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CN118834833A - 一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体在检测农药残留中的应用 - Google Patents

一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体在检测农药残留中的应用 Download PDF

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CN118834833A
CN118834833A CN202410893958.1A CN202410893958A CN118834833A CN 118834833 A CN118834833 A CN 118834833A CN 202410893958 A CN202410893958 A CN 202410893958A CN 118834833 A CN118834833 A CN 118834833A
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Wuxi Fuyang Biotech Co ltd
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Wuxi Fuyang Biotech Co ltd
Shanghai Agricultural Products Quality And Safety Center
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用，所述杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，生物保藏编号为CCTCC NO.C2023291的杂交瘤细胞株FY094‑2，拉丁文名称为Hybridoma cell line FY094‑2，保藏日期为2023年10月24日，本发明杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体制备的速测卡能够实现在其他结构相似的农药干扰下，对农残小分子的快速、精确的检测。

Description

一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体在检测农药残留中 的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用。
背景技术
农药在当今农业生产中作为不可或缺的重要生产资料，农药的合理利用可有效保障农作物的产量和质量，提高农业生产中的生产效率。农药的主要作用是防治农作物种植中的病虫害和杂草等。但是由于现今农药的大量使用，给土壤、水和环境都造成了巨大的负面影响，甚至严重危及到人类和动物的健康。
由于化学防治简单高效，节约经济成本，在现阶段的农业生产中，化学防治还是清除农作物病虫害的主要手段。一般可分为有机磷类、有机氯类、氨基甲酸类、菊酯类和生长调节剂类等。
烯酰吗啉(dimethomorph)在农业生产中作为一种内吸性、广谱性杀菌剂使用，对大多数农作物在生长过程中的霜霉病、疫霉病和腐霉病等可有效防治。烯酰吗啉作用机理和其他杀菌剂类似，都是通过破坏病菌细胞壁的形成，使其不能够繁殖并裂解死亡。对霜霉菌、疫霉菌、腐霉真菌特别有效，可用于葡萄、黄瓜、烟草、十字花科蔬菜等作物。当前全球烯酰吗啉年使用量为2000～3000吨。蔬菜和水果是除粮食作物外经济价值最高，需求量最大的作物，在培育过程中，据统计用于防治蔬菜病虫害的农药中，使用量最高的是杀虫剂，其次是杀菌剂。大量的农药施用很容易造成农药残留超标，甚至对人体健康和环境安全造成危害。烯酰吗啉作为典型的杀菌剂，适用范围广泛，是影响食品安全的重要关注对象。烯酰吗啉还特别容易吸附残留于土壤中，破坏生态环境，造成环境污染。
为了确保农产品使用安全，建立有效的测试机制尤为重要。现用于农药残留检测的方法主要可分为两大类：一是以色谱-质谱联用为主的精密仪器分析法，二是包括酶联免疫法、活体生物检测法、生物传感法、电化学分析法等在内的快速检测方法。精密仪器分析检测蔬菜中农药残留方法有很多，如液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-串联质谱等。然而，农产品具有流转周期短、数量大且存储时间较短等特点，流转至实验室检测具有很大的局限性，成本高、耗时长。目前，国内外通用的准确、高通量的果蔬农药残留色谱法检测技术不适合基层一线果蔬菜等初级农产品的实时快速移动检测。因此，开发一种准确、快速、高通量、便携的果蔬农药残留快速检测方法十分必要。
发明内容
针对现有技术稳定性灵敏度差、易出现假阳性、分析结果稳定性差、重现性和使用寿命低等不足，本发明提供一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用，针对烯酰吗啉这种杀菌剂、杀虫剂型农药，在其他结构相似的农药干扰下，能够实现对农残小分子的快速、精确确的检测，为化学合成材料、免疫学、仪器分析学及纳米材料等学科的高度结合和进一步的产学研工作提供了科学的途径。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，生物保藏编号为CCTCC NO.C2023291的杂交瘤细胞株FY094-2，拉丁文名称为Hybridoma cellline FY094-2，保藏日期为2023年10月24日，保藏地址为中国武汉大学。
本发明中，发明人通过大量筛选发现保藏的杂交瘤细胞株具体如下：
FY094共有10个细胞株，对应的50％抑制浓度分别为1.42ppm、0.36ppm、0.68ppm、1.31ppm、1.24ppm、0.99ppm、1.13ppm、0.81ppm、1.21ppm、0.56ppm，经过大量试验筛选发现FY094-2细胞株是所有细胞株中抑制效果最好的。
第二方面，本发明提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由第一方面所述的杂交瘤细胞株FY094-2分泌产生。
第三方面，本发明提供第二方面所述的单克隆抗体在检测农药残留中的应用。
在具体的实施例中，所述农药为烯酰吗啉。
第四方面，本发明提供第二方面所述的单克隆抗体在制备农药检测产品中的应用，所述农药为烯酰吗啉。
在具体的实施例中，所述农药为烯酰吗啉。
在具体的实施例中，所述检测产品为免疫检测产品，所述免疫检测产品包括酶联免疫试剂盒、胶体金层析试纸条，优选为胶体金层析试纸条。
第五方面，本发明提供一种检测农药的胶体金层析试纸条，所述胶体金层析试纸条包括第二方面所述的单克隆抗体。
在具体的实施例中，所述农药为烯酰吗啉。
在具体的实施例中，所述单克隆抗体包被在胶体金层析试纸条的结合垫上。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的单克隆抗体特异性强、灵敏度高，效价高，可特异性对不同蔬菜和水果中的烯酰吗啉残留的检测；
(2)本发明制备的烯酰吗啉胶体金检测卡，检测烯酰吗啉的灵敏度可以达到0.5ppm。
附图说明
图1A为本申请速测试纸结构图的主视图；图1B为本申请速测试纸结构图的俯视图；图1C为本申请速测试纸的示意图，1为样品垫，2为标记垫，3为NC膜(结果观察区)，4为吸水垫，5为控制区(C)，6为检测区(T)，7为底板。
图2不同烯酰吗啉细胞株抑制结果图。
图3A不同喷金量烯酰吗啉试纸条对烯酰吗啉含量的消线效果图，其中，喷金量2.0μl/cm，C线0.5mg/mL，T线1mg/mL；图3B不同喷金量烯酰吗啉试纸条对烯酰吗啉含量的消线效果图，其中，喷金量1.5μl/cm，C线0.5mg/mL，T线1mg/mL；图3C不同喷金量烯酰吗啉试纸条对烯酰吗啉含量的消线效果图，其中，喷金量1.0μl/cm，C线0.5mg/mL，T线1mg/mL，其中，喷金量1.0μl/cm，C线0.5mg/mL，T线1mg/mL。
图4不同的缓冲液检测烯酰吗啉检测卡的显色情况。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。本发明实施例涉及的试剂、抗体、仪器如下表1：
表1
实施例1制备单克隆抗体实验步骤：
1、单抗制备
(1)免疫原制备：FY094-BSA分别与等体积的弗氏佐剂、弗氏不完全佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，以备免疫小鼠。
(2)免疫策略：将FY094-BSA分别免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，间隔4周，最后经间接ELISA检测。
间接ELISA方法步骤为：
1)用0.1mol/L，pH＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释FY094-OVA至1ug/ml，加入96孔酶标板，每孔100μl，37℃反应3h或者4℃静置过夜。
2)甩去板孔中液体，加入250μl洗涤缓冲液，静置30s，甩去板中液体，重复3次。
3)加入检测样本，每孔100μl，同时加入阳性对照(步骤(2)中所取阳性小鼠血清)、阴性对照(免疫前小鼠血清)和空白对照(不加小鼠血清)37℃反应45min，
4)重复步骤2)；
5)加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗，每孔100μl，37℃反应45min。
6)重复步骤2)；
7)加入显色剂，每孔100μl，室温避光反应15min。
8)加入终止液，每孔100μl，使用酶标仪在波长450读取OD值，抗血清效价如下表2：
表2
(3)细胞融合：最后一次免疫后两周，腹腔注射抗原进行加强免疫，三天后进行细胞融合。将小鼠断颈处死，70％乙醇浸泡30min消毒，在超净台剪开腹腔，取出脾脏，磨碎，过80目筛网，得到脾细胞，加入SP2/0骨髓瘤细胞，在PEG4000的作用下进行细胞融合，
(4)融合筛选：将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，三天后换液，改用HT培养液培养。10天后，取细胞培养上清进行检测。
(5)克隆化与建株：使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，10天后检测，将阳性克隆继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，可建立阳性细胞株。
(6)扩大培养：将建株的单克隆细胞扩大培养，并进行冻存。
2、腹水制备与纯化
(1)腹水制备：提前一周在小鼠腹腔注射矿物油，将一定数量的细胞注射入小鼠腹腔，10天左右收集腹水，4000rpm离心，得上清即为单克隆抗体腹水。
(2)单克隆抗体纯化：腹水离心15min(4000rpm，室温)，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M，pH7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01M,pH7.4)，4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml 0.4M PB缓冲液(pH7.0)平衡纯化小柱；5ml 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。
3、抗体筛选
(1)效价检测
以间接ELISA方法对纯化后的抗体进行效价检测，数据如下表3：
表3
(2)亚型检测
用小鼠抗体亚型检测试剂盒对抗体进行亚型检测，结果如下表4：
表4
最终FY094得到有效的10株阳性细胞株与其对应的单克隆抗体各2mg。
实施例2金标速测卡的制备
速测试纸大板的组装：将抗原和羊抗鼠二抗固定于大板中部的NC膜上，标记为T线和C线，将标记有多菌灵特异性单克隆抗体金标垫盖在NC膜的下方，标记垫宽度约10mm，标记有特异性单克隆抗体(实施例1得到的单克隆抗体)的金标垫盖在NC膜的下方，标记垫宽度约10mm，其前沿搭在NC膜的底部1-2mm处；样品垫宽度约为20-30mm，盖在金标垫的上面，其前沿搭在金标垫的下部1-2mm；吸收垫宽度约20-30mm，位于试纸条的最上方，其下部盖在NC膜的上部1-2mm处，如图1A和图1B。
速测试纸的裁切：用切条机将大板裁切成宽度3-4mm左右的速测试纸成品。
使用时，将速测试纸垂直插入样品溶液中。样本中的标品在侧向移动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上抗原的结合。5-8min后，如果样本中标品含量大于检测线，检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显红色，结果为阴性。
实施例3烯酰吗啉速测卡的制备
选择520-522nm的胶体金，每1.5mL的胶体金加0.1mL碳酸钾20μL，抗体标金浓度按照25μg进行标记，反应30min，加10％BSA 100μL封闭，反应30min后，5000rpm 4℃离心30min，弃上清，用金标液复容后测试。喷金1.0、1.5、2.0μl/cm，C线羊抗鼠划膜浓度为0.5mg/mL，T线多菌灵-BSA划膜浓度为1.0mg/mL。
按图1C所示将速测试纸各个组分组装，不同编号的金标垫与膜两两组合，检测速测卡对多菌灵的检测效果。
如图2所示，烯酰吗啉10个阳性细胞株，分泌产生的10株抗体，2#、5#、6#、7#、9#、10#抗体，噻虫嗪含量2.5ppm时均可以消线，其中2#抗体效果最好。
如图3A、3B、3C所示，选择2#抗体标金，25ug标金，喷金量分别是2.0、1.5、1.0μl/cm，C线羊抗鼠划膜浓度为0.5mg/mL，T线烯酰吗啉-BSA划膜浓度为1mg/mL，结果是喷金1.0μl/cm时，烯酰吗啉阴性C线和T线显色相当，烯酰吗啉0.5ppm阳性显色T比C弱2-3个色度，阴阳明显能够分辨出。
实施例4缓冲液加标测试检测卡的优化测试
使用PBS、PBST(PBS+吐温)、10％甲醇水溶液(甲醇：水＝1:9)、10％甲醇PBS溶液(甲醇：PBS＝1:9)4种不同的缓冲液检测烯酰吗啉检测卡的显色情况，结果如图4所示，10％甲醇PBS溶液(甲醇：PBS＝1:9)溶液显色效果最好。
综上所述，本发明提供了一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用，本发明提供的单克隆抗体特异性强、灵敏度高，效价高，可特异性对不同蔬菜和水果中的烯酰吗啉定量检测，鉴定结果准确、可靠，灵敏度高，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，生物保藏编号为CCTCC NO.C2023291的杂交瘤细胞株FY094-2，拉丁文名称为Hybridoma cell line FY094-2，保藏日期为2023年10月24日。
2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株FY094-2分泌产生。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测农药残留中的应用；
优选地，所述农药为烯酰吗啉。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备农药检测产品中的应用；
优选地，所述农药为烯酰吗啉。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测产品为免疫检测产品。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述免疫检测产品包括酶联免疫试剂盒、胶体金层析试纸条，优选为胶体金层析试纸条。
7.一种检测农药的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述胶体金层析试纸条包括权利要求2所述的单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述单克隆抗体包被在胶体金层析试纸条的结合垫上。
9.一种检测农药的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒包括权利要求2所述的单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述农药为烯酰吗啉。
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