的稳定性，能够有效解决药物定向递送问题。本发明的递送单体和缀合物具有制备工艺简单、适用于各类靶向药物的递送，并且用途十分广泛等优势。
Description
本申请是申请日为2021年12月9日、申请号为202111499092.9、发明名称为“化合物、缀合物及其用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及小核酸药物递送技术领域，具体涉及化合物、缀合物及其用途。
背景技术
递送系统是小核酸药物开发中的核心关键技术之一，目前全球范围内对小核酸递送系统研究最广泛的一类递送系统是靶向缀合递送技术。尽管以特定寡核苷酸和寡核苷酸类似物为代表的组织特异性活性剂在作为治疗剂的应用方面已取得部分进展，但是仍然存在对其药理特性的改进的需求，例如使其靶向性地递送至病灶以提高治疗剂的选择性，提高其生物活性及功效。最近靶向缀合递送技术成为一类研究最广泛的递送系统，特别是集中于肝靶向递送。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种化合物、缀合物及其制备方法和用途。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种化合物M，该化合物M具有式(V)或(V’)所示的结构：
式(V)或(V’)中，
A为适配体，具有来自糖或多肽的结构；
L1为长度为1-50个碳原子的具有醚键和/或酰胺键的直链基团；
Z具有来自第一磷化合物的结构，所述第一磷化合物选自亚磷酰胺、H-磷酸酯和磷酸三酯中的一种，并且能够通过磷酸酯键或磷酰胺二酯键以共价键的方式与相邻的基团连接。
本发明第二方面提供了一种缀合物N，该缀合物N具有式(VI)所示的结构：
(M)m-R”(VI)
式(VI)中，m为1-4的整数，M具有来自权利要求1中式(V)或(V’)所示结构的化合物提供，且当m大于1时，多个M相同或不同；
R”具有能够与Nu相连接的活性位点。
本发明第三方面还提供了一种缀合物T，该缀合物T具有式(VIII)所示的结构：
式(VIII)中，M1、M2和M3至少一个具有来自化合物M的结构，其中，所述化合物M的结构与前述第一方面定义相同；M1、M2和M3相同或不同。
本发明第四方面提供了一种前述化合物M、缀合物N和T在制备小核酸药物中的用途。
本发明提供了一种核酸类药物靶向递送单体和缀合物及其制备方法，该单体以及由该单体所形成的特定设计结构的缀合物能够特异性地靶向递送活性药物(或小核酸)到细胞受体(或表面)，并与受体结合。连接了活性药物(或小核酸)的缀合物利用其结构特性能提高核酸类药物的细胞穿透的能力，并增强其在细胞内的稳定性，能够有效解决药物定向递送问题。本发明的递送单体和缀合物具有制备工艺简单、适用于各类靶向药物的递送，并且用途十分广泛等优势。
附图说明
图1是本发明一种具体实施方式的siRNA缀合物的制备流程示意图；
图2为siRNA(SNK-17)在C57BL/6小鼠中降低肝脏TTR mRNA表达的结果；
图3为siRNA(SNK-18)在C57BL/6小鼠中降低肝脏TTR mRNA表达的结果。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明中，C1-C10的基团是指碳原子数为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，C6-C10或C5-C10亦然。
本发明中，1-10的整数包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，1-4的整数或1-6的整数亦然。
本发明中，Ac为乙酰基。
本发明中，Nu为活性药物，优选为功能性寡聚核糖核酸和/或寡聚脱氧核糖核酸。本发明中，所述活性药物Nu优选为siRNA，如实施例所述的siRNA，且本发明的缀合物可以通过磷酸二酯键与所述siRNA的正义链的5’端或3’端相连，也可以通过磷酸二酯键与siRNA的反义链的5’端或3’端相连。
本发明第一方面提供一种化合物L2，L2具有式(I)、(II)、(III)或(IV)所示的结构：
其中，式(I)、(II)、(III)或(IV)中Ra各自独立地为H或羟基保护基；所述羟基保护基可以选自DMT(4,4’-二甲氧基三苯甲基)、MMT(4-甲氧基三苯甲基)、三苯甲基、TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、PNT(4-戊烯酰基)和酰氧基烷基中的一种；
式(I)中的R1和R2、式(II)中R4均具有共价键的连接位点；
式(III)或(IV)中，n为1-10的整数；
式(II)、(III)或(IV)中，表示通过活性位点连接活性基团后得到的结构；其中，所述活性位点为可以通过共价键连接的位点；所述活性基团选自亚磷酰胺基、H-磷酸酯基、磷酸酯基和多羟基烷基中的一种。
式(I)中R1、R2以及式(II)中R4各自独立地为取代或未取代的长度为1-70个碳原子的直链基团，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O和S；并且其中，R1可任选地具有以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10的烷基、C6-C10的芳基、C5-C10的杂芳基、C1-C10的卤代烷基、-O-C1-C10的烷基、-O-C1-C10的烷基苯基、-C1-C10的烷基-OH、-O-C1-C10的卤代烷基、-S-C1-C10的烷基、-SC1-C10的烷基苯基、-C1-C10的烷基-SH、-S-C1-C10的卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10的烷基-NH2、-N-(C1-C10的烷基)(C1-C10的烷基)、-NH-(C1-C10的烷基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)-O-(C1-C10的烷基)、-CON-(C1-C10的烷基)(C1-C10的烷基)、-CONH(C1-C10的烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10的烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10的烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10的卤烷基、-OC(O)C1-C10的烷基、-SO2(C1-C10的烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10的卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10的烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10的烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10的卤代烷基)；
式(I)中，R2还可以为H；
式(II)中，R3是取代或未取代的C1-C20的烷基；并且其中，R3可任选地具有以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10的烷基、C6-C10的芳基、C5-C10的杂芳基、C1-C10的卤代烷基、-OC1-C10的烷基。
根据本发明的一些实施方式，R1各自独立地选自以下基团中的一种或多种的基团以任意数量任意方式连接后得到的基团；
-(CH2)n-、-O-和-CONH-；其中，n为1-10的整数。
根据本发明的一些实施方式，R2和R4各自独立地选自以下基团中的一种或多种的基团以任意数量任意方式连接后得到的基团；
-(CH2)n-、-O-、-CONH-和-(OCH2CH2)n-；其中，n为1-10的整数。
根据本发明的一些实施方式，R3为C1-C6的烷基。
根据本发明的一些实施方式，所述化合物L2具有选自式(A1)-(A24)所示结构中的一种：
其中，式(A2)-(A24)中m或n各自独立地为1-10的整数；可以表示通过活性位点连接活性基团后得到的结构；其中，所述活性位点为可以通过共价键连接的位点；所述活性基团可以选自亚磷酰胺基、H-磷酸酯基、磷酸酯基和多羟基烷基中的一种。
根据本发明的一些实施方式，式(A2)-(A24)中，-OH表示羟基或被羟基保护基保护的羟基。其中，所述羟基保护基可以选自DMT(4,4’-二甲氧基三苯甲基)、MMT(4-甲氧基三苯甲基)、三苯甲基、TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)、(4-氧戊烷酰基)、2-氰基乙基和PNT(4-戊烯酰基)和酰氧基烷基中的一种。
本发明第二方面提供一种化合物M，所述化合物M具有式(V)或(V’)所示的结构：
式(V)或(V’)中，
A为适配体，为能促进所递送物质与相应的配体(如去唾液酸糖蛋白受体)进行高亲和力和强特异性的结合的结构，具有来自糖或多肽的结构；
L1为长度为1-50个碳原子的具有醚键和/或酰胺键的直链基团；
L2的结构如前所述(L2与A、L1和Z的连接位置可以在氧、硫、氮、碳原子上)；
Z为具有来自第一磷化合物的结构，主要起连接和偶合作用，所述第一磷化合物可以选自亚磷酰胺、H-磷酸酯和磷酸三酯中的一种，并且可以通过磷酸酯键或磷酰胺二酯键以共价键的方式与相邻的基团连接。
根据本发明的一些实施方式，L1可以选自以下基团中的一种或多种的基团以任意数量任意方式连接后得到的基团：
-CH2-、-O-、-OCH2-和-CONH-。
根据本发明的一些实施方式，L1可以选自以下基团中的一种：
-O-[CH2CH2O]-n、-[CH2]m-CONH-[CH2]nO-和-O-[CH2CH2O]m-CONH-[CH2]nO-；其中，m和n各自独立地为1-10的整数。
根据本发明的一些实施方式，所述糖可以选自单糖、二糖、三糖或多糖中的一种；优选地，所述糖可以为修饰的糖。
根据本发明的一些实施方式，A可以选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖中的一种；优选地，所述糖为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。
根据本发明的一些实施方式，A还可以选自蛋白质、单克隆抗体和纳米体中的一种。
本发明中，A可以选自能够和细胞表面受体结合的配体；并且，A具有活性羟基或氨基，A可以通过与羟基或氨基以共价键的方式与L1相连；A的作用为利用其与受体的亲和性，将活性药物Nu递送到靶点位置；其中，当A为糖时，连接位点通常包括1位羟基。
本发明中，所述受体可以为肝细胞表面受体，也可以为人体肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体。
本发明中，所述活性药物Nu可以为寡聚核糖核酸和/或寡聚脱氧核糖核酸。
根据本发明的一些实施方式，Z具有式(B1)、(B2)、(B3)、(B4)、(B5)或(B6)所示的结构：
其中，式(B3)中的M选自TEA(三乙胺)、三甲胺、三异丙胺和三丙胺中的一种。其中，式(B4)-(B6)中的R’可选自2,2,2-三氯乙基、苯基、邻氯苯基、氰乙基、和Nu中的一种。(B1)、(B2)、(B3)、(B4)、(B5)或(B6)中表示可以通过共价键连接的位点。
根据本发明的一些实施方式，所述化合物M具有式(101)、(102)、(201)、(202)、(203)、(301)或(302)所示的结构：
根据本发明的一些实施方式，所述化合物M可以与活性药物Nu连接；所述活性药物Nu可以通过磷酸酯键(例如磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键)或磷酰胺二酯键与所述化合物M连接。所述活性药物Nu如前所述。
本发明第三方面提供第一缀合物N，所述第一缀合物N具有式(VI)所示的结构：
(M)m-R”(VI)
式(VI)中，m可以为1-4的整数，当m大于1时，M可以独立地为式(V)或(V’)所示的结构且多个M可以相同或不同；R”具有能够与活性药物Nu相连接的活性位点；或者，R”可以为通过活性位点连接了活性药物Nu的基团。
根据本发明的一些实施方式，所述第一缀合物N具有式(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示的结构：
其中，式(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中，
n、n1或n2各自独立地为1-10的整数，优选为1-6的整数；m各自独立地为1-10的整数，优选为1-4的整数；X为氧原子或硫原子；
L1’是长度为1-50个碳原子的具有醚键和/或酰胺键的直链基团；
A’为适配体，具有来自糖或多肽的结构，A为能促进所递送物质与相应的配体(如去唾液酸糖蛋白受体)进行高亲和力和强特异性的结合的结构；
式(a)中，R5各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
式(c)中，R6选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；R7为H或羟基保护基，所述羟基保护基选自DMT(4,4’-二甲氧基三苯甲基)、MMT(4-甲氧基三苯甲基)、三苯甲基、TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、PNT(4-戊烯酰基)和酰氧基烷基中的一种，优选地，R7为2-氰基乙基；
式(e)中，R8为H或羟基保护基；所述羟基保护基可以选自DMT(4,4’-二甲氧基三苯甲基)、MMT(4-甲氧基三苯甲基)、三苯甲基、TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、PNT(4-戊烯酰基)和酰氧基烷基中的一种，优选为2-氰基乙基；优选地，R8为2-氰基乙基；
其中，“”可以表示通过共价键与活性药物Nu或其他基团连接的位点，或者，“”可以表示通过共价键连接了活性药物Nu的基团。所述活性药物Nu如前所述。
根据本发明的一些实施方式，L1’可以选自以下基团中的一种或多种的基团以任意数量任意方式连接后得到的基团：
-CH2-、-O-、-OCH2-和-CONH-。
根据本发明的一些实施方式，L1’可以选自以下基团中的一种：
-O-[CH2CH2O]n、-[CH2]m-CONH-[CH2]nO-、-O-[CH2CH2O]m-CONH-[CH2]nO-和-O-[CH2CH2O]m-CONH-[CH2]nO-；其中，m和n各自独立地为1-10的整数。
根据本发明的一些实施方式，A’可以选自单糖、二糖、三糖或多糖中的一种，并且A’可以为修饰的糖。
根据本发明的一些实施方式，A’可以选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-三氟乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖中的一种；优选地，A’为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。
根据本发明的一些实施方式，A’还可以选自蛋白质、单克隆抗体和纳米体中的一种。
本发明中，A’可以选自能够和细胞表面受体结合的配体；并且，A’具有活性羟基或氨基，可以通过与羟基或氨基形成共价键的方式与L1相连；A’的作用为利用其与受体的亲和性，将活性药物Nu递送到靶点位置；其中，当A’为糖时，连接位点通常包括1位羟基。
根据本发明的一些实施方式，A’可以选自蛋白质、单克隆抗体和纳米体中的一种。
本发明中，A’可以独立地选自能够和细胞表面受体结合的配体；并且，A’具有活性羟基或氨基，可以通过与羟基或氨基形成共价键的方式与L1相连；A’的作用包括利用其与受体的亲和性，将活性药物Nu递送到靶点位置；其中，当A’为糖时，连接位点通常包括1位羟基。
根据本发明的一些实施方式，所述第一缀合物N具有式(401)、(402)、(501)、(502)或(503)所示的结构：
式(401)、(402)、(501)、(502)或(503)中，X为氧原子或硫原子；Rx具有连接固相载体的位点基团，可选择固相载体上的琥珀酰胺基或羟基；Nu是通过共价键连接的活性药物小核酸(例如活性功能性寡核苷酸)；Rz为羟基保护基，可以选自2-氰基乙基。
根据本发明的一些实施方式，式(401)、(402)、(501)、(502)或(503)中，Nu可以被其他具有活性位点的基团代替。
本发明第四方面提供一种化合物L3，所述化合物L3具有式(VII)所示的结构：
其中，Y为取代或未取代的长度为1-10个碳原子的直链基团，其中一个或多个碳原子任选地被一个或多个-CONH-所替换；
式(VII)中，Ra’各自独立地为H或羟基保护基；所述羟基保护基可以选自DMT(4,4’-二甲氧基三苯甲基)、MMT(4-甲氧基三苯甲基)、三苯甲基、TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、PNT(4-戊烯酰基)和酰氧基烷基中的一种；
R9和R10各自独立地具有H或长度为1-70个碳原子的端基含有羟基和/或被羟基保护基保护的羟基的直链基团，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O和S；并且其中，R9和R10各自独立地任选地具有以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10的烷基、C6-C10的芳基、C5-C10的杂芳基、C1-C10的卤代烷基、-OC1-C10的烷基、-OC1-C10的烷基苯基、-C1-C10的烷基-OH、-OC1-C10的卤代烷基、-SC1-C10的烷基、-SC1-C10的烷基苯基、-C1-C10的烷基-SH、-SC1-C10的卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10的烷基-NH2、-N(C1-C10的烷基)(C1-C10的烷基)、-NH(C1-C10的烷基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10的烷基)、-CON(C1-C10的烷基)(C1-C10的烷基)、-CONH(C1-C10的烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10的烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10的烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10的卤烷基、-OC(O)C1-C10的烷基、-SO2(C1-C10的烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10的卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10的烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10的烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10的卤代烷基)。其中，R9和R10还可以表示具有连接活性药物Nu的位点的基团。R9和R10还可以表示连接了活性药物Nu的基团。所述活性药物Nu如前所述。
根据本发明的一些实施方式，Y可以为-CONH-或CH2。
根据本发明的一些实施方式，R9和R10各自独立地选自以下基团中的一种或多种的基团以任意数量任意方式连接后得到的基团：
-NH2-、-CH2-、-O-、-CONH-、-(OCH2CH2)n-、Z’、
本发明中，可以由式(F1)、式(F2)、式(F3)、或式(F4)的基团衍生得到，
式(F1)、式(F2)、式(F3)或式(F4)中，Rq为羟基保护基团，Rq可以选自三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基和4,4’,4”-三甲氧基苯甲基中的一种。式(F3)中，M+可以为阳离子，也可以为金属阳离子，优选地，M+选自铵阳离子，叔胺阳离子和季胺阳离子。式(F4)中，X为O或NH，SPS表示固相载体。
根据本发明的一些实施方式，R9和R10各自独立地具有式(D1)、(D2)或(D3)所示的结构：
其中，m为0-6的整数(如0、1、2、3、4、5、6)；M+为三乙胺阳离子；
Rk’各自独立地选自H、羟基保护基或Nu；所述羟基保护基选自4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、4-戊烯酰基和酰氧基烷基中的一种；Nu为活性药物。Rk’还可以表示具有连接活性药物Nu的位点。Rk’还可以表示通过活性位点连接了活性药物Nu的基团。
其中，n为1-10的整数；Z’为第二磷化合物，并且可以通过磷酸酯键或磷酰胺二酯键以共价键的方式与其他基团连接。
根据本发明的一些实施方式，Z’具有式(C1)或(C2)所示的结构：
其中，Q和Q’各自独立地为O或S；R11和R12各自独立地选自H、C1-C10的烷基、C1-C10卤代烷基，C1-C10烷氧基；并且其中，R11和R12各自独立地含有如下所述的基团：腈基、氨基、羟基、羧基和酰胺基。
根据本发明的一些实施方式，所述化合物L3具有式(E1)-(E12)所示的结构：
其中，式(E1)-(E12)中，m和n为1-10的整数；Rb-Rk’各自独立地选自H、羟基保护基或Nu；所述羟基保护基选自DMT(4,4’-二甲氧基三苯甲基)、MMT(4-甲氧基三苯甲基)、三苯甲基、TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、PNT(4-戊烯酰基)和酰氧基烷基中的一种。
本发明第五方面提供第二缀合物T，所述第二缀合物T具有式(VIII)所示的结构：
式(VIII)中，M1、M2和M3至少一个具有来自前述化合物M的结构，其中，所述化合物M的结构如前所述；或者，M1、M2和M3各自独立地由如前所述的A、L1、L2或Z以任意数量任意方式连接后得到。其中，式(VIII)所示的化合物还可以表示连接了活性药物Nu；所述活性药物Nu如前所述。
根据本发明的一些实施方式，M1、M2和M3相同或不同。
根据本发明的一些实施方式，M1、M2和M3均具有来自前述化合物M的结构，相同或不同。
根据本发明的一些实施方式，所述第二缀合物T具有式(IX)或式(X)所示的结构：
式(IX)中，A、L1、L2、L3或Z’的结构如前所述；其中，Z’可以为Z与L3连接之后形成的结构。式(X)中，A、L1的结构如前所述。其中，式(IX)、式(X)所示的化合物还可以表示连接了活性药物Nu。其中，Nu还可以表示保护基或固相载体。所述保护基如前所述。其中，对所述固相载体的种类不做特别的限制，可以为本领域的常规选择。
根据本发明的一些实施方式，所述缀合物T具有式(IX-1)或式(X-1)所示的结构：
式(IX-1)或式(X-1)中，m和n各自独立地为0-6的整数；Rt和Rt’各自独立地选自H、羟基保护基、活性药物Nu、固相载体、C2-C6的羧基、羧酸盐或酰胺基；所述羟基保护基选自4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、4-戊烯酰基和酰氧基烷基中的一种。
根据本发明的一些实施方式，所述第二缀合物T具有式(601)、(602)、(603)、(604)、(605)、(606)或(607)所示的结构：
其中，式(601)、(602)、(603)、(604)、(605)、(606)或(607)中，X为氧原子或硫原子；Nu为活性药物小核酸。
本发明中，式(603)所示结构的缀合物可以由式(603A)与酸酐(如丁二酸酐)接触得到相应的羧酸盐(603B)，(603B)进一步连接至固相得到(603C)，(603C)进而连接到活性基团Nu(如功能性小核酸)上，
本发明中，式(606)所示结构的缀合物可以由式(101)所示的化合物经固相合成的方式制备得到。其中，对固相合成的方式不做特别的限制，可以为本领域的常规选择。
根据本发明的一些实施方式，式(601)、(602)、(603)、(604)、(605)、(606)或(607)中，Nu可以被其他具有活性位点的基团代替。
本发明中，化合物M的制备可以按照以下方法制备(以式(101)的制备为例)：
(a)在氮气保护下，在第一溶剂中，将化合物3与N,N,N’N’-四异丙基氯亚磷酸酯和二异丙基乙胺接触进行反应；其中，接触的条件可以为室温；
(b)在第一溶剂的存在下，将1-O-二甲氧基三苯甲基-1,3-丙二醇和乙硫四唑加入上述反应后的溶液中，继续在室温氮气保护下进行反应。其中，化合物3、N,N,N’N’-四异丙基氯亚磷酸酯、二异丙基乙胺、1-O-二甲氧基三苯甲基-1,3-丙二醇和乙硫四唑的摩尔比可以为1:(1.2-2)：(2.5-3.5)：(1.2-2)：(0.2-0.6)。其中，对所述第一溶剂的种类和用量不做特别的限制，只要能够满足本发明的需求即可。例如，所述第一溶剂可以为二氯甲烷。
本发明对化合物M制备的后处理没有特别的限制，可以参照本领域常规的方式进行。例如所述后处理的步骤可以包括：将反应后的体系用饱和的食盐水洗涤，并用萃取溶剂(如二氯甲烷)进行萃取，合并有机相浓缩，之后经柱层析分离得到化合物(101)。
本发明中，化合物3的制备为本领域技术人员熟知，本发明对化合物3的制备不做特别的限制，可以参照本领域常规的方式进行。
本发明中，第二缀合物T的制备按照以下方法制备(以式(603A)的制备为例)：
(a)室温下，在第二溶剂的存在下，使化合物22与部分N,N-二异丙基乙胺混合得到混合物；其中，化合物22与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比可以为1:(3-5)；
(b)在-5℃至5℃条件下，将上述混合物与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺以及化合物14混合并搅拌反应0.5-1小时；并继续在-5℃至5℃条件下，向反应溶液中补加部分N,N-二异丙基乙胺，继续反应1-2小时；其中，化合物22、化合物14、N,N-二异丙基乙胺以及2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的摩尔比可以为1：(1-1.2)：(5-10)：(1-1.2)；优选地，部分N,N-二异丙基乙胺、和补加的N,N-二异丙基乙胺的摩尔比可以为1：(0.5-1)；
其中，对所述第二溶剂的种类和用量不做特别的限制，只要能够满足本发明的需求即可。例如，所述第二溶剂可以为二氯甲烷。
本发明对第二缀合物T制备的后处理没有特别的限制，可以参照本领域常规的方式进行。例如所述后处理的步骤可以包括：将反应后的体系的温度从0℃逐渐升至室温，然后继续搅拌2-5小时。将反应后的体系用饱和的食盐水洗涤，并用萃取溶剂(如二氯甲烷)进行萃取，合并有机相浓缩，之后经柱层析分离。
本发明中，化合物22和化合物14的制备为本领域技术人员熟知，本发明对化合物22和化合物14的制备不做特别的限制，可以参照本领域常规的方式进行。
根据本发明的第一、第二缀合物，其中所述活性功能性寡核苷酸可选自以下核酸物质：小干扰RNA、微小RNA、单链RNA、反义核酸、诱导寡核苷酸、茎环RNA等。其中，所述功能性寡核苷酸为单链寡核苷酸或者双链寡核苷酸所组成。本发明中的小干扰RNA选自双链寡核苷酸，其中包含一个正义链和一个反义链，正义和反义链为互补，即在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以氢键相互作用形成互补方式配对。
本发明中，前述第一缀合物和第二缀合物均可以为核酸缀合物。优选情况下，所述核酸缀合物为包含以下序列的SiRNA缀合物：
SNK-17的序列
正义链(S)：
5’-AfsmAsCfmAGfmUGfmUUfCfUfmUGfmCUfmCUfmAUfmAAf-EgGaGaGaC3(碱基序列如SQE ID NO：1所示)
反义链(AS)：
5’-mUsUfsmAUfmAGfmAGfmCAfmAmGmAAfmCAfmCUfmGUfmUsmUsmU(碱基序列如SQEID NO：2所示)
SNK-18的序列：
正义链(S)：
5’-AfsmAsCfmAGfmUGfmUUfCfUfmUGfmCUfmCUfmAUfmAAf-TriGalNac(碱基序列如SQE ID NO：1所示)
反义链(AS)：
5’-mUsUfsmAUfmAGfmAGfmCAfmAmGmAAfmCAfmCUfmGUfmUsmUsmU(碱基序列如SQEID NO：2所示)。
本发明中，上述序列中修饰的核苷酸可以通过商购获得，也可以自行修饰，且核苷酸的修饰方式为本领域技术人员熟知的，可以参照本领域常规的方式进行，本发明不做特别的限制。
本发明中，寡核苷酸缀合物可以采用如下方法制备，该方法包括在亚磷酰胺固相合成的条件下，分别按照所述寡核苷酸的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向将核苷单体依次连接，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；在一些实施方式中，所述方法还包含在偶联反应条件和偶联试剂存在下，将如式(101)所示的化合物与核苷单体或连接在固相载体上的核苷酸序列接触，从而使式(101)所示的化合物经偶联反应连接至核苷酸序列。其中，该方法还包含脱除保护基并与固相载体切割的步骤、分离纯化步骤、以及任选的退火步骤。
本发明中，在将所有核苷单体连接之后，退火之前，该方法还包括分离出siRNA的正义链和反义链。分离的方法为本领域技术人员所公知，一般包括将合成得到的核苷酸序列从固相载体上切割下来，脱除碱基上、磷酸基上和配体上的保护基团，纯化和脱盐。
本发明中，上述siRNA缀合物的制备过程中涉及的方法和具体条件为本领域技术人员熟知的，可以参照本领域常规的方式进行。
本发明还提供了前述化合物M、缀合物在制备小核酸药物中的用途；
优选地，所述小核酸药物中的小核酸的特定靶点基因可以选自PCSK9、HBV、TTR、AGT等。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，在没有特别说明的情况下，所有商购获得的原料、试剂直接使用，不做进一步的处理。有机溶剂通过旋转蒸发器在减压下浓缩。
化合物(101)按照如下路线制备
化合物2的合成
N-乙酰半乳糖胺四乙酸盐1(10g,25.68mmol)室温溶解在二氯乙烷(60mL)中，将三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(8.6g,38.66mmol)搅拌加入到上述溶液中，继续搅拌并将此溶液加热到50℃。在50℃条件下反应2小时后，停止加热，继续在室温下搅拌12小时。将反应后的溶液倒入含饱和碳酸氢钠的冰水中，并用二氯甲烷萃取，有机相经水洗涤。分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，得到棕黄色泡沫糖稀状化合物2。此化合物不必纯化，直接用于下一步反应。
化合物3的合成
将化合物2(5g,15.18mmol)与四乙烯醇(29.49g,151.8mmol)，对甲苯磺酸吡啶鎓(3.43g,13.66mmol)混合后，搅拌加热到80℃反应18小时。将反应溶液倒入体积比为1:1的饱和食盐水和饱和碳酸氢钠溶液中，用300mL的二氯甲烷萃取。分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压蒸到半干。用硅胶色谱纯化，使用一个梯度淋洗。先用二氯甲烷淋洗，然后用一个混合溶剂(二氯甲烷/甲醇，92:8，v/v)淋洗，减压抽干溶剂得到近白色的化合物3(3.61g,45.4％)。1H NMR(CDCl3):δ,6.79-6.77(1H,m),5.31-5.29(1H,m),5.11-5.08(1H,m),4.81-4.79(1H,m),4.22-4.10(7H,m),3.93-3.89(2H,m),3.86-3.81(1H,m),3.74-3.61(8H,m),2.17(3H,s),2.17-2.15(1H,s),2.12(4H,s),2.10(7H,m)。
1-O-二甲氧基三苯甲基-1,3-丙二醇(A-1)的合成
将4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(18g,0.053mol)溶解到至混合溶剂中(40mL的二氯甲烷,8.7mL的三乙胺，0.1mL的4-(二甲氨基)吡啶)。将1,3-丙二醇(21g,0.265mol)逐滴搅拌加入至上述溶液中，继续在室温下搅拌12小时。将反应液倒入100mL饱和食盐水中，用300mL的二氯甲烷萃取，分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压蒸到半干。用硅胶色谱柱纯化，使用一个梯度淋洗，先用混合溶剂(正己烷/乙酸乙酯，3:1,v/v)淋洗，然后用另一个混合溶剂(正己烷/乙酸乙酯，1:1,v/v)淋洗，减压抽干溶剂得到橙色的化合物1-O-二甲氧基三苯甲基-1,3-丙二醇(16g,80％)。1H NMR(CDCl3):δ,7.43-7.41(2H,m),7.33-7.27(6H,m),7.29-7.27(1H,m),6.85-6.82(4H,m),3.79-3.75(7H,m),3.29-3.27(2H,m),2.20-2.18(1H,br),1.88-1.83(2H,br),1.57(1H,s)。
化合物(101)的合成
将化合物3(687mg,1.31mmol)解在10mL的干燥二氯甲烷，然后迅速将N,N,N’N’-四异丙基氯亚磷酸酯(570mg,2.1mmol)和二异丙基乙胺(550mg,4.2mmol)加入到上面的溶液中。上述反应溶液在氮气保护下室温中搅拌20分钟。将1-O-二甲氧基三苯甲基-1,3-丙二醇(800mg,2.1mmol)溶解至5mL干燥二氯甲烷，然后倒入上述溶液中，同时加入乙硫四唑(70mg,0.525mmol)，继续在室温氮气保护下搅拌反应2小时。将反应后的溶液倒入饱和食盐水中，用2×60mL的二氯甲烷萃取，分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压蒸到半干。用硅胶色谱纯化，使用一个梯度淋洗，先用混合溶剂(正己烷/乙酸乙酯/三乙胺，48:48；4,v/v/v)淋洗，然后用另一个混合溶剂(乙酸乙酯/三乙胺，96:4,v/v)淋洗，减压抽干溶剂得到一个透明泡沫近白色的化合物101。1H NMR(CD3CN):δ,7.44-7.42(3H,m),7.32-7.30(6H,m),7.29-7.21(1H,m),6.87-6.84(4H,m),6.50(1H,m),5.28-5.27(1H,m),5.00-4.97(1H,m),4.65-4.63(1H,m),4.11-4.09(3H,m),4.07-4.06(3H,m),3.97-3.95(1H,m),3.76(6H,s),3.69-3.57(6H,m),3.56-3.50(8H,m),3.11-3.10(2H,m),2.21(4H,s),1.98(3H,s),1.97(3H,s),1.94(3H,s),1.85(4H,s),1.37-1.34(1H,m),1.28-1.27(1H,m),1.20(4H,m),1.14(4H,m),1.12(1H,m)。31P NMR(CD3CN):δ,147.95,147.41ppm。HRMS(ESI)m/z,C52H75N2O17P(M+Na++H+)/2理论值:527.56,实测值:527.20.
缀合物(603A)的合成
1、化合物7按照以下路线制备
化合物恶唑啉5的合成
N-乙酰半乳糖胺四乙酸盐4(10g,25.68mmol)室温溶解在二氯乙烷(60mL)中，将三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(8.6g,38.66mmol)搅拌加入到上述溶液中，继续搅拌并将此溶液加热到50℃。在50℃下反应2小时后，停止加热，继续在室温下搅拌12小时。将溶液倒入含饱和碳酸氢钠的冰水中，用二氯甲烷萃取，有机相经过水洗涤。分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压蒸干，得到棕黄色泡沫糖稀状化合物5。此化合物5直接用于下一步反应。
化合物6的合成
化合物恶唑啉5(4.26g,12.9mmol)室温溶解在二氯甲烷(20mL)中，在0℃条件下与溶解有叠氮-三聚乙二醇(3.4g,19mmol)的干燥二氯甲烷(20mL)的溶液混合搅拌。在0℃条件下缓慢加入三甲硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf,1.4g,6.45mmol)至上述溶液中并持续搅拌一小时。混合溶液继续在室温下搅拌14小时，然后将溶液到入含饱和碳酸氢钠的冰水中，用二氯甲烷萃取(2×50mL)，有机相经过水洗涤。分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压旋蒸浓缩至半干。用硅胶色谱柱继续纯化，使用一个梯度淋洗，先用混合溶剂(乙酸乙酯/甲醇，10:1,v/v)淋洗，收集产物组分，减压抽干溶剂得到近白色的化合物6(5.3g,81％)1H NMR(CDCl3):δ,6.15(d,1H,NH),5.32(d,1H,sugar-H-4’),5.07(dd,1H,J＝11.2Hz,J＝3.3Hz,sugar-H-3’),4.76(d,1H,J＝8.6Hz,sugar-H-1’),4.17(m,3H,sugar-H-2’,sugar-H-6’),3.91(m,2H,-CH2O),3.89(m,1H,suager-H-5’),3.76-3.61(m,8H,-CH2O),3.47(m,2H,-CH2N3),2.16(s,3H,-CH3,NHAc),1.99,2.00,2.05(3xs,9H,-CH3,Ac).HRMS(ESI)m/z,C20H32N4O11(M+H+)理论值：505.49,实测值:505.20.
化合物7的合成
叠氮化合物6(522mg,1.04mmol)溶解于10mL的乙酸乙酯中，Pd/C(80mg)，在氮气的保护下加入30mL的乙酸乙酯中。将反应瓶接通氢气球，经过多次氢气置换，在室温下，反应瓶与氢气球接通，反应溶液持续搅拌3小时。将Pd/C通过Celite过滤后，在反应瓶中缓慢滴加0.5mL的盐酸(2M),溶液在持续搅拌下反应30分钟，反应温度为0℃。在反应溶液中加入10mL的乙腈，共沸减压浓缩两次。将浓缩的溶液与二氯甲烷(10mL)混合，再次减压浓缩两次，得到一油状泡沫状粗产物7(500mg)，该粗产物将直接用于下一步反应，不需进一步纯化。1H NMR(CDCl3):δ,8.25(m,2H,-NH2),5.34(d,1H,sugar-H-4’),5.21(dd,1H,J＝11.2Hz,J＝3.3Hz,sugar-H-3’),4.91(d,1H,J＝8.5Hz,sugar-H-1’),4.12(m,3H,sugar-H-6’,sugar-H-2’),4.07(m,2H,sugar-H-5’,-NH),3.76(m,2H,-CH2O),3.68(m,2H,-CH2O),3.61(m,2H,-CH2O),3.58(m,4H,2x-CH2O),3.20(m,2H,NH2),2.09(s,3H,-NHCO2CH3),2.04,1.96,1.89(3x s,9H,-CO2CH3).HRMS(ESI)m/z,C20H34N2O11(M+H+)理论值：479.49,实测值:479.20.
2、化合物12按照以下路线制备
化合物9的合成
三羟甲基氨基甲烷8(10g,82.6mmol)溶解在15mL的二恶烷中，在反应溶液中搅拌滴加1.26mL的40wt％氢氧化钾水溶液，并继续在室温下加入20mL的二恶烷。在0℃下，向反应瓶中慢慢滴加丙烯腈(18mL,272mmol)，整个滴加过程大约1小时。反应溶液继续在室温下搅拌24小时。将反应溶液倒入饱和氯化钠的水溶液中，用二氯甲烷萃取(2×50mL)，有机相经过水洗涤。分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压旋蒸浓缩至半干。用硅胶色谱柱继续纯化，先用二氯甲烷淋洗，然后使用一个混合溶剂(二氯甲烷/甲醇，10:1,v/v)淋洗，收集产物组分。经过旋蒸减压浓缩，得到浅黄色油状物9(20g,86％)。1H NMR(CDCl3):δ,3.68(t,6H,J＝7.1Hz,3x-CH2O),3.44(s,6H,3x-CH2CNH2),2.61(t,6H,J＝6.2Hz,3x–CH2CN),1.70(s,2H,-NH2).HRMS(ESI)m/z,C13H20N4O3(M+H+)理论值：281.32,实测值:281.20.
化合物10的合成
三[(氰基乙氧基)甲基]氨基甲烷9(1.2g,4.28mmol)溶解在10mL的无水乙醇中，在室温下，缓慢向反应瓶中的溶液滴加2mL的浓硫酸和10mL的无水乙醇。反应溶液加热至80℃，保持反应溶液呈回流状态约36小时。将反应溶液冷却至室温后，加入25mL饱和碳酸氢钠冰溶液。减压旋蒸，将乙醇蒸出。水溶液用乙酸乙酯(2×50mL)进行萃取，所得的有机相经过无水硫酸钠干燥后，再经过减压旋蒸浓缩得到浅黄色的油状物10(0.8g,46％)，此粗产物直接用于下一步反应，不需进一步纯化。
化合物11的合成
将粗产物化合物10(0.8g,1.9mmol)溶解在20mL的二氯甲烷中。在反应溶液中加入二碳酸二叔丁酯(2mL,8.8mmol)和5mL的三乙胺。在室温下，搅拌反应溶液14小时。将反应溶液倒入含饱和碳酸氢钠的水溶液中，用二氯甲烷萃取(2×50mL)，有机相经过水洗涤。分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压旋蒸浓缩至半干，用硅胶色谱柱继续纯化，使用一个梯度淋洗，先用二氯甲烷溶剂洗涤，然后用(二氯甲烷/甲醇，96:4,v/v)淋洗，收集产物组分，减压抽干溶剂得到近白色的油状物11(0.5g,51％),1H NMR(CDCl3):δ,4.92(b,1H,-CONH-),4.14(m,3x2H,-CO2CH2-),3.69(m,3x2H,-OCH2-),3.63(s,3x2H,-OCH2-),2.53(m,3x2H,-COCH2-),1.45(s,3x3H,-CH3),1.26(t,3x3H,-CH2CH3).HRMS(ESI)m/z,C24H43NO11(M+H+)理论值:522.60,实测值:522.40.
化合物12的合成
将Boc保护的化合物11(0.6g,1.43mmol)溶解在20mL的无水乙醇中，缓慢向反应溶液中滴加4mL的氢氧化钠(4M)，保持反应溶液在0℃，并搅拌14小时。用液质时时监控反应进程，待反应物的峰消失，减压旋蒸，将乙醇蒸出后，将10mL硫酸氢钾(1M)加入反应溶液中继续搅拌15分钟在0℃。上述反应溶液用乙酸乙酯(2×50mL)进行萃取，所得的有机相经过无水硫酸钠干燥后，再经过减压旋蒸浓缩得到一个粘稠状物12(0.5g,81％)，此粗产物直接用于下一步反应，不需进一步纯化。1H NMR(CDCl3):d,9.40(b,3H,-CO2H),5.0(b,1H,-CONH-),3.70(m,m,3x2H,-OCH2-),3.65(s,3x2H,-OCH2-),2.60(m,3x2H,-COCH2-),1.42(s,3x3H,-CH3).HRMS(ESI)m/z,C18H31NO11(M+H+)理论值:438.32,实测值:438.20.
化合物14按照以下路线制备
化合物13的合成
将三羧酸12(0.5g,1.14mmol)溶解在20mL的二氯甲烷，并加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.3g,3.42mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.2g,3.95mmol),同时加入8mL的二甲基甲酰胺。将化合物胺7(2.19g,4.08mmol)溶解在5mL的二甲基甲酰胺中，并加入1mL的N,N-二异丙基乙胺。将上述两种溶液在室温下混合搅拌，并持续搅拌14小时。经过层析色谱检测，确定反应物完全消失。将20mL的饱和碳酸氢钠水溶液加入反应溶液中，并用2×50mL的二氯甲烷进行萃取，有机相经过旋蒸浓缩至半干，用硅胶色谱柱继续纯化，使用一个梯度淋洗，先用二氯甲烷溶剂洗涤，然后用(二氯甲烷/甲醇，85:15,v/v)淋洗，收集产物组分，减压抽干溶剂得到近黄色的油状粗品13(2g,86％).将粗产物13进一步用反相色谱柱纯化，淋洗溶剂为(H2O/MeOH,1:1,v/v),收集产物组分，经过旋蒸浓缩至全干，得到化合物13(1.24g,60％)。1H NMR(CDCl3):δ,5.32(d,3H,J＝3.0Hz,sugar-H-4’),5.18(dd,3H,sugar-H-3’),4.78(d,3H,sugar-H-1’),4.18-4.06(m,24H,-OCH2,sugar-H-5’),3.93(m,9H,sugar-2xH-6’,sugar-H-2’),3.77,3.64,3.46(m,6H,-CH2NH-),2.44,2.20(m,6H,-COCH2-),2.15(s,9H,-NHCOCH3),2.09(s,2H,-CH2-),2.05,1.99,1.95(3xs,27H,-OCOCH3),1.81(s,9H,CH3,Boc).HRMS(ESI)m/z,C78H127N7O41(M+2H+)/2,理论值:910.1,实测值:910.0.
化合物14的合成
将纯化的化合物13(2g,1.1mmol)溶解在30mL的二氯甲烷中，缓慢将1mL的盐酸溶液(4M)和1mL的二恶烷在0℃的温度下加入至上述的二氯甲烷反应液中。上述反应溶液在0℃的温度下持续搅拌30分钟，然后在室温下继续搅拌30分钟。旋蒸浓缩至全干，得到白色泡沫状粗产物14(1.7g,90％),粗产物直接用于下一步反应，不需进一步纯化。1H NMR(CDCl3):δ,8.20(b,2H,-NH2),5.35(d,3H,J＝3.0Hz,sugar-H-4’),5.22(dd,3H,sugar-H-3’),4.80(d,3H,sugar-H-1’),4.13(m,9H,sugar-2xH-6’,sugar-H-2’),3.94-3.44(m,24H,-OCH2,sugar-H-5’),3.77,3.64,3.46(m,6H,-CH2NH-),2.55,2.43(m,6H,-COCH2-),2.15(s,9H,-NHCOCH3),2.09(s,2H,-CH2-),2.05,1.98,1.96(3xs,27H,-OCOCH3).HRMS(ESI)m/z,C73H119N7O39(M+H+)/2,理论值:860.4,实测值:860.0.
化合物21按照以下路线制备
化合物16的合成
将4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(1.8g,5.3mmol)溶解在5mL的二氯甲烷中，在室温条件下，将此溶液缓慢滴加入含有3-羟基-2-羟基甲基-2-甲基-丙酸15(0.8g,5.97mmol)的无水吡啶(10mL)溶液中。在室温条件下持续搅拌上述溶液14小时。将20mL水加入到反应混合物中，用2×50mL的乙酸乙酯进行萃取。有机相经过旋蒸浓缩至半干，用硅胶色谱柱继续纯化，使用一个梯度淋洗，先用正己烷溶剂洗涤，然后用(正己烷/乙酸乙酯，1:1,v/v)淋洗，收集产物组分，减压抽干溶剂得到黄色固体16(1.5g,58％).产物16直接用于下一步反应。
化合物19的合成
将己二酸单甲酯17(0.16g,1mmol)和N-(叔丁氧羰基)-1,3-二氨基丙烷N-(3-氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯18(0.174g，1mmol)在室温条件下溶解在5mL的无水四氢呋喃中。将上述溶液与0.892mL的1-丙基磷酸环酐(0.892mL，1.5mmol，在50％(体积比例1:1)乙酸乙酯)和0.522mL的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，0.522mL,3mmol)混合。将上述混合的反应溶液在室温下持续搅拌30分钟，然后向反应溶液中加入20mL的乙酸乙酯稀释，同时加入20mL的饱和食盐水，并用2×20mL的乙酸乙酯进行萃取。分出有机相，加无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至全干，得到淡黄色泡沫状粗产物19(0.29g,91％),粗产物19直接用于下一步反应，不需进一步纯化。1H NMR(CDCl3),δ,5.89(b,1H,-CONH-),4.97(b,1H,-NHCO-),3.75(s,3H,-CH3),3.27(m,2H),3.15(m,2H),2.34(m,2H),2.19(m,2H),1.67(m 2x2H),1.64(m,2H),1.4(s,9H).HRMS(ESI)m/z,C15H28N2O5,理论值:316.39,实测值:316.40.
化合物20的合成
将化合物19(0.8g,2.5mmol)溶解在5mL的乙酸乙酯中，将此反应溶液与3.2mL的盐酸(4M)水溶液混合，再加入5mL的二恶烷。在室温条件下，将此混合反应溶液持续搅拌30分钟。经过旋蒸浓缩后，得到粘稠状得粗产品20(0.5g,92％)，直接用于下一步反应。
化合物21的合成
将上述粗产品化合物20(0.252g,1mmol)溶解在5mL的二甲基甲酰胺中，在0℃下，将上述反应液与3-O-4,4'-二甲氧基三苯甲基-2-羟基-2-甲基丙酸16(0.45g,0.9mmol)混合，并加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.46g,1.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.52mL)，搅拌20分钟。缓慢将上述反应溶液的温度升至室温，持续搅拌14小时。反应溶液与20mL的饱和氯化钠水溶液混合，并用2×50mL的乙酸乙酯萃取，有机相经过无水硫酸钠干燥后，再经过减压旋蒸浓缩得到粗产物21。用硅胶色谱柱继续纯化，使用一个梯度淋洗，先用乙酸乙酯溶剂洗涤，然后用(乙酸乙酯/甲醇，90:10,v/v)淋洗，收集产物组分，减压抽干溶剂得到化合物21(0.38g,61％)。1H NMR(CDCl3):δ,8.01(b,1H,-CONH-),7.26(m,4H,Trityl),7.05(m,4H,Trityl),6.67(m,4H,Trityl),6.48(b,1H,-NHCO-),5.25(s,3H,-OCH3),3.78(s,6H,2x-OCH3),3.64(s,4H,2X-CH2-),3.26(m,2H,-NHCH2-),3.17(m,2H,-CH2NH-),2.79(m,3H,-OCH3),2.31(m,2H),2.18(m,2H),1.65-1.56(m,6H),1.25(s,3H).HRMS(ESI)m/z,C36H46N2O8,(M+Na+)理论值:657.34,实测值:657.40.
化合物(603A)按照以下路线制备
化合物22的合成
将纯化的化合物21(0.7g,1.1mmol)溶解在5mL的无水甲醇中，然后将1.5mL的氯化锂的甲醇溶液(2M)在0℃下缓慢加入反应溶液中。在0℃的条件下搅拌30分钟，然后将反应溶液升温至室温，继续在室温条件下搅拌2小时。在室温条件下，将反应溶液与2mL的水混合后，经过旋蒸浓缩至半干，将甲醇除去，然后用制备反相高压液相色谱进行分离，流动相溶剂是甲醇和水(MeOH:H2O,1:1,v/v)。收集产物组分，减压抽干溶剂得到黄色固体化合物22(0.66g,93％)。1H NMR(CDCl3):δ,7.38(m,4H,Trityl),7.29(b,1H,-CONH-),7.28(m,5H,Trityl),7.16(b,1H,-NHCO-),6.79(m,4H,Trityl),3.76(s,10H,2x-OCH3,2x–CH2),3.71(m,2H,-CH2-),3.21(m,2H,-NHCH2-),2.07(m,2H,-CH2NH-),1.87(m,2H),1.50(m,2H),1.27(m,2H),1.21(s,3H).HRMS(ESI)m/z,C35H43N2O8,(M+H++Na+)理论值:643.72实测值:643.20.
化合物(603A)的合成
将纯化的化合物22(0.65g,1.04mmol)溶解在15mL的二氯甲烷中，然后在室温下，将上述溶液与0.723mL的N,N-二异丙基乙胺(4.16mmol)混合。在0℃条件下，将此混合溶液与纯化的化合物14(1.83g,1.04mmol)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.435g,1.1mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.723mL,4.16mmol)混合并搅拌30分钟。继续在0℃条件，向反应溶液中加入1mL的N,N-二异丙基乙胺，并持续搅拌反应溶液1小时。将反应温度从0℃逐渐升至室温，然后继续搅拌2小时。反应溶液与5mL的饱和氯化钠水溶液混合，并用2×50mL的二氯甲烷萃取，有机相经过无水硫酸钠干燥后，再经过减压旋蒸浓缩得到粗产物603A。用硅胶色谱柱继续纯化，使用一个梯度淋洗，先用二氯甲烷溶剂洗涤，然后用(二氯甲烷/甲醇/三乙胺，94:5:1,v/v/v)淋洗，收集产物组分，减压抽干溶剂得到黄色固体化合物603A(1.56g,65％)。1H NMR(CDCl3):δ,7.38(m,3H,-NH-),7.28(m,4H,trityl),7.26(m,1H,-NH-),7.18(m,1H,-NH-),6.84(m,5H,trityl),6.37(m,4H,trityl),5.33(m,3H,sugar-H-4’),5.16(dd,J＝3.4Hz,J＝11.3Hz,3H,sugar-H-3’),4.77(d,J＝8.4Hz,3H,sugar-H-1’),4.18-4.07(m,3x2H,3x1H,sugar-H-5’,sugar-H-6’),3.94(m,3H,sugar-H-2’),3.77-3.53(m,14H),3.42(m,2H,-NHCH2-),3.30-3.19(m,2H,-CH2NH-),2.42(m,2H),2.19(m,4H),2.15(s,9H),2.07(m,2H),2.05(s,9H,2.01(s,9H),1.96(s,9H),1.20(s,3H).HRMS(ESI)m/z,C87H143N9O44,(M-trityl+H+)/2,理论值:1010.55,实测值:1010.4.
按照以下路线制备缀合物(603B)三乙胺羧酸盐
将化合物(603A)(1.5g,0.646mmol)溶解在30mL的干燥二氯甲烷，然后加入5mL的三乙胺。将4-二甲氨基吡啶(0.159g,1.3mmol)搅拌溶解在反应溶液中，在室温下将丁二酸酐(0.13g,1.3mmol)搅拌溶解在反应溶液中，搅拌反应8小时。继续加入丁二酸酐(32mg,0.32mmol),并在室温下继续搅拌14小时。将上述反应后的溶液倒入饱和食盐水中，用2×50mL的二氯甲烷萃取，分出有机相，加无水硫酸钠干燥，减压蒸到半干。用硅胶色谱纯化，使用一个梯度淋洗，先用混合溶剂(二氯甲烷/甲醇/三乙胺，100:2；1,v/v/v)淋洗，继续用混合溶剂(二氯甲烷/甲醇/三乙胺，100:5:1,v/v/v)淋洗，最后用混合溶剂(二氯甲烷/甲醇/三乙胺，100:5:1,v/v/v)淋洗出终产物，减压抽干溶剂得到一个白色的化合物(603B)(1.56g,65％)。1H NMR(CDCl3)δ,1H NMR(CDCl3):δ,7.39(m,3H,-NH-),7.28(m,5H,trityl),7.22(m,1H,-NH-),7.10(m,1H,-NH-),6.80(m,4H,trityl),6.37(m,4H,trityl),5.32(m,3H,sugar-H-4’),5.29(s,2H),5.15(dd,J＝3.4Hz,J＝11.3Hz,3H,sugar-H-3’),4.77(d,J＝8.4Hz,3H,sugar-H-1’),4.18-4.07(m,3x2H,3x1H,sugar-H-5’,sugar-H-6’),3.94(m,3H,sugar-H-2’),3.67(m,9H),3.61-3.53(m,42H),3.42(m,2H,-NHCH2-),3.30-3.19(m,2H,-CH2NH-),2.42(m,2H),2.19(m,4H),2.15(s,9H),2.07(m,2H),2.05(s,9H,2.01(s,9H),1.96(s,9H),1.23(s,3H).HRMS(ESI)m/z,C112H165N9O49,(M-H+)/2,理论值：1209.27实测值:1209.83。
按照以下工艺路线通过将(603B)缀合分子连接至固相载体，制备(603C)缀合分子的固相载体
将缀合物半丁二酸酯(603B)(50mg,0.021mmol)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(10mg,0.026mmol)在室温下溶解于1.25mL的无水乙腈。将N,N-二异丙基乙胺(10μL)加入反应溶液中，待所有试剂溶解后，将125mg的长链胺基烷烃玻璃沙(500°A,native lcaa-CPG,厂商Chemgenes,USA)加入到上述反应溶液中。在室温下，将固、液两相旋转搅拌300转/分钟。反应持续2小时后，将残留液滤出，用乙腈洗涤长链胺基烷烃玻璃沙固相载体三次(3×1mL)。将0.5mL的盖帽试剂A(乙酸酐)的四氢呋喃溶液，浓度为(10％,v/v)和0.5mL的盖帽试剂B(N-甲基咪唑在吡啶和乙腈的混合溶剂，浓度为(15:10:75,v/v/v))与长链胺基烷烃玻璃沙在室温下旋转搅拌1小时。过滤出反应液，将长链胺基烷烃玻璃沙固相载体用乙腈淋洗3次，用真空油泵使长链胺基烷烃玻璃沙固相载体在减压下干燥2小时。得到玻璃沙固相载体(603C,130mg)。称量长链胺基烷烃玻璃沙603C固相载体(8.3mg),加入到100mL的3％的三氯乙酸的二氯甲烷溶液中，旋转搅拌30秒，静置1分钟。取上清液在498nm处测量可见光吸收，其光吸收度为0.309，计算出缀合物603C的载量(也即(603B)在CPG上的载量)为53.25μmol/g。
TTR siRNA正义和反义序列的制备(siRNA缀合物的制备)
本发明中的小干扰RNA选自双链寡核苷酸，其中包含一个正义链和一个反义链，正义和反义链为互补，即在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以氢键相互作用形成互补方式配对。在双股螺旋的寡核苷酸中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(G)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(C)相配对。两条互补链的序列为从5’-到3’-，另一为从3’-到5’-排序走向。小干扰RNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，修饰是指2’-的羟基被其他基团取代。核苷酸2’-位置的修饰可选自2’-甲氧基、2’-氟、2’-甲氧乙基、2’-2,4-二硝基苯酚、2’-胺基、2’-4’-环锁乙基等基团。序列中每个核苷之间是由磷酸二酯键链接，其中磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代可形成硫代磷酸二酯键。正义链和一个反义链序列长度通常由19(或21)个核苷酸组成，并以互补方式形成双股配对。正义链核苷序列为靶mRNA中的一段核苷酸。反义链中通常连有连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸或连续的2个尿嘧啶核苷酸。靶mRNA通常指细胞中蛋白异常表达的基因中的mRNA。
功能性寡核苷酸缀合物的制备，可以按照图1所示的流程制备：
按照亚磷酰胺固相合成的方法，根据上述序列顺序按照从3'-5'的方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包括脱保护、偶联、盖帽、和氧化四步反应。
固相合成试剂配制：
脱保护试剂为三氯乙酸或二氯乙酸的二氯甲烷溶液(3％,v/v).核苷单体溶解在无水乙腈，浓度为(0.05M-0.1M)，适量加入少量分子筛3A°做无水处理。耦联活化剂为5-乙基硫基1H-四氮唑(5-Ethylthio-1H-Tetrazole)的无水乙腈，浓度为(0.25M,或0.45M)，活化剂也可选1H-四氮唑(Tetrazole)；5-苄硫基四氮唑(5-Benzylthio-1H-Tetrazole)；4,5-二氰基咪唑(4,5-Dicyanoimidazole)。盖帽试剂A为乙酸酐的四氢呋喃溶液，浓度为(10％,v/v)。盖帽试剂B为N-甲基咪唑在吡啶和乙腈的混合溶剂，浓度为(15:10:75,v/v/v)。氧化试剂为碘的水和吡啶溶液(0.05M,95wt％的吡啶水溶液)。硫化试剂为N-Dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazoline-3-thione((二甲基氨基-亚甲基)氨基-3H-1-2,4-噻唑-3-硫酮),浓度为(0.05M,吡啶/乙腈,2:3,v/v)。切割脱保护试剂为28wt％浓氨水。
其中，核苷酸固相合成的固相载体为市售的通用固相载体(HLUnyLinkerTM 300，或500°A,native lcaa-CPG,厂商Chemgenes,USA)。
固相合成的步骤：
在合成仪上固相载体或与载体相联的核苷单体上的4,4'-二甲氧基三苯甲基保护基与三氯乙酸的二氯甲烷的溶液(3％,v/v),摩尔比为(1:30)。室温固相反应1.5分钟，反复操作三次，待固相载体的洗脱液颜色由红色变成无色停止滴加脱保护液。经过用无水乙腈反复洗涤后，加入核苷单体和活化剂(耦联活化剂,5-乙硫基四氮唑)(核苷单体和活化剂的比例(摩尔比为1:20),固相载体和核苷单体的摩尔比为1:(5-6)。室温试剂和固相反应时间为3-4分钟为一个循环，两个循环后，停止反应。用无水乙腈洗涤后，加入氧化试剂溶液，固相载体和氧化剂的摩尔比为1:6。室温下氧化试剂与固相载体反应时间约为2分钟，重复操作两次。在耦合反应之后，如需硫化反应步骤，加入硫化试剂溶液，固相载体和硫化剂的摩尔比为1:6。室温下氧化试剂与固相载体反应时间约为4-5分钟，重复操作两次。盖帽保护反应，加入盖帽反应试剂，固相载体和盖帽试剂的摩尔比为1:80。室温下盖帽试剂与固相载体反应时间大约为1-2分钟，重复操作两次。循环上述脱保护、耦合、氧化、盖帽步骤，直到完成最后一个核苷酸的耦合。将在由载有核酸序列正义链或反义链的固相载体转移至小玻璃瓶中，加入28％氨水溶液，并将玻璃盖旋紧密封，在55℃的温度下，将正义链或反义链中的碱基保护基水解脱掉，同时将正义链或反义链与固相载体水解分离。反应持续16个小时。将所得到的小核酸序列链溶液与固相载体过滤分离。经过浓缩后，得到小核酸序列链的粗产物。
用制备高压液相色谱纯化分离和脱盐
使用制备型阴离子交换色谱柱(Source 15Q)，通过NaBr的梯度洗脱纯化小核酸。流动相A:20mM磷酸钠(pH 8.0),流动相B:20mM磷酸钠(pH 8.0),1M溴化钠在10％乙腈的水溶液。柱温是65℃。流速为10mL/min。淋洗梯度是起始为流动相A，随后流动相B从0％在12分钟增至20％。之后的15分钟，将流动相B从20％增至到50％。收集产品洗脱液，并进行组分分析和组分合并。采用反相色谱纯化柱进行脱盐，或透析脱盐。经过浓缩和冷冻干燥，得到纯化的小核苷酸。对于上述合成的正义链和反义链，使用阴离子交换液相色谱(AEX-HPLC)检测纯度，并以反相液质联用色谱(LC-MS)鉴定分析全序列分子量，分子量的实测值与理论值相符，确认所合成的核酸序列。
退火
将所合成的正义链(S链)与反义链(AS链)以等摩尔比混合在注射用生理盐水中，在90℃温度下加热5分钟，随后缓慢至冷却至室温，保存在4℃冰箱中12小时，使其通过氢键形成双链结构，即可得到siRNA缀合物(SNK-17的序列和SNK-18的序列)。
靶向鼠TTR siRNA为编号为SNK-17的序列:
正义链(S)：
5’-AfsmAsCfmAGfmUGfmUUfCfUfmUGfmCUfmCUfmAUfmAAf-EgGaGaGaC3(碱基序列如SQE ID NO：1所示)
反义链(AS)：
5’-mUsUfsmAUfmAGfmAGfmCAfmAmGmAAfmCAfmCUfmGUfmUsmUsmU(碱基序列如SQEID NO：2所示)
靶向鼠TTR siRNA为编号为SNK-18的序列：
正义链(S)：
5’-AfsmAsCfmAGfmUGfmUUfCfUfmUGfmCUfmCUfmAUfmAAf-TriGalNac(碱基序列如SQE ID NO：1所示)
反义链(AS)：
5’-mUsUfsmAUfmAGfmAGfmCAfmAmGmAAfmCAfmCUfmGUfmUsmUsmU(碱基序列如SQEID NO：2所示)
S：正义链；AS：反义链
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m右侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸(即核苷酸的戊糖2’-OH被甲氧基取代)；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸(即核苷酸的戊糖2’-OH被氟取代)；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸二酯键连接(即磷酸二酯键中的非桥氧原子被硫原子取代)；左右相邻的两个核苷酸之间没有其他字母均表示为磷酸二酯键连接。TriGalNac表示式(603)中除Nu之外的部分，Eg为乙二醇，三个Ga表示单一N-乙酰半乳糖胺(式(101))制备(通过固相合成的方式)得到的(606)，C3为1,3-丙二醇。
液质分析数据确认，SNK-17的序列中正义链(S)，HRMS(ESI)m/z理论值为：8704.23；实测值为:8704.0；SNK-17的序列中反义链(A)，HRMS(ESI)m/z理论值为：7595.43,实测值为：7595.0。SNK-18的序列中正义链(S)，HRMS(ESI)m/z理论值为：8503.94；实测值为:8503.1；SNK-18的序列中反义链(A)，HRMS(ESI)m/z理论值为：7595.43,实测值为：7595.0。
活性测试(靶向鼠TTR的生物活性测试)
雌性C57BL/6小鼠(4-6周年龄)按照体重随机分组，在第0天注射5mg/kg上述得到的siRNA缀合物(SNK-17)，在第21天杀死小鼠后取肝脏组织，根据RNAeasy Mini试剂盒(QIAGEN,货号74104)的操作指示提取RNA。对照组采用注射无药物的生理盐水的方式进行。根据High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Thermo Fisher,货号：4368814)的建议做RT-PCR,每个反应内含1微克RNA。用实时荧光PCR法测基因表达定量，鼠TTR的TaqMan探针为Mm00443267_m1，内参基因(鼠HPRT)的探针为Mm03024075_m1(Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)。PCR条件为95℃ 20秒1个循环，95℃ 1秒和60℃ 20秒40个循环，实时荧光PCR仪为StepOne Plus(Thermo Fisher)。TTR基因表达是以2^-ΔΔCt计算，鼠HPRT基因表达作为内参。TTR基因表达量以和对照组小鼠肝TTR基因表达为对照(见图2)。
雌性C57BL/6小鼠(4-6周年龄)按照体重随机分组，在第0，2，4天注射5mg/kgsiRNA(SNK-18)，在第21天杀死小鼠后取肝脏组织，根据RNAeasy Mini试剂盒(QIAGEN,货号74104)的操作指示提取RNA。对照组采用注射无药物的生理盐水的方式进行。根据HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kits(Thermo Fisher,货号：4368814)的建议做RT-PCR,每个反应内含1微克RNA。用实时荧光PCR法测基因表达定量，鼠TTR的TaqMan探针为Mm00443267_m1，内参基因(鼠HPRT)的探针为Mm03024075_m1(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)。PCR条件为95℃20秒1个循环，95℃1秒和60℃20秒40个循环，实时荧光PCR仪为StepOne Plus(Thermo Fisher)。TTR基因表达是以2^-ΔΔCt计算，鼠HPRT基因表达作为内参。TTR基因表达量以和对照组小鼠肝TTR基因表达为对照(见图3)。
从图2和图3可以看出，本发明的缀合物具有定向递送小核酸的性能，在体内的稳定性强。进一步的实验显示，本发明提供的双链寡核苷酸或寡核苷酸缀合物在体内具有更高的稳定性、更低的毒性和/或更高的肝脏TTR mRNA表达的抑制活性。
采用正义链碱基序列为5’-CUAGGAGGCUGUAGGCAUAAA-3’(SEQ ID NO：3)且反义链碱基序列为5’-UUUAUGCCUACAGCCUCCUAG-3’(SEQ ID NO：4)的siRNA-100作为活性药物Nu能够获得更优的抑制乙肝病毒的复制的效果。进一步地，按照如下方式对siRNA-100进行修饰使得修饰后的siRNA具有更稳定的核酸结构、更高特异性和亲和力的碱基配对；且具有以下修饰的siRNA表现出更为优异的体内抑制效果，能够进一步降低本发明的siRNA在体内的免疫原性(详见发明名称为“靶向乙肝病毒的核酸及其用途”的说明书)：
5’-CsUsAGGAGfGCfUGfUAGGCAUAAA-3’
5’-UsUfsUAfUGfCCUACAGCfCUfCCUAGsUsU-3’
其中，小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2’-氟修饰的核苷酸(即核苷酸的戊糖的2’-OH被氟取代)；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间通过硫代磷酸二酯键连接(即磷酸二酯键中的非桥氧原子被硫原子取代)；下划线标记的核苷酸代表该核苷酸的2’羟基被甲氧基取代。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种化合物M，其特征在于，该化合物M具有式(V)或(V’)所示的结构：
式(V)或(V’)中，
A为适配体，具有来自糖或多肽的结构；
L1为长度为1-50个碳原子的具有醚键和/或酰胺键的直链基团；
Z具有来自第一磷化合物的结构，所述第一磷化合物选自亚磷酰胺、H-磷酸酯和磷酸三酯中的一种，并且能够通过磷酸酯键或磷酰胺二酯键以共价键的方式与相邻的基团连接；
L2由具有式(I)、(II)、(III)或(IV)所示的结构提供：
其中，式(I)、(II)、(III)或(IV)中Ra各自独立地为H或羟基保护基；
式(I)中的R1和R2、式(II)中R4均具有共价键的连接位点；
式(III)或(IV)中，n为1-10的整数；
式(II)、(III)或(IV)中，表示通过活性位点连接活性基团后得到的结构；其中，所述活性位点为通过共价键连接的位点；所述活性基团选自亚磷酰胺基、H-磷酸酯基、磷酸酯基和多羟基烷基中的一种；
所述化合物M不为具有以下结构的化合物：
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，L2由具有选自式(A1)-(A24)所示结构中的一种结构提供：
其中，式(A2)-(A24)中m或n各自独立地为1-10的整数；表示通过活性位点连接活性基团后得到的结构；其中，所述活性位点为通过共价键连接的位点；所述活性基团选自亚磷酰胺基、H-磷酸酯基、磷酸酯基和多羟基烷基中的一种；
式(A2)-(A24)中，-OH表示羟基或被羟基保护基保护的羟基，所述羟基保护基选自4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基和4-戊烯酰基和酰氧基烷基中的一种；
和/或，L1选自以下基团中的一种：-O-[CH2CH2O]n-、-[CH2]m-CONH-[CH2]nO-和-O-[CH2CH2O]m-CONH-[CH2]nO-；其中，m和n各自独立地为1-10的整数；
和/或，所述糖选自单糖、二糖、三糖和多糖中的一种；优选地，所述糖为N-乙酰基半乳糖胺；
和/或，Z具有式(B1)、(B2)、(B3)、(B4)、(B5)或(B6)所示的结构：
其中，式(B3)中的M选自三乙胺、三甲胺、三异丙胺和三丙胺中的一种；其中，式(B4)-(B6)中的R’各自独立地选自2,2,2-三氯乙基、苯基、邻氯苯基、氰乙基和Nu中的一种；Nu为活性药物；(B1)、(B2)、(B3)或(B4)中表示通过共价键连接的位点。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中，所述化合物M具有式(101)、(102)、(201)、(202)、(203)、(301)或(302)所示的结构：
4.一种缀合物N，其特征在于，所述缀合物N具有式(VI)所示的结构：
(M)m-R”(VI)
式(VI)中，m为1-4的整数，M具有来自权利要求1中式(V)或(V’)所示结构的化合物提供，且当m大于1时，多个M相同或不同；
R”具有能够与Nu相连接的活性位点；优选地，Nu为活性药物；
优选地，所述缀合物N具有式(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示的结构：
其中，式(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中，
n、n1或n2各自独立地为1-10的整数，优选为1-6的整数；m各自独立地为1-10的整数，优选为1-4的整数；X为氧原子或硫原子；
L1’是长度为1-50个碳原子的具有醚键和/或酰胺键的直链基团；
A’为适配体，具有来自糖或多肽的结构；
式(a)中，R5各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；
式(c)中，R6选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基或C1-C10烷氧基；R7为H或羟基保护基，所述羟基保护基选自4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、4-戊烯酰基和酰氧基烷基中的一种，优选地，R7为2-氰基乙基；
式(e)中，R8为H或羟基保护基，所述羟基保护基选自4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、4-戊烯酰基和酰氧基烷基中的一种，优选为2-氰基乙基；
其中，表示通过共价键与Nu或相邻的基团连接的位点，或者表示通过共价键连接了Nu的基团。
5.一种缀合物T，其特征在于，该缀合物T具有式(VIII)所示的结构：
式(VIII)中，M1、M2和M3至少一个具有来自化合物M的结构，其中，所述化合物M的结构与权利要求1-3中任意一项定义相同；或者，M1、M2和M3各自独立地由权利要求1-3中任意一项所述的A、L1、L2或Z以任意数量任意方式连接后得到；M1、M2和M3相同或不同；
优选地，M1、M2和M3均具有来自权利要求1-3中任意一项所述的化合物M的结构，相同或不同；
L3由具有式(VII)所示的结构提供：
其中，Y为取代或未取代的长度为1-10个碳原子的直链基团，其中一个或多个碳原子任选地被一个或多个-CONH-所替换；优选地，Y为-CONH-或-CH2-；
式(VII)中，Ra’各自独立地为H或羟基保护基；所述羟基保护基选自4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、4-戊烯酰基和酰氧基烷基的一种；
R9和R10各自独立地为H或长度为1-70个碳原子的端基含有羟基和/或被羟基保护基保护的羟基的直链基团，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O和S；并且其中，R9和R10各自独立地任选地具有以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10的烷基、C6-C10的芳基、C5-C10的杂芳基、C1-C10的卤代烷基、-OC1-C10的烷基、-OC1-C10的烷基苯基、-C1-C10的烷基-OH、-OC1-C10的卤代烷基、-SC1-C10的烷基、-SC1-C10的烷基苯基、-C1-C10的烷基-SH、-SC1-C10的卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10的烷基-NH2、-N(C1-C10的烷基)(C1-C10的烷基)、-NH(C1-C10的烷基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10的烷基)、-CON(C1-C10的烷基)(C1-C10的烷基)、-CONH(C1-C10的烷基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10的烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10的烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10的卤烷基、-OC(O)C1-C10的烷基、-SO2(C1-C10的烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10的卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10的烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10的烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10的卤代烷基)；
优选地，R9和R10各自独立地具有选自以下基团中的一种或多种的基团以任意数量任意方式连接后得到的基团：
-NH2-、-CH2-、-O-、-CONH-、-(OCH2CH2)n-、Z’、
优选地，Z’具有来自第二磷化合物的结构，并且通过磷酸酯键或磷酰胺二酯键以共价键的方式与其他基团连接；
优选地，Z’具有式(C1)或(C2)所示的结构：
优选地，Q和Q’各自独立地为O或S；R11和R12各自独立地选自H、C1-C10的烷基、C1-C10卤代烷基、或C1-C10烷氧基；并且其中，R11和R12各自独立地含有如下所述的基团：腈基、氨基、羟基、羧基或酰胺基；
更优选地，R9和R10各自独立地具有式(D1)、(D2)或(D3)所示的结构：
其中，m为0-6的整数；M+为三乙胺阳离子；
式(D1)-(D3)中，Rk’各自独立地选自H、羟基保护基或Nu；所述羟基保护基选自4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、4-戊烯酰基和酰氧基烷基中的一种；Nu为活性药物。
6.根据权利要求5所述的缀合物，其中，所述L3由具有式(E1)-(E12)所示的结构提供：
其中，式(E1)-(E12)中，m和n为1-10的整数；Rb-Rk和Rk’各自独立地选自H、羟基保护基或Nu；所述羟基保护基选自4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、4-戊烯酰基和酰氧基烷基中的一种；Nu为活性药物。
7.根据权利要求5或6所述的缀合物，其中，所述缀合物T具有式(IX)或式(X)所示的结构：
式(IX)或式(X)中，A、L1、L2或Z’的结构与权利要求1-3和5中任意一项定义相同；Z’具有来自权利要求5或6中所示的化合物Z’的结构。
8.根据权利要求5或6所述的缀合物，其中，所述缀合物T具有式(IX-1)所示的结构：
式(IX-1)中，m和n各自独立地为0-6的整数；Rt和Rt’各自独立地选自H、羟基保护基、活性药物Nu、固相载体、C2-C6的羧基、羧酸盐或酰胺基；所述羟基保护基优选选自4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、4-戊烯酰基和酰氧基烷基中的一种。
9.根据权利要求5或6所述的缀合物，其中，所述缀合物T具有式(601)、(602)、(603)、(604)或(605)所示的结构：
式(601)、(602)、(603)、(604)或(605)中，X为氧原子或硫原子。
10.一种缀合物，其特征在于，所述缀合物具有式(X-1)或式(607)所示的结构：
式(X-1)中，m和n各自独立地为0-6的整数；Rt选自H、羟基保护基、活性药物Nu、固相载体、C2-C6的羧基、羧酸盐或酰胺基；所述羟基保护基优选选自4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、4-氧戊烷酰基、2-氰基乙基、4-戊烯酰基和酰氧基烷基中的一种；
式(607)中，X为氧原子或硫原子，Nu为活性药物。
11.根据权利要求10所述的缀合物，其中，所述缀合物具有式(606)所示的结构：
式(606)中，X为氧原子或硫原子。
12.权利要求1-3中任意一项所述的化合物M、权利要求4-11中任意一项所述的缀合物在制备小核酸药物中的用途；
优选地，所述小核酸药物中的小核酸的特定靶点基因选自PCSK9、HBV、TTR和AGT中的至少一种。
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