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CN118813644B - 一种SoMYB1基因及其在制备高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷转基因植物中的用途 - Google Patents

一种SoMYB1基因及其在制备高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷转基因植物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种SoMYB1基因及其在制备高产矢车菊素‑3‑O‑芸香糖苷转基因植物中的用途，属于基因工程领域。本发明首次发现，与野生型烟草相比，过表达SoMYB1基因的转基因烟草的花青素代谢物，特别是矢车菊素‑3‑O‑芸香糖苷的含量显著提高。本发明的SoMYB1基因，及其重组载体、重组菌可以用来提高植物中的矢车菊素‑3‑O‑芸香糖苷含量。本发明提供的构建高产矢车菊素‑3‑O‑芸香糖苷转基因植物的方法，在定向生产高产矢车菊素‑3‑O‑芸香糖苷转基因植物中具有广阔的应用前景。

Description

一种SoMYB1基因及其在制备高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷转 基因植物中的用途
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及使用SoMYB1基因过表达制备高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷转基因植物的方法。
背景技术
矢车菊素-3-O-芸香糖苷(cyanidin-3-O-rutinoside，C3R)是一种天然存在于植物中的重要的花青素代谢物。研究发现，C3R对H2O2所致的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)氧化损伤具有保护作用，与抑制细胞凋亡通路相关蛋白的表达，提高胞内抗氧化酶活性，清除胞内过量ROS，降低细胞凋亡有关，是预防阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)和亨廷顿氏病(Huntington’s disease,HD)等神经退行性疾病(neurodegeneration disease,，NDD)的一个有前景的候选天然药物。
近年来，基因工程技术在植物药用物质的合成和提取方面取得了显著进展，成为获取药用物质的重要方法。在众多植物中，烟草由于具有组织易操作、再生能力强、生长量大等生物特性，长期以来被作为基因工程研发对象用于合成和提取药用物质。自2008年，利用基因工程技术以烟草为对象获得了肿瘤细胞表面蛋白、ZMapp、血清蛋白活化剂TPA、癌症免疫物质、青蒿酸等治疗非何杰金氏淋巴瘤、埃博拉病毒、心脏病、癌症和疟疾等疾病的药物。
目前还未见利用基因工程技术开发高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷的转基因植物的报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种新的SoMYB1基因，以及其重组载体、重组菌，并首次发现过表达SoMYB1基因能够显著提高植物中矢车菊素-3-O-芸香糖苷的含量。
本发明的第二个目的在于提供一种制备高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷的转基因植物的方法。
本发明提供了一种SoMYB1基因，它的CDS序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种重组载体，它包括CDS序列如SEQ ID No.1所示的基因。
本发明还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。
进一步地，所述重组菌为重组农杆菌。
进一步地，所述重组农杆菌为重组根癌农杆菌。
本发明还提供了一种制备高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷的转基因植物的方法，其特征在于，它是将前述的SoMYB1基因转入植物中，获得表达SoMYB1蛋白的植物。
进一步地，所述转入植物的方法是农杆菌法、基因枪法、电转法、PEG介导法、脂质体法、磷酸钙-DNA共沉淀法中的一种。
进一步地，所述植物为烟草。
本发明还提供了前述SoMYB1基因、前述重组载体或前述重组菌在制备高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷的转基因植物中的用途。
进一步地，所述植物为烟草。
本发明取得了以下有益效果：
本发明首次发现，与野生型烟草相比，过表达SoMYB1基因的转基因烟草的花青素代谢物，特别是矢车菊素-3-O-芸香糖苷的含量显著提高。
本发明的SoMYB1基因，及其重组载体、重组菌可以用来提高植物中的矢车菊素-3-O-芸香糖苷含量。
本发明提供的构建高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷转基因植物的方法，在定向生产高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷转基因植物中具有广阔的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：SoMYB1 CDS扩增跑胶图(M:D2000；1-10为SoMYB1 CDS阳性扩增)。
图2：SoMYB1 CDS连接pLB载体筛菌跑胶图(M:D2000；1-6为阳性菌)。
图3：SoMYB1-attB1-F和SoMYB1-attB2-R引物扩增跑胶图(M:D2000；1-6为阳性扩增)。
图4：SoMYB1表达载体构建跑胶图(M:D2000；1.Bp反应阳性菌；2.LR反应阳性菌；3.BP反应阳性菌质粒；4.LR反应阳性菌质粒)。
图5：SoMYB1农杆菌转化筛菌跑胶图(M:D2000；1-10为阳性菌)。图6：过表达SoMYB1转基因烟草株系的PCR鉴定(M:D2000；1-9为阳性扩增)。
图7：烟草的照片(CK：野生型烟草；SoMYB1：转基因烟草株系)。图8：过表达SoMYB1转基因烟草株系叶片中花青素代谢物含量(CK：野生型烟草；SoMYB1：转基因烟草株系；Anthocyanidin_12：矢车菊素-3-O-芸香糖苷)。
具体实施方案
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、SoMYB1基因的克隆
1、实验方法
通过已知调控花青素合成的MYB转录因子，在紫丁香转录组数据库中进行同源比对，找到目标基因SoMYB1序列。
使用TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit(TaKaRa,Beijing,China)试剂盒按照说明书操作流程提取紫丁香花瓣中的RNA，使用TaKaRa PrimeScriptTM 1stStrand cDNASynthesis Kit(TaKaRa,Beijing,China)试剂盒按照说明书操作流程合成cDNA。以cDNA为模板，根据SoMYB1基因编码区设计引物SoMYB1-F和SoMYB1-R，引物序列分别为5’-CTACAGATTTTCACGTGCTTATTGG-3’(SEQ ID No.2)；5’-TGCATGTCTGATGTGTCTATGTCT-3’(SEQ ID No.3)，进行PCR扩增。
PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃90s，35个循环；72℃5min，4℃保存，PCR产物使用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示，扩增成功。
使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)按照说明书操作流程回收SoMYB1目的片段，根据pLB零背景快速克隆试剂盒(TIANGEN，中国)说明书操作流程连接目的片段后进行阳性菌筛选，将阳性菌送上海生工测序。测序成功后使用快速质粒小提试剂盒(TIANGEN，中国)按照说明书操作流程提取阳性菌质粒用于下一步表达载体构建。结果如图2所示，构建成功。通过测序，确定SoMYB1基因的CDS序列为：ATGTTAAGTACACAAGTTGAATTGAGAAAAGGTGCATGGACTGAAGAAGAAGATAAACTTCTCCGGAAGTGCATTAACAAGTATGGAGAAGGAAAATGGCATCTAGTTCCTCTCAGAGCAGGGTTGAACAGATGCAGGAAGAGCTGTAGGCTGAGGTGGTTAAACTATCTCAGGCCAAATATCAAAAGAGGAGACTTTGCTCCGGATGAAGATGA TCTCATTATAAGGCTTCATAACTTGTTAGGAAACAGATGGTCACTGATATCCGGTAGAATTCCTGGAAGAACCGGCAACGACGTGAAAAACCATTGGAACACCCATCTGCAGAAGAAGGTATTGGGTCGAGAAGAGGGGAAGACGAAAGCCCAGAAAACCACCAAAACGACAATCTTGAGACCTCGACCTCGGACCTTCAAAAGAATTATTAATGGATCTTTTTCGTCATTAGATCAGAAAATAAATAATATTTCAGCTCTAACTGATCAAAGTTCAGACATTCCATCTCCATCATCGTCAAAACAAGTAGACGATGCATGCACCCAGACGCAGTGGTGGAGTAACTTGCTCGATTCTGTCGAAATTGATGGAGAAACTGAGCCAGGATCTAAAGGAATATCTCTAGAATTGCAACAAGATGATGGCTGGAATGACTTTTCTCTTGATAAGGGCATTTGGGAATTCCTGAGTTCTGAAAATATCATATGA(SEQ ID No.1)。
该基因的CDS为705bp。
实施例2、构建SoMYB1基因的表达载体
1、实验方法
使用Gateway Cloning kit(Invitrogen，USA)试剂盒，按照使用说明书设计引物SoMYB1-attB1-F和SoMYB1-attB2-R，引物序列分别为：
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGTTAAGTAC ACAAGTTG-3’(SEQ ID No.4)，
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATATGATATT TTCAGA-3’(SEQ ID No.5)，
使用2×Pfu PCR Mix(TIANGEN，中国)按照说明书操作流程扩增SoMYB1质粒。
PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，30个循环；72℃5min，4℃保存，PCR产物使用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果如图3所示，扩增成功。
回收PCR产物，按照Gateway Cloning kit(Invitrogen，USA)试剂盒说明书操作流程构建SoMYB1表达载体。入门载体构建(Bp反应)：将SoMYB1-CDS序列连接到入门载体pDONR207中，获得pDONR207-SoMYB1；表达载体构建(LR反应)：将pDONR207-SoMYB1与表达载体pJAM1502进行重组，获得表达载体pJAM1502-SoMYB1。结果如图4所示，构建成功。将表达载体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性菌，提取质粒用于下一步农杆菌转化。
采用冻融法将pJAM1502-SoMYB1表达载体转入根癌农杆菌菌株GV3101中。具体方法如下：
取GV3101农杆菌感受态细胞置于冰上溶解，反应体系如下：1μL DNA质粒、100μL农杆菌感受态细胞。充分混匀后冰浴30min，然后在液氮中冷冻5min，取出后立即在37℃水浴锅中水浴5min，最后在冰上放置5min。在超净工作台中向其体系中加入500μL的YEP液体培养基(农杆菌培养基)，封口后置于摇床上220rpm、28℃培养2h。在超净工作台中吸取100μL摇好的菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEP固体培养基上，28℃黑暗倒置培养两天。对长出的菌落使用引物SoMYB1-attB1-F和SoMYB1-attB2-R进行PCR检测。结果如图5所示，转化成功。
实施例3、SoMYB1基因转化烟草
1、实验方法
利用农杆菌介导的转化方法将实施例2制备的pJAM1502-SoMYB1表达载体转入烟草基因组，具体方法如下：
烟草(Nicotiana tabacum L.)无菌组培苗培养2-3周后，剪叶片长×宽约1cm×1cm，将剪好的叶片放至含有pJAM1502-SoMYB1表达载体的菌液中侵染10min，农杆菌的浓度约为0.6(OD600)。用无菌吸水纸将叶片上的菌液吸干后，放置于基础培养基上28℃黑暗培养2天。将叶片转移到含有300mg/L头孢霉素的基础培养基上，25℃，2000lx光照培养3-5天，然后将叶片转移至含有300mg/L头孢和50mg/L的卡那霉素(Diamond，中国上海)的基础培养基中进行抗性筛选。当叶片分化幼苗长至约1.5cm时将幼苗转至含有300mg/L头孢和50mg/L卡那霉素的MS培养基中培养20天左右(培养温度为25℃)，获得SoMYB1基因转化烟草。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1过表达SoMYB1基因的转基因烟草的鉴定和检测
1.实验样品
实施例3构建的过表达SoMYB1基因的转基因烟草，以野生型烟草(Nicotianatabacum L.)为对照。
2.实验方法
使用特异性引物SoMYB1-attb1-F和SoMYB1-attb2-R扩增转化烟草的DNA，对转基因烟草进行鉴定。具体实验方法如下：
PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃90s，35个循环；72℃5min，4℃保存，PCR产物使用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
通过花青素靶向代谢组检测(迈维代谢，中国)比较过表达SoMYB1转基因烟草和野生型烟草叶片中的花青素代谢物含量。
3.实验结果
通过PCR检测，共筛选9个过表达SoMYB1的转基因烟草株系，如图6。
对转基因烟草株系进行表型观察发现，与野生型烟草相比，转基因烟草不同组织均显著积累花青素。野生型烟草根为白色，茎、叶、果实、种子均为绿色，花为淡粉色，而转基因烟草根、茎、叶、花、果实、种子均呈现紫色(图7)。
对过表达SoMYB1基因的转基因烟草株系叶片进行花青素靶向代谢组检测，发现检测到的49种花青素代谢物总量由野生型烟草中28.6μg/g DW升高至1020.7μg/g DW，花青素代谢物总量升高了约36倍。在这49中花青素代谢物中，转基因烟草株系中矢车菊素-3-O-芸香糖苷含量为912.7μg/g，是野生型烟草的约4590倍，占转基因烟草株系中花青素代谢物总量的89.4％，如图8。
上述实验结果表明，与野生型烟草相比，过表达SoMYB1基因的转基因烟草的花青素代谢物，特别是矢车菊素-3-O-芸香糖苷的含量显著提高。
综上，本发明首次发现，与野生型烟草相比，过表达SoMYB1基因的转基因烟草的花青素代谢物，特别是矢车菊素-3-O-芸香糖苷的含量显著提高。本发明的SoMYB1基因，及其重组载体、重组菌可以用来提高植物中的矢车菊素-3-O-芸香糖苷含量。本发明提供的构建高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷转基因植物的方法，在定向生产高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷转基因植物中具有广阔的应用前景。

Claims (8)

1.一种SoMYB1基因，其特征在于，它的CDS序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种重组载体，其特征在于，它包括CDS序列如SEQ ID No.1所示的基因。
3.一种重组菌，其特征在于，它包含权利要求2所述的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为重组农杆菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组农杆菌为重组根癌农杆菌。
6.一种制备高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷的转基因烟草的方法，其特征在于，它是将权利要求1所述的SoMYB1基因转入烟草中，获得表达SoMYB1蛋白的烟草。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转入烟草的方法是农杆菌法、基因枪法、电转法、PEG介导法、脂质体法、磷酸钙-DNA共沉淀法中的一种。
8.权利要求1所述SoMYB1基因、权利要求2所述重组载体或权利要求3-5任一项所述重组菌在制备高产矢车菊素-3-O-芸香糖苷的转基因烟草中的用途。
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