CN118852056A - 一种紫萁酮曼尼希碱类衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫萁酮曼尼希碱类衍生物及其合成方法和应用，属于有机化合物合成和医药的技术领域。本发明的紫萁酮曼尼希碱类衍生物的合成方法，包括在氢氧化钠/氢氧化钾/氢氧化锂提供的碱性条件下，3，4‑二羟基苯甲醛与丙酮反应生成紫萁酮，随后，紫萁酮与仲胺和醛在甲苯/乙醇/二甲基甲酰胺/乙腈/1，4‑二氧六环/四氢呋喃中发生曼尼希反应，生成曼尼希碱。本发明提供的制备方法合成路线简单，原料廉价易得，具有适用范围广、产率较高、易储存的优点，可以实现产业化生产，目标化合物性质稳定易于储存。上述制备方法制得的紫萁酮曼尼希碱类化合物可以在体外抑制肿瘤细胞增殖及迁移，促进肿瘤细胞凋亡，在Balb/C小鼠的4T1移植瘤模型上也有较好的抗肿瘤效果，并表现出生物安全性。
Description
技术领域
本发明属于有机化合物合成和医药的技术领域，具体涉及一种紫萁酮曼尼希碱类化合物及其合成方法和应用。
背景技术
如今，全球癌症的防治水平和治疗策略都在不断提升，但癌症特别是乳腺癌的发病率仍在增长，世界卫生组织最新的报告显示，乳腺癌发病率位居全球恶性肿瘤首位，化疗作为乳腺癌临床治疗的主要手段，效果已进入瓶颈期，应对乳腺癌仍面临着诸多问题和挑战。
虽然有研究表明从桑黄中提取而来的活性单体-紫萁酮对多种肿瘤细胞具有抑制活性，但应用紫萁酮并未缓解恶行肿瘤的发病率和死亡率，紫萁酮作为肿瘤治疗药物在临床中存在着局限性。
开发结构新颖、具有更强抑制肿瘤细胞增殖的效果以及具有良好体内外抗肿瘤活性的药物具有十分紧迫的现实需求。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明提供了一种紫萁酮曼尼希碱类衍生物及其合成方法和应用。该类化合物合成方法简单且高效，抗肿瘤活性强且毒性小，可以为医药领域提供较高的应用价值。
本发明还提出一种上述紫萁酮曼尼希碱类化合物的合成方法。
本发明还提出一种上述紫萁酮曼尼希碱类化合物的应用。
根据本发明的一个方面，提出了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，包括式(I)所示结构的化合物及其药学上可接受的盐：
其中，R1选自O、N-CH3、N-CH(CH3)2的一种；R2选自H、卤素、烷基、烷氧基和卤代烷基中的一种。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
本发明提供的紫萁酮曼尼希碱类化合物，在体内外的验证中均具有抗肿瘤效果。在体外对多种肿瘤细胞具有抑制活性，IC50值可达到10μM以下。在Balb/C小鼠的4T1移植瘤模型中，给予小鼠40mg/kg的药物，肿瘤的生长抑制率可达到46％，且与阳性药顺铂相比，毒性较小。
在本发明的一些实施方式中，所述式(I)中，当R1选自O时，R1选自H、卤素、烷基、烷氧基和卤代烷基中的一种。
在本发明的一些实施方式中，所述式(I)中，当R1选自N-CH3时，R1选自卤素和卤代烷基中的一种。
在本发明的一些实施方式中，所述式(I)中，当R1选自N-CH(CH3)2时，R1选自H、卤素、烷基、烷氧基和卤代烷基中的一种。
在本发明的一些实施方式中，所述式(I)中，当R2选自卤素时，所述卤素包括氟原子、氯原子和溴原子中的一种。
在本发明的一些实施方式中，所述式(I)中，当R2选自烷基时，所述烷基包括甲基。
在本发明的一些实施方式中，所述式(I)中，当R2选自烷氧基时，所述烷氧基包括甲氧基。
在本发明的一些实施方式中，所述式(I)中，当R2选自卤代烷基时，所述三氟甲基包括三氟甲基。
在本发明的一些实施方式中，所述紫萁酮曼尼希碱类化合物包括式A1-14、B1-14和C1-4所示结构化合物的至少一种：
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的盐包括与无机酸和有机酸形成的盐。
根据本发明的再一个方面，提出了所述紫萁酮曼尼希碱类化合物的合成方法，其特征在于，包括在碱催化剂的催化下，式(Ia)所示3，4-二羟基苯甲醛和式(Ib)即丙酮进行羟醛缩合反应，生成式(Ic)所示的紫萁酮，随后，紫萁酮与式(Id)所示的仲胺类化合物和式(Ie)所示的苯甲醛类化合物在甲苯/乙醇/二甲基甲酰胺/乙腈/1，4-二氧六环/四氢呋喃中发生曼尼希反应，得到如式(I)所示的紫萁酮曼尼希碱类化合物：
在本发明的一些实施方式中，仲胺类化合物包括吗啉、对甲基哌嗪和对异丙基哌嗪；
在本发明的一些实施方式中，苯甲醛类化合物包括下式所示化合物中的至少一种：
在本发明的一些实施方式中，所述3，4-二羟基苯甲醛、丙酮和氢氧化钠的摩尔比为1：10～20：2～5。
在本发明的一些实施方式中，所述氢氧化钠/氢氧化钾/氢氧化锂的水溶液浓度为10mol/L。
在本发明的一些实施方式中，所述紫萁酮、仲胺和苯甲醛的的摩尔比为1：1.3：1.2。
在本发明的一些实施方式中，所述反应在溶剂中进行。
在本发明的一些实施方式中，所述溶剂为丙酮。
在本发明的一些实施方式中，所述溶剂为甲苯/乙醇/二甲基甲酰胺/乙腈/1，4-二氧六环/四氢呋喃。
在本发明的一些实施方式中，所述反应的温度为室温。
在本发明的一些实施方式中，所述反应的温度约为110℃。
在本发明的一些实施方式中，所述反应的温度约为78℃。
在本发明的一些实施方式中，所述反应的温度约为153℃。
在本发明的一些实施方式中，所述反应的温度约为82℃。
在本发明的一些实施方式中，所述反应的温度约为101℃。
在本发明的一些实施方式中，所述反应的温度约为66℃。
在本发明的一些实施方式中，所述合成方法还包括在所述反应后对所得紫萁酮类衍生物进行提纯。
在本发明的一些实施方式中，所述提纯处理方法包括萃取、柱层析和重结晶。
在本发明的一些实施方式中，所述萃取采用的萃取剂包括乙酸乙酯和二氯甲烷。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥的对象为有机相。
在本发明的一些实施方式中，所述的柱层析分离为硅胶柱层析。
根据本发明的再一个方面，提出了一种抗肿瘤药物，制备原料包括所述的紫萁酮曼尼希碱类化合物，或所述合成方法合成的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
根据本发明的一种优选的实施方式的药物，至少具有以下有益效果：
本发明所提供的紫萁酮曼尼希碱类化合物对多种肿瘤细胞具有广谱的抗肿瘤活性，可以抑制肿瘤细胞的生长。
本发明所提供的紫萁酮曼尼希碱类化合物可以通过腹腔注射的方式，对4T1移植瘤模型的Balb/C小鼠产生治疗效果且不产生毒性，可作为药物活性成分使用。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的活性成分包括所述紫萁酮曼尼希碱类化合物。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的活性成分包括所述紫萁酮曼尼希碱类化合物作为有机合成中间体合成的化合物。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的制备原料还包括药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述辅料包括但不限于溶剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧化剂、抑菌剂、乳化剂、粘合剂和助悬剂中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌中的至少一种。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述肿瘤包括乳腺癌。
本发明提供的制备方法合成路线简单，原料廉价易得，具有适用范围广、产率较高、易储存的优点，可以实现产业化生产，目标化合物性质稳定易于储存。上述制备方法制得的紫萁酮曼尼希碱类化合物可以在体外抑制肿瘤细胞增殖及迁移，促进肿瘤细胞凋亡，在Balb/C小鼠的4T1移植瘤模型上也有较好的抗肿瘤效果，并表现出生物安全性。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明应用例2给药组与正常组在三种肿瘤细胞上的克隆形成数量图；
图2为本发明应用例3给药组与正常组的三阴性乳腺癌细胞迁移图(2A)和愈合面积统计图(2B)；
图3为本发明应用例4给药组与正常组的乳腺癌细胞凋亡比率的流式分析图与统计图；
图4为本发明应用例5给药期间高剂量组、低剂量组和对照组小鼠肿瘤体积与给药时间的关系图；
图5为本发明应用例5给药期间低剂量组、它莫昔芬组和对照组小鼠肿瘤体积与给药时间的关系图；
图6为本发明应用例5给药期间高剂量组、顺铂组和对照组小鼠肿瘤体积与给药时间的关系图；
图7为本发明应用例5给药结束后小鼠体内肿瘤重量统计图；
图8为本发明应用例5给药结束后小鼠体内肿瘤外观图；
图9为本发明应用例5给药结束后小鼠体内肿瘤的H&E染色图；
图10为本发明应用例5给药期间小鼠体重统计图；
图11为本发明应用例6给药期间小鼠体重变化统计图；
图12为本发明应用例6给药组与对照组小鼠体内ALT，AST，CRE，BUN，LDH含量统计图；
图13为本发明应用例6给药组与对照组小鼠脏器的H&E染色图。
具体实施方式
以下列举的实施例是为了让本领域的技术人员更清楚去理解本发明。需要说明的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用，仅作为说明性的实施例。以下实施例中所提及的原料、试剂或装置，如无特殊说明，均可从商业途径得到，或通过已知现有的方式获得。
实施例1
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A1所示，具体过程为：
S1.将3，4-二羟基苯甲醛1(138mg,1mmol，CAS：139-85-5)溶于丙酮2(870mg,15mmol，CAS：67-64-1)中，加入氢氧化钠(160mg,4mmol，CAS：1310-73-2)或氢氧化钾(224mg,4mmol，CAS：1310-58-3)或氢氧化锂(96mg,4mmol，CAS：1310-65-2)的水溶液(10mol/L)，于室温下搅拌12h后，停止反应，将反应瓶中的固体产物用水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1)，即得到产物紫萁酮(3)，黄色固体化合物，以氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂为碱的产率分别为产率78％、62％和60％，因此，其他实施例选择以氢氧化钠为碱；
S2.将甲苯(5mL，CAS：108-88-3)、乙醇(5mL，CAS：64-17-5)、二甲基甲酰胺(5mL，CAS：68-12-2)、乙腈(5mL，CAS：75-05-8)、1，4-二氧六环(5mL，CAS：123-91-1)或四氢呋喃(5mL，CAS：109-99-9)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至回流搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol,CAS：110-91-8)和苯甲醛(127mg,1.2mmol,CAS：110-52-7)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL,CAS：144-55-8)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A1，黄色固体化合物，以甲苯/乙醇/二甲基甲酰胺/乙腈/1，4-二氧六环/四氢呋喃为溶剂的产率分别为42％、35％、38％、15％、12％、8％和1％，因此，其他实施例选择以甲苯为溶剂。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A1对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物3(紫萁酮)核磁数据,1H NMR(600MHz,D2O-d2)δ2.37(s,3H),6.55(d,J＝16.2Hz,1H),6.91(d,J＝7.8Hz,1H),7.10(dd,J＝1.8,8.4Hz,1H),7.15(d,J＝1.8Hz,1H),7.54(d,J＝16.8Hz,1H)；13C NMR(600MHz,D2O-d2)δ204.48,147.42,146.66,144.26,126.95,124.07,123.21,116.19,115.23,25.92。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C10H10O3(M+H)+:179.0703,found179.0698。
化合物A1核磁数据,1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.29(s,3H),2.42-2.55(m,4H),3.71-3.73(m,4H),4.58(s,1H),6.47(d,J＝16.2Hz,1H),6.89(d,J＝2.4Hz,1H),6.98(d,J＝2.4Hz,1H),7.23-7.26(m,1H),7.29-7.31(m,2H),7.41(s,1H),7.44-7.46(m,2H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.06,147.12,145.89,145.11,139.58,128.49,128.21,127.73,126.28,126.10,123.62,121.92,112.66,74.52,66.51,52.02,25.61。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C21H23NO4(M+H)+:354.1700,found354.1716。
实施例2
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A2所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和对甲基苯甲醛(144mg,1.2mmol,CAS：104-87-0)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A2，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A2对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A2核磁数据,1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.27(s,3H),2.28(s,3H),2.42-2.54(m,4H),3.70-3.72(m,4H),4.53(s,1H),6.46(d,J＝16.2Hz,1H),6.85(d,J＝1.8Hz,1H),6.97(d,J＝2.4Hz,1H),7.11(d,J＝8.4Hz,2H),7.30(d,J＝7.8Hz,2H),7.39(d,J＝16.2Hz,1H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.07,147.18,145.87,145.14,137.70,136.33,128.87,128.38,128.19,126.85,126.63,126.32,126.04,123.58,121.97,112.64,74.46,66.51,51.93,25.60,19.68。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C22H25NO4(M+H)+:368.1856,found368.1887。
实施例3
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A3所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和对甲氧基苯甲醛(163mg,1.2mmol,CAS：123-11-5)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A3，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A3对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A3核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.28(s,3H),2.41-2.53(m,4H),3.70-3.72(m,4H),3.73(s,3H),4.51(s,1H),6.47(d,J＝14.4Hz,1H),6.84(d,J＝8.4Hz,3H),6.98(d,J＝1.8Hz,1H),7.32(d,J＝8.0Hz,2H),7.40(d,J＝16.2Hz,1H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.06,159.57,147.18,145.89,145.15,131.81,129.49,127.98,126.43,126.04,123.58,121.98,113.78,113.16,112.63,74.14,66.52,54.30,54.26,51.87,25.62。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C22H25NO5(M+H)+:384.1805,found384.1852。
实施例4
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A4所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和3,4,5-三甲氧基苯甲醛(235mg,1.2mmol,CAS：86-81-7)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A4，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A4对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A4核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.30(s,3H),2.46-2.56(m,4H),3.71(s,3H),3.72-3.75(m,4H),3.80(s,3H),4.51(s,1H),6.50(d,J＝16.2Hz,1H),6.80(s,2H),6.93(d,J＝1.8Hz,1H),6.99(d,J＝2.4Hz,1H),7.43(d,J＝16.2Hz,1H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ201.49,154.79,148.48,147.35,146.51,138.87,137.20,127.76,127.62,125.13,123.30,114.20,106.73,75.99,67.98,61.14,56.69,53.43,27.07。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C24H29NO7(M+H)+:444.2017,found444.2065。
实施例5
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A5所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和4-氟苯甲醛(149mg,1.2mmol,CAS：459-57-4)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A5，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A5对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A5核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.29(s,3H),2.41-2.55(m,4H),3.71-3.73(m,4H),4.61(s,1H),6.48(d,J＝16.2Hz,1H),6.91(d,J＝1.8Hz,1H),6.98(d,J＝1.8Hz,1H),7.02-7.05(m,2H),7.42(d,J＝16.2Hz,1H),7.46-7.49(m,2H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.06,163.20,161.58,146.97,145.93,145.05,135.74,130.13,130.08,126.29,126.20,123.69,121.71,115.18,115.04,112.68,73.20,66.50,51.98,25.62。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C21H22FNO4(M+H)+:372.1606,found372.1638。
实施例6
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A6所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和2-氯苯甲醛(169mg,1.2mmol,CAS：89-98-5)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A6，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A6对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A6核磁数据1H NMR(600MHz,CDCl3-d)δ1.60-1.62(m,2H),2.30(s,3H),2.52-2.56(m,2H),3.77(s,4H),5.36(s,1H),6.46(d,J＝16.2Hz,1H),6.74(d,J＝1.8Hz,1H),7.05(d,J＝1.8Hz,1H),7.22-7.24(m,2H),7.28(d,J＝16.2Hz,1H),7.42-7.44(m,1H),7.50-7.52(m,1H)；13C NMR(600MHz,CDCl3-d)δ198.37,146.37,145.54,143.47,135.57,134.13,130.14,129.77,129.62,127.89,126.62,125.09,124.16,121.90,112.66,69.38,66.84,27.35。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C21H22ClNO4(M+H)+:388.131,found388.1345。
实施例7
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A7所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和3-氯苯甲醛(169mg,1.2mmol,CAS：587-04-2)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A7，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A7对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A7核磁数据1H NMR(600MHz,CDCl3-d)δ2.30(s,3H),2.48(d,J＝4.8Hz,4H),3.78(s,4H),4.43(s,1H),6.47(d,J＝16.2Hz,1H),6.69(s,1H),7.05(d,J＝1.8Hz,1H),7.28-7.31(m,4H),7.37(s,1H)；13C NMR(600MHz,CDCl3-d)δ198.33,171.20,145.76,145.58,143.32,140.11,134.98,130.48,128.86,126.78,125.15,124.03,121.86,112.88,75.65,66.69,60.42,27.40,14.20。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C21H22ClNO4(M+H)+:388.131,found388.1345。
实施例8
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A8所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和4-氯苯甲醛(169mg,1.2mmol,CAS：104-88-1)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A8，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A8对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A8核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.36(s,3H),3.19-3.23(m,2H),3.34-3.36(m,2H),3.98-3.99(m,4H),5.70(s,1H),6.63(d,J＝16.2Hz,1H),7.14(d,J＝1.8Hz,1H),7.36(d,J＝1.8Hz,1H),7.49(dd,J＝1.8,6.6Hz,2H),7.51(d,J＝16.8Hz,1H),7.76(d,J＝8.4Hz,2H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ199.72,146.34,145.75,143.68,135.47,132.64,130.31,129.28,129.25,127.38,124.93,120.86,120.79,114.01,71.40,63.39,51.91,25.85。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C21H22ClNO4(M+H)+:388.131,found388.1339。
实施例9
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A9所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和2-溴苯甲醛(222mg,1.2mmol,CAS：6630-33-7)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A9，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A9对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A9核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.30(s,3H),2.50-2.53(m,2H),2.66(s,2H),3.72-3.74(m,4H),5.35(s,1H),6.46(d,J＝16.2Hz,1H),6.88(d,J＝1.8Hz,1H),7.02(d,J＝1.8Hz,1H),7.15-7.18(m,1H),7.32-7.35(m,1H),7.41(d,J＝16.2Hz,1H),7.61-7.63(m,1H),7.68-7.69(m,1H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.06,147.47,146.02,145.00,138.86,133.05,129..64,129.21,127.98,126.12,125.51,124.51,123.76,121.75,112.71,70.55,66.59,51.56,25.56。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C21H22BrNO4(M+H)+:432.0805,found432.0842。
实施例10
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A10所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和3-溴苯甲醛(222mg,1.2mmol,CAS：3132-99-8)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A10，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A10对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A10核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.33(s,3H),2.45-2.57(m,4H),3.75-3.77(m,4H),4.63(s,1H),6.52(d,J＝16.2Hz,1H),6.98-7.03(m,2H),7.24(t,J＝7.8Hz,1H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),7.46-7.49(m,2H),7.67(s,1H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.09,146.91,145.94,145.04,142.63,130.97,130.65,130.28,126.92,126.30,126.01,123.79,122.27,121.63,112.71,72.89,66.49,52.07,25.61。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C21H22BrNO4(M+H)+:432.0805,found432.0844。
实施例11
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A11所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和4-溴苯甲醛(222mg,1.2mmol,CAS：1122-91-4)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A11，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A11对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A11核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.32(s,3H),2.42-2.55(m,4H),3.73-3.75(m,4H),4.61(s,1H),6.51(d,J＝16.2Hz,1H),6.94(d,J＝1.8Hz,1H),7.01(d,J＝1.8Hz,1H),7.39(d,J＝9.0Hz,2H),7.44-7.48(m,3H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.05,146.97,145.93,145.03,139.09,131.55,130.08,126.24,126.04,123.75,121.68,121.33,112.71,73.00,66.49,51.99,25.64。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C21H22BrNO4(M+H)+:432.0805,found432.0845。
实施例12
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A12所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和2-三氟甲基苯甲醛(206mg,1.2mmol,CAS：447-61-0)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A12，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A12对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A12核磁数据1H NMR(600MHz,Acetone-d6)δ2.23(s,3H),2.44-2.66(m,4H),3.72(s,4H),5.07(s,1H),6.44(d,J＝16.2Hz,1H),6.82(d,J＝1.8Hz,1H),7.08(d,J＝1.8Hz,1H),7.36(d,J＝16.2Hz,1H),7.51(t,J＝7.8Hz,1H),7.66-7.68(m,1H),7.78(d,J＝7.8Hz,1H),8.01(d,J＝7.8Hz,1H)；13CNMR(600MHz,Acetone-d6)δ196.76,146.84,146.48,142.95,139.08,133.37,130.00,128.54,128.09,127.90,127.71,127.52,127.27,126.60,126.17,126.13,126.09,126.05,125.46,125.10,124,78,123.64,121.56,112.97,68.70,66.51,51.93,26.30。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C22H22F3NO4(M+H)+:422.1574,found422.1531。
实施例13
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A13所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和3-三氟甲基苯甲醛(206mg,1.2mmol,CAS：454-89-7)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A13，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A13对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A13核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.31(s,3H),2.41-2.44(m,4H),3.73-3.75(m,4H),4.75(s,1H),6.50(d,J＝16.2Hz,1H),7.00(s,2H),7.44(d,J＝16.2Hz,1H),7.49-7.52(m,1H),7.55(d,J＝7.8Hz,1H),7.75(d,J＝7.8Hz,1H),7.83(s,1H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ201.52,148.35,147.40,146.45,143.06,133.28,132.19,131.98,131.77,130.77,128.27,127.80,127.53,126.47,126.22,126.20,125.74,125.71,125.69,125.28,124.68,122.95,114.13,73.90,67.94,53.54,27.05。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C22H22F3NO4(M+H)+:422.1574,found422.1626。
实施例14
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式A14所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入吗啉(113mg,1.3mmol)和4-三氟甲基苯甲醛(206mg,1.2mmol,CAS：444-19-6)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物A14，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式A14对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物A14核磁数据1H NMR(600MHz,Acetone-d6)δ2.23(s,3H),2.46-2.60(m,4H),3.71-3.73(m,4H),4.80(s,1H),6.48(d,J＝16.2Hz,1H),7.03(dd,J＝2.4,21.0Hz,2H),7.37(d,J＝16.2Hz,1H),7.69(d,J＝8.4Hz,2H),7.76(d,J＝8.4Hz,2H)；13C NMR(600MHz,Acetone-d6)δ196.75,146.35,146.09,144.56,142.98,129.54,129.33,129.10,126.76,125.75,125.72,125.70,125.67,125.55,125.19,124.78,123.39,121.32,113.28,74.04,66.38,52.22,26.32。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C22H22F3NO4(M+H)+:422.1574,found422.1640。
实施例15
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B1所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol,CAS：4318-42-7)和苯甲醛(127mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B1，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B1对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B1核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ1.06(d,J＝6.6Hz,6H),2.29(s,3H),2.51-2.74(m,9H),4.59(s,1H),6.47(d,J＝15.6Hz,1H),6.85(d,J＝2.4Hz,1H),6.98(d,J＝2.4Hz,1H),7.24-7.27(m,1H),7.30-7.32(m,2H),7.41(d,J＝16.2Hz,1H),7.44-7.45(m,2H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.04,147.58,145.98,145.20,139.67,128.49,128.21,127.74,126.33,125.87,123.50,121.92,112.60,74.37,54.40,51.11,48,49,45.83,25.61,17.33,17.26,9.17。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C24H30N2O3(M+H)+:395.2329,found395.2375。
实施例16
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B2所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和对甲基苯甲醛(144mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B2，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B2对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B2核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ1.08(d,J＝6.0Hz,6H),2.29(s,6H),2.52-2.71(m,9H),4.57(s,1H),6.47(d,J＝16.2Hz,1H),6.85(s,1H),6.98(s,1H),7.12(d,J＝7.2Hz,2H),7.31(d,J＝7.8Hz,2H),7.41(d,J＝16.2Hz,1H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ201.52,148.97,147.32,146.67,139.14,137.91,130.50,129.83,129.61,128.08,127.89,127.31,124.94,124.87,123.35,121.66,113.98,75.32,56.11,49.94,27.03,21.14,18.65,18.59。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C25H32N2O3(M+H)+:409.2486,found409.2478。
实施例17
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B3所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和对甲氧基苯甲醛(163mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B3，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B3对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B3核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ1.07(d,J＝6.0Hz,6H),2.29(s,3H),2.51-2.68(m,9H),3.75(s,3H),4.56(s,1H),6.47(d,J＝15.6Hz,1H),6.83-6.98(m,5H),7.33(d,J＝8.4Hz,2H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ201.50,161.03,149.00,147.34,146.67,132.73,131.49,130.92,129.42,127.95,127.28,124.92,123.26,115.54,115.20,114.60,113.97,75.07,56.03,55.75,49.94,27.04,18.68,18.62。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C25H32N2O4(M+H)+:425.2435,found425.2431。
实施例18
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B4所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和3,4,5-三甲氧基苯甲醛(235mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B4，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B4对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B4核磁数据1H NMR(600MHz,Acetone-d6)δ0.87(d,J＝6.6Hz,6H),2.10(s,3H),2.39-2.60(m,9H),3.55(s,3H),3.65(s,6H),4.43(s,1H),6.34(d,J＝16.2Hz,1H),6.71(s,2H),6.79(d,J＝1.2Hz,1H),6.91(d,J＝1.8Hz,1H),7.24(d,J＝16.2Hz,1H)；13CNMR(600MHz,Acetone-d6)δ196.73,153.62,147.07,146.08,143.30,138.09,135.31,126.22,126.15,124.41,121.55,112.79,105.90,104.71,75.25,59.60,55.64,55.58,53.96,48.40,26.31,17.73。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C27H36N2O6(M+H)+:485.2646,found485.2736。
实施例19
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B5所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和4-氟苯甲醛(149mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B5，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B5对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B5核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ1.05(d,J＝6.6Hz,6H),2.25-2.29(m,3H),2.50-2.67(m,9H),4.62(s,1H),6.47(d,J＝16.2Hz,1H),6.85(d,J＝1.2Hz,1H),6.99(d,J＝1.8Hz,1H),7.02-7.05(m,2H),7.41(d,J＝15.6Hz,1H),7.45-7.47(m,2H)；13CNMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.11,200.06,200.01,163.20,161.58,147.39,146.01,145.12,145.11,135.84,135.82,130.12,130.07,126.33,126.00,123.62,121.73,115.19,115.05,112.66,73.11,54.43,48.48,17.31,17.25。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C24H29FN2O3(M+H)+:413.2235,found413.2295。
实施例20
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B6所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和2-氯苯甲醛(169mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B6，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B6对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B6核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ1.06(d,J＝6.6Hz,6H),2.29(s,3H),2.56-2.70(m,9H),5.35(s,1H),6.45(d,J＝16.2Hz,1H),6.82(d,J＝1.8Hz,1H),7.01(d,J＝1.8Hz,1H),7.22-7.29(m,2H),7.40-7.43(m,2H),7.63(dd,J＝1.8,7.8Hz,1H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.04,147.98,146.21,145.10,137.17,133.76,129.63,129.50,128.98,127.37,125.93,125.49,123.63,121.73,112.68,67.88,54.41,50.68,48.52,45.76,25.59,17.30,17.26,9.30。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C24H29ClN2O3(M+H)+:429.1939,found429.2015。
实施例21
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B7所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和3-氯苯甲醛(169mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B7，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B7对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B7核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ1.07(d,J＝6.6Hz,6H),2.31(s,3H),2.51-2.69(m,9H),4.62(s,1H),6.49(d,J＝16.2Hz,1H),6.92(d,J＝1.2Hz,1H),7.00(d,J＝1.8Hz,1H),7.25-7.31(m,2H),7.40(d,J＝7.2Hz,1H),7.43(d,J＝16.2Hz,1H),7.49(t,J＝1.8Hz,1H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.07,147.32,146.03,145.10,142.47,134.23,130.01,127.97,127.66,126.48,126.10,126.06,123.67,121.63,112.69,72.94,54.56,48.48,25.60,17.32,17.25。高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C24H29ClN2O3(M+H)+:429.1939,found 429.2007。
实施例22
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B8所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和4-氯苯甲醛(169mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B8，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B8对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B8核磁数据1H NMR(600MHz,CDCl3-d)δ0.96(s,3H),0.97(s,3H),1.17-1.19(m,1H),2.22(s,3H),2.45-2.64(m,9H),4.43(s,3H),6.37(d,J＝16.2Hz,1H),6.57(d,J＝1.8Hz,1H),6.96(d,J＝2.4Hz,1H),7.19(d,J＝1.2Hz,1H),7.22(s,2H)；13C NMR(150MHz,CDCl3-d)δ198.37,146.71,145.57,143.62,136.54,134.39,130.08,129.20,128.74,128.67,126.23,124.87,124.45,121.84,112.59,74.65,54.38,48.52,27.32,18.45。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C24H29ClN2O3(M+H)+:429.1939,found429.2001。
实施例23
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B9所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和2-溴苯甲醛(222mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B9，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B9对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B9核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ1.07(d,J＝6.6Hz,6H),2.30(s,3H),2.58-2.68(m,9H),5.36(s,1H),6.45(d,J＝16.2Hz,1H),6.84(d,J＝2.4Hz,1H),7.02(d,J＝1.8Hz,1H),7.15-7.18(m,1H),7.31-7.34(m,1H),7.41(d,J＝16.2Hz,1H),7.62-7.65(m,2H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.07,147.77,146.14,145.04,138.92,133.06,129.62,129.28,128.03,126.01,125.64,124.44,123.69,121.61,112.72,70.66,54.43,48.53,48.02,25.56,17.27,17.23。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C24H29BrN2O3(M+H)+:473.1434,found473.1527。
实施例24
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B10所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和3-溴苯甲醛(222mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B10，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B10对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B10核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ1.07(d,J＝6.6Hz,6H),2.30(s,3H),2.50-2.67(m,9H),4.61(s,1H),6.49(d,J＝16.2Hz,1H),6.91(d,J＝1.8Hz,1H),7.00(d,J＝1.8Hz,1H),7.22-7.24(m,1H),7.403-7.408(m,1H),7.41-7.46(m,2H),7.64(d,J＝1.8Hz,1H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.09,147.49,146.12,145.16,142.75,130.93,130.65,130.28,126.90,126.04,126.02,123.61,122.27,121.65,112.65,72.85,54.44,51.17,48.47,45.85,25.61,17.33,17.27,9.12。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C24H29BrN2O3(M+H)+:473.1434,found473.1503。
实施例25
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B11所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和4-溴苯甲醛(222mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B11，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B11对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B11核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ1.06(d,J＝6.6Hz,6H),2.30(s,3H),2.49-2.68(m,9H),4.60(s,1H),6.48(d,J＝16.2Hz,1H),6.88(d,J＝1.8Hz,1H),6.99(d,J＝1.8Hz,1H),7.37(d,J＝8.4Hz,2H),7.42(d,J＝13.2Hz,1H),7.45(d,J＝9.0Hz,2H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.04,147.35,146.00,145.10,139.18,131.55,130.06,126.08,126.05,123.64,121.67,121.36,112.67,72.93,54.46,51.09,48.48,25.62,22.29,21.58,17.30,17.25,13.02。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C24H29BrN2O3(M+H)+:473.1434,found473.1506。
实施例26
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B12所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和2-三氟甲基苯甲醛(206mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B12，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B12对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B12核磁数据1H NMR(600MHz,Acetone-d6)δ0.86(d,J＝6.0Hz,6H),2.10(s,3H),2.32-2.56(m,9H),4.90(s,1H),6.30(d,J＝16.2Hz,1H),6.64(d,J＝1.8Hz,1H),6.94(d,J＝2.4Hz,1H),7.23(d,J＝16.2Hz,1H),7.37-7.40(m,1H),7.52-7.54(m,1H),7.65(d,J＝7.8Hz,1H),7.83(d,J＝7.8Hz,1H)；13C NMR(600MHz,Acetone-d6)δ196.78,147.24,146.58,143.05,139.42,133.37,129.97,128.51,127.73,127.54,126.38,126.12,126.09,126.05,126.01,125.47,125.40,124.65,123.66,121.38,112.83,68.75,53.87,48.45,26.29,17.77,17.66。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C25H29F3N2O3(M+H)+:463.2203,found463.2298。
实施例27
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B13所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和3-三氟甲基苯甲醛(206mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B13，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B13对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B13核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ1.08(d,J＝6.6Hz,6H),2.30(s,3H),2.50-2.72(m,9H),4.76(s,1H),6.49(d,J＝16.2Hz,1H),6.96(d,J＝1.8Hz,1H),7.00(d,J＝1.8Hz,1H),7.43(d,J＝16.2Hz,1H),7.50-7.53(m,2H),7.56(d,J＝7.8Hz,2H),7.74-7.77(m,2H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ201.52,148.69,147.48,146.51,143.11,133.26,132.21,132.00,130.79,127.64,127.55,126.48,126.19,125.77,125.75,125.19,124.73,124.68,123.58,122.94,116.62,115.31,114.13,73.83,56.02,52.53,49.93,27.05,18.72,18.66。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C25H29F3N2O3(M+H)+:463.2203,found463.2332。
实施例28
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式B14所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入异丙基哌嗪(167mg,1.3mmol)和4-三氟甲基苯甲醛(206mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物B14，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式B14对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物B14核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ1.07(d,J＝6.6Hz,6H),2.30(s,3H),2.51-2.72(m,9H),4.74(s,1H),6.49(d,J＝16.2Hz,1H),6.94(d,J＝1.8Hz,1H),7.00(d,J＝1.8Hz,1H),7.43(d,J＝16.2Hz,1H),7.60(d,J＝8.4Hz,2H),7.66(d,J＝8.4Hz,2H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ201.47,192.80,131.35,131.13,130.92,130.70,130.14,128.30,127.57,127.43,126.77,126.74,126.72,126.50,125.14,124.70,123.03,114.10,73.95,56.15,55.96,52.56,49.92,27.05,18.72,18.68。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C25H29F3N2O3(M+H)+:463.2203,found463.2302。
实施例29
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式C1所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入甲基哌嗪(130mg,1.3mmol,CAS：109-01-3)和4-氟苯甲醛(149mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物C1，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式C1对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物C1核磁数据1H NMR(600MHz,CDCl3-d)δ2.22(d,J＝13.8Hz,6H),2.45(s,8H),4.44(s,1H),6.38(d,J＝15.6Hz,1H),6.58(s,J＝1.8Hz,1H),6.93-6.96(m,3H),7.19(d,J＝4.2Hz,1H),7.26(s,2H)；13C NMR(600MHz,CDCl3-d)δ197.32,162.43,160.79,145.42,144.52,142.53,132.90,132.88,129.38,128.40,128.34,125.32,123.89,123.70,120.85,115.05,114.91.111.52,73.56,53.87,44.58,26.33。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C22H25FN2O3(M+H)+:385.1922,found385.2021。
实施例30
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式C2所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入甲基哌嗪(130mg,1.3mmol)和4-氯苯甲醛(169mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物C2，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式C2对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物C2核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.28(d,J＝9.6Hz,6H),2.48-2.65(m,8H),4.62(s,1H),6.48(d,J＝16.2Hz,1H),6.89(s,1H),7.00(s,1H),7.29(d,J＝8.4Hz,2H),7.42-7.44(m,3H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ201.53,201.48,201.42,148.58,147.37,146.47,146.46,140.12,134.77,131.13,129.96,129.91,129.89,129.56,129.23,127.63,127.57,125.16,123.05,114.15,73.98,45.71。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C22H25ClN2O3(M+H)+:401.1626,found401.1717。
实施例31
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式C3所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入甲基哌嗪(130mg,1.3mmol)和4-溴苯甲醛(222mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物C3，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式C3对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物C3核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.19(s,3H),2.20(s,3H),2.30-2.52(m,8H),4.52(s,1H),6.38(d,J＝16.2Hz,1H),6.80(d,J＝1.8Hz,1H),6.89(d,J＝2.4Hz,1H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),7.32(s,1H),7.35-7.37(m,2H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ200.06,147.18,145.95,145.07,139.21,131.56,130.03,126.14,123.70,121.62,121.36,112.69,72.68,54.53,44.35,25.61。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C22H25BrN2O3(M+H)+:445.1121,found445.1233。
实施例32
本实施例制备了一种紫萁酮曼尼希碱类化合物，具体结构如式C4所示，具体过程为：
S1.同实施例1。
S2.将甲苯(5mL)加入紫萁酮(178mg,1mmol)中，升温至110℃搅拌使其溶解，随后加入甲基哌嗪(130mg,1.3mmol)和4-三氟甲基苯甲醛(206mg,1.2mmol)搅拌，0.5h后加入碳酸氢钠(10mL)的水溶液淬灭反应，随后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩后进行柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝50：1)，即得到产物紫萁酮曼尼希碱类化合物C4，黄色固体化合物。
本实施例发生的反应如下式所示：
本实施例所得的紫萁酮曼尼希碱类化合物测试结果如下，说明本实施例确实获取了式C4对应的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
化合物C4核磁数据1H NMR(600MHz,MeOD-d4)δ2.30(s,3H),2.54(s,3H),2.65-2.67(m,8H),4.80(s,1H),6.49(d,J＝16.2Hz,1H),6.99(d,J＝4.2Hz,2H),7.44(d,J＝16.2Hz,1H),7.60-7.68(m,4H)；13C NMR(600MHz,MeOD-d4)δ201.48,148.50,147.37,146.47,146.27,131.10,130.88,130.06,128.82,128.39,127.68,127.55,126.76,126.74,126.50,125.23,124.71,122.89,114.02,72.86,55.84,51.97,45.45,27.06。
高分辨率质谱数据：HRMS(ESI)calcd for C23H25F3N2O3(M+H)+:435.189,found435.1999。
应用例1
本应用例以实施例1～实施例32所得紫萁酮曼尼希碱类化合物和底物紫萁酮对七种肿瘤细胞系进行了细胞毒性试验。
首先，复苏七种肿瘤细胞系(小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1，人结肠癌细胞HCT116，小鼠结肠癌细胞MC38，人卵巢癌细胞A2780，人非小细胞肺癌细胞A549，人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和人乳腺癌细胞T47D)，之后，待细胞处于对数生长期时用MTT(四甲基偶氮唑盐法)测定化合物对肿瘤细胞的生长抑制活性。将培养皿中的培养基吸出，用3mL PBS冲洗细胞两次，加入1mL胰酶消化细胞，随后加3mL DMEM完全培养基终止消化，离心机1000rpm离心5min后进行细胞计数，调整细胞浓度为2*104个/mL，然后以100μL/孔种于96孔板中，放入培养箱。待12小时细胞完全贴壁后，弃去培养基，加入含药培养基。设置给药组(将紫萁酮曼尼希碱类衍生物和紫萁酮用DMSO配置成50mM的母液，稀释1000倍于培养基中使其终浓度为50μM，然后依次倍半稀释成25，12.5，6.25，3.125，1.5625μM)，空白组(含1‰DMSO的培养基)，阳性对照组(顺铂，配置方法同给药组)和调零组(不含细胞的培养基)，每组3个复孔。药物处理72小时后，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，于培养箱中静置4h，弃去培养基，每孔加入100μL DMSO，置摇床上震荡10min充分溶解结晶，使用酶标仪于490nm处测定OD值。细胞存活率按照如下公式计算：存活率(％)＝(OD药物组-OD调零组)/(OD空白组-OD调零组)×100％。计算出每个化合物不同浓度下的细胞存活率之后，采用GraphPad Prism 8.00拟合细胞生长曲线并计算药物的半数抑制浓度IC50值，该实验重复3次。实验结果如表1所示。
表1所得结果显示，紫萁酮曼尼希碱类化合物对肿瘤细胞的毒性具有广谱性，对于7种肿瘤细胞均有较强的抑制作用。与底物紫萁酮相比，经过修饰的衍生物表现出更强的抑制肿瘤细胞增殖的效果。其中，化合物B14成为该系列化合物中最有潜力化合物，对7种肿瘤细胞系均具有优于母体化合紫琪酮的肿瘤细胞毒性，尤其对5种肿瘤细胞系4T1、MDA-MB-231、HCT116、MC38和A2780的IC50值小于等于10μM，显著优于母体化合物紫萁酮，作为优选，以其中之一化合物B14作为示例进行说明，其余化合物的实施例可进行类比设计。
表1中，>50表示药物浓度在50μM时肿瘤细胞的存活率仍大于50％，即为细胞毒性很弱。
表1实施例1-32所得紫萁酮曼尼希碱类衍生物及紫萁酮对七种肿瘤细胞系的抑制作用
应用例2本应用例对实施例28所得紫萁酮曼尼希碱类化合物B14进行了体外抗乳腺癌细胞克隆形成能力的测试。
该实验的操作过程为：首先将生长状态良好的细胞制备成细胞悬液，然后将4T1以500/孔，MDA-MB-231以2000/孔，T47D以3000/孔的密度均匀地铺在六孔细胞培养板上，待细胞完全贴壁后，每孔给予浓度为10，5，2.5，0μM的药物刺激72h，之后更换为正常培养基继续培养5-15天，其中每隔3天更换一次培养基，直至形成显微镜下可见的细胞群落，停止培养。弃掉培养基，用PBS清洗细胞一次之后每孔加入组织固定液1mL，固定50min，继续用PBS清洗一次，然后加入0.1％的结晶紫染液1mL，染色20min后用PBS清洗两遍，待孔中PBS晾干后，用相机拍照。
经过不同浓度药物处理的细胞克隆形成数量如图1所示：随着给药浓度的增加，三种乳腺癌细胞的克隆数呈剂量依赖性减少，浓度为2.5μM的药物可以阻止50％以上的克隆形成，当药物浓度达到10μM时，培养板中几乎没有克隆形成。尤其在4T1细胞上，效果最为显著。因此，化合物B14可以剂量依赖性地抑制三种乳腺癌细胞克隆的形成，具有抑制细胞的增殖活性。
应用例3
本应用例对实施例28所得紫萁酮曼尼希碱类化合物B14进行了体外抗乳腺癌细胞迁移能力的测试。
将MDA-MB-231细胞制成细胞悬液，以80万/皿种于35mm的细胞培养皿中，待细胞完全贴壁后，用枪头在培养皿上划出划痕，然后将培养基配置成浓度为10，5，2.5，0μM的含药且无血清培养基，于0，12，24，36h后在显微镜下拍照，观察划痕的愈合情况。采用Image J计算愈合面积，采用GraphPad Prism 8.00统计相应组间差异。
如图2所示，Control组的细胞随着时间的增加，划痕愈合速度较快，给药组的细胞愈合速度较慢，并呈剂量依赖性；比较第36h后各组细胞的愈合面积可以看出，Control组细胞的愈合面积达到75％以上，而当药物浓度为5μM时愈合面积为43％，当药物浓度为10μM时愈合面积为22％，与Control组相比有极显著差异，具有剂量依赖性。因此，化合物B14可以显著降低三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移能力(图2中,给药组与Control组比较**p<0.01，***p<0.001)。
应用例4
本应用例对实施例28所得紫萁酮曼尼希碱类化合物B14进行了体外促进乳腺癌细胞凋亡的测试。
该实验使用联科生物Annexin V-APC/PI apoptosis kit进行测试。将三种乳腺癌细胞(4T1,MDA-MB-231,T47D)以合适的密度种于6孔细胞培养板上，分别给药24h后，收集细胞，用PBS清洗细胞1次，弃去上清，加入500μL 1×Binding Buffer工作液重悬细胞，接着每管加入5μLAnnexin V-APC及10μLPI，避光孵育5min后，用流式细胞分析仪进行分析。采用GraphPad Prism 8.00统计相应组间差异。
如图3所示，三种乳腺癌细胞经过药物处理后凋亡细胞数明显增加，并且具有剂量依赖性，在细胞4T1和MDA-MB-231上，三个剂量下的凋亡细胞数与Control组相比均有显著性差异，并且高剂量组与低剂量组，高剂量组与中剂量组均有显著性差异，高剂量组的凋亡率超过50％。在T47D细胞上，凋亡细胞数在中剂量组和高剂量组与Control组相比显著性升高，低剂量组与中剂量组，低剂量组与高剂量组，中剂量组与高剂量组也呈现显著性差异。因此，化合物B14可以诱导乳腺癌细胞，尤其是三阴性乳腺癌细胞，走向细胞凋亡，进一步抑制肿瘤细胞的增殖(图3中,给药组与Control组比较*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，中剂量组和低剂量组比较&p<0.05，高剂量组和低剂量组比较#p<0.05，####p<0.0001，高剂量组和中剂量组比较$p<0.05，$$p<0.01，$$$p<0.001)。
应用例5
本应用例对实施例28所得紫萁酮曼尼希碱类化合物B14进行了体内抗肿瘤活性的测试。
采用的实验方法为，选择健康的雌性Balb/C小鼠适应性饲养一周，同时培养4T1细胞。将对数生长期的4T1细胞消化离心后，调整细胞浓度为1*107个/mL，以每只100μL接种于Balb/C小鼠的右腹部皮下，造模当天为第0天。之后测量肿瘤的长和宽，第7天时，肿瘤体积达到90mm3，按照肿瘤体积将小鼠随机分为5组。以顺铂和它莫昔芬为阳性对照，设置B14高剂量组(40mg/kg)、B14低剂量组(10mg/kg)、顺铂组(2mg/kg)、它莫昔芬组(10mg/kg)和Control组，每组9只小鼠。分组完成后，随即采用腹腔注射的方式开始给药(药物用5％DMSO+5％吐温+90％生理盐水溶解，Control组给予同样体积的溶剂)，此为给药治疗的第一天。每天给药一次，同时测量肿瘤长和宽以及小鼠体重。连续给药14天后，次日测量肿瘤长和宽及小鼠体重后脱颈椎处死小鼠，取肿瘤和脏器并称重。每组肿瘤按大小顺序排列后拍照，并用组织固定液每组固定3只小鼠的肿瘤用于H&E染色分析，后将所有脏器置于-80℃冰箱保存备用。采用GraphPad Prism 8.00统计相应组间差异，分析目标化合物B14的体内抗肿瘤效果。
小鼠肿瘤体积计算公式：体积(V/mm3)＝长*宽*宽/2
小鼠肿瘤生长抑制率(Tumor Growth Inhibtion,TGI)公式：TGI(％)＝(Wc-Wt)/Wc×100％(Wc为对照组小鼠肿瘤的平均重量，Wt为给药组小鼠肿瘤的平均重量)
小鼠肿瘤体积在14天给药过程中的变化趋势统计如图4，5，6所示(15天为取材当天数据，未给药)。与Control组相比，高剂量组与低剂量组都表现出显著的抗肿瘤效果，从第二天起肿瘤体积与Control组有显著性差异，且高剂量组与低剂量组有显著性差异(图4中,低剂量组与Control组比较*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001；高剂量组与Control组比较##p<0.01，####p<0.0001；高剂量组与低剂量组比较$p<0.05，$$p<0.01)，低剂量组与它莫昔芬组在第15天有显著性差异(图5中,它莫昔芬组与对照组比较*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001；低剂量组与它莫昔芬组比较$p<0.05)，高剂量组与顺铂组无显著性差异(图6中，顺铂组与Control组比较*p<0.05，****p<0.0001)。
末次给药结束，次日取材后对肿瘤和脏器进行称重，如图7所示，与Control组相比，高剂量组和低剂量组都表现出显著的抗肿瘤效果，其中高剂量组的TGI为46％，与阳性对照顺铂相当(43％)，低剂量组的TGI为33％，与阳性对照它莫昔芬相当(27％)，另外，高剂量组与低剂量组的TGI有显著性差异，说明化合物B14具有剂量依赖性的抗肿瘤效果(图7中，给药组与Control组比较***p<0.001，****p<0.0001，高剂量组与低剂量组比较##p<0.01)。各组肿瘤形态如图8所示。从肿瘤组织的H&E染色(图9，n＝3)中可以看出，Control组的肿瘤组织表现为乳腺癌细胞增殖活跃；B14低剂量组的肿瘤组织，边界模糊，细胞核缺失，出现了坏死现象；而B14高剂量组则发生了细胞大面积坏死，进一步证实了抗肿瘤效果。
分析给药过程中各组小鼠的体重变化，如图10所示，B14高、低剂量组和它莫昔芬组呈现与Control组相同的趋势，顺铂组小鼠体重逐渐下降，从第6天开始与Control组相比有显著性差异，第15天时，顺铂组的小鼠平均体重下降了16.7％，表示顺铂对Balb/C小鼠的毒性较大，体内安全性较差，而化合物B14对小鼠体重无明显影响，初步说明了紫萁酮曼尼希碱类化合物的体内安全性(图10中，顺铂组与对照组比较**p<0.01，****p<0.0001)。
应用例6
本应用例对实施例22和28所得紫萁酮曼尼希碱类化合物B8和B14进一步进行了体内安全性评价。
采用的实验方法为，选择健康的雌性Balb/C小鼠适应性饲养一周，随机分为3组，每组8只，分别为B8(60mg/kg)组和B14(60mg/kg)组和Control组。随后采取腹腔注射的方式连续给药14天，于第15天称重后眼球取血，取脏器心肝脾肺肾并称重。将小鼠全血一分为二，一半加入肝素后离心(3000rpm,4℃,15min)取上清即得血浆样品，一半直接离心(3000rpm,4℃,15min)取上清即得血清样品，分装后放置-80℃保存。根据试剂盒说明书，血清用于检测谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，肌酐(CRE)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量，血浆用于检测尿素氮(BUN)的含量。每组取三只小鼠的脏器固定于组织固定液中，用于H&E染色分析，ALT、AST、CRE和LDH的含量测定方法与试剂采用南京建成相关试剂盒。
从第1天给药至第15天取材的体重变化如图11所示，B8(60mg/kg)组、B14(60mg/kg)组和Control组小鼠体重都呈现总体上升的趋势，指示化合物B8和B14对小鼠的体重无明显的影响。如图12所示，经化合物B8处理过的小鼠除血清内ALT明显高于Control组外，其余各项指标与Control组相比没有显著性差异，经化合物B14处理过的小鼠血清中的ALT，AST，CRE和LDH以及血浆中BUN含量与Control组相比均无异常，说明化合物B8对肝功能有轻微毒性，而化合物B14对小鼠肝功能，肾功能以及细胞正常生长没有影响(图12中，B8组与Control比较*p<0.05)。从各组小鼠脏器的H&E染色结果来看(图13)，给药组小鼠的各个脏器没有出现异常现象。因此，本发明所提供的紫萁酮曼尼希碱类化合物具有较好的体内安全性。
综上所述，本发明提供了32个紫萁酮曼尼希碱类化合物，对7种肿瘤细胞系有较强的肿瘤细胞毒性，其中活性最强的化合物B14可以在体外抑制乳腺癌细胞的克隆形成与迁移，促进乳腺癌细胞凋亡，在小鼠的4T1体内肿瘤模型中也表现出了剂量依赖性的抗肿瘤效果，并且该化合物在有效剂量下呈现体内安全性，有望进一步开发研究，为新型抗乳腺癌及其他肿瘤药物研发提供了新型活性有机小分子。
上述应用例结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (13)
1.一种曼尼希碱类化合物，其特征在于，包括式(I)所示结构的化合物及其药学上可接受的盐：
其中，
R1选自O、N-CH3、N-CH(CH3)2的一种；
R2选自H、卤素、烷基、烷氧基和卤代烷基中的一种。
2.根据权利要求1所述的曼尼希碱类化合物，其特征在于，所述卤素包括氟、氯和溴中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的曼尼希碱类化合物，其特征在于，所述卤代烷基为三氟甲基。
4.根据权利要求1～3任一项所述的曼尼希碱类化合物，其特征在于，所述曼尼希碱类化合物包括式A1-14、B1-14和C1-4所示结构化合物的至少一种：
5.一种如权利要求1～4任一项所述紫萁酮曼尼希碱类化合物的合成方法，其特征在于，包括在碱催化剂的催化下，式(Ia)所示的3，4-二羟基苯甲醛和式(Ib)所示的丙酮进行羟醛缩合反应，生成式(Ic)所示的紫萁酮，随后，紫萁酮与式(Id)所示的仲胺类化合物和式(Ie)所示的苯甲醛类化合物发生曼尼希反应，得到如式(I)所示的紫萁酮曼尼希碱类化合物：
6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述碱催化剂包括氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述3，4-二羟基苯甲醛、丙酮和碱催化剂的摩尔比为1：10～20：2～5，最佳摩尔比为1：15：4。
8.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述紫萁酮、仲胺类化合物和苯甲醛类化合物的摩尔比为1：1～5：1～5，最佳摩尔比为1：1.2：1.2。
9.根据权利要求5所述的紫萁酮的合成方法，其特征在于，所述反应的温度为室温，反应时间为12h。
10.根据权利要求5所述的曼尼希碱类化合物的合成方法，其特征在于，所述反应的温度为100℃～110℃，反应时间为0.5h。
11.一种抗肿瘤的药物，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的紫萁酮曼尼希碱类化合物，或权利要求5～10任一项所述合成方法合成的紫萁酮曼尼希碱类化合物。
12.根据权利要求11所述的药物，其特征在于，所述药物的制备原料还包括药学上可接受的辅料。
13.根据权利要求11或12所述的药物，其特征在于，所述肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌中的至少一种。
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| GR01 | Patent grant | ||
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