CN118813858B - 一种与紫花苜蓿地上部干重性状紧密连锁的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与紫花苜蓿地上部干重性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记位于紫花苜蓿参考基因组ZM‑4alfalfa genome的4号染色体6021492位的碱基处，多态性为C/T。本发明提供了一种与紫花苜蓿干重性状紧密连锁的SNP分子标记，为共显性标记，具有高特异性、高灵敏度、高分辨力和高分型质量的特点；标记不受环境条件影响，能够使用种子或不同类型的植物组织进行检测，结果准确、重复性和稳定性好；不同检测实验室和不同的数据结果可以相互比较验证，可以根据基因型实现快速、高通量、低成本地紫花苜蓿干重性状突变型的检测，判定紫花苜蓿地上部干重，具有广泛的应用普适性。

Description

一种与紫花苜蓿地上部干重性状紧密连锁的SNP分子标记及 其应用

技术领域

本发明属于农业分子生物学领域，具体涉及一种与紫花苜蓿地上部干重性状紧密连锁的SNP分子标记及其应用。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上最重要的多年生豆科牧草之一，其生物量大，营养价值高，具有抗旱、耐盐碱等特点，被誉为“牧草之王”，在牧草产业中占据重要的地位，在优质畜牧业发展和生态治理修复方面有着不可替代的作用。目前，紫花苜蓿品种选育主要依赖杂交、选择等传统育种方法，造成品种研发效率低下，稳定性差，性状突出的优异紫花苜蓿品种较少，严重制约苜蓿产业的发展。因此，深入解析紫花苜蓿重要性状的分子遗传机理，开发具有高效、精准、低成本特点的分子遗传标记用于紫花苜蓿基因型鉴定和相关性状预测，突破紫花苜蓿种质资源评价与品种培育存在的瓶颈问题，提高育种效率，助力紫花苜蓿由常规育种进入分子设计育种。

目前对紫花苜蓿种质资源的精准评价鉴定工作开展较少，种质资源鉴定效率低、准确性不高，对其重要性状，特别是产量、营养品质和抗逆性状的挖掘鉴定不够深入，不能有效获得优异苜蓿种质材料。紫花苜蓿的鉴定评价主要依靠育种材料在生长过程中表现出表型后进行调查。这类评价方法存在以下问题：通常取决于对形态特征和生物学特性的视觉识别，判断标准很难精确量化，主观性强；易受环境和栽培条件影响，准确性和稳定性差；耗时长、时效性差；需投入大量人力、物力，成本高。

DNA分子标记法是当前作物品种选育常用的一种技术方法。DNA分子标记是直接反应DNA差异(多态性)的一种遗传标记，目前主要为SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列)和SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)等。SSR标记具有操作简便，成本低，重复性较好，结果真实可靠等特点。相比SSR标记法，SNP标记技术更加简便，且易于自动化，检测通量高，速度快；单位数据点检测成本低；不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；是快速、简便、灵敏、准确、稳定、低成本鉴定功能基因的最常用方法。紫花苜蓿在功能基因标记方面的研究工作较少，目前仍缺乏高通量基因型鉴定与分析技术体系和具有重要育种价值的分子标记，基于SNP标记选择法用于紫花苜蓿地上部干重性状的选择方法更是鲜见报道。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种与紫花苜蓿地上部干重性状紧密连锁的SNP分子标记。

本发明还提出用于检测上述SNP分子标记的引物组。

本发明还提出一种试剂盒。

本发明还提出一种基因芯片。

本发明还提出上述SNP分子标记、引物组、试剂盒和/或基因芯片的应用。

本发明还提出一种鉴定或辅助鉴定紫花苜蓿地上部干重的方法。

本发明还提出一种紫花苜蓿的育种方法。

根据本发明的第一方面，提出了一种与紫花苜蓿地上部干重性状紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于紫花苜蓿参考基因组ZM-4alfalfa genome的4号染色体60214922位的碱基处，多态性为C/T。

根据本发明第二方面，提出了一种用于扩增上述SNP分子标记的引物组。

在本发明的一些实施方式中，所述引物组包括如SEQ ID NO.4(表2)所示的第一特异性引物、如SEQ ID NO.5(表2)所示的第二特异性引物序列。

在本发明的一些实施方式中，所述第一特异性引物和所述第二特异性引物分别连接有不同的荧光接头序列。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光接头序列选自FAM、HEX。

根据本发明的一些实施方式，所述引物组还包括通用引物，所述通用引物的序列如SEQ ID NO.6(表2)所示。

根据本发明第三方面，提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。

根据本发明第四方面，提出了一种基因芯片，所述基因芯片包括上述引物组。

根据本发明的第五方面，提出了上述SNP分子标记、引物组、试剂盒或基因芯片在以下任一项中的应用：

(1)检测紫花苜蓿地上部干重；

(2)鉴定及筛选不同地上部干重的紫花苜蓿种质；

(3)选育单株地上部干重≥150g的紫花苜蓿；

(4)紫花苜蓿分子标记辅助育种；

(5)紫花苜蓿育种；

(6)制备紫花苜蓿育种的产品。

在本发明的一些实施方式中，所述不同地上部干重的紫花苜蓿种质包括单株干重≥150g的紫花苜蓿种质和/或单株干重＜150g的紫花苜蓿种质。

根据本发明的第六方面，提出了一种鉴定或辅助鉴定紫花苜蓿地上部干重的方法，所述方法包括以下步骤：

S1、从紫花苜蓿材料中提取基因组DNA；

S2、对步骤S1中提取的基因组DNA进行所述SNP分子标记的多态性检测，根据基因型判断所述紫花苜蓿材料的地上部干重。

在本发明的一些实施方式中，若所述SNP分子标记检测得到的基因型为CC时，则所述紫花苜蓿材料的单株干重≥150g；若所述SNP分子标记检测得到的基因型为TT时，则所述紫花苜蓿材料的单株干重＜150g；若所述SNP分子标记检测得到的基因型为TC时，则所述紫花苜蓿材料的单株干重≥150g。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中，紫花苜蓿材料中提取基因组DNA采用简化CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2中，用KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术对SNP分子标记进行检测。

在本发明的一些实施方式中，所述用KASP技术对SNP分子标记进行检测的KASP反应混合液的组成如下：

在本发明的一些实施方式中，所述用KASP技术对SNP分子标记进行检测的扩增程序为：94℃15min；94℃20s，65℃-57℃60s，10个循环；94℃20s，57℃60s，33个循环。

根据本发明的第七方面，提出了一种紫花苜蓿育种方法，包括如下步骤：利用上述方法，选择单株地上部干重≥150g的紫花苜蓿种质进行后续育种。

根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明提供了一种与紫花苜蓿地上部干重性状紧密连锁的SNP分子标记，标记为共显性标记，PIC值高于>0.3，样本数据检出率>98％，具有高特异性、高灵敏度、高分辨力和高分型质量的特点；标记不受环境条件影响，能够使用种子或不同类型的植物组织进行检测，结果准确、重复性和稳定性好；不同检测实验室和不同的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性，可以根据基因型实现快速、高通量、低成本地检测紫花苜蓿干重突变型，判定单株地上部干重，用于紫花苜蓿高产株型改良的标记辅助育种，具有广泛的应用普适性。

本发明检测方法结合KASP检测技术，可用于紫花苜蓿地上部干重突变型的检测，检测方法简单、快捷，检测成本低，适用于不同的检测仪器设备。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中的分子标记开发流程图；

图2为本发明实施例1中的分子标记Me900010分型典型结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例：一种与紫花苜蓿地上部干重性状相关的紧密连锁的SNP分子标记及其应用

该分子标记的设计过程，如图1所示，基于63份紫花苜蓿核心种质资源的重测序数据构建育种种质资源数据库，根据已有资源的表型调查数据和全基因组重测序数据的分析，紫花苜蓿地上部干重紧密关联位点被定位在如下表1所示区间的多个位点，紫花苜蓿的参考基因组版本为ZM-4alfalfa genome，来源为组装的基因组。将得到的数据基于序列信息进行提取，并对基因序列进行SNP多态性分析，最后得到多个SNP位点并获取其侧翼序列前后约150bp，进行标记设计及合成。

表1

Phenotype	Target_Type	Chr	Position
				DryWeight.GLM	SNP	chr1	51340716
DryWeight.GLM	SNP	chr4	60214922
				DryWeight.GLM	SNP	chr5	43772478
DryWeight.GLM	SNP	chr3	23749587

与紫花苜蓿干重性状紧密连锁的SNP分子标记的筛选与验证步骤如下：

1引物设计

对于上述表1中筛选得到的分子标记，基于紫花苜蓿参考基因组ZM-4alfalfagenome，利用在线引物设计网站BatchPrimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对其进行KASP标记引物设计。每组标记有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。设计完成后，进一步对引物序列进行全基因组拷贝数分析，最终得到高质量的单拷贝的KASP标记，位点设计信息如下表2所示。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

利用上述设计得到的分子标记，可对紫花苜蓿材料的地上部干重开展高通量检测。当检测的分子标记为含有Allele X对应碱基的基因型时，说明紫花苜蓿材料的地上部干重≥150g，具有高干重(生物量)的表型；当检测得到的基因型为不含有Allele X对应碱基的基因型时，说明紫花苜蓿材料的地上部干重＜150g，具有低干重(生物量)的表型，当检测得到的基因型为杂合基因型，同样表明紫花苜蓿材料的地上部干重≥150g，具有高干重(生物量)的表型。

表2

2样品检测

DNA提取：从紫花苜蓿中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。

KASP反应测试：KASP标记的验证和检测使用Douglas Scientific的Array Tape系统进行。Array Tape基因型分型平台包括用于PCR扩增体系组装的NEXAR、PCR扩增的SOELLEX、荧光信号扫描的ARAYA以及数据分析的INTELLICS。扩增体系如表3所示。

表3KASP标记基因型分型的PCR扩增体系

PCR扩增反应条件为：采用SOELLEX进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃15min；94℃20s，65℃-57℃(每个循环退火温度降低0.8℃)60s，10个循环；94℃20s，57℃60s，33个循环。

信号扫描和基因型分型：PCR反应完成后用ARAYA进行反应体系荧光信号扫描；然后用INTELLICS进行基因型分型和数据分析。

3标记分型数据

根据上述检测方法，用63个紫花苜蓿材料对上述表2中的标记Me900009、Me900010、Me900011、Me900019进行KASP反应验证。

典型的KASP标记基因型分型图如图2所示，从图中可以看出，在KASP标记基因型分型检测中，样品的基因型分成3簇，分别为X簇、Y簇以及杂合基因型簇，其中X簇表示样品在该KASP标记位点含有纯合X等位基因型(分型图中标为红色，位于图形左上角)，Y簇表示样品在该KASP标记位点含有纯合Y等位基因型(分型图中标为蓝色，位于图形右下角)，杂合基因型簇表示样品在该KASP标记位点含有X和Y杂合等位基因型(分型图中标为紫色)。

质量验证结果表明，KASP标记仅有Me900010的两个纯合和杂合簇分型好、紧凑，位点为单拷贝，检出率都高于98％且与表型对应一致度高，KASP标记的基因型分型质量完全能满足紫花苜蓿地上部干重的精准检测。因此，后续选择Me900010进行后续实验验证。

4特异性和实用性检测

为检测本发明中标记Me900010的特异性及实用性，收集不同地区紫花苜蓿的品系进行田间种植，根据上述检测方法，进行基因型和实际表型检测验证。为了确保地上部干重表型测量的准确性，每个品系紫花苜蓿选取每10株作为一个测量样品，重复3次的平均值作为表型测量值，根据地上部干重质量(g)进行分类，单株地上部干重≥150g为高干重种质材料；单株地上部干重＜150g的为低干重种质材料，以此判定表型。

表4

结果如表4所示，从表中可以看出，基因型与表型鉴定结果基本一致，本发明的标记Me900010在检测紫花苜蓿地上部干重(生物量)方面具有高特异性，可快速准确的鉴定所测试紫花苜蓿种质材料的地上部干重水平。

本发明中使用的Douglas Arraytape基因分型平台配套的试剂和耗材均购于英国LGC公司。基于Douglas Array Tape平台的KASP标记检测优点：KASP标记自动化程度达90％，极大减少了实验室的人力及人为错误；检测通量高，8小时可获得122,880个数据点，是传统的96孔板SNP基因分型方法的10倍；检测反应体积小(仅0.8uL/反应)，与传统的96孔板SNP基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70％-90％。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (8)

1.一种用于检测与紫花苜蓿地上部干重性状紧密连锁的SNP分子标记的试剂在以下任一项中的应用：

（1）鉴定及筛选不同地上部干重的紫花苜蓿；

（2）选育单株地上部干重≥150g的紫花苜蓿；

所述SNP分子标记位于紫花苜蓿参考基因组ZM-4 alfalfa genome的4号染色体60214922位的碱基处，多态性为C/T。

2.用于扩增如权利要求1中所述的SNP分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括如SEQ ID NO.4所示的第一特异性引物、如SEQ ID NO.5所示的第二特异性引物和如SEQID NO.6所示的通用引物。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述第一特异性引物和所述第二特异性引物分别连接有不同的荧光接头。

4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述荧光接头选自FAM、HEX。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2-4任一项所述的引物组。

6.权利要求2-4任一项所述的引物组或权利要求5所述的试剂盒在以下任一项中的应用：

（1）鉴定及筛选不同地上部干重的紫花苜蓿；

（2）选育单株地上部干重≥150g的紫花苜蓿。

7.一种鉴定紫花苜蓿地上部干重的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、从紫花苜蓿种质材料中提取基因组DNA；

S2、对步骤S1中提取的基因组DNA进行如权利要求1中所述的SNP分子标记的多态性检测，根据基因型判断所述紫花苜蓿种质材料的地上部干重。

8.一种选择单株地上部干重≥150g的紫花苜蓿种质进行育种的方法，其特征在于，包括如下步骤：利用如权利要求7所述的方法，选择单株地上部干重≥150g的紫花苜蓿种质材料进行后续育种。