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CN118813494A - 一株月季防病促生细菌Pseudomonas canavaninivorans及其应用 - Google Patents

一株月季防病促生细菌Pseudomonas canavaninivorans及其应用 Download PDF

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CN118813494A
CN118813494A CN202411214547.1A CN202411214547A CN118813494A CN 118813494 A CN118813494 A CN 118813494A CN 202411214547 A CN202411214547 A CN 202411214547A CN 118813494 A CN118813494 A CN 118813494A
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rose
canavaninivorans
growth
pseudomonas
strain
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Application number
CN202411214547.1A
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何祥凤
张德强
李雪
隗立依
侯芳梅
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Beijing University of Agriculture
Original Assignee
Beijing University of Agriculture
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Abstract

本发明公开了一株月季防病促生细菌Pseudomonas canavaninivorans及其应用。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.30656，分类命名为Pseudomonas canavaninivorans，为革兰氏阴性菌，可产生蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素，能够溶磷、固氮，并能耐受盐和多种重金属胁迫。该菌株能够抑制月季黑斑病菌蔷薇盘二孢，并能够拮抗其它植物病原灰葡萄孢、胶胞炭疽菌、尖孢镰刀菌和木贼镰刀菌生长，抑菌谱广，可应用范围广。本发明的菌株可防治月季黑斑病和白粉病，并且能促进月季生长。本发明为防治月季病害及促进月季生长提供了一株优良的生防菌株，对月季病害的绿色防控技术和促进月季产业可持续发展具有重要意义。

Description

一株月季防病促生细菌Pseudomonas canavaninivorans及其 应用
技术领域
本发明涉及一株能够抑制月季黑斑病病原菌蔷薇盘二孢，以及其它植物病原菌灰葡萄孢、胶胞炭疽菌、尖孢镰刀菌和木贼镰刀菌生长的Pseudomonas canavaninivoransLX5及其应用，该菌株具有溶磷、固氮、产生嗜铁素、蛋白酶和纤维素酶、耐盐和重金属胁迫的能力，能够防治月季黑斑病和白粉病，并能够促进月季生长。
背景技术
月季是蔷薇属(Rosa)植物杂交后形成的杂种品种群的通称，不仅是中国十大传统名花之一，还可以食用及提取精油。在月季种植过程中常受到黑斑病、灰霉病、白粉病、炭疽病等多种病害的侵袭。其中月季黑斑病对露地栽培月季危害最为严重，病原菌为兼性寄生子囊菌门蔷薇双壳菌(Diplocarpon rosae)，无性态为蔷薇盘二孢(Marssonina rosae，异名Actinonema rosae)。染病植株叶片边缘呈现不规则黑色病斑，发病后期叶片变黄脱落，甚至整株死亡，且发病植株活力降低，更容易受到其它非生物胁迫，如霜冻、干旱等危害，严重制约了月季产业的发展。
目前生产中对月季黑斑病的防治主要依赖化学药剂。由于月季黑斑病是多循环病害，有效预防黑斑病大规模发生需要在整个生长季中频繁施药，如使用多菌灵、速克灵等。长期使用大量化学药剂不仅增加成本，残留药剂也会污染环境。此外，化学药剂的使用还会造成病原菌的定向选择产生耐药性。随着“绿色植保”概念的提出，安全、低毒、持效期长、不易产生耐药性的生物防治受到越来越多的关注。因此，应用绿色无污染的有益微生物来防治月季病害是未来发展的方向。
假单胞菌属(Pseudomonas)细菌种类较多，广泛存在于环境中，是目前应用于植物防病促生的主要有益菌之一，具有分布广、繁殖快、易定殖、代谢产物丰富的优点。目前报道的具有防病促生作用的主要的有荧光假单胞菌(P.fluorescens)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)、油菜假单胞菌(P.brassicacearum)、恶臭假单胞菌(P.putida)等。这些假单胞菌能够通过提高磷酸盐和铁溶解、固氮、产生植物激素等机制提高番茄、黄瓜、大豆、莴苣等多种植物的产量，还能够通过产生抑菌次生代谢产物、诱导抗性等机制防治镰刀菌、立枯丝核菌、腐霉菌、灰葡萄孢菌等多种病原菌引起的植物病害。尽管假单胞菌已经广泛应用于植物的促生防病中，但是目前还没有在月季的防病促生中应用假单胞菌的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株对月季病原菌蔷薇盘二孢菌及其它4种植物病原真菌有抑制作用，且能够溶磷、固氮、产生嗜铁素、蛋白酶和纤维素酶、耐盐和重金属胁迫的细菌，及其在月季黑斑病和白粉病防治及促生长中的应用。
本发明所提供的月季病害防治及生长促进的菌为Pseudomonascanavaninivorans LX5。
所述Pseudomonas canavaninivorans LX5，已于2024年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的保藏编号为CGMCC No.30656。所述Pseudomonas canavaninivorans LX5分离自土壤，为革兰氏阴性菌。菌体在LB培养基上能形成乳白色的菌落，菌落圆形边缘规则，菌落边缘整齐，表面光滑，稍有粘度。
以上述Pseudomonas canavaninivorans LX5为活性成分的生物菌剂或微生物菌肥也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明中能够防治月季多种病害并能促进生长的细菌为Pseudomonascanavaninivorans LX5，能够有效防治月季黑斑病和月季白粉病，同时可以有效促进月季生长。
本发明的对月季具有促生防病作用的细菌为Pseudomonas canavaninivoransLX5，分离自土壤。平板抑菌实验表明该菌株对月季黑斑病病原蔷薇盘二孢菌及其它植物病原菌灰葡萄孢菌、胶胞炭疽菌、尖孢镰刀菌和木贼镰刀菌均有较好的拮抗作用。该菌株还能够耐盐和重金属胁迫，能够产生蛋白酶、纤维素酶及嗜铁素，并能够固氮、溶解无机磷和有机磷。离体叶片防效试验表明该菌株对月季黑斑病的防效可达91.1％。温室实验显示，该菌株还能够防治月季白粉病，防效可达69.0％；该菌株处理后月季植株的株高比对照增加8.7cm。该菌株的获得有望为月季的病害防治及促进生长提供一条环保、简单、有效的途径。本发明的Pseudomonas canavaninivorans LX5是一株具有良好防病促生应用前景的菌株。
附图说明
图1为Pseudomonas canavaninivorans LX5对病原菌生长抑制结果。
图2为Pseudomonas canavaninivorans LX5对月季黑斑病的防效测定。
图3为在蛋白酶、纤维素酶、嗜铁素、溶解无机磷和有机磷、固氮检测平板上Pseudomonas canavaninivorans LX5菌落特征。
图4为Pseudomonas canavaninivorans LX5在添加重金属和盐的LB平板上的生长。Cd2+，八水硫酸镉30mg/L；Pb2+,硝酸铅50mg/L；Cu2+,硫酸铜50mg/L；Zn2+,硫酸锌150mg/L；Na+，氯化钠800mmol/L。
生物材料保藏
保藏编号：CGMCC No.30656
名称：Pseudomonas canavaninivorans LX5
分类命名：Pseudomonas canavaninivorans
是否存活：存活
保藏时间：2024年05月16日
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、抑制月季黑斑病菌生长的细菌筛选及其抑菌谱测定
为了筛选拮抗月季黑斑病菌蔷薇盘二孢的细菌，将本实验室前期保存的分离自土壤中的300株细菌分别接种于装有2mL LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH7.0)的2.5mL离心管中，在30℃180rpm条件下培养过夜后，将1mL菌液转入装有100mL LB培养基的三瓶中30℃180rpm培养24h。收集的菌液以10000×g离心20min，并用0.22μm的过滤器过滤其上清液。将上清液与高压灭菌后冷却到45℃的PDA(马铃薯400g，蔗糖40g，琼脂40g，蒸馏水1000mL)等的比例混合，摇匀后将其倒入直径为9cm的培养皿，凝固后待用。将月季黑斑病病原蔷薇盘二孢菌在PDA(马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL)培养基上30℃培养30d，用打孔器从的菌落边缘取直径为0.5cm菌饼，放置于混合了细菌上清液的PDA平板中心，以加入无菌水的PDA平板为对照，每处理三次重复，30℃培养30d，测量菌落直径，并计算抑菌率。
应用平板对峙法测定上述菌株对植物病原真菌灰葡萄孢菌、胶胞炭疽菌、尖孢镰刀菌和木贼镰刀菌是否有拮抗效果。按照上述方法培养病原真菌和筛选出的拮抗蔷薇盘二孢的细菌菌株，取直径为0.5cm的病原菌菌饼置于PDA培养基中央，在距离中心点3cm的位置接种待测细菌菌悬液2μL，每培养皿接种3个点，3个重复，以接种无菌水的平板为对照。30℃培养7d，测量菌落直径，并计算其抑菌率。计算公式为：抑菌率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落值径-菌饼直径)×100％
筛选结果显示，一株细菌LX5的无菌代谢液能够有效的抑制月季病原菌薇盘二孢菌的生长，抑菌率为86.9％。该菌株对植物病原菌灰葡萄孢、胶胞炭疽菌、尖孢镰刀菌和木贼镰刀菌均具有拮抗作用(图1和表1)。
表1菌株LX5对月季病原菌的抑制作用
*表示和对照在P<0.05水平有差异。
实施例2、LX5抑制月季黑斑病菌孢子萌发和芽管伸长
按照实施例1中方法培养蔷薇盘二孢菌，使用无菌水冲洗平板，收集真菌分生孢子，通过无菌纱布过滤孢子悬浮液，后用PDB(马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL)稀释孢子，直至孢子浓度为1×105孢子/mL。按照实施例1中方法培养拮抗菌LX5，并收集无菌上清液，按照体积比1/10混合蔷薇盘二孢的孢子悬液和无菌上清液，在28℃、180rpm培养。以无菌水为对照，每处理三个重复。14d后每处理观察记录100个孢子的萌发情况并测定芽管的长度。
结果显示，处理14d后，对照组的蔷薇盘二孢菌孢子的萌发率为100％，芽管长度为8.1μm，而菌株LX5处理后的孢子萌发率仅为35.47％，芽管长度仅为2.86μm(表2)。
表2LX5对蔷薇盘二孢菌孢子萌发及芽管伸长的抑制作用
处理 孢子萌发率(％) 芽管长度(μm)
对照 100.0±0.0 8.10±3.13
LX5 35.3±7.4* 2.86±0.83*
*表示和对照在P<0.05水平有差异。
实施例3、LX5菌株种属鉴定
采用常规生理生化及16S rDNA序列分析对LX5菌株进行鉴定，确认该菌株为Pseudomonas canavaninivorans。该菌株的生理生化及基本生物学特性见表3。
表3LX5的基本生物学特征
注：“+”表示能够利用碳源(或氮源)，“-”表示不能利用碳源(或氮源)
以菌株LX5的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA序列通用引物作为引物(27F：5’-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物为1492R：5’-TACGGGTACCTTGTTACGACTT-3’)，PCR扩增出约为1.5kb左右的产物片段，用27F和1492R测序得到1433个核苷酸(序列表中序列1)。将该序列与Pseudomonas canavaninivorans(登陆号：NR_181810.1)同源性最高，达99.93％。
依据《常见细菌鉴定手册》，LX5菌株以上生理生化特征均与Pseudomonascanavaninivorans相同，结合上述分子鉴定，将其鉴定为Pseudomonas canavaninivorans。将LX5命名为Pseudomonas canavaninivorans LX5。该菌株已于2024年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC NO.30656。
实施例4、Pseudomonas canavaninivorans LX5对月季病害的防效测定
1.对月季黑斑病的防效测定
按照实施例1中的方法培养Pseudomonas canavaninivorans LX5，并用无菌水将菌体浓度调至1×108GFU/mL。选择大小一致的月季‘月月粉’健康叶片，75％酒精表面消毒2min后用无菌水冲洗3次。用无菌滤纸吸干叶片表面水分，并在制备好的LX5菌悬液中浸泡5s，置于铺有双层滤纸的培养皿，每皿加5mL无菌水保湿。按照实施例1中方法培养月季黑斑病菌，加入无菌水将孢子洗脱，双层无菌纱布过滤，用无菌水将孢子悬液稀释至l06 CFU/mL。将15μL病原菌孢子悬浮液滴在叶片表面中央，于25℃12h/12h光照/黑暗培养。为保持湿度，接种后每3d在培养皿中补加5mL无菌水。每处理3个叶片，3次重复，以无菌水为对照。接种14d后按照发病分级调查发病情况。
离体叶片法黑斑病发病分级标准：
病级 分级标准
0级 无症状
1级 出现病斑，无分生孢子盘和分生孢子
2级 出现可见病斑，有分生孢子盘，无分生孢子
3级 出现可见病斑，有分生孢子盘和少量分生孢子
4级 病斑面积大于接种区域，有分生孢子盘和少量分生孢子
5级 病斑面积大于接种区域，有大量分生孢子盘和分生孢子
注：发病级数按发病症状和程度不同分为0级、1级、2级、3级、4级和5级。
按照下列公式计算防治效率：
发病率(％)＝出现症状叶片数/供试叶片数×100
病情指数＝[∑(各级发病叶片数×该病级)]/(调查总叶片数×最高病级)×100
防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
结果显示，接种月季黑斑病菌14d后，对照组叶片均出现大面积的黑斑病典型的病斑，而用LX5菌悬液预先处理后显著减轻叶片的发病症状，防效达到91.1％(图3和表4)。
表4、离体叶片法测定LX5对月季黑斑病的防效
处理 发病率(％) 病情指数 防效(％)
无菌水 0.0±0.0b 0.0±0.0b /
无菌水+蔷薇盘二孢菌 100.0±0.0a 100.0±0.0a /
LX5+蔷薇盘二孢菌 22.2±11.1b 8.9±4.4b 91.1
注：同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。
2.对月季白粉病的防效测定
将‘月月粉’扦插苗种植在蛭石：草炭＝1：1的土壤，在温室白粉病严重发生时置于玻璃温室22℃/16℃12h/12h光照/黑暗培养。按照实施例1中方法培养并制备浓度为1×108GFU/mL的Pseudomonas canavaninivorans LX5菌悬液。将备好的LX5菌悬液均匀喷洒于扦插苗各叶片表面，以清水和康圃2000倍液作为对照，每处理4株3次重复。于处理后20d后观察发病害情况。分级标准为0级：无病斑；1级：病斑面积占整株叶片总面积的1/4以下；2级：病斑面积占整株叶片总面积1/4至小于1/2；3级：病斑面积占整株叶片总面积的1/2至小于3/4；4级：病斑占整株叶片总面积的3/4及以上。按照下列公式计算防治效率：
发病率(％)＝出现症状植株数/供试植株数株×100
病情指数＝[∑(各级发病植株数×该病级)]/(调查总株数×最高病级)×100
防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
接种20d后统计试验结果，实验结果表明清水对照组病情指数达到27.1。LX5菌悬液预先处理之后接种病原菌病情指数仅为8.4，防效达到69％(表5)。而使用目前常用的药剂康圃2000倍液处理后的防效仅为54.2％。实验结果表明预先接种LX5能够有效的预防月季白粉病的发生。
表5LX5对月季白粉病的温室防治效果
处理 发病率(％) 病情指数 防效(％)
清水对照 66.7a 27.1±4.2a /
康圃2000倍液 50.0a 12.4±3.5b 54.2
LX5 33.3b 8.4±2.1b 69.0
注：同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)。
实施例4、P.canavaninivorans LX5促进月季生长测定
按照实施例1中方法培养并制备浓度为1×108GFU/mL的Pseudomonascanavaninivorans LX5菌悬液。按照实施例3中方法种植‘月月粉’扦插苗，选择长势一致的植株，用制备好的LX5菌悬液均匀喷洒扦插苗叶片表面，以无菌水为对照。60d后观察其生长情况，测定月季植株的株高。结果显示，用无菌水处理后‘月月粉’株高为15.3cm，而用P.canavaninivorans LX5菌悬液处理后植株的株高是24.0cm，比对照高8.7cm(表6)。
表6LX5对月季促生效果
处理 株高(cm)
无菌水 15.3±1.8
LX5 24.0±1.3*
*表示和对照在P<0.05水平有差异。
实施例6、P.canavaninivorans LX5能够产生蛋白酶
将活化的P.canavaninivorans LX5接种于LB液体培养基，于28℃，200rpm下过夜摇培。取10μL培养液滴加在蛋白酶检测培养基平板(脱脂奶粉100g，蛋白胨5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL)，重复3次。晾干后在28℃倒置培养2d，观察是否出现透明圈。结果显示，接种P.canavaninivorans LX5的平板上在菌落周围出现明显的水解透明圈(图3)，证明P.canavaninivorans LX5具有产蛋白酶的能力，可以分解培养基中的蛋白。
实施例7、P.canavaninivorans LX5能够产生纤维素酶
按实施例6中方法培养菌株LX5，取10μL培养液滴加在纤维素酶活检测培养基平板(蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纤维素钠10g，磷酸二氢钾1g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL)，重复3次。超净台吹干后在28℃避光倒置培养7d，观察是否出现水解晕圈。结果显示，对照组平板无任何变化，而接种P.canavaninivorans LX5的纤维素酶活检测培养基平板上菌落周围出现水解晕圈(图3)，说明P.canavaninivorans LX5具有产生纤维素酶的能力。
实施例8、P.canavaninivorans LX5能够产生嗜铁素
按实施例6中方法培养菌株LX5，取10μL培养液滴加在嗜铁素-CAS琼脂培养基平板(铬天青S 60.5mg，十六烷基三甲基溴化铵72.9mg，六水氯化铁2.645mg，二水磷酸二氢钠295.25mg，十二水磷酸氢二钠1213.5mg，氯化铵125mg，磷酸二氢钾37.5mg，氯化钠62.5mg，琼脂9000mg，蒸馏水定容到1000mL，pH6.8±0.2)，重复3次。超净台吹干后在28℃避光倒置培养3d，观察菌落周围培养基的颜色是否由蓝色变为橘黄色。结果显示，对照组平板无任何变化，而接种P.canavaninivorans LX5的菌落周围培养基出现蓝色褪色晕圈(图3)，说明P.canavaninivorans LX5具有产生嗜铁素的能力。
实施例9、P.canavaninivorans LX5能够溶解无机磷和有机磷
按实施例6中方法培养菌株LX5，取10μL培养液滴加在无机磷培养基平板(酵母粉0.5g，葡萄糖10g，磷酸三钙5g，硫酸铵0.5g，硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，氯化钠0.3g，硫酸锰0.03g，硫酸亚铁0.03g，琼脂15g，蒸馏水1000mL)，重复3次。超净台吹干后在28℃避光倒置培养7d，观察是否出现水解晕圈。同时，取10μL培养液点接于有机磷培养基平板(葡萄糖10g，碳酸钙1g，硫酸铵0.5g，硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，氯化钠0.3g，硫酸锰0.03g，硫酸亚铁0.03g，卵磷脂0.2g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL)，重复3次。超净台吹干后在28℃避光倒置培养7d，观察是否出现水解晕圈。
结果显示，无机磷培养基中P.canavaninivorans LX5菌落周围出现水解晕圈(图3)，说明P.canavaninivorans LX5能够水解无机磷。有机磷培养基上P.canavaninivoransLX5菌落周围出现微弱的水解晕圈(图3)，说明P.canavaninivorans LX5能够水解有机磷。
实施例10、P.canavaninivorans LX5能够固氮
按实施例6中方法培养菌株LX5，取10μL培养液滴加在阿须贝固氮培养基(硫酸镁0.2g，碳酸钙5g，磷酸二氢钾0.2g，甘露醇10g，硫酸钙0.1g，氯化钠0.2g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000mL)，超净台吹干后在28℃避光倒置培养7d，观察有无菌落形成，每个处理重复3次。若有菌落出现，则将单个菌落再连续转接2次，第3代仍能在阿须贝固氮培养基上稳定生长的菌株即表明具有固氮能力。以大肠杆菌为阴性对照。
结果显示，LX5在阿须贝培养基上能够正常生长，而阴性对照菌大肠杆菌不能生长，这说明菌株LX5具有固氮能力(图3)。
实施例12、P.canavaninivorans LX5能够耐受多种重金属和盐胁迫
在灭菌后降至65℃左右的LB培养基中加入过滤除菌的重金属溶液和多菌灵至终浓度分别为：八水硫酸镉30mg/L、硝酸铅50mg/L、硫酸铜50mg/L和硫酸锌150mg/L。同时配置终浓度为800mmol/L NaCl的LB平板。用灭菌牙签从新鲜培养的LX5菌落挑取菌体，在制备好的加入不同重金属的LB培养基平板上划线，28℃避光倒置培养7d，观察有LX5生长情况。
结果显示菌株LX5能够在含有高浓度的镉、铅、铜或锌的LB培养上正常生长，并且能够在含高浓度氯化钠的平板上正常生长(图4)。这些结果说明菌株LX5具有耐受多种重金属离子及盐胁迫的能力。
以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一株月季防病促生细菌，其特征在于，名称为Pseudomonas canavaninivorans LX5，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.30656。
2.权利要求1所述的月季防病促生细菌在防治植物病害中的应用；所述植物病害为蔷薇盘二孢引起的月季黑斑病和/或蔷薇单丝壳引起的月季白粉病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物病害为月季上发生的病害。
4.权利要求1所述的月季防病促生细菌在制备针对植物病原真菌和植物病原细菌的生防菌剂或微生物菌肥中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述植物病原真菌为蔷薇盘二孢(Marssonina rosae)、胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。
6.一种防治植物病害的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂的活性成分为Pseudomonas canavaninivorans CGMCC No.30656。
7.一种防治植物病害的微生物菌肥，其特征在于，所述微生物菌肥的活性成分为Pseudomonas canavaninivorans CGMCC No.30656。
8.根据权利要求6所述的生防菌剂或权利要求7所述的微生物菌肥，其特征在于，所述植物病害为蔷薇盘二孢引起的月季黑斑病、蔷薇单丝壳引起的月季白粉病。
9.Pseudomonas canavaninivorans LX5 CGMCC No.30656在产生蛋白酶、纤维素酶、嗜铁素、溶磷和/或固氮中的应用。
10.Pseudomonas canavaninivorans LX5 CGMCC No.30656在促进月季生长中的应用。
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