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CN118742201A - 通过操纵赤霉素代谢以增加可收获产量的用于矮小植物的方法和组合物 - Google Patents

通过操纵赤霉素代谢以增加可收获产量的用于矮小植物的方法和组合物 Download PDF

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CN118742201A
CN118742201A CN202380022057.9A CN202380022057A CN118742201A CN 118742201 A CN118742201 A CN 118742201A CN 202380022057 A CN202380022057 A CN 202380022057A CN 118742201 A CN118742201 A CN 118742201A
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oxidase
seq
corn
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T·帕西奥雷克
T·斯勒维斯基
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Original Assignee
Monsanto Technology LLC
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    • C12Y114/11015—Gibberellin 3-beta-dioxygenase (1.14.11.15)
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Abstract

本公开提供了用于改变玉米或其他谷类植物中的赤霉素(GA)含量的组合物和方法。还提供了用于通过遏制、诱变和/或编辑GA20或GA3氧化酶基因的特定亚型来改变与赤霉素生物合成相关的基因的表达的方法和组合物。还提供了具有降低GA氧化酶基因的表达或活性的遏制元件或突变的经修饰的植物细胞和植物，其包含降低的赤霉素水平和改善的特性，诸如降低的植株高度和增加的抗倒伏性，但没有异型。

Description

通过操纵赤霉素代谢以增加可收获产量的用于矮小植物的方 法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2022年2月22日提交的美国临时申请序列号63/312,703的优先权，其全部公开内容以引用方式并入。
序列表的并入
大小为332千字节(在MS-WINDOWS中测量)并且于2023年2月21日创建的名为“MONS550WO_ST26”的序列表文件与本申请一起提交并且全文以引用方式并入本文。
背景技术
领域
本公开涉及用于改善单子叶植物或谷类植物(包括玉米)的性状(诸如抗倒伏性和增加的产量)的组合物和方法。
相关领域
赤霉素(Gibberellin)(赤霉酸(gibberellic acid)或GA)是调节许多主要植物生长和发育过程的植物激素。在20世纪，半矮化小麦、水稻和高粱植物品种中GA水平的控制导致这些谷类作物产量的增加和倒伏的减少，这主要是造成绿色革命的原因。然而，在其他谷类作物诸如玉米中，还没有通过GA途径的操纵实现成功的产量增加。事实上，GA途径基因中的一些突变与玉米中与产量不相容的各种异型相关联，这使得研究人员不再通过操纵GA途径来寻找半矮化高产玉米品种。
本领域需要开发具有增加的产量和/或抗倒伏性的单子叶或谷类作物植物，诸如玉米。
附图说明
图1示出了与近交对照植物相比跨八个转化事件表达GA20氧化酶遏制构建体的玉米近交植物的降低的植株高度；
图2A示出了与杂种对照植物相比表达GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物的降低的平均植株高度；
图2B示出了具有降低的植株高度的表达GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物(右)旁边的野生型杂种对照植物(左)的图像；
图3A示出了与杂种对照植物相比表达GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物的增加的平均茎直径；
图3B示出了具有增加的茎直径的表达GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物的秆的横截面(右)旁边的野生型杂种对照植物的秆的横截面(左)的图像；
图4示出了与杂种对照植物相比表达GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物的增加的平均鲜穗重量；
图5示出了响应于在杂种对照植物中引起较大倒伏的风事件，与野生型杂种对照植物相比，两个田间试验中表达GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物的增加的平均鲜穗重量；
图6示出了与杂种对照植物相比表达GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物的增加的收获指数；
图7示出了与杂种对照植物相比表达GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物的平均谷粒产量估计值的增加；
图8示出了与杂种对照植物相比表达GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物的增加的平均多产性得分；
图9示出了在发育阶段V11至超过R1期间转基因玉米植物与对照之间植株高度随时间的变化；
图10示出了在转基因玉米植物与对照之间比较R5阶段叶组织中作为气孔导度的指示的稳定氧同位素比率(δ18O)和含水量的测量结果的图；
图11示出了在转基因与对照植物之间比较使用处于不同土壤深度的传感器在SAP和HD两种条件下测得的在发育阶段V10到超过R2期间的根下扎速度的图，这些传感器检测含水量的变化，从而指示根在该深度处的存在情况；
图12A示出了在温室中在正常和干旱条件下转基因玉米植物与对照之间在早晨和下午期间的气孔导度的差异；
图12B示出了在温室中在正常和干旱条件下转基因玉米植物与对照之间在早晨和下午期间的光合作用的差异；
图13A示出了转基因玉米植物相对于对照的整体茎组织、或分离的维管和非维管茎组织中的miRNA表达水平的差异；并且
图13B示出了转基因玉米植物相对于对照的整体茎组织、或分离的维管和非维管茎组织中的GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5mRNA转录物表达水平的差异。
具体实施方式
定义
为有助于理解本公开，如本文所用的若干术语和缩写在下文中定义如下：
术语“和/或”在用于两个或更多个条目的清单中时意指所列条目中的任一者可单独采用或与所列条目中的任何一者或多者组合采用。例如，表述“A和/或B”意指A和B中的一者或两者—即单独A，单独B，或A和B的组合。表述“A、B和/或C”意指单独A，单独B，单独C，A和B组合，A和C组合，B和C组合，或A、B和C组合。
如本文所用的术语“约”意图限定它修饰的数值，从而将此种值表示为在某一误差界限内的变量。当没有列举具体的误差界限时，例如平均值的标准偏差，术语“约”应被理解为意指涵盖所列举的值的范围以及考虑到有效数字通过上舍入或下舍入到该数字而包括的范围。
如本文所用的术语“谷类植物”是指在禾草(grasses)的禾本科(Poaceae)或早熟禾科(Gramineae)中且通常收获其种子的单子叶的(单子叶)作物植物，包括例如小麦、玉米、水稻、粟米、大麦、高粱、燕麦和黑麦。如通常所理解的，“玉米植物”或“玉蜀黍植物”是指物种玉蜀黍(Zea mays)的任何植物并且包括可与玉米育种的所有植物品种，包括野生玉蜀黍物种。
如本文关于两个或更多个核苷酸或蛋白质序列所用的术语“同一性百分比”或“相同百分比”通过以下方式计算：(i)在比较窗上比较两个最优对准的序列(核苷酸或蛋白质)，(ii)确定相同核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白质)存在于两个序列中所处的位置的数目以产生匹配位置的数目，(iii)用匹配位置的数目除以所述比较窗中位置的总数，接着(iv)用100％乘以这个商以产生同一性百分比。为了计算DNA和RNA序列之间的“同一性百分比”，RNA序列的尿嘧啶(U)被认为与DNA序列的胸腺嘧啶(T)相同。如果将比较窗口定义为两个或更多个序列之间的比对区域(即，不包括在所比较的序列之间不相同的在所比对的多核苷酸序列的5'和3'端的核苷酸或在所比对的蛋白质序列的N-末端和C-末端的氨基酸)，则“同一性百分比”也可称为“比对同一性百分比”。如果“同一性百分比”是在没有指定特定比较窗口的情况下相对于参考序列计算的，则通过将比对区域上匹配位置的数量除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当两个序列(查询和主题)被最佳比对时(在它们的比对中允许空位)，查询序列的“同一性百分比”等于两个序列之间的相同位置的数量除以查询序列在其长度(或比较窗口)上的位置的总数，然后乘以100％。
认识到不相同的蛋白质的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似大小和化学性质(例如，电荷、疏水性、极性等)的其他氨基酸残基取代，并且因此可能不改变分子的功能性质。当序列在保守取代上不同时，可向上调整序列相似性百分比以校正不相同取代的保守性。由于这种保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。因此，如本文所用的关于两个或更多个蛋白质序列的“相似性百分比”或“相似百分比”通过以下计算：(i)在比较窗口上比较两个最佳比对的蛋白质序列，(ii)确定在两个序列中出现相同或相似氨基酸残基的位置的数量以产生匹配位置的数量，(iii)将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数(或如果未指定比较窗口，则除以参考或查询蛋白质的总长度)，然后(iv)将该商乘以100％以产生相似性百分比。蛋白质的保守氨基酸取代是本领域已知的。
为了对序列进行最佳比对以计算它们的同一性或相似性百分比，各种成对或多重序列比对算法和程序是本领域已知的，诸如ClustalW、或Basic Local Alignment Search等，它们可用于比较两个或更多个核苷酸或蛋白质序列之间的序列同一性或相似性。尽管其他比对和比较方法是本领域已知的，但是两个序列之间的比对(包括上述同一性百分比范围)可通过ClustalW或算法来确定，参见例如Chenna R.等人,“Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs,”Nucleic Acids Research31:3497-3500(2003)；Thompson JD等人,“Clustal W:Improvingthe sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice,”NucleicAcids Research 22:4673-4680(1994)；以及Larkin MA等人,“Clustal W and Clustal Xversion 2.0,”Bioinformatics23:2947-48(2007)；以及Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman,D.J.(1990)"Basic local alignment search tool."J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，所述文献的全部内容和公开内容通过引用并入本文。
如本文关于两个核苷酸序列所用的术语“互补性百分比”或“百分比互补”类似于同一性百分比的概念，但指代当查询序列和目标序列线性排列并且最优碱基配对而无二级折叠结构诸如环、茎或发夹时，查询序列的与目标序列的核苷酸最优碱基配对或杂交的核苷酸的百分比。此种互补性百分比可在两个DNA链，两个RNA链，或DNA链与RNA链之间。“互补性百分比”通过以下方式计算：(i)在比较窗上以线性和充分伸展排列方式(即无折叠或二级结构)使两个核苷酸序列最优碱基配对或杂交，(ii)确定在所述比较窗上在两个序列之间碱基配对的位置的数目以产生互补位置的数目，(iii)用互补位置的数目除以所述比较窗中位置的总数，以及(iv)用100％乘以这个商以产生两个序列的互补性百分比。两个序列的最优碱基配对可基于核苷酸碱基通过氢键合达成的已知配对确定，诸如G-C、A-T和A-U。如果“互补性百分比”在未指定特定比较窗的情况下相对于参考序列计算，那么通过用在两个线性序列之间互补的位置的数目除以所述参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当两个序列(查询和主题)是最佳碱基配对的(允许错配或非碱基配对的核苷酸但没有折叠或二级结构)时，查询序列的“互补百分比”等于两个序列之间碱基配对位置的数目除以查询序列在其长度上的位置总数(或除以比较窗口上查询序列中的位置数目)，然后乘以100％。
术语“可操作地连接”是指启动子或其他调节元件与基因(或转基因)的相关可转录DNA序列或编码序列之间的功能性连接，使得启动子等至少在某些细胞、组织、发育阶段和/或状况中操作或起作用以启动、辅助、影响、引起和/或促进相关可转录DNA序列或编码序列的转录和表达。
术语“植物可表达启动子”是指能够启动、辅助、影响、引起和/或促进其相关的可转录DNA序列、编码序列或基因在植物细胞或组织中的转录和表达的启动子。
关于与相关多核苷酸序列(例如，可转录DNA序列或编码序列或基因)相关的启动子或其他调节序列的术语“异源”是在自然界中不可操作地连接到此类相关多核苷酸序列的启动子或调节序列，例如，启动子或调节序列相对于相关多核苷酸序列具有不同的起源，以及/或者启动子或调节序列在待用启动子或调节序列转化的植物物种中不是天然存在的。
关于多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白质、构建体、载体等的术语“重组体”是指人工制造的并且在自然界中通常不存在的和/或存在于自然界中通常不存在的环境中的多核苷酸或蛋白质分子或序列，包括包含在没有人为干预的情况下不会以相同方式一起天然存在的两个或更多个多核苷酸或蛋白质序列的组合的多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白质、构建体等，诸如包含至少两个可操作地连接但彼此异源的多核苷酸或蛋白质序列的多核苷酸分子、蛋白质、构建体等。例如，术语“重组体”可指同一分子(例如质粒、构建体、载体、染色体、蛋白质等)中的两种或更多种DNA或蛋白质序列的任何组合，其中此类组合是人造的并且在自然界中通常不存在。如在此定义中所使用的，短语“在自然界中通常不存在”意指在没有人类引入的情况下在自然界中不存在。重组多核苷酸或蛋白质分子、构建体等可包含这样的多核苷酸或蛋白质序列，其(i)与自然界中彼此邻近存在的其他多核苷酸或蛋白质序列分离，和/或(ii)与天然不彼此邻近的其他多核苷酸或蛋白质序列相邻(或邻接)。这种重组多核苷酸分子、蛋白质、构建体等还可以是指已经过基因工程改造和/或在细胞外构建的多核苷酸或蛋白质分子或序列。例如，重组DNA分子可包含任何工程改造或人造质粒、载体等，并且可包括线性或环状DNA分子。此类质粒、载体等可含有各种维持元件，包括原核复制起点和可选择标记，以及可能除了植物可选择标记基因等之外的一个或多个转基因或表达盒。
如本文所用，术语“分离的”是指至少部分地使分子与在其天然状态下通常与它相关的其他分子分离。在一个实施方案中，术语“分离的”是指DNA分子与在天然状态下通常侧接DNA分子的核酸分离。例如，如果编码天然存在于细菌中的蛋白质的DNA分子不在天然地发现编码所述蛋白质的DNA分子的细菌的DNA内，那么它将为分离的DNA分子。因此，与在自然界中不会与之缔合的一个或多个其他DNA分子例如作为重组DNA或植物转化技术的结果而融合或可操作地连接的DNA分子被认为是分离的。此类分子即使在与其他DNA分子一起整合至宿主细胞的染色体中或存在于核酸溶液中时也被认为是分离的。
如本文所用，“编码(encoding)区”或“编码(coding)区”是指编码功能单位或分子(例如，但不限于mRNA、蛋白质或非编码RNA序列或分子)的多核苷酸的一部分。
如本文所用，在植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组的上下文中的“经修饰的”是指相对于野生型或对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组，包含一种或多种GA氧化酶基因的表达水平和/或编码序列的工程改造改变的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组，诸如经由(A)包含编码靶向一个或多个GA3和/或GA20氧化酶基因进行遏制的非编码RNA的遏制构建体或可转录DNA序列的转基因事件，或(B)影响(例如降低或消除)一个或多个内源GA3和/或GA20氧化酶基因的表达水平或活性的基因组编辑事件或突变。实际上，术语“经修饰的”可进一步指具有影响一个或多个内源GA氧化酶基因(诸如一个或多个内源GA3和/或GA20氧化酶基因)表达的一个或多个突变的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组，该一个或多个突变通过化学诱变、转座子插入或切除、或任何其他已知的诱变技术引入，或通过基因组编辑(即，靶向基因组编辑技术)引入。因此，为了清楚起见，经修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组包括相对于野生型或对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组具有经修饰的一种或多种GA氧化酶基因的表达水平、表达模式和/或编码序列的经突变的、经编辑的和/或转基因的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组。经修饰的植物或种子可含有影响GA氧化酶基因(诸如GA3和/或GA20氧化酶基因)表达的各种分子改变，包括遗传和/或表观遗传修饰。可对经修饰的植物、植物部分、种子等进行诱变、基因组编辑或定点整合(例如但不限于，通过使用位点特异性核酸酶的方法)、遗传转化(例如，但不限于，通过土壤杆菌转化或微粒轰击的方法)或它们的组合。此类“经修饰的”植物、植物种子、植物部分和植物细胞包括这样的植物、植物种子、植物部分和植物细胞，它们是保持对一种或多种GA氧化酶基因的分子改变(例如，表达水平和/或活性的改变)的“经修饰的”植物、植物种子、植物部分和植物细胞的后代或衍生自它们。本文提供的经修饰的种子可产生本文提供的经修饰的植物。本文提供的经修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞或植物基因组可包含如本文提供的重组DNA构建体或载体或基因组编辑。“经修饰的植物产品”可以是由本文提供的经修饰的植物、植物部分、植物细胞或植物染色体或其任何部分或组分制成的任何产品。
如本文所用，术语“对照植物”(或类似地“对照”植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)是指用于与经修饰的植物(或经修饰的植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)进行比较并且除了影响一个或多个GA氧化酶基因的转基因和/或基因组编辑事件之外具有与经修饰的植物(或植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)相同或相似的遗传背景(例如，相同的亲本系、杂交系、近交系、测试种等)的植物(或植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)。例如，对照植物可以是与用于制备经修饰的植物的近交系相同的近交系，或者对照植物可以是与经修饰的植物相同的近交亲本系杂交的产物，除了在对照植物中不存在任何影响一个或多个GA氧化酶基因的转基因或基因组编辑事件。为了与经修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组进行比较，“野生型植物”(或类似的“野生型”植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)是指非转基因和非基因组编辑的对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组。如本文所用，“对照”植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组也可以是与经修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组具有相似(但不同或不相同)遗传背景的植物、植物种子、植物细胞和/或植物基因组，如果被认为足够相似以比较待分析的特征或性状的话。
如本文所用，“基因座”是多态性核酸、性状决定簇、基因或标记所在的染色体或基因组基因座或区域。“基因座”可由两个同源染色体共享以指代它们相应的基因座或区域。如本文所用，“等位基因”是指基因或特定基因座处的另选核酸序列(例如，与相同基因或基因座的其他等位基因不同的基因或基因座的核酸序列)。此类等位基因可被认为是(i)野生型，或(ii)如果相对于野生型等位基因在突变体等位基因的核酸序列中存在一个或多个突变或编辑，则是突变体。如本文所用，“突变基因”或“突变等位基因”是指相对于野生型基因或野生型等位基因在基因或等位基因的核酸序列中具有一个或多个突变或编辑的基因或等位基因，其中相对于野生型基因或野生型等位基因，突变基因或突变等位基因具有降低的和/或改变的表达和/或降低的和/或改变的活性。如本文所用，“野生型基因”或“野生型等位基因”是指这样的基因或等位基因，其具有在特定植物物种中最常见的序列或基因型，或相对于最常见的序列或基因型具有不显著影响基因或等位基因的表达和活性的天然变异、多态性或其他沉默突变的另一序列或基因型。实际上，“野生型”基因或等位基因不包含实质上影响基因或等位基因的正常功能、活性、表达或表型结果的变异、多态性或任何其他类型的突变。基因的突变等位基因可以是功能缺失等位基因和/或相对于野生型等位基因具有降低或消除的基因活性或表达水平。突变等位基因可以是相对于野生型等位基因具有降低的活性和/或表达的亚效等位基因。突变等位基因可以是相对于野生型等位基因没有活性和/或表达的无效等位基因。基因或基因座的突变等位基因可具有经由任何诱变和/或靶向基因组编辑技术引入该基因或基因座的一个或多个突变。对于二倍体生物体诸如玉米，第一等位基因可出现在一条染色体上，和第二等位基因可出现在第二条同源染色体上的相同基因座上。如果植物的一条染色体上的基因座处的一个等位基因是突变等位基因并且该植物的同源染色体上的另一个对应等位基因是野生型的，则该植物被描述为对于该突变等位基因是杂合的。然而，如果一个基因座处的两个等位基因都是突变等位基因，则该植物被描述为对于该突变等位基因是纯合的。对于基因座处的突变等位基因纯合的植物可包含相同的突变等位基因或不同的突变等位基因(如果是异等位基因或双等位基因)。
如本文所用，基因组编辑的“靶标位点”是指植物基因组内由位点特异性核酸酶结合和切割的多核苷酸序列的位置，所述结合和切割将双链断裂(或单链切口)引入至所述多核苷酸序列和/或它的互补性DNA链的核酸骨架中。靶标位点可包含至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少29个或至少30个连续核苷酸。RNA引导的核酸酶的“靶标位点”可包含双链核酸(DNA)分子或染色体的任一互补链的在所述靶标位点处的序列。位点特异性核酸酶可诸如经由非编码引导RNA(例如但不限于，CRISPR RNA(crRNA)或单引导RNA(sgRNA)，如下文进一步描述的)与靶标位点结合。本文提供的非编码引导RNA可与靶标位点互补(例如，与靶标位点处的双链核酸分子的任一条链或染色体互补)。应了解完全同一性或互补性可不为非编码引导RNA结合或杂交于靶标位点所需。例如，可容许靶标位点与非编码RNA之间有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、或至少8个错配(或更多个)。“靶标位点”还指植物基因组内由可不由非编码RNA分子引导的另一位点特异性核酸酶诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)结合和切割的多核苷酸序列的位置，所述结合和切割用以将双链断裂(或单链切口)引入至所述多核苷酸序列和/或它的互补性DNA链中。如本文所用，“靶标区域”或“靶向区域”是指由两个或更多个靶标位点侧接的多核苷酸序列或区域。在不加限制下，在一些实施方案中，靶标区域可经受突变、缺失、插入或倒位。如本文所用，当用于描述多核苷酸序列或分子的靶标区域时，“侧接”是指多核苷酸序列或分子的两个或更多个靶标位点围绕靶标区域，其中在靶标区域的每一侧有一个靶标位点。除了基因组编辑之外，术语“靶标位点”还可用于基因遏制的上下文中以指与由遏制构建体编码的非编码RNA分子(例如，miRNA、siRNA等)的至少一部分互补的mRNA分子的一部分(例如，“识别位点”)。
如本文所用，可以是重组DNA供体模板的“供体分子”、“供体模板”或“供体模板分子”(统称为“供体模板”)被定义为具有核酸模板或插入序列的核酸分子，这些核酸模板或插入序列用于通过修复植物细胞基因组中的切口或双链DNA断裂而定点、靶向插入或重组到植物细胞的基因组中。例如，“供体模板”可用于转基因或遏制构建体的定点整合，或作为将突变诸如插入、缺失等引入植物基因组内的靶标位点的模板。本文提供的靶向基因组编辑技术可包括使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种供体分子或模板。“供体模板”可为单链或双链DNA或RNA分子或质粒。供体模板的“插入序列”为设计用于靶向插入植物细胞基因组的序列，其可具有任何合适的长度。例如，供体模板的插入序列的长度可为2个与50,000个之间、2个与10,000个之间、2个与5000个之间、2个与1000个之间、2个与500个之间、2个与250个之间、2个与100个之间、2个与50个之间、2个与30个之间、15个与50个之间、15个与100个之间、15个与500个之间、15个与1000个之间、15个与5000个之间、18个与30个之间、18个与26个之间、20个与26个之间、20个与50个之间、20个与100个之间、20个与250个之间、20个与500个之间、20个与1000个之间、20个与5000个之间、20个与10,000个之间、50个与250个之间、50个与500个之间、50个与1000个之间、50个与5000个之间、50个与10,000个之间、100个与250个之间、100个与500个之间、100个与1000个之间、100个与5000个之间、100个与10,000个之间、250个与500个之间、250个与1000个之间、250个与5000个之间或个250与10,000个之间的核苷酸或碱基对。供体模板还可具有至少一个同源序列或同源臂，诸如两个同源臂，以经由同源重组指导突变或插入序列整合到植物基因组内的靶标位点中，其中所述同源序列或同源臂与植物基因组内靶标位点处或附近的序列同一或互补或具有一定的百分比同一性或百分比互补性。当供体模板包含同源臂和插入序列时，同源臂将侧接或围绕供体模板的插入序列。
供体模板的插入序列可包含一个或多个基因或序列，所述一个或多个基因或序列各自编码转录的非编码RNA或mRNA序列和/或翻译的蛋白序列。供体模板的转录序列或基因可编码蛋白质或非编码RNA分子。供体模板的插入序列可包含不包含功能基因或完整基因序列的多核苷酸序列(例如，供体模板可仅包含调节序列，诸如启动子序列，或仅包含基因或编码序列的一部分)，或可不包含任何可鉴别的基因表达元件或任何活性转录的基因序列。此外，供体模板可以是线性的或环状的，并且可以是单链的或双链的。供体模板可作为裸核酸(例如，经由粒子轰击)、作为与一种或多种递送剂(例如，脂质体、蛋白质、泊洛沙姆、用蛋白质包封的T-链等)的复合物递送至细胞，或包含在细菌或病毒递送媒介物(诸如例如，分别为根癌土壤杆菌或双生病毒)中。本文提供的供体模板的插入序列可包含可转录成RNA分子的可转录DNA序列，该RNA分子可以是非编码的并且可以或可以不可操作地连接到启动子和/或其他调节序列。
根据一些实施方案，供体模板可不包含插入序列，而是包含一个或多个同源序列，该一个或多个同源序列相对于植物基因组内靶标位点处的基因组序列，诸如在植物基因组内的GA3氧化酶或GA20氧化酶基因处或附近，包含一个或多个突变，诸如插入、缺失、取代等。另选地，供体模板可包含不包含编码或可转录DNA序列的插入序列，其中该插入序列用于将一个或多个突变引入植物基因组内的靶标位点，诸如植物基因组内的GA3氧化酶或GA20氧化酶基因处或附近。
本文提供的供体模板可包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个基因或可转录DNA序列。另选地，供体模板可不包含基因。非限制性地，供体模板的基因或可转录DNA序列可包括例如杀虫抗性基因、除草剂耐受性基因、氮利用效率基因、水利用效率基因、营养品质基因、DNA结合基因、可选择标记基因、RNAi或遏制构建体、位点特异性基因组修饰酶基因、CRISPR/Cas9系统的单引导RNA、基于双生病毒的表达盒、或植物病毒表达载体系统。根据其他实施方案，供体模板的插入序列可包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，该非编码RNA分子可靶向GA氧化酶基因诸如GA3氧化酶或GA20氧化酶基因进行遏制。供体模板可包含启动子，诸如组织特异性或组织偏好性启动子、组成型启动子或诱导型启动子。供体模板可包含前导序列、增强子、启动子、转录起始位点、5’-UTR、一个或多个外显子、一个或多个内含子、转录终止位点、区域或序列、3’-UTR和/或聚腺苷酸化信号。前导序列、增强子和/或启动子可与编码非编码RNA、引导RNA、mRNA和/或蛋白质的基因或可转录DNA序列可操作地连接。
如本文所用，“维管启动子”是指植物可表达启动子，其在植物的一个或多个维管组织中驱动、引起或启动可操作地连接到此类启动子的可转录DNA序列或转基因的表达，即使该启动子也在其他非维管植物细胞或组织中表达。此类维管组织可包括植物的韧皮部、维管薄壁组织和/或束鞘细胞或组织中的一种或多种。“维管启动子”与组成型启动子的区别在于其具有受调节且相对更有限的表达模式，包括植物的一个或多个维管组织。维管启动子包括维管特异性启动子和维管偏好性启动子。
如本文所用，“叶启动子”是指植物可表达启动子，其在植物的一个或多个叶组织中驱动、引起或启动可操作地连接到此类启动子的可转录DNA序列或转基因的表达，即使该启动子也在其他非叶植物细胞或组织中表达。叶启动子包括叶特异性启动子和叶偏好性启动子。“叶启动子”与维管启动子的区别在于，相对于其他植物组织，它更主要或专门在植物的叶组织中表达，而维管启动子在维管组织中表达，更一般地包括叶外的维管组织，诸如植物的茎或茎和叶的维管组织。
如本文所用，术语“纯合的”是指在二倍体基因组中的给定基因座处包含两个相同等位基因的基因型，或在二倍体基因组中的给定基因座处包含两个不相同突变等位基因的基因型。包含两个不相同的突变等位基因的后一种基因型也被称为异等位基因或交叉杂合的，或称为异等位基因组合。如本文所用，“杂合”描述在二倍体基因组中的给定基因座处包含突变等位基因和野生型等位基因的基因型。
描述
大多数产谷粒的禾草，诸如小麦、水稻和高粱，在穗的每个小花内产生雄性和雌性结构(即，它们具有单一的生殖结构)。然而，玉米或玉蜀黍在产谷粒禾草中的独特之处在于其形成单独的雄性花序(雄穗)和雌性花序(穗)。玉米通过在发育阶段前期内选择性地停止穗小花中的雄性器官(花药)和雄穗小花中的雌性器官(胚珠)的发育而产生完全性二形的生殖结构。精确调节的赤霉素合成和信号传导对于这种选择性停止发育过程的调节至关重要，其中雌性生殖穗对GA途径的破坏最敏感。实际上，“花药穗”表型是GA玉米突变体中最常见的生殖表型。
与玉米相反，引起小麦、水稻和高粱的“绿色革命”的赤霉素合成或信号传导途径的突变对它们的生殖结构几乎没有影响，因为这些作物物种在发育期间不经历携带圆锥花序的谷粒的选择性停止发育过程，并且因此对GA水平的破坏不敏感。在玉米中尚未使用相同的突变，因为除了在一些情况下的极端矮化之外，GA合成和信号传导途径的破坏已反复导致穗(“花药穗”)的明显畸变和雄性化以及雄穗的不育性(被破坏的花药和小孢子发育)。参见例如，Chen,Y.等人,“The Maize DWARF1 Encodes a Gibberellin 3-Oxidase and IsDual Localized to the Nucleus and Cytosol,”Plant Physiology 166:2028-2039(2014)。玉米中的这些GA突变表型(异型)导致籽粒产生的显著降低和产量的降低。此外，在穗内产生花药增加了真菌或昆虫感染的可能性，这降低了在那些突变穗上产生的谷粒的质量。用于开发半矮化玉米品系的向前育种尚未成功，并且GA突变体的生殖异型(以及极端矮化)一直难以克服。因此，在其他禾草中引起绿色革命的GA途径中的相同突变在玉米中尚未成功。
尽管通过GA途径的操纵在玉米中实现更高的谷粒产量存在这些先前的困难，但本发明人已经发现了以降低总体植株高度和茎节间长度并增加抗倒伏性，但不引起先前与玉米中GA途径的突变相关联的生殖异型的方式操纵玉米植物中的GA水平的方法。进一步的证据表明，这些矮小或半矮化玉米植物也可具有一个或多个附加的性状，包括增加的茎直径、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、增加的氮利用效率、增加的水利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和面积、增加的穗重量、增加的籽粒数量、增加的籽粒重量、增加的产量和/或增加的收获指数。
遏制和/或减少或降低GA20或GA3氧化酶基因的表达和/或活性可有效实现矮小的半矮化表型，其具有增加的抗倒伏性，但在穗中无生殖异型。在不受理论限制的情况下，进一步提出将GA20和/或GA3氧化酶基因的遏制限制于某些活性GA产生组织，诸如植物的维管和/或叶组织，可能足以产生具有增加的倒伏抗性但在生殖组织中没有显著异型的矮小植物。以组织特异性或组织偏好性方式表达GA20或GA3氧化酶遏制元件可能足以并有效地产生具有矮小表型的植物，同时避免了先前用玉米中的GA突变体观察到的生殖组织中的潜在异型(例如，通过避免或限制那些生殖组织中GA20氧化酶基因的遏制)。例如，GA20和/或GA3氧化酶基因可使用驱动植物维管组织中的表达的维管启动子(诸如水稻东格鲁(tungro)杆状病毒(RTBV)启动子)靶向以进行遏制。如以下实施例中所支持的，相对于非维管组织，RTBV启动子的表达模式富集于玉米植物的维管组织中，当与靶向GA20和GA3氧化酶基因的遏制元件可操作地连接时，其足以在玉米植物中产生半矮化表型。降低产生活性GA的玉米或谷类植物的组织中的活性GA水平可降低植株高度并增加抗倒伏性，并且如果不同时显著影响或降低生殖组织(诸如植物的发育中的雌性器官或穗)中的活性GA水平，则可在那些植物中避免异型。如果可在不显著影响生殖组织(例如，雌性或雄性生殖器官或花序)中的GA水平的情况下降低玉米或谷类植物的秆、茎或节间中的活性GA水平，则可产生具有降低的植株高度和增加的抗倒伏性的玉米或谷类植物，而在植物的生殖组织中没有异型。
因此，本文提供了重组DNA构建体和转基因植物，其包含与植物可表达启动子可操作地连接的GA20或GA3氧化酶遏制元件或序列，所述启动子可以是组织特异性或组织偏好性启动子。此类组织特异性或组织偏好性启动子可驱动其相关联的GA氧化酶遏制元件或序列在植物的一个或多个活性GA产生组织中的表达，以遏制或降低在那些组织中产生的活性GA的水平。此类组织特异性或组织偏好性启动子可在发育的一个或多个营养阶段期间驱动其相关联的GA氧化酶遏制构建体或转基因的表达。此类组织特异性或组织偏好性启动子也可在植物的发育中的雌性器官或穗的一个或多个细胞或组织中具有很少或没有表达，以避免在那些生殖组织中发生异型的可能性。根据一些实施方案，组织特异性或组织偏好性启动子是维管启动子，诸如RTBV启动子。RTBV启动子的序列在本文中提供为SEQ ID NO:65，并且RTBV启动子的截短形式在本文中进一步提供为SEQ ID NO:66。
对于给定的植物物种，区别于非活性GA，活性或生物活性的赤霉酸(即“活性赤霉素”或“活性GA”)是本领域已知的。例如，玉米和高等植物中的活性GA包括以下：GA1、GA3、GA4和GA7。因此，“活性GA产生组织”是产生一种或多种活性GA的植物组织。
除了用维管组织启动子遏制植物的活性GA产生组织中的GA20氧化酶基因之外，用各种组成型启动子遏制相同的GA20氧化酶基因也可在玉米中引起矮的半矮化株型表型，但在穗中没有任何可见的异型。鉴于GA途径中的突变先前已显示出引起生殖组织中的异型，令人惊讶的是，GA20氧化酶的组成型遏制不在穗中引起类似的生殖表型。因此，可使用组成型启动子进行一种或多种GA20氧化酶基因的遏制，以产生矮小的、抗倒伏的玉米或谷类植物，且在植物中没有任何显著或可观察到的生殖异型。当相同的GA20氧化酶遏制构建体在茎、叶或生殖组织中表达时，作出了其他令人惊讶的观察。如下文进一步描述的，在玉米植物的茎或穗组织中靶向遏制相同的GA20氧化酶基因不引起矮小的半矮化表型。此外，利用雌性生殖组织(穗)启动子使GA20氧化酶遏制构建体直接在玉米植物发育穗的生殖组织中定向表达不在穗中引起任何显著或可观察到的异型。然而，相同的GA20氧化酶遏制构建体在叶组织中的表达足以引起中度矮小表型，且在植物中没有显著或可观察到的生殖异型。
不受理论的限制，玉米和其他谷类植物中的矮小的半矮化表型可能是由靶向某些GA氧化酶基因的遏制构建体在植物的活性GA产生组织中的充足表达水平导致的。至少对于玉米中某些GA20氧化酶基因的靶向遏制，限制表达模式以避免生殖穗组织对于避免发育中的穗中的生殖异型可能不是必需的。然而，GA20或GA3氧化酶遏制构建体在低水平和/或在有限数量的植物组织中的表达可能不足以引起显著的矮小的半矮化表型。鉴于所观察到的具有靶向GA20氧化酶遏制的半矮化表型是缩短植物茎节间的结果，令人惊讶的是，至少一些茎组织中的GA20氧化酶基因的遏制不足以引起节间的缩短和植株高度的降低。不受理论的束缚，植物的产生活性GA的组织和/或细胞且不必须是茎或节间组织中某些GA氧化酶基因的遏制可足以产生半矮化植物，即使矮小性状是由茎节间的缩短造成的。鉴于GA可通过植物的维管迁移，操纵产生活性GA的植物组织中的GA氧化酶基因可导致矮小的半矮化植物，即使这可在很大程度上通过遏制在非茎组织(即，远离茎中的作用位点，其中节间伸长的减少导致半矮化表型)中产生的活性GA的水平来实现。实际上，发现遏制叶组织中的某些GA20氧化酶基因在玉米植物中引起中度半矮化表型。鉴于利用几种不同的“茎”启动子表达GA20氧化酶遏制构建体不在玉米中产生半矮化表型，值得注意的是，利用RTBV维管启动子表达相同的GA20氧化酶遏制构建体在持续产生半矮化表型方面是有效的，跨事件和种质具有高外显度。在使用其他维管启动子表达相同的GA20氧化酶遏制构建体的情况下也观察到这种半矮化表型。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的谷类或玉米植物，其具有至少一种有益的农艺学性状和至少一个基本上或完全不含异型的雌性生殖器官或穗。有益的农艺学性状可包括例如较矮的植株高度、一个或多个节间中较短的节间长度、较大(较粗)的茎或秆直径、增加的抗倒伏性、改善的耐旱性、增加的氮利用效率、增加的水利用效率、较深的根、较大的叶面积、较早的冠层郁闭、和/或增加的可收获产量。异型可包括雄性(雄穗或花药)不育、减少的籽粒或种子数量、和/或在植物的雌性器官或穗(例如，花药穗)中存在一个或多个雄性化的或雄性(或类雄性)生殖结构。本文提供了一种经修饰的谷类或玉米植物，其在植物的生殖组织中没有显著的异型。此类经修饰的谷类或玉米植物可具有相对于对照或野生型植物表现正常的雌性生殖器官或穗。实际上，提供了包括至少一个生殖器官或穗的经修饰的谷类或玉米植物，该生殖器官或穗不具有或不表现出、或基本上或完全不含异型，这些异型包括雄性不育、减少的籽粒或种子数量、和/或一个或多个雌性器官或穗中的雄性化结构。如本文所用，如果在生殖阶段后期基于雌性器官或穗的视觉检查在植物的雌性器官或穗中不存在或几乎不存在雄性生殖结构，则植物(诸如玉米)的雌性器官或穗“基本上不含”雄性生殖结构。如果在生殖阶段后期通过雌性器官或穗的视觉检查发现在植物(诸如玉米植物)的雌性器官或穗中不存在或未观察到或观察不到雄性生殖结构，则植物(诸如玉米)的雌性器官或穗“完全不含”成熟的雄性生殖结构。在穗中没有显著异型且基本上不含雄性生殖结构的植物(诸如玉米)的雌性器官或穗的每个植物雌性器官或穗的籽粒或种子数量可为每个野生型或对照植物雌性器官或穗的籽粒或种子数量的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％。同样，在穗中没有显著异型且基本上不含雄性生殖结构的植物(诸如玉米)的雌性器官或穗的每个植物雌性器官或穗的平均籽粒或种子重量可为每个野生型或对照植物雌性器官或穗的平均籽粒或种子重量的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％。完全不含成熟的雄性生殖结构的植物(诸如玉米)的雌性器官或穗可具有与野生型或对照大致相同的每个植物雌性器官或穗的籽粒或种子数量。换句话讲，植物的雌性器官或穗的生殖发育可以是正常或基本上正常的。然而，每个雌性器官或穗的种子或籽粒的数量可取决于影响植物的资源利用和发育的其他因素。实际上，每个植物雌性器官或穗的籽粒或种子数量、和/或每个植物雌性器官或穗的籽粒或种子重量可与野生型或对照植物大致相同或更大。
植物激素赤霉素在许多植物发育过程中起重要作用，包括萌发、细胞伸长、开花、胚胎发生和种子发育。GA途径中的某些生物合成酶(例如，GA20氧化酶和GA3氧化酶)和分解代谢酶(例如，GA2氧化酶)对于影响植物组织中的活性GA水平是关键的。因此，除了遏制某些GA20氧化酶基因之外，还提出以组成型或组织特异性或组织偏好性方式遏制GA3氧化酶基因也可产生具有矮小表型和增加的抗倒伏性的玉米植物，产量可能增加，但在穗中没有异型。因此，根据一些实施方案，提供了包含GA3氧化酶遏制元件或序列的构建体和转基因，该元件或序列可操作地连接到组成型或组织特异性或组织偏好性启动子，诸如维管或叶启动子。根据一些实施方案，组织特异性或组织偏好性启动子是维管启动子，诸如RTBV启动子。然而，其他类型的组织特异性或组织偏好性启动子可潜在地用于在玉米或谷类植物的活性GA产生组织中遏制GA3氧化酶，以产生半矮化表型而没有显著的异型。
根据本发明的实施方案，本领域已知的用于遏制靶基因的任何方法可用于遏制GA氧化酶基因，包括反义RNA、双链RNA(dsRNA)或反向重复RNA序列的表达，或经由通过表达小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)或微RNA(miRNA)实现的共遏制或RNA干扰(RNAi)。此外，可使用有义和/或反义RNA分子，其靶向GA氧化酶基因内或附近的编码和/或非编码基因组序列或区域，以引起基因的沉默。因此，这些方法中的任一种可用于以组织特异性或组织偏好性方式靶向遏制内源GA20氧化酶或GA3氧化酶基因。参见例如，美国专利申请公开号2009/0070898、2011/0296555和2011/0035839，其内容和公开内容以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“遏制”是指相较于在一个或多个植物发育阶段野生型或对照植物、细胞或组织中由靶基因编码的mRNA和/或蛋白质的表达水平，降低、减少或消除相同植物发育阶段的植物、植物细胞或植物组织中此类靶mRNA和/或蛋白质的表达水平。根据一些实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，其具有与对照植物相比在至少一种植物组织中降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％的GA20氧化酶基因表达水平。根据一些实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，其具有与对照植物相比在至少一种植物组织中降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％的GA3氧化酶基因表达水平。根据一些实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，其具有与对照植物相比在至少一种植物组织中降低5％-20％、5％-25％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、5％-60％、5％-70％、5％-75％、5％-80％、5％-90％、5％-100％、75％-100％、50％-100％、50％-90％、50％-75％、25％-75％、30％-80％、或10％-75％的GA20氧化酶基因表达水平。根据一些实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，其具有与对照植物相比在至少一种植物组织中降低5％-20％、5％-25％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、5％-60％、5％-70％、5％-75％、5％-80％、5％-90％、5％-100％、75％-100％、50％-100％、50％-90％、50％-75％、25％-75％、30％-80％、或10％-75％的GA3氧化酶基因表达水平。根据这些实施方案，具有降低的GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因表达水平的经修饰或转基因植物的至少一种组织包括在发育的一个或多个营养阶段期间植物的一个或多个活性GA产生组织，诸如植物的维管和/或叶组织。
在一些实施方案中，内源GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因的遏制是组织特异性的(例如，仅在叶和/或维管组织中)。GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因的遏制可以是组成型和/或维管或叶组织特异性的或偏好的。在其他实施方案中，GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因的遏制是组成型且非组织特异性的。根据一些实施方案，与对照植物的相同组织相比，内源GA20氧化酶基因和/或GA3氧化酶基因的表达在经修饰或转基因植物的一种或多种组织类型中(例如，在叶和/或维管组织中)诸如一种或多种活性GA产生组织中降低。
根据本公开的实施方案，提供了一种重组DNA分子、构建体或载体，其包含与植物可表达的组成型或组织特异性或组织偏好性启动子可操作地连接的靶向GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的遏制元件。遏制元件可包含长度为至少19个核苷酸的可转录DNA序列，诸如长度为约19个核苷酸至长度为约27个核苷酸，或长度为19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或27个核苷酸，其中该可转录DNA序列对应于待遏制的靶GA氧化酶基因的至少一部分、和/或与其互补的DNA序列。遏制元件的长度可以是19-30个、19-50个、19-100个、19-200个、19-300个、19-500个、19-1000个、19-1500个、19-2000个、19-3000个、19-4000个或19-5000个核苷酸。遏制元件的长度可以是至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个核苷酸或更多(例如，长度为至少25个、至少30个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少500个、至少1000个、至少1500个、至少2000个、至少3000个、至少4000个或至少5000个核苷酸)。根据遏制元件的长度和序列，如果由遏制元件编码的非编码RNA分子仍然能够与GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的靶mRNA分子充分杂交并结合，则可容许一个或多个序列错配或非互补碱基，诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个错配而不丧失遏制。实际上，长度在约19个核苷酸至约27个核苷酸范围内的甚至更短的RNAi遏制元件可具有一个或多个错配或非互补碱基，但仍有效遏制靶GA氧化酶基因。因此，有义或反义遏制元件序列可分别与靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分的对应序列或其互补序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一或互补。
用于GA氧化酶基因的靶向遏制的本公开的遏制元件或可转录DNA序列可包括以下各项中的一项或多项：(a)包括至少一个反义DNA序列的DNA序列，该至少一个反义DNA序列与靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分反义或互补；(b)包括至少一个反义DNA序列的多个拷贝的DNA序列，该至少一个反义DNA序列与靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分反义或互补；(c)包括至少一个有义DNA序列的DNA序列，该至少一个有义DNA序列包含靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分；(d)包括至少一个有义DNA序列的多个拷贝的DNA序列，该多个拷贝各自包含靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分；(e)包含靶向GA氧化酶基因的区段或部分的反向重复序列和/或转录成用于通过形成双链RNA来遏制靶向GA氧化酶基因的RNA的DNA序列，其中所转录的RNA包括与靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分反义或互补的至少一个反义DNA序列和包含靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分的至少一个有义DNA序列；(f)转录成用于通过形成单个双链RNA来遏制靶向GA氧化酶基因的RNA且包括多个连续的反义DNA序列和多个连续的有义DNA序列的DNA序列，该多个连续的反义DNA序列各自与靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分反义或互补，该多个连续的有义DNA序列各自包含靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分；(g)转录成用于通过形成RNA的多个双链来遏制靶向GA氧化酶基因的RNA且包括多个反义DNA序列和多个有义DNA序列的DNA序列，该多个反义DNA序列各自与靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分反义或互补，该多个有义DNA序列各自包含靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分，其中该多个反义DNA区段和该多个有义DNA区段被排列成一系列反向重复序列；(h)包括来源于miRNA、优选植物miRNA的核苷酸的DNA序列；(i)包括miRNA前体的DNA序列，该miRNA前体编码与靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分互补的人工miRNA；(j)包括siRNA的核苷酸的DNA序列；(k)转录成能够结合配体的RNA适体的DNA序列；以及(l)转录成能够结合配体的RNA适体的DNA序列和转录成能够调节靶向GA氧化酶基因的表达的调节RNA的DNA，其中靶向GA氧化酶基因的调节取决于调节RNA的构象，并且调节RNA的构象受到配体对RNA适体的结合状态的别构性影响。这些基因遏制元件中的任何一者，无论是转录成单链还是双链RNA，都可被设计来遏制多于一种GA氧化酶靶基因，这取决于遏制元件的数量和序列。
用于多于一种GA氧化酶靶标的多个有义和/或反义遏制元件可串联连续排列或排列成串联区段或重复序列，诸如串联反向重复序列，其也可被一个或多个间隔序列中断，并且每个遏制元件的序列可靶向一种或多种GA氧化酶基因。此外，遏制元件的有义或反义序列可与靶向GA氧化酶基因序列不完全匹配或互补，这取决于遏制元件的序列和长度。长度为约19个核苷酸至约27个核苷酸的甚至更短的RNAi遏制元件可具有一个或多个错配或非互补碱基，而仍有效遏制靶GA氧化酶基因。因此，有义或反义遏制元件序列可分别与靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分的对应序列或其互补序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。
对于反义遏制，可转录DNA序列或遏制元件包含与靶向GA氧化酶基因的至少一部分或区段反义或互补的序列。遏制元件可包含与靶向GA氧化酶基因的一个或多个部分或区段互补的多个反义序列，或与靶向GA氧化酶基因互补的反义序列的多个拷贝。反义遏制元件序列可与和靶向GA氧化酶基因的至少一个区段或部分互补的DNA序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。换句话讲，反义遏制元件序列可与靶向GA氧化酶基因或mRNA至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。
为了使用反向重复序列或转录的dsRNA遏制GA氧化酶基因，可转录DNA序列或遏制元件可包括包含靶向GA氧化酶基因的区段或部分的有义序列和与靶向GA氧化酶基因的区段或部分互补的反义序列，其中有义和反义DNA序列串联排列。如上所述，有义和/或反义序列每一者可分别与靶向GA氧化酶基因的区段或部分小于100％同一或互补。有义和反义序列可以被间隔序列分开，使得从遏制元件转录的RNA分子在有义序列与反义序列之间形成茎、环或茎环结构。遏制元件还可以包含串联排列的多个有义序列和反义序列，这些序列也可以被一个或多个间隔序列分开。包含多个有义和反义序列的这类遏制元件可以排列为一系列有义序列接着一系列反义序列，或者排列为一系列串联排列的有义和反义序列。另选地，一个或多个有义DNA序列可与一个或多个反义序列分开表达(即，一个或多个有义DNA序列可从第一可转录DNA序列表达，并且一个或多个反义DNA序列可从第二可转录DNA序列表达，其中第一可转录DNA序列和第二可转录DNA序列作为单独的转录物表达)。
对于使用微RNA(miRNA)遏制GA氧化酶基因，可转录DNA序列或遏制元件可包含源自病毒或真核生物(例如动物或植物)天然的miRNA序列或者从这种天然miRNA序列修饰或衍生的miRNA序列的DNA序列。这类天然或天然衍生的miRNA序列可形成折回结构并用作前体miRNA(pre-miRNA)的支架，并且可对应于天然miRNA前体序列的茎区，例如来自天然(或天然衍生的)初级-miRNA(pri-miRNA)或pre-miRNA序列。然而，除了这些天然或天然衍生的miRNA支架或预加工序列之外，本实施方案的经工程改造或合成miRNA还包含对应于靶向GA氧化酶基因的区段或部分的序列。因此，除了预加工或支架miRNA序列之外，遏制元件还可以包含与靶向GA氧化酶基因的区段或部分相对应的有义和/或反义序列，和/或与其互补的序列，不过可以容忍一个或多个序列错配。
经工程改造miRNA可用于以提高的特异性靶向遏制基因。参见例如Parizotto等人,Genes Dev.18:2237-2242(2004)，以及美国专利申请公布No.2004/0053411、2004/0268441、2005/0144669和2005/0037988，它们的内容和公开内容以引用的方式并入本文中。miRNA是非蛋白质编码RNA。当miRNA前体分子切割时，会形成成熟的miRNA，其长度通常为约19个至约25个核苷酸(在植物中通常长度为约20个至约24个核苷酸)，例如长度为19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸，并且具有与旨在遏制的基因和/或其补体相对应的序列。成熟的miRNA与靶mRNA转录物杂交，并引导蛋白质复合物与靶转录物结合，这可能起到抑制翻译和/或导致转录物降解的作用，从而负面调节或遏制靶基因的表达。miRNA前体在植物中也可用于指导siRNA、反式作用siRNA(ta-siRNA)的同相产生，这一过程需要RNA依赖性RNA聚合酶来引起靶基因的遏制。参见例如，Allen Cell 121:207-221(2005),Vaucheret Science STKE,2005:pe43(2005)，以及Yoshikawa等人Genes Dev.,19:2164-2175(2005)，其内容和公开内容以引用方式并入本文。
植物miRNA通过识别并结合靶mRNA转录物中的互补或接近完全互补的序列(miRNA识别位点)，随后通过RNase III酶(诸如ARGONAUTE1)切割转录物来调节其靶基因。在植物中，给定miRNA识别位点与对应的成熟miRNA之间的某些错配通常是不被容许的，特别是在成熟miRNA的位置10和11处的错配核苷酸。成熟miRNA内的位置以5'至3'方向给出。在成熟miRNA的位置10和11处通常需要给定miRNA识别位点与对应的成熟miRNA之间的完全互补性。参见例如，Franco-Zorrilla等人(2007)Nature Genetics,39:1033-1037；以及Axtell等人(2006)Cell,127:565-577。
许多微RNA基因(MIR基因)已被鉴定并可在数据库(“miRBase”，可在microrna.sanger.ac.uk/sequences上在线获得；还参见Griffiths-Jones等人(2003)Nucleic Acids Res.,31:439-441)中公开获得。MIR基因已被报道存在于基因间区域中，在基因组中为分离的和成簇的，但也可以完全或部分位于其他基因(蛋白质编码和非蛋白质编码两者)的内含子内。关于miRNA生物发生的综述，参见Kim(2005)NatureRev.Mol.Cell.Biol.,6:376-385。MIR基因的转录至少在一些情况下可受MIR基因自身启动子的促进控制。被称为“pri-miRNA”的初级转录物可以是相当大的(若干千碱基)并且可以是多顺反子的，含有一个或多个pre-miRNA(含有被加工为成熟miRNA的茎-环排列的折回结构)以及mRNA常见的5’“帽”和聚腺苷酸化尾巴。参见例如，Kim(2005)NatureRev.Mol.Cell.Biol.,6:376-385中的图1。
miRNA(无论是天然存在序列还是人工序列)的转基因表达可用于调节miRNA的一种或多种靶基因的表达。miRNA的识别位点已在mRNA的所有区域中得到验证，包括5'非翻译区、编码区、内含子区域和3'非翻译区，这表明miRNA靶标或识别位点相对于编码序列的位置不一定会影响遏制(参见例如Jones-Rhoades和Bartel(2004).Mol.Cell,14:787-799；Rhoades等人(2002)Cell,110:513-520；Allen等人(2004)Nat.Genet.,36:1282-1290；Sunkar和Zhu(2004)Plant Cell,16:2001-2019)。miRNA是真核生物中重要的调节元件，利用miRNA进行转基因遏制是操纵生物途径和反应的有效工具。美国专利申请公布No.2006/0200878中提供了对天然miRNA、其前体、识别位点和启动子的描述，它们的内容和公开内容以引用的方式并入本文中。
可以通过用与预期靶标互补的序列取代miRNA前体茎区中的核苷酸来设计人工miRNA序列，例如正如Zeng等人(2002)Mol.Cell,9:1327-1333所证明的那样。根据许多实施方案，靶标可以是GA20氧化酶基因或GA3氧化酶基因的序列。用于确定天然miRNA序列中的核苷酸变化以产生用于感兴趣的靶标的经工程改造的miRNA前体的一般方法的一个非限制性实例包括以下步骤：(a)选择对于靶基因具有特异性的至少18个核苷酸的独特靶序列，例如，通过使用序列比对工具诸如BLAST(参见例如，Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.,215:403-410；Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)；cDNA和/或基因组DNA序列可用于鉴定靶转录物直向同源物和与不相关基因的任何潜在匹配，从而避免非靶序列的无意沉默或遏制；(b)针对不需要序列分析靶基因(例如，与来自非靶物种的序列的匹配)，并针对GC含量、雷诺得分(参见Reynolds等人(2004)Nature Biotechnol.,22:326-330)以及通过自由能的负差(“ΔΔG”)表征的功能性不对称(参见Khvorova等人(2003)Cell,115:209-216)对每个潜在靶序列进行评分。优选地，可选择具有全部或大部分以下特性的靶序列(例如，19聚体)：(1)雷诺得分>4，(2)GC含量在约40％至约60％之间，(3)负ΔΔG，(4)末端腺苷，(5)缺乏4个或更多个相同核苷酸的连续延伸；(6)位置接近靶基因的3’末端；(7)与miRNA前体转录物的差异最小。在一个方面，本文中用于遏制靶基因(例如，GA20或GA3氧化酶基因)的非编码RNA分子被设计为具有表现出一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或五个或更多个前述特性的靶序列。遏制元件的每第三个核苷酸的位置对于影响RNAi功效可能是重要的；例如，算法“siExplorer”在rna.chem.t.u-tokyo.ac.jp/siexplorer.htm处可公开获得(参见Katoh和Suzuki(2007)Nucleic AcidsRes.,10.1093/nar/gkl1120)；(c)确定所选靶序列(例如，19聚体)的反向互补序列以用于制备经修饰的成熟miRNA。相对于19聚体序列，可将位置20处的附加核苷酸与所选的靶标或识别序列匹配，并且可将位置21处的核苷酸选择为不配对以防止靶转录物上沉默的扩散或选择为与靶序列配对以促进靶转录物上沉默的扩散；以及(d)将人工miRNA转化到植物中。
根据本公开的实施方案，提供了一种重组DNA分子、构建体或载体，其包含编码用于GA氧化酶基因的靶向遏制的miRNA或前体miRNA分子的可转录DNA序列或遏制元件。此类可转录DNA序列和遏制元件可包含长度为至少19个核苷酸的序列，其对应于一种或多种GA氧化酶基因和/或与一种或多种GA氧化酶基因互补的序列，但可容许一个或多个序列错配或非碱基配对的核苷酸。
还可使用一种或多种小干扰RNA(siRNA)来遏制GA氧化酶基因。siRNA途径涉及将较长的双链RNA中间体(“RNA双链体”)非定相切割成小干扰RNA(siRNA)。siRNA的大小或长度在约19个至约25个核苷酸或碱基对的范围内，但常见类别的siRNA包括含有21个或24个碱基对的那些。因此，可转录DNA序列或遏制元件可编码长度为至少约19个至约25个核苷酸(或更多)的RNA分子，诸如长度为至少19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。对于siRNA遏制，因此提供了一种重组DNA分子、构建体或载体，其包含编码用于GA氧化酶基因的靶向遏制的siRNA分子的可转录DNA序列和遏制元件。此类可转录DNA序列和遏制元件的长度可为至少19个核苷酸并且具有与一种或多种GA氧化酶基因相对应的序列和/或与一种或多种GA氧化酶基因互补的序列。
GA氧化酶基因还可以使用一个或多个反式作用小干扰RNA(ta-siRNA)来遏制。在ta-siRNA途径中，miRNA用于在需要RNA依赖性RNA聚合酶来产生双链RNA前体的过程中引导siRNA初级转录物的同相加工。ta-siRNA的定义是缺乏二级结构，缺乏引发双链RNA产生的miRNA靶标位点，需要DCL4和RNA依赖性RNA聚合酶(RDR6)并产生具有含2-核苷酸3’悬端的精确匹配双链体的多个精确定相的～21-nt小RNA(参见Allen等人(2005)Cell,121:207-221)。ta-siRNA的大小或长度在约20个至约22个核苷酸或碱基对的范围内，但最通常为21个碱基对。因此，本发明的可转录DNA序列或遏制元件可编码长度为至少约20个至约22个核苷酸(诸如长度为20个、21个、或22个核苷酸)的RNA分子。对于ta-siRNA遏制，因此提供了一种重组DNA分子、构建体或载体，其包含编码用于GA氧化酶基因的靶向遏制的ta-siRNA分子的可转录DNA序列或遏制元件。此类可转录DNA序列和遏制元件的长度可为至少20个核苷酸并且具有与一种或多种GA氧化酶基因相对应的序列和/或与一种或多种GA氧化酶基因互补的序列。对于构建合适的ta-siRNA支架的方法，参见例如美国专利号9,309,512，其全文以引用方式并入本文。
根据本发明的实施方案，提供了一种重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码与植物细胞中的靶mRNA结合或杂交的非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中该靶mRNA分子编码GA20或GA3氧化酶基因，并且其中该可转录DNA序列可操作地连接到组成型或组织特异性或组织偏好性启动子。除了靶向成熟mRNA序列之外，非编码RNA分子可替代地靶向GA氧化酶基因或mRNA转录物的内含子序列、或与编码和非编码序列重叠的GA氧化酶mRNA序列。根据其他实施方案，提供了一种重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA(前体)分子的可转录DNA序列，该非编码RNA(前体)分子被切割或加工成与植物细胞中的靶mRNA结合或杂交的成熟的非编码RNA分子，其中该靶mRNA分子编码GA20或GA3氧化酶蛋白，并且其中该可转录DNA序列可操作地连接到组成型或组织特异性或组织偏好性启动子。出于本公开的目的，“非编码RNA分子”是不编码蛋白质的RNA分子。非编码RNA分子的非限制性实例包括微RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、siRNA前体、小RNA(长度为18-26个nt)和编码它的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、示踪RNA(tracrRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)。
根据本公开的实施方案，用于表达GA20氧化酶或GA3氧化酶遏制元件的合适的组织特异性或组织偏好性启动子可包括驱动或引起其相关联的遏制元件或序列至少在玉米或谷类植物的维管和/或叶组织中、或在GA3氧化酶的情况下可能在其他组织中表达的那些启动子。利用组织特异性或组织偏好性启动子表达GA氧化酶遏制元件或构建体也可发生在谷类或玉米植物的维管和叶组织之外的其他组织中，但植物的发育中的生殖组织中(特别是雌性生殖器官或穗中)的活性GA水平优选地不显著降低或受影响(相对于野生型或对照植物)，使得雌性器官或穗的发育可在转基因植物中正常进行，而在穗中没有异型且产量潜力没有损失。
本领域已知的任何维管启动子可潜在地用作组织特异性或组织偏好性启动子。维管启动子的实例包括RTBV启动子(参见例如，SEQ ID NO:65)、已知的蔗糖合酶基因启动子(诸如玉米蔗糖合酶-1(Sus1或Sh1)启动子(参见例如，SEQ ID NO:67))、玉米Sh1基因旁系同源物启动子、大麦蔗糖合酶启动子(Ss1)启动子、水稻蔗糖合酶-1(RSs1)启动子(参见例如，SEQ ID NO:68)、或水稻蔗糖合酶-2(RSs2)启动子(参见例如，SEQ ID NO:69)、已知的蔗糖转运蛋白基因启动子(诸如水稻蔗糖转运蛋白启动子(SUT1)(参见例如，SEQ ID NO:70))，或各种已知的病毒启动子，诸如鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)启动子、小麦矮小双生病毒(WDV)大基因间区域(LIR)启动子、玉蜀黍条斑双生病毒(MSV)外壳蛋白(CP)启动子、或水稻类黄色条纹1(YS1)或OsYSL2启动子(SEQ ID NO:71)，以及具有类似表达模式的任何前述启动子的任何功能序列部分或截短，诸如截短的RTBV启动子(参见例如，SEQ ID NO:66)。
本领域已知的任何叶启动子可潜在地用作组织特异性或组织偏好性启动子。叶启动子的实例包括玉米丙酮酸磷酸二激酶或PPDK启动子(参见例如，SEQ ID NO:72)、玉米果糖1,6二磷酸醛缩酶或FDA启动子(参见例如，SEQ ID NO:73)和水稻Nadh-Gogat启动子(参见例如，SEQ ID NO:74)、以及具有类似表达模式的任何前述启动子的任何功能序列部分或截短。来自单子叶植物基因的叶启动子的其他实例包括核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCO)或RuBisCO小亚基(RBCS)启动子、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子和Myb基因启动子，以及具有类似表达模式的任何这些启动子的任何功能序列部分或截短。
也可使用本领域已知的任何其他维管和/或叶启动子，包括来自相同或不同植物物种或病毒的具有类似表达模式的相关基因的启动子序列(例如，蔗糖合酶、蔗糖转运蛋白和病毒基因启动子序列)。还提供了与前述中的任一种具有高度同源性的启动子序列。例如，维管启动子可包含与SEQ ID NO:65、66、67、68、69、70和71中的一者或多者、其任何功能序列部分或截短、和/或与前述序列中的任一种互补的任何序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的DNA序列；叶启动子可包含例如与SEQ ID NO:72、73和74中的一者或多者、其任何功能序列部分或截短、和/或与前述序列中的任一种互补的任何序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的DNA序列；并且组成型启动子可包含与SEQ ID NO:75、76、77、78、79、80、81、82和83中的一者或多者、其任何功能序列部分或截短、和/或与前述序列中的任一种互补的任何序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的DNA序列。维管和/或叶启动子的实例还可包括显示出在谷类或玉米植物的维管和/或叶组织中具有表达模式的其他已知的经工程改造的和/或后来鉴定的启动子序列。此外，任何已知的或后来鉴定的组成型启动子也可用于表达GA20氧化酶或GA3氧化酶遏制元件。下面提供了组成型启动子的常见实例。
如本领域通常理解的，术语“启动子”通常可指含有RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和/或TATA盒并协助或促进相关可转录多核苷酸序列和/或基因(或转基因)的转录和表达的DNA序列。启动子可为合成或人工的，和/或由已知或天然存在的启动子序列工程改造、变化或衍生。启动子可以是包含两个或更多个异源序列的组合的嵌合启动子。因此，本发明的启动子可包括组成上与本文已知或提供的其他启动子序列类似但不相同的启动子序列的变体。可根据与可操作地连接到启动子的相关编码或可转录序列或基因(包括转基因)的表达模式相关联的多种标准对启动子进行分类，诸如组成型、发育型、组织特异性、诱导型等。在植物的所有或几乎所有组织中驱动表达的启动子被称为“组成型”启动子。然而，利用“组成型启动子”实现的表达水平在不同组织类型和细胞之间不一定是一致的。在发育的某些时期或阶段驱动表达的启动子被称为“发育型”启动子。相对于其他植物组织在植物的某些组织中驱动增强表达的启动子被称为“组织增强型”或“组织偏好性”启动子。因此，“组织偏好性”启动子在植物的特定组织中引起相对较高或优先或主要的表达，但在植物的其他组织中具有较低水平的表达。在植物的特定组织内表达且在其他植物组织中很少或没有表达的启动子被称为“组织特异性”启动子。组织特异性或组织偏好性启动子也可根据其驱动其相关联的可转录DNA序列或遏制元件的表达所处的特定或优选组织来定义。例如，在维管组织中引起特异性表达的启动子可称为“维管特异性启动子”，而在维管组织中引起优先或主要表达的启动子可称为“维管偏好性启动子”。同样，在叶组织中引起特异性表达的启动子可称为“叶特异性启动子”，而在叶组织中引起优先或主要表达的启动子可称为“叶偏好性启动子”。“诱导型”启动子是响应于环境刺激诸如冷、干旱或光、或其他刺激(诸如创伤或化学品施加)而引发转录的启动子。启动子也可根据其来源进行分类，诸如异源、同源、嵌合、合成等。“异源”启动子是相对于其相关联的可转录序列、编码序列、或基因(或转基因)具有不同来源、和/或不是如上文所定义的天然存在于待转化的植物物种中的启动子序列。
谷类植物中的几种GA氧化酶由相关GA氧化酶基因的家族组成。例如，玉米具有至少九个GA20氧化酶基因的家族，包括GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8和GA20氧化酶_9。然而，在玉米中存在三种已知的或潜在的GA3氧化酶，即GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和GA3氧化酶_3。表1中以SEQ ID NO提供了这些GA20氧化酶基因中每一者的DNA和蛋白质序列，并且表2中以SEQ ID NO提供了这些GA3氧化酶基因中每一者的DNA和蛋白质序列。
表1.玉米中GA20氧化酶基因的由序列标识符表示的DNA和蛋白质序列。
表2.玉米中GA3氧化酶基因的由序列标识符表示的DNA和蛋白质序列。
GA20氧化酶_3的基因组DNA序列在SEQ ID NO:34中提供，并且GA20氧化酶_5的基因组DNA序列在SEQ ID NO:35中提供。对于GA20氧化酶_3基因，SEQ ID NO:34提供了在GA20氧化酶_3 5’-UTR上游的3000个核苷酸(核苷酸1-3000)；核苷酸3001-3096对应于5’-UTR；核苷酸3097-3665对应于第一外显子；核苷酸3666-3775对应于第一内含子；核苷酸3776-4097对应于第二外显子；核苷酸4098-5314对应于第二内含子；核苷酸5315-5584对应于第三外显子；并且核苷酸5585-5800对应于3’-UTR。SEQ ID NO:34还提供了在3’-UTR的末端下游的3000个核苷酸(核苷酸5801-8800)。对于GA20氧化酶_5基因，SEQ ID NO:35提供了在GA20氧化酶_5起始密码子上游的3000个核苷酸(核苷酸1-3000)；核苷酸3001-3791对应于第一外显子；核苷酸3792-3906对应于第一内含子；核苷酸3907-4475对应于第二外显子；核苷酸4476-5197对应于第二内含子；核苷酸5198-5473对应于第三外显子；并且核苷酸5474-5859对应于3'-UTR。SEQ ID NO:35还提供了在3’-UTR的末端下游的3000个核苷酸(核苷酸5860-8859)。
GA3氧化酶_1的基因组DNA序列在SEQ ID NO:36和168中提供，GA3氧化酶_2的基因组DNA序列在SEQ ID NO:37和169中提供，并且GA3氧化酶_3的基因组DNA序列在SEQ ID NO:170中提供。虽然SEQ ID NO:36和37分别提供了GA3氧化酶_1和GA3氧化酶_2基因的5'-UTR、外显子、内含子和3'-UTR序列，但SEQ ID NO:168和169还分别提供了GA3氧化酶_1和GA3氧化酶_2基因的上游和下游基因组序列以及附加的5'和3'UTR序列。对于GA3氧化酶_1基因，SEQ ID NO:36的核苷酸1-29对应于5’-UTR；SEQ ID NO:36的核苷酸30-514对应于第一外显子；SEQ ID NO:36的核苷酸515-879对应于第一内含子；SEQ ID NO:36的核苷酸880-1038对应于第二外显子；SEQ ID NO:36的核苷酸1039-1158对应于第二内含子；SEQ ID NO:36的核苷酸1159-1663对应于第三外显子；并且SEQ ID NO:36的核苷酸1664-1788对应于3’-UTR。另选地，对于GA3氧化酶_1基因，SEQ ID NO:168提供了在GA3氧化酶_1 5’-UTR上游的3000个核苷酸(核苷酸1-3000)；SEQ ID NO:168的核苷酸3001-3161对应于5’-UTR；SEQ ID NO:168的核苷酸3162-3646对应于第一外显子；SEQ ID NO:168的核苷酸3647-4011对应于第一内含子；SEQ ID NO:168的核苷酸4012-4170对应于第二外显子；SEQ ID NO:168的核苷酸4171-4290对应于第二内含子；SEQ ID NO:168的核苷酸4291-4795对应于第三外显子；并且SEQ ID NO:168的核苷酸4796-5406对应于3’-UTR。SEQ ID NO:168还提供了3’-UTR末端下游的3000个核苷酸(核苷酸5407-8406)。对于GA3氧化酶_2基因，SEQ ID NO:37的核苷酸1-38对应于5-UTR；SEQ ID NO:37的核苷酸39-532对应于第一外显子；SEQ ID NO:37的核苷酸533-692对应于第一内含子；SEQ ID NO:37的核苷酸693-851对应于第二外显子；SEQ IDNO:37的核苷酸852-982对应于第二内含子；SEQ ID NO:37的核苷酸983-1445对应于第三外显子；并且SEQ ID NO:37的核苷酸1446-1698对应于3’-UTR。另选地，对于GA3氧化酶_2基因，SEQ ID NO:169提供了在GA3氧化酶_2 5’-UTR上游的3000个核苷酸(核苷酸1-3000)；SEQ ID NO:169的核苷酸3001-3056对应于5’-UTR；SEQ ID NO:169的核苷酸3057-3550对应于第一外显子；SEQ ID NO:169的核苷酸3551-3710对应于第一内含子；SEQ ID NO:169的核苷酸3711-3869对应于第二外显子；SEQ ID NO:169的核苷酸3870-3991对应于第二内含子；SEQ ID NO:169的核苷酸3992-4463对应于第三外显子；并且SEQ ID NO:169的核苷酸4464-4581对应于3’-UTR。SEQ ID NO:169还提供了3’-UTR末端下游的3000个核苷酸(核苷酸4582-7581)。对于GA3氧化酶_3基因，SEQ ID NO:170提供了在GA3氧化酶_3 5'-UTR上游的3000个核苷酸(核苷酸1-3000)；SEQ ID NO:170的核苷酸3001-3130对应于5'-UTR；SEQ IDNO:170的核苷酸3131-3483对应于第一外显子；SEQ ID NO:170的核苷酸3484-3582对应于第一内含子；SEQ ID NO:170的核苷酸3583-3907对应于第二外显子；SEQ ID NO:170的核苷酸3908-3998对应于第二内含子；SEQ ID NO:170的核苷酸3999-4274对应于第三外显子；并且SEQ ID NO:170的核苷酸4275-4332对应于3'-UTR。SEQ ID NO:170还提供了3’-UTR末端下游的3000个核苷酸(核苷酸4333-7332)。
除了在靶向GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因、或GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因进行遏制的情况下的表型观察之外，还在GA20氧化酶_4基因的遏制的情况下观察到半矮化表型。GA20氧化酶_4的基因组DNA序列在SEQ ID NO:38中提供。对于GA氧化酶_4基因，SEQ ID NO:38提供了在5'-UTR上游的核苷酸1-1416；SEQ ID NO:38的核苷酸1417-1543对应于5'-UTR；SEQ ID NO:38的核苷酸1544-1995对应于第一外显子；SEQ ID NO:38的核苷酸1996-2083对应于第一内含子；SEQ ID NO:38的核苷酸2084-2411对应于第二外显子；SEQID NO:38的核苷酸2412-2516对应于第二内含子；SEQ ID NO:38的核苷酸2517-2852对应于第三外显子；SEQ ID NO:38的核苷酸2853-3066对应于3'-UTR；和SEQ ID NO:38的核苷酸3067-4465对应于3'-UTR下游的基因组序列。
根据本公开的实施方案，提供了一种重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中该非编码RNA分子包含与植物中(i)由内源GA氧化酶基因表达和/或(ii)编码内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少一个区段或部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，其中该可转录DNA序列可操作地连接到植物可表达启动子，并且其中该植物是谷类或玉米植物。
根据一些实施方案，非编码RNA分子靶向GA20氧化酶基因，例如GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因进行遏制并且包含与SEQ ID NO:7、8、13和14中的一者或多者的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，非编码RNA分子与编码植物中的与SEQ ID NO:9和15中的一者或两者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。根据其他实施方案，非编码RNA分子可包含与编码植物中的与SEQ ID NO:9和15中的一者或两者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。除了靶向成熟mRNA序列(包括非翻译或外显子序列中的一者或两者)之外，非编码RNA分子还可靶向GA20氧化酶基因或转录物的内含子序列。
根据一些实施方案，非编码RNA分子靶向GA3氧化酶基因进行遏制并且包含与SEQID NO:28、29、31、32、171和172中的一者或多者的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据其他实施方案，非编码RNA分子与编码植物中的与SEQ ID NO:30、33和173中的一者或两者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。根据其他实施方案，非编码RNA分子可包含与编码植物中的与SEQ ID NO:30、33和173中的一者或两者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。除了靶向成熟mRNA序列(包括非翻译或外显子序列中的一者或两者)之外，非编码RNA分子还可靶向GA3氧化酶基因或转录物的内含子序列。
根据一些实施方案，非编码RNA分子靶向GA20氧化酶_4基因进行遏制并且包含与SEQ ID NO:10和11中的一者或两者的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据其他实施方案，非编码RNA分子与编码植物中的与SEQ ID NO:12中的一者或两者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。根据其他实施方案，非编码RNA分子可包含与编码植物中的与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。除了靶向成熟mRNA序列(包括非翻译或外显子序列中的一者或两者)之外，非编码RNA分子还可靶向GA20氧化酶基因或转录物的内含子序列。
根据许多实施方案，由重组DNA分子、载体或构建体的可转录DNA序列编码的非编码RNA分子可为在植物细胞中加工或切割以形成靶向GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的成熟miRNA或siRNA的前体miRNA或siRNA。
根据本发明的实施方案，通过仅靶向GA氧化酶家族内的有限基因亚组进行遏制，可降低谷类或玉米植物的秆或茎中的GA水平。不受理论的束缚，提出靶向GA氧化酶家族内有限数量的基因进行遏制可在转基因植物中产生矮小表型和抗倒伏性，但在植物的生殖或穗组织中没有异型，这是由于GA氧化酶基因之间的差异表达、那些生殖组织中的其他GA氧化酶基因对被遏制的GA氧化酶基因的充分补偿、和/或靶向GA氧化酶基因的不完全遏制。因此，通过利用组织特异性或组织偏好性启动子限制GA氧化酶基因的表达或对其进行遏制不仅可避免异型，还提出可靶向GA氧化酶基因的有限亚组(例如，有限数量的GA20氧化酶基因)进行遏制，使得相同基因家族内的其他GA氧化酶基因(例如，其他GA20氧化酶基因)可补偿那些组织中被遏制的GA氧化酶基因的表达损失。靶向GA氧化酶基因的不完全遏制还可允许靶向GA氧化酶基因在一种或多种组织中的足够水平的表达，以避免在植物中将对作物产量造成负面影响的异型或不期望的性状，诸如生殖异型或植株高度过度缩短。与基因中完全丧失功能的突变不同，遏制可允许靶向基因的部分活性持续存在。由于不同的GA20氧化酶基因在植物中具有不同的表达模式，因此靶向GA20氧化酶基因的有限亚组进行遏制可允许修饰某些性状，同时避免先前与谷类植物中的GA突变体相关联的异型。换句话讲，先前与玉米和其他谷类作物中的GA突变体相关联的生长、发育和生殖性状或异型可通过仅靶向GA20或GA3氧化酶基因的有限数量或亚组(即，一种或多种，但不是全部)和/或通过靶向GA氧化酶基因的不完全遏制来解除关联。通过在植物内转基因地靶向一种或多种内源GA3或GA20氧化酶基因的亚组进行遏制，可使用更普遍的表达模式(例如，利用组成型启动子)产生半矮化植物而在植物中没有显著的生殖异型和/或其他不期望的性状，即使在转基因构建体在生殖组织中表达的情况下也是如此。实际上，本文提供了选择性地靶向GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因(在上表1中鉴定)进行遏制的遏制元件和构建体，其可以可操作地连接到维管、叶和/或组成型启动子。
使用仅靶向GA20氧化酶基因的有限亚组(诸如GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、和/或GA20氧化酶_5基因)或靶向GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因的遏制构建体，限制遏制元件的表达模式由于来自其他GA20和/或GA3氧化酶基因的补偿等而可能对于获得谷类或玉米植物的正常生殖发育和避免雌性器官或穗中的异型不太重要。因此，选择性地或优先地靶向例如玉米中的GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因、GA20氧化酶_4基因、和/或GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2、和/或GA3氧化酶_3基因、或其他谷类植物中的类似基因和同源物的遏制构建体和元件的表达可由多种不同的植物可表达启动子类型驱动，包括组成型和组织特异性或组织偏好性启动子，诸如维管或叶启动子，其可包括例如上文介绍的RTBV启动子(例如，包含RTBV(SEQ ID NO:65)或截短的RTBV(SEQ ID NO:66)序列的启动子)以及驱动在涵盖植物的大部分或全部维管和/或叶组织的组织中的表达的任何其他启动子。具有足够高的表达水平的任何已知或后来鉴定的组成型启动子也可用于靶向玉米中的GA20和/或GA3氧化酶基因的亚组，特别是GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因、GA20氧化酶_4基因、和/或GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因、或其他谷类植物中的类似基因或同源物的遏制构建体的表达。
可用于单子叶植物诸如谷类或玉米植物的组成型启动子的实例包括例如各种肌动蛋白基因启动子，诸如水稻肌动蛋白1启动子(参见例如，美国专利号5,641,876；还参见SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76)和水稻肌动蛋白2启动子(参见例如，美国专利号6,429,357；还参见例如，SEQ IDNO:77或SEQ ID NO:78)，CaMV 35S或19S启动子(参见例如，美国专利号5,352,605；对于CaMV 35S还参见例如SEQ ID NO:79)，玉蜀黍泛素启动子(参见例如，美国专利号5,510,474)，薏苡(Coix lacryma-jobi)多泛素启动子(参见例如，SEQ ID NO:80)，水稻或玉蜀黍Gos2启动子(参见例如，Pater等人,The Plant Journal,2(6):837-441992；对于水稻Gos2启动子还参见例如，SEQ ID NO:81)，FMV 35S启动子(参见例如，美国专利号6,372,211)，双重增强型CMV启动子(参见例如，美国专利号5,322,938)，MMV启动子(参见例如，美国专利号6,420,547；还参见例如，SEQ ID NO:82)，PCLSV启动子(参见例如，美国专利号5,850,019；还参见例如，SEQ ID NO:83)，Emu启动子(参见例如，Last等人,Theor.Appl.Genet.81:581(1991)；和Mcelroy等人,Mol.Gen.Genet.231:150(1991))，来自玉蜀黍、水稻或其他物种的微管蛋白启动子，胭脂氨酸合酶(nos)启动子，章鱼碱合酶(ocs)启动子，甘露碱合酶(mas)启动子，或植物醇脱氢酶(例如，玉蜀黍Adh1)启动子，本领域已知的或后来鉴定的在谷类或玉米植物中提供组成型表达的任何其他启动子(包括病毒启动子)，本领域已知的可用于单子叶植物或谷类植物的任何其他组成型启动子，以及前述启动子中的任一种的任何功能序列部分或截短。
编码靶向GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的足够水平的表达可能是产生抗倒伏的矮小的半矮化表型所必需的，因为较低水平的表达可能不足以将植物中的活性GA水平降低到足以引起显著表型的程度。因此，可能优选使用驱动等植物中产生活性GA的组织中其相关的可转录DNA序列以中等或强水平表达的组织特异性和组织偏好性启动子。此外，此类组织特异性和组织偏好性启动子应在植物正在生长和/或伸长时的植物发育的一个或多个营养阶段期间驱动其相关联的可转录DNA序列的表达，该一个或多个营养阶段包括以下营养阶段中的一者或多者：VE、V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13、V14、Vn、VT，诸如至少在V3-V12、V4-V12、V5-V12、V6-V12、V7-V12、V8-V12、V3-V14、V5-V14、V6-V14、V7-V14、V8-V14、V9-V14、V10-V14等期间、或在正在发生植物的生长和/或伸长时的营养阶段的任何其他范围期间的表达。
根据许多实施方案，植物可表达启动子可优选地组成型地或在植物的维管和/或叶组织的至少一部分中驱动表达。驱动靶向玉米中的内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因、GA20氧化酶_4基因、GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因、或其他谷类植物中的类似基因和同源物的遏制元件的表达的不同启动子可取决于它们在植物中的具体表达模式和强度而在不同程度上有效地降低植株高度和增加抗倒伏性。然而，由于启动子在植物发育期间的时空表达模式、和/或启动子的表达量或强度太低或太弱，驱动GA20或GA3氧化酶遏制元件在植物中的表达的一些组织特异性和组织偏好性启动子可能不产生显著的矮小或抗倒伏表型。此外，一些遏制构建体当在植物中表达时可能仅降低而不消除靶向GA20或GA3氧化酶基因的表达，并且因此取决于利用给定启动子实现的表达模式和强度，利用此类启动子实现的GA20或GA3氧化酶遏制构建体的表达模式和水平可能不足以在植物中产生可观察到的植株高度和抗倒伏性表型。
根据本发明的实施方案，提供了一种用于遏制植物中的一种或多种内源GA20或GA3氧化酶基因的重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中该非编码RNA分子包含与植物中由内源GA氧化酶基因表达并编码内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少一个区段或部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，其中该可转录DNA序列可操作地连接到植物可表达启动子，并且其中该植物是谷类或玉米植物。如上所述，除了靶向成熟mRNA序列之外，非编码RNA分子还可靶向GA氧化酶基因或转录物的内含子序列。根据许多实施方案，非编码RNA分子可靶向GA20氧化酶_3基因进行遏制并且包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，靶向GA20氧化酶_3基因进行遏制的非编码RNA分子可与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的至少19个连续核苷酸但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，非编码RNA分子可靶向GA20氧化酶基因进行遏制并且包含与编码植物中的与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与编码与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
如上所提及，代替GA氧化酶基因的外显子、5’UTR或3’UTR、或除其之外，非编码RNA分子可靶向GA氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向GA20氧化酶_3基因进行遏制的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:34、和/或SEQ ID NO:34的核苷酸3666-3775或4098-5314的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。重要的是要注意，由于基因的多态性和/或不同等位基因的存在，本文针对GA20氧化酶_3基因提供的序列可跨玉米植物、品系和种质的多样性而变化。此外，GA20氧化酶_3基因可被表达为可变剪接的同种型，其可产生可影响遏制构建体和非编码RNA分子的设计的不同的mRNA、cDNA和编码序列。因此，靶向GA20氧化酶_3基因进行遏制的非编码RNA分子可被更广义地定义为包含与SEQ ID NO:34的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
根据本公开的实施方案，提供了一种用于遏制植物中的内源GA20氧化酶_5基因的重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中靶向GA20氧化酶_5基因进行遏制的非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，靶向GA20氧化酶_5基因进行遏制的非编码RNA分子可与SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:14的至少19个连续核苷酸但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，非编码RNA分子可靶向GA20氧化酶基因进行遏制并且包含与编码植物中的与SEQ ID NO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与编码内源与SEQ ID NO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似的GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
如上所提及，代替GA氧化酶基因的成熟mRNA的外显子或非翻译区域或除其之外，非编码RNA分子可靶向GA氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向GA20氧化酶_5基因进行遏制的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:35、和/或SEQ ID NO:35的核苷酸3792-3906或4476-5197的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。由于基因的多态性和/或不同等位基因的存在，本文针对GA20氧化酶_5提供的序列可跨玉米植物、品系和种质的多样性而变化。此外，GA20氧化酶_5基因可被表达为可变剪接的同种型，其可产生可影响遏制构建体和非编码RNA分子的设计的不同的mRNA、cDNA和编码序列。因此，靶向GA20氧化酶_3基因进行遏制的非编码RNA分子可被更广义地定义为包含与SEQ ID NO:35的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
根据另外的实施方案，提供了一种用于联合遏制植物中的内源GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因进行遏制的非编码RNA分子包含以下序列，该序列(i)与SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，并且(ii)与SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。根据这些实施方案的一些实施方案，联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因进行遏制的非编码RNA分子可与(i)SEQ ID NO:7(和/或SEQ ID NO:8)和(ii)SEQ ID NO:13(和/或SEQ IDNO:14)的至少19个连续核苷酸但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或27个连续核苷酸互补。根据许多实施方案，联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因进行遏制的非编码RNA分子包含以下序列，该序列(i)与编码植物中的与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，并且(ii)与编码植物中的与SEQ ID NO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。如上所提及，非编码RNA分子可靶向GA氧化酶基因的内含子序列。因此，非编码RNA分子可靶向如上文所鉴定的GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因中的一者或两者的内含子序列。
根据具体实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子包含(i)与SEQ IDNO:39、41、43或45至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，和/或(ii)编码非编码RNA分子的序列或遏制元件，该非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:40、42、44或46至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的序列。根据一些实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子可包含相对于靶向GA20氧化酶基因mRNA的靶标或识别位点的序列具有一个或多个错配(诸如1、2、3、4、5或更多个互补错配)的序列，诸如与SEQ ID NO:40几乎互补但相对于SEQ ID NO:40具有一个或多个互补错配的序列。根据具体实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:40 100％同一的序列，其与GA20氧化酶_3的cDNA和编码序列(即，分别为SEQ ID NO:7和8)内的靶序列、和/或与由内源GA20氧化酶_3基因编码的mRNA的对应序列100％互补。然而，由与SEQ ID NO:40、42、44或46 100％同一的可转录DNA序列编码的非编码RNA分子的序列可不与GA20氧化酶_5基因的cDNA和编码序列(即，分别为SEQ ID NO:13和14)内的靶序列、和/或由内源GA20氧化酶_5基因编码的mRNA的对应序列完全互补。例如，SEQ ID NO:40中的非编码RNA分子或miRNA序列与GA20氧化酶_5基因的cDNA和编码序列之间最接近互补匹配可包括在SEQ ID NO:39的第一位置处的一个错配(即，SEQ ID NO:39的第一位置处的“C”被“G”替换；即，GTCCATCATGCGGTGCAACTA)。然而，尽管存在这种少许错配，但SEQ ID NO:40中的非编码RNA分子或miRNA序列仍可与由内源GA20氧化酶_5基因编码的mRNA结合和杂交。
根据本公开的实施方案，提供了一种用于遏制植物中的一种或多种内源GA3氧化酶基因的重组DNA分子、载体或构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中该非编码RNA分子包含与植物中由内源GA3氧化酶基因表达并编码内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少一个区段或部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，其中该可转录DNA序列可操作地连接到植物可表达启动子，并且其中该植物是谷类或玉米植物。除了靶向成熟mRNA序列之外，非编码RNA分子还可靶向GA3氧化酶基因或转录物的内含子序列。
根据一些实施方案，非编码RNA分子可靶向GA3氧化酶_1基因进行遏制并且包含与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，靶向GA3氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子可与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的至少19个连续核苷酸但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，靶向GA3氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子包含与编码植物中的与SEQID NO:30至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与编码与SEQ ID NO:30至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
如上所提及，代替GA氧化酶基因的外显子、5’UTR或3’UTR、或除其之外，非编码RNA分子可靶向GA3氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向GA3氧化酶_1基因进行遏制的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:36和/或168、SEQ ID NO:36的核苷酸515-879或1039-1158、和/或SEQ ID NO:168的核苷酸3647-4011或4171-4290的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。由于基因的多态性和/或不同等位基因的存在，本文针对GA3氧化酶_1提供的序列可跨玉米植物、品系和种质的多样性而变化。此外，GA3氧化酶_1基因可被表达为可变剪接的同种型，其可产生可影响遏制构建体和非编码RNA分子的设计的不同的mRNA、cDNA和编码序列。因此，靶向GA3氧化酶_1基因进行遏制的非编码RNA分子可被更广义地定义为包含与SEQ ID NO:36和/或168的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
根据一些实施方案，非编码RNA分子可靶向GA3氧化酶_2基因进行遏制并且包含与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，靶向GA3氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子可与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的至少19个连续核苷酸但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，靶向GA3氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子包含与编码植物中的与SEQID NO:33至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与编码与SEQ ID NO:33至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
如上所提及，代替GA3氧化酶基因的外显子、5’UTR或3’UTR、或除其之外，非编码RNA分子可靶向GA3氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向GA3氧化酶_2基因进行遏制的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:37和/或169、SEQ ID NO:37的核苷酸533-692或852-982、和/或SEQ ID NO:169的核苷酸3551-3710或3870-3991的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。由于基因的多态性和/或不同等位基因的存在，本文针对GA3氧化酶_2提供的序列可跨玉米植物、品系和种质的多样性而变化。此外，GA3氧化酶_2基因可被表达为可变剪接的同种型，其可产生可影响遏制构建体和非编码RNA分子的设计的不同的mRNA、cDNA和编码序列。因此，靶向GA3氧化酶_2基因进行遏制的非编码RNA分子可被更广义地定义为包含与SEQ ID NO:37和/或169的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
根据一些实施方案，非编码RNA分子可靶向GA3氧化酶_3基因进行遏制并且包含与SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，靶向GA3氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子可与SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:172的至少19个连续核苷酸但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，靶向GA3氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子包含与编码植物中的与SEQ ID NO:173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与编码与SEQ ID NO:173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
如上所提及，代替GA3氧化酶基因的外显子、5’UTR或3’UTR、或除其之外，非编码RNA分子可靶向GA3氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向GA3氧化酶_2基因进行遏制的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:170、和/或SEQ ID NO:170的核苷酸3484-3582或3908-3998的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。由于基因的多态性和/或不同等位基因的存在，本文针对GA3氧化酶_3提供的序列可跨玉米植物、品系和种质的多样性而变化。此外，GA3氧化酶_3基因可被表达为可变剪接的同种型，其可产生可影响遏制构建体和非编码RNA分子的设计的不同的mRNA、cDNA和编码序列。因此，靶向GA3氧化酶_3基因进行遏制的非编码RNA分子可被更广义地定义为包含与SEQID NO:170的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
根据具体实施方案，用于靶向GA3氧化酶基因的由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子包含(i)与SEQ ID NO:57或59至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，和/或(ii)包含与SEQ ID NO:58或60至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的序列的编码非编码RNA分子的序列或遏制元件。根据一些实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子可包含相对于靶向GA3氧化酶基因mRNA的靶标或识别位点的序列具有一个或多个错配(诸如1、2、3、4、5或更多个互补错配)的序列，诸如与SEQ ID NO:57或59几乎互补但相对于SEQ ID NO:57或59具有一个或多个互补错配的序列。根据具体实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:58或60 100％同一的序列，其与玉米中的GA3氧化酶_1或GA3氧化酶_2的cDNA和编码序列(即，SEQ ID NO:28、29、31和/或32)内的靶序列、和/或与由内源GA3氧化酶_1或GA3氧化酶_2基因编码的mRNA的对应序列100％互补。
根据一些实施方案，非编码RNA分子可靶向GA20氧化酶_4基因进行遏制并且包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，靶向GA20氧化酶_4基因进行遏制的非编码RNA分子可与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少19个连续核苷酸但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，靶向GA20氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子包含与编码植物中的与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据另外的实施方案，非编码RNA分子可包含与编码与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
如上所提及，代替GA20氧化酶基因的外显子、5’UTR或3’UTR、或除其之外，非编码RNA分子可靶向GA20氧化酶基因的内含子序列。因此，靶向GA20氧化酶_4基因进行遏制的非编码RNA分子可包含与SEQ ID NO:38、和/或SEQ ID NO:38的核苷酸1996-2083或2412-2516的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。由于基因的多态性和/或不同等位基因的存在，本文针对GA20氧化酶_4提供的序列可跨玉米植物、品系和种质的多样性而变化。此外，GA20氧化酶_4基因可被表达为可变剪接的同种型，其可产生可影响遏制构建体和非编码RNA分子的设计的不同的mRNA、cDNA和编码序列。因此，靶向GA20氧化酶_4基因进行遏制的非编码RNA分子可被更广义地定义为包含与SEQ ID NO:38的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
根据具体实施方案，用于靶向GA20氧化酶_4基因的由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子包含(i)与SEQ ID NO:61至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，和/或(ii)包含与SEQ ID NO:62至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的序列的编码非编码RNA分子的序列或遏制元件。根据一些实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子可包含相对于靶向GA20氧化酶基因mRNA的靶标或识别位点的序列具有一个或多个错配(诸如1、2、3、4、5或更多个互补错配)的序列，诸如与SEQ ID NO:61几乎互补但相对于SEQ ID NO:61具有一个或多个互补错配的序列。根据具体实施方案，由可转录DNA序列编码的非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:62 100％同一的序列，其与玉米中的GA20氧化酶_4的cDNA和编码序列(即，SEQID NO:10或11)内的靶序列、和/或与由内源GA20氧化酶_4基因编码的mRNA的对应序列100％互补。
根据本公开的实施方案，提供了一种重组DNA构建体，其包含编码靶向内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述可转录DNA序列可操作地连接到组成型、组织特异性或组织偏好性启动子，并且其中在用所述可转录DNA序列转化的植物的一个或多个组织中可转录DNA序列引起内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的表达水平变得减少或降低。由可转录DNA序列编码的此类非编码RNA分子可包含以下序列，该序列(i)与编码植物中的与SEQ ID NO:9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，和/或(ii)与编码植物中的与SEQ ID NO:15至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。
根据本公开的实施方案，提供了一种重组DNA构建体，其包含编码靶向内源GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中该可转录DNA序列可操作地连接到组成型、组织特异性或组织偏好性启动子，并且其中该可转录DNA序列引起内源GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因的表达水平在用可转录DNA序列转化的植物的一种或多种组织中减少或降低。由可转录DNA序列编码的此类非编码RNA分子可包含以下序列，该序列(i)与编码植物中的与SEQ ID NO:30至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，(ii)与编码植物中的与SEQ ID NO:33至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，和/或(iii)与编码植物中的与SEQ ID NO:173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。
根据本公开的实施方案，提供了一种重组DNA构建体，其包含编码靶向内源GA20氧化酶_4基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中该可转录DNA序列可操作地连接到组成型、组织特异性或组织偏好性启动子，并且其中该可转录DNA序列引起内源GA20氧化酶_4基因的表达水平在用可转录DNA序列转化的植物的一种或多种组织中减少或降低。由可转录DNA序列编码的此类非编码RNA分子可包含(i)与编码植物中的与SEQ ID NO:12至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA20氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
根据许多实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，该经修饰或转基因植物用包含编码靶向内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体转化，和/或具有通过如本文提供的靶向基因组编辑技术编辑的内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因，其中该可转录DNA序列可操作地连接到组成型启动子或组织特异性或组织偏好性启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且其中与野生型或对照植物相比，内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的表达水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个维管和/或叶组织)中被消除、减少或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。根据许多实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，该经修饰或转基因植物用包含编码靶向内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体转化，和/或具有通过靶向基因组编辑技术编辑以减少或消除其表达水平和/或活性的内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因，其中该可转录DNA序列可操作地连接到组成型启动子或组织特异性或组织偏好性启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且其中与野生型或对照植物相比，一种或多种活性GA(诸如GA1、GA3、GA4和/或GA7)的水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个茎、节间、维管和/或叶组织或一个或多个茎和/或节间组织)中减少或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。
根据许多实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，该经修饰或转基因植物用包含编码靶向内源GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体转化，和/或具有通过如本文提供的靶向基因组编辑技术编辑的内源GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因，其中该可转录DNA序列可操作地连接到组成型启动子或组织特异性或组织偏好性启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且/或者其中与野生型或对照植物相比，内源GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因的表达水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个维管和/或叶组织)中被消除、减少或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。根据许多实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，该经修饰或转基因植物用包含编码靶向内源GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体转化，和/或具有通过靶向基因组编辑技术编辑以减少或消除其表达水平和/或活性的内源GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因，其中该可转录DNA序列可操作地连接到组成型启动子或组织特异性或组织偏好性启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且其中与野生型或对照植物相比，一种或多种活性GA(诸如GA1、GA3、GA4和/或GA7)的水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个茎、节间、维管和/或叶组织或一个或多个茎和/或节间组织)中减少或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。
根据许多实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，该经修饰或转基因植物用包含编码靶向内源GA20氧化酶_4基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体转化，和/或具有通过如本文提供的靶向基因组编辑技术编辑的内源GA20氧化酶_4基因，其中该可转录DNA序列可操作地连接到组成型启动子或组织特异性或组织偏好性启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且/或者其中与野生型或对照植物相比，内源GA20氧化酶_4基因的表达水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个维管和/或叶组织)中被消除、减少或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。根据许多实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，该经修饰或转基因植物用包含编码靶向内源GA20氧化酶_4基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体转化，和/或具有通过靶向基因组编辑技术编辑以减少或消除其表达水平和/或活性的内源GA20氧化酶_4基因，其中该可转录DNA序列可操作地连接到组成型启动子或组织特异性或组织偏好性启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且其中与野生型或对照植物相比，一种或多种活性GA(诸如GA1、GA3、GA4和/或GA7)的水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个茎、节间、维管和/或叶组织或一个或多个茎和/或节间组织)中减少或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。
根据许多实施方案，提供了一种经修饰或转基因植物，该经修饰或转基因植物是用包含编码靶向内源GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4和/或GA20氧化酶_5基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体转化的；是用包含编码靶向内源GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体转化的；和/或具有如本文提供的通过靶向基因组编辑技术编辑以减少或消除其表达水平和/或活性的内源GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4或GA20氧化酶_5基因；和/或具有如本文提供的通过靶向基因组编辑技术编辑以减少或消除其表达水平和/或活性的内源GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2或GA3氧化酶_3基因，其中该可转录DNA序列可操作地连接到组成型启动子或组织特异性或组织偏好性启动子，诸如维管启动子或叶启动子，并且/或者其中该经修饰或转基因植物具有以下性状中的一者或多者：半矮化或降低的植株高度或株型、减小的茎节间长度、增加的抗倒伏性、和/或增加的茎或秆直径。此类经修饰或转基因植物可能不具有任何显著的生殖异型。经修饰或转基因植物可具有以下附加性状中的一者或多者：减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、增加的氮利用效率、增加的水利用效率、在正常和/或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和花青素面积、增加的穗重量、增加的籽粒数量、增加的籽粒重量、增加的产量和/或增加的收获指数。根据这些实施方案中的许多实施方案，与野生型或对照植物相比，内源GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4和/或GA20氧化酶_5基因、或内源GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因的表达水平和/或活性在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个维管和/或叶组织)中可被消除、减少或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％，和/或与野生型或对照植物相比，一种或多种活性GA(诸如GA1、GA3、GA4和/或GA7)的水平在经修饰或转基因植物的一个或多个植物组织(诸如一个或多个茎、节间、维管和/或叶组织，或一个或多个茎和/或节间组织)中减少或降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％。
根据上述段落中描述的实施方案中的许多实施方案，由重组DNA分子、载体或构建体的可转录DNA序列编码的非编码RNA分子可以是可随后在植物细胞中加工或切割以形成成熟miRNA或siRNA的前体miRNA或siRNA。
本公开的重组DNA分子、构建体或载体可包含编码靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中该可转录DNA序列可操作地连接到植物可表达启动子(诸如组成型或维管和/或叶子启动子)。出于本公开的目的，由可转录DNA序列编码的靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子可包含靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的成熟非编码RNA分子，和/或可在植物细胞中加工成靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的成熟非编码RNA分子(诸如miRNA或siRNA)的前体RNA分子。除了其相关联的启动子之外，编码用于遏制内源GA氧化酶基因的非编码RNA分子的可转录DNA序列还可以可操作地连接到一种或多种附加调节元件，诸如增强子、前导序列、转录起始位点(TSS)、接头、5’和3’非翻译区(UTR)、内含子、聚腺苷酸化信号、终止区或序列等，这些调节元件对于加强、调节或允许可转录DNA序列在植物细胞中的表达是合适的、必需的或优选的。此类附加调节元件可以是任选的和/或用于增强或优化转基因或可转录DNA序列的表达。如本文所提供的，“增强子”与“启动子”的区别可在于增强子通常缺乏转录起始位点、TATA盒或等同序列，并且因此单独不足以驱动转录。如本文所用，“前导序列”通常可被定义为在可转录DNA序列或转基因的蛋白质编码序列的转录起始位点(TSS)与5’末端之间的基因(或转基因)的5’-UTR的DNA序列。
根据另外的实施方案，提供了用重组DNA分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体以产生转基因植物的方法，该重组DNA分子或构建体包含与植物可表达启动子可操作地连接的可转录DNA序列或转基因。可转录DNA序列可编码靶向GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子，或被加工成靶向一种或多种GA氧化酶基因进行遏制的成熟RNA分子(诸如miRNA或siRNA)的RNA前体。用重组DNA分子或构建体转化植物细胞中的染色体或质粒的许多方法是本领域已知的，其可根据本发明的方法实施方案用于产生转基因植物细胞和植物。本领域中已知的用于转化植物细胞的任何适合方法或技术都可根据本发明方法加以使用。用于转化植物的有效方法包括细菌介导的转化诸如土壤杆菌介导或根瘤菌(Rhizobium)介导的转化、以及微粒或粒子轰击介导的转化。用于通过细菌介导的转化或微粒或粒子轰击来用转化载体转化外植体，接着随后对那些外植体进行培养等以再生或发育成转基因植物的多种方法在本领域中是已知的。用于植物转化的其他方法，诸如显微注射、电穿孔、真空渗入、加压、声波处理、碳化硅纤维搅拌、PEG介导的转化等，在本领域中也是已知的。
转化植物细胞和外植体的方法为本领域普通技术人员所熟知。用于通过微粒轰击用经重组DNA包被的粒子转化植物细胞的方法例如提供在美国专利第5,550,318；5,538,880 6,160,208；6,399,861；和6,153,812号中，并且土壤杆菌介导的转化例如描述于美国专利第5,159,135；5,824,877；5,591,616；6,384,301；5,750,871；5,463,174；和5,188,958号中，所述专利全都通过引用并入本文。用于转化植物的额外方法可例如见于Compendiumof Transgenic Crop Plants(2009)Blackwell Publishing中。本领域已知或后期开发的任何合适的植物转化方法可用于利用本文提供的任何核酸分子、构建体或载体转化植物细胞或外植体。
取决于所用的方法和外植体，通过转化方法产生的转基因植物针对转化事件可以是嵌合的或非嵌合的。还提供了用于在一种或多种植物细胞或组织中在植物可表达启动子(诸如如本文提供的组成型、组织特异性、组织偏好性、维管和/或启动子)的控制下表达靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子的方法。此类方法可用于产生具有较矮的半矮化株型、减小的节间长度、增加的秆/茎直径、和/或改善的抗倒伏性的转基因谷类或玉米植物。此类转基因谷类或玉米植物还可具有可有益于产量的其他性状，诸如相对于野生型或对照植物，减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、改善的耐旱性、增加的氮利用效率、增加的水利用效率、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和/或面积、增加的穗重量、增加的种子或籽粒数量、增加的种子或籽粒重量、增加的产量和/或增加的收获指数。如本文所用，“收获指数”是指收获谷粒的质量除以收获区域上植物的地上生物量的总质量。
表达靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的GA氧化酶转基因或非编码RNA分子的转基因植物、或在GA氧化酶基因中具有一个或多个突变的经修饰的植物可具有比野生型或对照植物更早的冠层郁闭(例如，大约早一天、或早12-48小时、12-36小时、18-36小时、或约24小时的冠层郁闭)。尽管表达靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的GA氧化酶转基因或非编码RNA分子的转基因植物和在GA氧化酶基因中具有一个或多个突变的经修饰的植物可具有比野生型或对照植物更低的穗高度，但穗的高度通常可高于地面至少18英寸。表达靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子的转基因植物或在GA氧化酶基因中具有一个或多个突变的经修饰的植物在一个或多个晚期营养阶段(例如，V8-V12)期间可具有比野生型或对照植物更大的生物量和/或叶面积。表达靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的GA氧化酶转基因或非编码RNA分子的转基因植物或在GA氧化酶基因中具有一个或多个突变的经修饰的植物当在田间生长时在晚期营养阶段期间可具有比野生型或对照植物更深的根，这可能是由于增加的根下扎速度。这些转基因或经修饰的植物可比野生型或对照植物更提早地(例如，提早10-25天、提早15-25天、或提早20天)达到地下90cm的深度，这可通过植物的营养到生殖转变(例如，通过在种植后约50天的V16/R1，相比于对照植物在种植后约70天)发生。
用于转化的一种或多种接受细胞或外植体或细胞靶标包括但不限于种子细胞、果实细胞、叶细胞、子叶细胞、下胚轴细胞、分生组织细胞、胚细胞、胚乳细胞、根细胞、嫩芽细胞、茎细胞、荚细胞、花细胞、花序细胞、柄细胞、花梗细胞、花柱细胞、柱头细胞、花托细胞、花瓣细胞、萼片细胞、花粉细胞、花药细胞、花丝细胞、子房细胞、胚珠细胞、果皮细胞、韧皮部细胞、芽细胞、愈伤组织细胞、叶绿体、气孔细胞、毛状体细胞、根毛细胞、贮藏根细胞或维管组织细胞、种子、胚、分生组织、子叶、下胚轴、胚乳、根、嫩芽、茎、节、愈伤组织、细胞悬液、原生质体、花、叶、花粉、花药、子房、胚珠、果皮、芽和/或维管组织、或前述各物中的任一者的任何可转化部分。对于植物转化，可用于接受本公开的重组DNA转化载体或分子的任何一种或多种靶标细胞、组织、外植体等都可被总称为用于转化的“外植体”。优选地，可使可转化或经转化外植细胞或组织进一步发育或再生成植物。可育植物可从其生长或再生的任何细胞或外植体都被考虑为用于实施本公开的有用接受细胞或外植体(即为用于转化的靶标外植体)。愈伤组织可从各种组织来源创始或创建，包括但不限于胚或胚的部分、非胚种子组织、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够增殖成愈伤组织的任何细胞都可充当用于转化的接受细胞。用于制备转基因植物的转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞或外植体以及转化和随后再生为转基因植物的方法)是本领域已知的。
靶植物材料或外植体的转化可在营养培养基上的组织培养物中实践，该培养基例如允许细胞体外生长或细胞培养的营养物的混合物。如本领域已知的，经转化的外植体、细胞或组织可进行附加的培养步骤，诸如愈伤组织诱导、选择、再生等。还可在不产生或不使用愈伤组织的情况下进行转化。可根据本领域已知的方法使含有重组DNA序列插入或事件的经转化的细胞、组织或外植体在培养基、塞子或土壤中生长、发育或再生为转基因植物。转基因植物可与自身或其他植物进一步杂交以产生转基因种子和子代。还可通过将包含重组DNA序列或转化事件的第一植物与缺乏插入的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可将重组DNA构建体或序列引入易于转化的第一植物系中，然后可将其与第二植物系杂交以将重组DNA构建体或序列渗入第二植物系中。这些杂交的子代可进一步回交到更期望的品系中多次，诸如通过6至8个世代或回交，以产生具有与原始亲本系基本相同的基因型但引入了重组DNA构建体或序列的子代植物。
本文提供的转基因的、突变的或编辑的植物、植物部分、细胞或外植体可属于优良品种或优良品系。优良品种或优良品系是指通过针对优异的农艺学表现育种和选择所得到的品种。本文提供的转基因的、突变的或编辑的植物、细胞或外植体可以是杂种植物、细胞、或外植体。如本文所用，“杂种”是通过使来自不同品种、品系、近交种、或物种的两种植物杂交，以使子代包含来自每个亲本的遗传物质而产生的。熟练技术人员认识到也可产生更高级杂种。例如，可通过使品种A与品种B杂交以创建A x B杂种来制备第一杂种，并且可通过使品种C与品种D杂交以创建C x D杂种来制备第二杂种。第一杂种和第二杂种可进一步杂交以产生包含来自所有四个亲本品种的遗传信息的更高级杂种(A x B)x(C x D)。
根据本公开的实施方案，提供了一种经修饰的植物，其包含靶向两种或更多种GA氧化酶基因进行遏制的GA氧化酶遏制元件，或两种或更多种GA氧化酶遏制元件和/或基因编辑或突变的组合。重组DNA构建体或载体可包含单个盒或遏制元件，其包含被设计或选择以编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，该非编码RNA分子与包括至少第一GA氧化酶基因和第二GA氧化酶基因的两种或更多种GA氧化酶基因的mRNA识别或靶序列互补—即，靶向GA氧化酶基因的mRNA共有相同或几乎相同(或相似)的序列，使得单个遏制元件和所编码的非编码RNA分子可靶向每个靶向GA氧化酶基因进行遏制。例如，本文提供了一种包含可转录DNA序列的表达盒和遏制构建体，该可转录DNA序列编码靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因进行遏制的单个非编码RNA分子。
根据其他实施方案，重组DNA构建体或载体可包含两种或更多种遏制元件或序列，其可在单个表达盒中或分别在两个或更多个表达盒中一起串联堆叠在构建体或载体中。重组DNA构建体或载体可包含含有可转录DNA序列的单个表达盒或遏制元件，该可转录DNA序列编码包含串联排列的两个或更多个靶向序列的非编码RNA分子，这些靶向序列包括至少第一靶向序列和第二靶向序列，其中该第一靶向序列与第一GA氧化酶基因的mRNA识别或靶标位点互补，并且该第二靶向序列与第二GA氧化酶基因的mRNA识别或靶标位点互补，并且其中该可转录DNA序列可操作地连接到植物可表达启动子。植物可表达启动子可以是组成型启动子、或组织特异性或组织偏好性启动子，如本文所提供的。非编码RNA分子可被表达为pre-miRNA，其被加工成两种或更多种成熟miRNA，包括至少第一成熟miRNA和第二miRNA，其中该第一miRNA包含与第一GA氧化酶基因的mRNA识别或靶标位点互补的靶向序列，并且该第二miRNA包含与第二GA氧化酶基因的mRNA识别或靶标位点互补的靶向序列。
根据其他实施方案，重组DNA构建体或载体可包含两个或更多个表达盒，包括第一表达盒和第二表达盒，其中该第一表达盒包含与第一植物可表达启动子可操作地连接的第一可转录DNA序列，并且该第二表达盒包含与第二植物可表达启动子可操作地连接的第二可转录DNA序列，其中该第一可转录DNA序列编码包含与第一GA氧化酶基因的mRNA识别或靶标位点互补的靶向序列的第一非编码RNA分子，并且该第二可转录DNA序列编码包含与第二GA氧化酶基因的mRNA识别或靶标位点互补的靶向序列的第二非编码RNA分子。第一植物可表达启动子和第二植物可表达启动子可各自为组成型启动子、或组织特异性或组织偏好性启动子，如本文所提供的，并且第一植物可表达启动子和第二植物可表达启动子可以是相同或不同的启动子。
根据其他实施方案，靶向GA氧化酶基因和/或GA氧化酶基因编辑或突变的两种或更多种遏制元件或构建体可通过在一代或多代中将两种或更多种植物杂交在一起而在经修饰的植物中组合以产生具有遏制元件和/或基因编辑或突变的期望组合的经修饰的植物。根据这些实施方案，可将包含靶向GA氧化酶基因(或GA氧化酶基因编辑或突变)的遏制元件或构建体的第一经修饰的植物与包含靶向GA氧化酶基因(或GA氧化酶基因编辑或突变)的遏制元件或构建体的第二经修饰的植物杂交，使得可制备包含第一遏制元件或构建体和第二遏制元件或构建体、遏制元件或构建体和GA氧化酶基因编辑或突变、或第一GA氧化酶基因编辑或突变和第二GA氧化酶基因编辑或突变的经修饰子代植物。另选地，包含靶向GA氧化酶基因和/或GA氧化酶基因编辑或突变的两种或更多种遏制元件或构建体的经修饰的植物可通过以下方式制备：(i)共转化第一遏制元件或构建体和第二遏制元件或构建体(各自靶向GA氧化酶基因进行遏制)，(ii)用第二遏制元件或构建体转化经修饰的植物，其中该经修饰的植物已经包含第一遏制元件或构建体，(iii)用遏制元件或构建体转化经修饰的植物，其中该经修饰的植物已经包含编辑的或突变的GA氧化酶基因，(iv)用构建体转化经修饰的植物以在GA氧化酶基因中产生一个或多个编辑或突变，其中该经修饰的植物已经包含遏制元件或构建体，或(v)用构建体转化以在GA氧化酶基因中产生两个或更多个编辑或突变。
根据本公开的实施方案，提供了包含靶向GA氧化酶基因进行遏制的两种或更多种构建体的经修饰的植物，这些构建体包括第一重组DNA构建体和第二重组DNA构建体，其中该第一重组DNA构建体包含编码第一非编码RNA分子的第一可转录DNA序列，该第一非编码RNA分子与第一GA氧化酶基因的mRNA识别或靶序列互补，并且该第二重组DNA构建体包含编码第二非编码RNA分子的第二可转录DNA序列，该第二非编码RNA分子与第二GA氧化酶基因的mRNA识别或靶序列互补。第一重组DNA构建体和第二重组DNA构建体可堆叠在单个载体中并作为单个事件转化到植物中，或存在于可作为单独事件转化的单独载体或构建体中。根据这些实施方案，该第一GA氧化酶基因可以是GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_4、GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2或GA3氧化酶_3基因，第一非编码RNA分子与由此类GA氧化酶基因表达的mRNA的识别或靶序列互补，并且该第二GA氧化酶基因可以是GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_4、GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2或GA3氧化酶_3基因。根据一些实施方案，第一GA氧化酶基因和第二GA氧化酶基因可以是相同或不同的GA氧化酶基因。另选地，该第二GA氧化酶基因可以是另一种GA氧化酶基因，诸如GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8、或GA20氧化酶_9基因，并且该第二非编码RNA分子与由此类GA氧化酶基因表达的mRNA的识别或靶序列互补。
根据本公开的实施方案，提供了包含靶向GA氧化酶基因进行遏制的重组DNA构建体的经修饰的植物，该重组DNA构建体包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，该非编码RNA分子包含串联排列的两个或更多个靶向序列，包括至少与第一GA氧化酶基因的mRNA识别或靶序列互补的第一靶向序列和与第二GA氧化酶基因的mRNA识别或靶序列互补的第二靶向序列。非编码RNA分子可被表达为pre-miRNA，其被加工成两种或更多种成熟miRNA，包括至少第一成熟miRNA和第二miRNA，其中该第一miRNA包含与第一GA氧化酶基因的mRNA识别或靶标位点互补的第一靶向序列，并且该第二miRNA包含与第二GA氧化酶基因的mRNA识别或靶标位点互补的第二靶向序列。根据这些实施方案，该第一GA氧化酶基因可以是GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_4、GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2或GA3氧化酶_3基因，第一非编码RNA分子与由此类GA氧化酶基因表达的mRNA的识别或靶序列互补，并且该第二GA氧化酶基因可以是GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_4、GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2或GA3氧化酶_3基因。根据一些实施方案，第一GA氧化酶基因和第二GA氧化酶基因可以是相同或不同的GA氧化酶基因。另选地，该第二GA氧化酶基因可以是另一种GA氧化酶基因，诸如GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8、或GA20氧化酶_9基因，并且该第二非编码RNA分子与由此类GA氧化酶基因表达的mRNA的识别或靶序列互补。
在以上堆叠情形中，并且无论靶向序列是串联堆叠在单个可转录DNA序列(或表达盒)中还是堆叠在分开的可转录DNA序列(或表达盒)中，第二GA氧化酶基因可以是除GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_4、GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2或GA3氧化酶_3之外的GA氧化酶基因，诸如GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8或GA20氧化酶_9基因。根据这些实施方案，非编码RNA分子的第二靶向序列可与SEQ IDNO:1、2、4、5、16、17、19、20、22、23、25和/或26中的任何一者或多者的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。根据一些实施方案，非编码RNA分子的第二靶向序列可与SEQ ID NO:1、2、4、5、16、17、19、20、22、23、25和/或26中的任何一者或多者的至少19个连续核苷酸但不超过27个连续核苷酸互补，诸如与19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或27个连续核苷酸互补。根据一些实施方案，非编码RNA分子的第二靶向序列可与编码植物中的与SEQ ID NO:3、6、18、21、24和/或27中的任何一者或多者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。根据另外的实施方案，非编码RNA分子的第二靶向序列可包含与编码与SEQ ID NO:3、6、18、21、24和/或27中的任何一者或多者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相似的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
本公开的重组DNA分子或构建体可包含用于转化靶植物细胞、组织或外植体的DNA转化载体或被包含在该DNA转化载体内。除了编码靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的GA氧化酶基因或非编码RNA分子的至少一种转基因、表达盒和/或可转录DNA序列之外，此类转化载体通常可包含对于有效转化必需或有益的序列或元件。对于土壤杆菌介导的、根瘤菌介导的或其他细菌介导的转化，转化载体可包含在至少可转录DNA序列或转基因处侧接的经工程改造的转移DNA(或T-DNA)区段或区域，其具有两个边界序列，即左边界(LB)和右边界(RB)，使得T-DNA插入植物基因组中将产生可转录DNA序列、转基因或表达盒的转化事件。因此，编码靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列、转基因或表达盒可位于T-DNA的左边界与右边界之间，可能连同附加的转基因或表达盒一起，诸如植物可选择标记转基因和/或可赋予植物农艺学上感兴趣的性状或表型的农艺学上感兴趣的其他基因。根据另选的实施方案，编码靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列、转基因或表达盒和植物可选择标记转基因(或农艺学上感兴趣的其他基因)可存在于相同或不同的重组DNA分子上的分开的T-DNA区段中，诸如以用于共转化。根据一些实施方案，用于基因组编辑的重组DNA分子或构建体或DNA转化载体的可转录DNA序列、转基因或表达盒可编码一种或多种引导RNA和/或位点特异性核酸酶。转化载体或构建体还可包含原核维持元件，其可在载体中位于T-DNA区域外部。
本公开的转化载体或构建体中的植物可选择标记转基因可用于辅助由于存在选择剂诸如抗生素或除草剂而达成的对经转化细胞或组织的选择，其中所述植物可选择标记转基因提供对所述选择剂的耐受性或抗性。因此，选择剂可偏向于或有利于表达植物可选择标记基因的经转化细胞的存活、发育、生长、增殖等，诸如以增加R0植物中经转化细胞或组织的比例。通常使用的植物可选择标记基因包括例如赋予对抗生素诸如卡那霉素(kanamycin)和巴龙霉素(paromomycin)(nptII)、潮霉素B(hygromycin B)(aph IV)、链霉素(streptomycin)或壮观霉素(spectinomycin)(aadA)和庆大霉素(gentamycin)(aac3和aacC4)的耐受性或抗性的那些，或赋予对除草剂诸如草铵膦(glufosinate)(bar或pat)、麦草畏(dicamba)(DMO)和草甘膦(glyphosate)(aroA或EPSPS)的耐受性或抗性的那些。还可使用提供目视筛选转化子的能力的植物可筛选标记基因，诸如荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)、或表达其各种显色底物是已知的β葡萄糖醛酸苷酶的基因或uidA基因(GUS)。在一些实施方案中，本文提供的载体或多核苷酸包含至少一种选自由以下组成的组的可选择标记基因：nptII、aph IV、aadA、aac3、aacC4、bar、pat、DMO、EPSPS、aroA、GFP和GUS。植物转化还可在不存在选择下在培养经转化外植体、组织、植物和/或植物部分，使经转化外植体、组织、植物和/或植物部分发育或再生的一个或多个步骤或阶段期间进行。
根据本发明实施方案，用于用重组DNA分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体的方法还可包括定点或靶向整合。根据这些方法，可将重组DNA供体模板分子的一部分(即插入序列)插入或整合到植物基因组内的期望位点或基因座上。供体模板的插入序列可包含转基因或构建体，诸如编码靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子的转基因或可转录DNA序列。供体模板还可具有侧接插入序列的一个或两个同源臂，以通过同源重组和/或同源定向修复来促进靶向插入事件。每个同源臂可与单子叶植物或谷类植物的基因组内的靶DNA序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。因此，本公开的重组DNA分子可包含用于将转基因或构建体(诸如编码靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子的转基因或可转录DNA序列)定点或靶向整合到植物基因组中的供体模板。
植物的基因组内的任何位点或基因座都可潜在地被选择用于定点整合本文提供的转基因、构建体或可转录DNA序列。对于定点整合，可首先用位点特异性核酸酶诸如锌指核酸酶、经工程改造或天然的大范围核酸酶、TALE核酸内切酶、或RNA引导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)，在选定的基因组基因座处产生双链断裂(DSB)或切口。可使用本领域中已知的用于定点整合的任何方法。在具有插入序列的供体模板分子存在下，DSB或切口可接着通过供体模板的一个或多个同源臂与植物基因组之间的同源性重组，或通过非同源性末端接合(NHEJ)来修复，从而导致所述插入序列定点整合至植物基因组中以在DSB或切口的位点处创建靶向插入事件。因此，可实现转基因、构建体或序列的位点特异性插入或整合。
DSB或切口的引入也可用于在植物基因组中引入靶向突变。根据该方法，可通过DSB或切口的不完全修复在靶标位点处引入突变诸如缺失、插入、倒位和/或取代，以产生GA氧化酶基因的敲除或敲低。即使在不使用供体模板分子的情况下，也可通过靶向基因座的不完全修复生成此类突变。GA氧化酶基因的“敲除”可通过在GA氧化酶基因的内源基因座处或附近诱导DSB或切口来实现，这导致GA氧化酶蛋白的不表达或非功能蛋白的表达；而GA氧化酶基因的“敲低”可通过在GA氧化酶基因的内源基因座处或附近诱导DSB或切口而以类似方式实现，该DSB或切口在不影响GA氧化酶基因的编码序列的位点处以将消除所编辑的GA氧化酶蛋白的功能的方式被不完全修复。例如，内源基因座内的DSB或切口的位点可在GA氧化酶基因的上游或5'区(例如，启动子和/或增强子序列)，以影响或降低其表达水平。类似地，GA氧化酶基因的此类靶向敲除或敲低突变可用供体模板分子生成，以经由DSB或切口的修复在靶标位点处或附近指导特定或期望的突变。供体模板分子可包含同源序列，其具有或不具有插入序列并且相对于DSB或切口位点处或附近的靶向基因组序列包含一个或多个突变，诸如一个或多个缺失、插入、倒位和/或取代。例如，GA氧化酶基因的靶向敲除突变可通过使基因的至少一部分缺失或倒位或通过将移码或提前终止密码子引入基因的编码序列中来实现。GA氧化酶基因的一部分的缺失还可通过在两个靶标位点处产生DSB或切口并引起由靶标位点侧接的居间靶标区域的缺失来引入。
本文提供的位点特异性核酸酶可选自由以下组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、RNA引导的核酸内切酶、TALE-核酸内切酶(TALEN)、重组酶、转座酶、或它们的任何组合。参见例如Khandagale,K.等人,“Genome editing for targeted improvement inplants,”Plant Biotechnol Rep 10:327-343(2016)；以及Gaj,T.等人,“ZFN,TALEN andCRISPR/Cas-based methods for genome engineering,”Trends Biotechnol.31(7):397-405(2013)，所述文献的内容和公开内容通过引用并入本文。重组酶可为连接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶、连接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶或本领域中已知的其他重组酶。重组酶或转座酶可为连接于DNA结合结构域的DNA转座酶或重组酶。连接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶可选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。根据一些实施方案，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶栓系于锌指DNA结合结构域。在另一实施方案中，本文提供的连接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在另一实施方案中，本文提供的连接于DNA结合结构域的DNA转座酶选自由以下组成的组：TALE-piggyBac和TALE-Mutator。
可基于可观察的表型(例如，本文所述的任何表型，诸如较矮的植株高度、增加的茎/秆直径等)，或使用具有可选择标记的选择剂(例如，除草剂等)、可筛选标记、或分子技术(例如，较低的GA水平、较低的GA氧化酶转录物或蛋白质水平、转基因或可转录序列的存在等)筛选和选择已经历诱变或基因组编辑处理的玉米或谷类植物。根据一些实施方案，RNA引导的核酸内切酶可以是Cas9或Cpf1酶。
在一方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：锌指核酸酶、大范围核酸酶、RNA引导的核酸酶、TALE-核酸酶、重组酶、转座酶、或它们的任何组合。在另一方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由Cas9或Cpf1组成的组。在另一方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、它们的同源物、或它们的经修饰形式。在另一方面，本文提供的RNA引导的核酸酶选自由Cas9或Cpf1组成的组。在另一方面，本文提供的RNA引导的核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、它们的同源物、或它们的修饰形式。在另一方面，本文提供的方法和/或组合物包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种位点特异性核酸酶。在另一方面，本文提供的方法和/或组合物包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种编码至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种位点特异性核酸酶的多核苷酸。
对于RNA引导的核酸内切酶，还提供了引导RNA(gRNA)分子以通过碱基配对或杂交将核酸内切酶导向至植物的基因组中的靶标位点以在所述靶标位点处或附近导致DSB或切口。gRNA可以gRNA分子形式，或以包含可操作地连接到植物可表达启动子的编码引导RNA的可转录DNA序列的重组DNA分子、构建体或载体形式转化或引入至植物细胞或组织中(也许连同核酸酶或核酸酶编码DNA分子、构建体或载体一起)。如本领域中所了解，“引导RNA”可包括例如CRISPR RNA(crRNA)、单链引导RNA(sgRNA)、或可将核酸内切酶引导或导向至基因组中特定靶标位点的任何其他RNA分子。“单链引导RNA”(或“sgRNA”)是包含由接头序列共价连接于tracrRNA的crRNA的RNA分子，其可表达为单个RNA转录物或分子。引导RNA包含与植物基因组内的靶标位点(诸如GA氧化酶基因处或附近)同一或互补的引导或靶向序列。原间隔序列邻近基序(PAM)可存在于基因组中、紧邻与引导RNA的靶向序列互补的基因组靶标位点序列的5’端且在其上游—即，紧邻基因组靶标位点(相对于引导RNA的靶向序列)的有义(+)链的下游(3’)，如本领域已知的。参见例如，Wu,X.等人,“Target specificity ofthe CRISPR-Cas9 system,”Quant Biol.2(2):59-70(2014)，其内容和公开内容以引用方式并入本文。与靶标位点(相对于引导RNA的靶向序列)相邻的有义(+)链上的基因组PAM序列可包含5’-NGG-3’。然而，引导RNA的对应序列(即，紧邻引导RNA的靶向序列的下游(3’))通常可不与基因组PAM序列互补。引导RNA通常可以是不编码蛋白质的非编码RNA分子。引导RNA的引导序列在长度方面可为至少10个核苷酸，诸如在长度方面可为12-40个核苷酸、12-30个核苷酸、12-20个核苷酸、12-35个核苷酸、12-30个核苷酸、15-30个核苷酸、17-30个核苷酸、或17-25个核苷酸，或在长度方面可为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸。引导序列可与基因组靶标位点处的DNA序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于利用RNA引导的核酸内切酶在GA20氧化酶_3基因处或附近进行基因编辑，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ IDNO:34或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:34或其互补序列的12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。对于利用RNA引导的核酸内切酶在GA20氧化酶_5基因处或附近进行基因编辑，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:35或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:35或其互补序列的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。如本文所用，关于多核苷酸或蛋白质序列的术语“连续”意指序列中没有缺失或空位。
对于通过基因组编辑进行的敲低(和可能的敲除)突变，RNA引导的核酸内切酶可靶向GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的上游或下游序列，诸如启动子和/或增强子序列、或内含子、5’UTR、和/或3’UTR序列，以使该基因的一个或多个启动子和/或调节序列突变并影响或降低其表达水平。对于玉米中的GA20氧化酶_3基因的敲低(和可能的敲除)，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围1-3096、SEQ IDNO:34的核苷酸序列范围3666-3775、SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围4098-5314、SEQ IDNO:34的核苷酸序列范围5585-5800、或SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围5801-8800或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围1-3096、3666-3775、4098-5314、5585-5800、5801-8800或5585-8800、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于玉米中的GA20氧化酶_5基因的敲低(和可能的敲除)，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围1-3000、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围1-3000、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3792-3906、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围4476-5197、或SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围5860-8859或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围1-3000、3792-3906、4476-5197或5860-8859、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于通过基因组编辑进行的敲除(和可能的敲低)突变，RNA引导的核酸内切酶可靶向GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的编码和/或内含子序列，以潜在地消除该基因的功能GA氧化酶蛋白的表达和/或活性。然而，在一些情况下，通过靶向基因的上游和/或5'UTR序列，或基因的基因组基因座处或附近的其他序列，也可实现GA氧化酶基因表达的敲除。因此，可通过靶向所靶向的GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的位点或基因座处或附近的基因组序列、GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的上游或下游序列(诸如启动子和/或增强子序列、或内含子、5'UTR、和/或3'UTR序列)来实现GA氧化酶基因表达的敲除，如上文针对GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的敲低所描述的。
对于玉米中的GA20氧化酶_3基因的敲除(和可能的敲低)，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围3097-5584、SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围3097-3665、SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围3776-4097、或SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围5315-5584或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围3097-5584、3097-3665、3097-3775、3665-4097、3776-4097、3776-5314、4098-5584或5315-5584、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于玉米中的GA20氧化酶_5基因的敲除(和可能的敲低)，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3001-5473、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3001-3791、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3907-4475、或SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围5198-5473或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3001-5473、3001-3791、3001-3906、3792-4475、3907-4475、3907-5197、4476-5473或5198-5473、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
根据一些实施方案，提供了用于靶向内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的引导RNA，其包含与SEQ ID NO:138-167中的任何一者或多者的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、或至少21个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补的引导序列。
对于利用RNA引导的核酸内切酶在GA20氧化酶_4基因处或附近进行基因编辑，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:38或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:38或其互补序列的12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于通过基因组编辑进行的敲除(和可能的敲低)突变，RNA引导的核酸内切酶可靶向GA20氧化酶_4基因的编码和/或内含子序列，以潜在地消除该基因的功能GA20氧化酶_4蛋白的表达和/或活性。对于玉米中的GA20氧化酶_4基因，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1544-2852、SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1544-1995、SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围2084-2411、或SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围2517-2852或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1544-2852、1544-1995、1544-2083、1996-2411、2084-2411、2084-2516、2412-2852或2517-2852、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于通过基因组编辑进行的敲低(和可能的敲除)突变，RNA引导的核酸内切酶可靶向GA20氧化酶_4基因的上游或下游序列，诸如启动子和/或增强子序列、或内含子、5’UTR、和/或3’UTR序列，以使该基因的一个或多个启动子和/或调节序列突变并影响或降低其表达水平。对于玉米中的GA20氧化酶_3基因的敲低，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1-1416、SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1417-1543、SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1996-2083、SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围2412-2516、SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围2853-3066、或SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围3067-4465或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:38的核苷酸序列范围1-1416、1417-1543、1-1543、1996-2083、2412-2516、2853-3066、3067-4465或2853-4465、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于利用RNA引导的核酸内切酶在GA3氧化酶_1基因处或附近进行基因编辑，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:168或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:168或其互补序列的12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。对于利用RNA引导的核酸内切酶在GA3氧化酶_2基因处或附近进行基因编辑，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:169或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:169或其互补序列的12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。对于利用RNA引导的核酸内切酶在GA3氧化酶_3基因处或附近进行基因编辑，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ IDNO:170或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:170或其互补序列的12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于通过基因组编辑进行的敲除(和可能的敲低)突变，RNA引导的核酸内切酶可靶向GA3氧化酶_1基因的编码和/或内含子序列，以潜在地消除该基因的功能GA3氧化酶_1蛋白的表达和/或活性。对于玉米中的GA3氧化酶_1基因，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:168的核苷酸序列范围3162-4795、SEQ ID NO:168的核苷酸序列范围3162-3646、SEQ ID NO:168的核苷酸序列范围4012-4170、或SEQ ID NO:168的核苷酸序列范围4291-4795或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:168的核苷酸序列范围3162-3646、3162-4011、3647-4170、4012-4170、4012-4290、4171-4795、4291-4795或3162-4795、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于通过基因组编辑进行的敲低(和可能的敲除)突变，RNA引导的核酸内切酶可靶向GA3氧化酶_1基因的上游或下游序列，诸如启动子和/或增强子序列、或内含子、5’UTR、和/或3’UTR序列，以使该基因的一个或多个启动子和/或调节序列突变并影响或降低其表达水平。对于玉米中的GA3氧化酶_1基因的敲低，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:168的核苷酸序列范围1-3161、SEQ ID NO:168的核苷酸序列范围3001-3161、SEQ ID NO:168的核苷酸序列范围3647-4011、SEQ ID NO:168的核苷酸序列范围4171-4290、SEQ ID NO:168的核苷酸序列范围4796-5406、或SEQ ID NO:168的核苷酸序列范围4796-8406或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:168的核苷酸序列范围1-3000、3001-3161、1-3161、3647-4011、4171-4290、4796-5406、5407-8406或4796-8406、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于通过基因组编辑进行的敲除(和可能的敲低)突变，RNA引导的核酸内切酶可靶向GA3氧化酶_2基因的编码和/或内含子序列，以潜在地消除该基因的功能GA3氧化酶_2蛋白的表达和/或活性。对于玉米中的GA3氧化酶_2基因，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:169的核苷酸序列范围3057-4463、SEQ ID NO:169的核苷酸序列范围3057-3550、SEQ ID NO:169的核苷酸序列范围3711-3869、或SEQ ID NO:169的核苷酸序列范围3992-4463或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:169的核苷酸序列范围3057-4463、3057-3550、3057-3710、3551-3869、3711-3869、3711-3991、3870-4463或3992-4463、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于通过基因组编辑进行的敲低(和可能的敲除)突变，RNA引导的核酸内切酶可靶向GA3氧化酶_2基因的上游或下游序列，诸如启动子和/或增强子序列、或内含子、5’UTR、和/或3’UTR序列，以使该基因的一个或多个启动子和/或调节序列突变并影响或降低其表达水平。对于玉米中的GA3氧化酶_2基因的敲低，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:169的核苷酸序列范围1-3056、SEQ ID NO:169的核苷酸序列范围3001-3056、SEQ ID NO:169的核苷酸序列范围3551-3710、SEQ ID NO:169的核苷酸序列范围3870-3991、SEQ ID NO:169的核苷酸序列范围4464-4581、或SEQ ID NO:169的核苷酸序列范围4464-7581或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:169的核苷酸序列范围1-3000、3001-3056、1-3056、3551-3710、3870-3991、4464-4581、4464-7581或4582-7581、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于通过基因组编辑进行的敲除(和可能的敲低)突变，RNA引导的核酸内切酶可靶向GA3氧化酶_3基因的编码和/或内含子序列，以潜在地消除该基因的功能GA3氧化酶_3蛋白的表达和/或活性。对于玉米中的GA3氧化酶_3基因，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:170的核苷酸序列范围3131-4274、SEQ ID NO:170的核苷酸序列范围3131-3483、SEQ ID NO:170的核苷酸序列范围3583-3907、或SEQ ID NO:170的核苷酸序列范围3999-4274或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:170的核苷酸序列范围3131-4274、3131-3483、3131-3582、3484-3907、3583-3907、3583-3998、3908-4274或3999-4274、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
对于通过基因组编辑进行的敲低(和可能的敲除)突变，RNA引导的核酸内切酶可靶向GA3氧化酶_3基因的上游或下游序列，诸如启动子和/或增强子序列、或内含子、5’UTR、和/或3’UTR序列，以使该基因的一个或多个启动子和/或调节序列突变并影响或降低其表达水平。对于玉米中的GA3氧化酶_3基因的敲低，可使用包含引导序列的引导RNA，该引导序列与SEQ ID NO:170的核苷酸序列范围1-3130、SEQ ID NO:170的核苷酸序列范围3001-3130、SEQ ID NO:170的核苷酸序列范围3484-3582、SEQ ID NO:170的核苷酸序列范围3908-3998、SEQ ID NO:170的核苷酸序列范围4275-4332、或SEQ ID NO:170的核苷酸序列范围4275-7332或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:170的核苷酸序列范围1-3000、3001-3130、1-3130、3484-3582、3908-3998、4275-4332、4275-7332或4333-7332、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
除了引导序列之外，引导RNA还可包含一个或多个其他结构或支架序列，其可与RNA引导的核酸内切酶结合或相互作用。此类支架或结构序列还可与其他RNA分子(例如，tracrRNA)相互作用。用于设计使用RNA引导的核酸内切酶在植物基因组内的靶标位点处进行基因组编辑和定点整合的靶向构建体和引导RNA的方法和技术是本领域已知的。
根据一些实施方案，提供了重组DNA构建体和载体，其包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列，该核酸酶诸如锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、RNA引导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶，其中该编码序列可操作地连接到植物可表达启动子。对于RNA引导的核酸内切酶，还提供了重组DNA构建体和载体，其包含编码引导RNA的多核苷酸序列，其中该引导RNA包含足够长度的引导序列，该引导序列与植物基因组内(诸如在靶向GA氧化酶基因处或附近)的靶标位点具有同一性百分比或互补性。根据一些实施方案，编码位点特异性核酸酶或引导RNA的重组DNA构建体和载体的多核苷酸序列可以可操作地连接到植物可表达启动子，诸如诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子等。
根据一些实施方案，重组DNA构建体或载体可包含可通过植物转化技术一起引入至植物细胞中的编码位点特异性核酸酶的第一多核苷酸序列和编码引导RNA的第二多核苷酸序列。另选地，可提供可通过植物转化技术一起或依序引入至植物细胞中的两种重组DNA构建体或载体，包括第一重组DNA构建体或载体和第二DNA构建体或载体，其中所述第一重组DNA构建体或载体包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列，并且所述第二重组DNA构建体或载体包含编码引导RNA的多核苷酸序列。根据一些实施方案，包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体可通过植物转化技术引入至已包含含有编码引导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用含有编码引导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体转化)的植物细胞中。另选地，包含编码引导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体可通过植物转化技术引入至已包含含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体转化)的植物细胞中。根据另外的实施方案，可将包含含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用该重组DNA构建体或载体转化)的第一植物与包含含有编码引导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用该重组DNA构建体或载体转化)的第二植物杂交。此类重组DNA构建体或载体可瞬时转化到植物细胞中或稳定转化或整合到植物细胞的基因组中。
在一方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)对植物细胞提供包含编码位点特异性核酸酶以及任选的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种gRNA的多核苷酸的载体。在一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如不限于粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)对植物细胞提供包含编码Cas9核酸酶以及任选的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种gRNA的多核苷酸的载体。在另一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)对细胞提供包含编码Cpf1以及任选的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种crRNA的多核苷酸的载体。
若干位点特异性核酸酶诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶和TALEN不是RNA引导的，而是依赖于它们的蛋白质结构确定它们的靶标位点以导致DSB或切口，或它们被融合、栓系或连接于DNA结合蛋白结构域或基序。位点特异性核酸酶(或融合/附接/拴系的DNA结合结构域)的蛋白质结构可将位点特异性核酸酶靶向靶标位点。根据这些实施方案中的许多实施方案，非RNA引导的位点特异性核酸酶，诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶和TALEN可根据已知方法设计、工程改造和构建，以靶向并结合玉米或谷类植物的内源GA氧化酶基因(诸如玉米中的GA20氧化酶_3基因或GA20氧化酶_5基因)的基因组基因座处或附近的靶标位点，以在此类基因组基因座处产生DSB或切口，以便通过DSB或切口的修复敲除或敲低GA氧化酶基因的表达。例如，经工程改造的位点特异性核酸酶，诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可被设计成靶向并结合(i)植物基因组内与SEQ ID NO:34内的序列或其互补序列相对应的靶标位点，以在GA20氧化酶_3基因的基因组基因座处产生DSB或切口，(ii)植物基因组内与SEQ ID NO:35内的序列或其互补序列相对应的靶标位点，以在GA20氧化酶_5基因的基因组基因座处产生DSB或切口，(iii)植物基因组内与SEQ ID NO:38内的序列或其互补序列相对应的靶标位点，以在GA20氧化酶_4基因的基因组基因座处产生DSB或切口，(iv)植物基因组内与SEQ ID NO:36和/或168内的序列或其互补序列相对应的靶标位点，以在GA3氧化酶_1基因的基因组基因座处产生DSB或切口，(v)植物基因组内与SEQ ID NO:37和/或169内的序列或其互补序列相对应的靶标位点，以在GA3氧化酶_2基因的基因组基因座处产生DSB或切口，或(vi)植物基因组内与SEQ ID NO:170内的序列或其互补序列相对应的靶标位点，以在GA3氧化酶_3基因的基因组基因座处产生DSB或切口，其接着可导致通过可由供体分子或模板引导的细胞修复机制在DSB或切口的位点处产生序列的突变或插入。
在一方面，本文所述的靶向基因组编辑技术可包括使用重组酶。在一些实施方案中，与DNA识别结构域或基序进行连接等的酪氨酸重组酶可选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一方面，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶可栓系于锌指DNA结合结构域。Flp-FRT定点重组系统可来自从面包酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)获得的2μ质粒。在这个系统中，Flp重组酶(flippase)可使flippase识别靶标(FRT)位点之间的序列重组。FRT位点包含34个核苷酸。Flp可结合FRT位点的“臂”(一个臂处于相反定向)，并且在间插核酸序列的任一末端切割FRT位点。在切割之后，Flp可使两个FRT位点之间的核酸序列重组。Cre-lox是一种源于噬菌体P1的与Flp-FRT重组系统类似的定点重组系统。Cre-lox可用于使核酸序列倒置，缺失核酸序列，或使核酸序列易位。在这个系统中，Cre重组酶可使一对lox核酸序列重组。Lox位点包含34个核苷酸，其中前13个核苷酸和后13个核苷酸(臂)是回文的。在重组期间，Cre重组酶蛋白结合在不同核酸上的两个lox位点，并且在lox位点处进行切割。将切割的核酸剪接在一起(相互易位)并完成重组。在另一方面，本文提供的lox位点是loxP、lox 2272、loxN、lox 511、lox 5171、lox71、lox66、M2、M3、M7或M11位点。
ZFN是由融合于切割结构域(或切割半部结构域)的经工程改造锌指DNA结合结构域组成的合成蛋白质，所述切割结构域可源于限制核酸内切酶(例如FokI)。DNA结合结构域可为典型的(C2H2)或非典型的(例如C3H或C4)。视靶标位点而定，DNA结合结构域可包含一个或多个锌指(例如2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个锌指)。DNA结合结构域中的多个锌指可由一个或多个接头序列分隔。通过修饰锌指DNA结合结构域，ZFN可被设计来切割双链DNA的几乎任何链段。ZFN从由融合于DNA结合结构域的非特异性DNA切割结构域(例如源于FokI核酸酶)组成的单体形成二聚体，所述DNA结合结构域包含被工程改造来结合靶标位点DNA序列的锌指阵列。ZFN的DNA结合结构域可通常由3-4个(或更多个)锌指组成。可改变和定制相对于锌指α螺旋的起点在位置-1、+2、+3和+6处的促进与靶标位点的位点特异性结合的氨基酸以适应特定靶标序列。其他氨基酸可形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的ZFN。用于设计ZFN以靶向和结合特定靶标序列的方法和规则在本领域中是已知的。参见例如美国专利申请第2005/0064474、2009/0117617和2012/0142062号，所述美国专利申请的内容和公开内容通过引用并入本文。FokI核酸酶结构域可需要二聚化来切割DNA，因此，需要两个具有它们的C末端区域的ZFN来结合切割位点的相对DNA链(分隔5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，那么ZFN单体可切割靶标位点。如本文所用的ZFN是广泛的，并且包括可在无来自另一ZFN的辅助下切割双链DNA的单体ZFN。术语ZFN还可用于指代被工程改造来一起在相同位点处起切割DNA的作用的一对ZFN中的一个或两个成员。
在不受任何科学理论限制的情况下，因为可使用各种方法中的一者对锌指结构域的DNA结合特异性进行再工程改造，所以可在理论上构建定制ZFN以靶向几乎任何靶标序列(例如在植物基因组中的GA氧化酶基因处或附近)。可公开获得的用于对锌指结构域进行工程改造的方法包括情形依赖性装配(CoDA)、寡聚库工程改造(OPEN)和模块装配。在一方面，本文提供的方法和/或组合物包括一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN。在另一方面，本文提供的ZFN能够产生靶向DSB或切口。在一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染、或土壤杆菌介导的转化)对细胞提供包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN的多核苷酸的载体。ZFN可以ZFN蛋白形式，以编码ZFN蛋白的多核苷酸形式，以及/或者以蛋白质和编码蛋白质的多核苷酸的组合形式引入。
通常在微生物中鉴定的大范围核酸酶，诸如归巢核酸内切酶的LAGLIDADG家族，是导致对靶标DNA的位点特异性消化的具有高活性和长识别序列(>14bp)的独特酶。天然存在的大范围核酸酶的经工程改造形式通常具有延长的DNA识别序列(例如14至40bp)。根据一些实施方案，大范围核酸酶可包含选自由以下组成的组的骨架或基础酶：I-CreI、I-CeuI、I-MsoI、I-SceI、I-AniI和I-DmoI。相比于ZFN和TALEN，大范围核酸酶的工程改造可更具挑战，因为大范围核酸酶的DNA识别功能和切割功能缠结在单个结构域中。专门化诱变和高通量筛选方法已用于创建识别独特序列，并且具有改善的核酸酶活性的新型大范围核酸酶变体。因此，可选择或工程改造大范围核酸酶以结合植物中的基因组靶标序列，诸如在GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近。在一方面，本文提供的方法和/或组合物包括一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种大范围核酸酶。在另一方面，本文提供的大范围核酸酶能够产生靶向DSB。在一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)对细胞提供包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种大范围核酸酶的多核苷酸的载体。
TALEN是通过将转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域(例如，FokI)融合而产生的人工限制性酶。当一对TALEN的每个成员结合侧接于靶标位点的DNA位点时，FokI单体二聚化，并且在所述靶标位点处导致双链DNA断裂。除野生型FokI切割结构域外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。FokI结构域以二聚体形式起作用，从而需要两个具有适当定向和间隔的具有针对靶基因组中的位点的独特DNA结合结构域的构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基的数目与两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数目两者均是用于实现高活性水平的参数。
TALEN是通过使转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域融合于核酸酶结构域来产生的人工限制酶。在一些方面，核酸酶选自由以下组成的组：PvuII、MutH、TevI、FokI、AlwI、MlyI、SbfI、SdaI、StsI、CleDORF、Clo051和Pept071。当一对TALEN的每个成员结合侧接于靶标位点的DNA位点时，FokI单体二聚化，并且在所述靶标位点处导致双链DNA断裂。如本文所用的术语TALEN是广泛的，并且包括可在无来自另一TALEN的辅助下切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN还指一起在相同位点处起切割DNA的作用的一对TALEN中的一个或两个成员。
转录激活因子样效应物(TALE)可被工程改造来结合实际上任何DNA序列，诸如在植物中的GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近。TALE具有由13-28个具有33-34个氨基酸的重复单体组成的中心DNA结合结构域。除在位置12和13处的高变氨基酸残基之外，每个单体的氨基酸是高度保守的。两个可变氨基酸被称为重复可变二残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可识别连续的DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这个简单关系已允许通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来对特定DNA结合结构域进行工程改造。
除野生型FokI切割结构域外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。FokI结构域以二聚体形式起作用，从而需要两个具有适当定向和间隔的具有针对靶基因组中的位点的独特DNA结合结构域的构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基的数目与两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数目两者均是用于实现高活性水平的参数。PvuII、MutH和TevI切割结构域是用于与TALE一起使用的FokI和FokI变体的有用替代物。当与TALE偶联时，PvuII作为高度特异性切割结构域起作用(参见Yank等人2013.PLoS One.8:e82539)。MutH能够在DNA中引入链特异性切口(参见Gabsalilow等人2013.Nucleic Acids Research.41:e83)。TevI在DNA中在所靶向位点处引入双链断裂(参见Beurdeley等人,2013.Nature Communications.4:1762)。
氨基酸序列与TALE结合结构域的DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。诸如DNA Works的软件程序可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法为本领域技术人员所知。参见Doyle等人,Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等人,Nucleic Acids Research(2011).39:e82；以及tale-nt.cac.cornell.edu/about。在一方面，本文提供的方法和/或组合物包括一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN。在另一方面，本文提供的TALEN能够产生靶向DSB。在一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)对细胞提供包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN的多核苷酸的载体。参见例如美国专利申请号2011/0145940、2011/0301073和2013/0117869，其内容和公开内容以引用方式并入本文。
如本文所用，“靶向基因组编辑技术”是指允许使用位点特异性核酸酶精确和/或靶向编辑植物基因组中的特定位置(即，编辑主要或完全是非随机)的任何方法、方案或技术，该位点特异性核酸酶诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA引导的核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas9系统)、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指产生内源植物基因组核酸序列的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少1000、至少2500、至少5000、至少10,000、或至少25,000个核苷酸的靶向突变、缺失、倒位或取代。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”还涵盖将至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少4000、至少5000、至少10,000、或至少25,000个核苷酸靶向插入或定点整合至植物的内源性基因组中。单数形式的“编辑”或“基因组编辑”是指一个此类靶向突变、缺失、倒位、取代或插入，而“编辑”或“基因组编辑”是指两个或更多个靶向突变、缺失、倒位、取代和/或插入，其中每个“编辑”通过靶向基因组编辑技术引入。
鉴于玉米中GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_5和/或GA3氧化酶_1基因的遏制产生除了其他有益性状之外具有较矮植株高度和节间长度的植物，提出GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因中的一者或多者的表达可通过对这些基因中的一者或多者进行基因组编辑来减少或消除，以为玉米植物提供类似的有益性状。另外鉴于靶向这些GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的遏制构建体的组成型表达产生具有有益的矮高度性状且在穗中没有异型的玉米植物，并且直接在生殖穗组织中表达也不产生生殖异型，提出可编辑这些基因座中的一者或多者以敲低或敲除它们的表达，以便在玉米植物中产生类似的效果。靶向基因编辑方法可用于修饰GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_5、GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因中的一者或多者的启动子和/或调节区的序列，以诸如通过靶向缺失、插入、突变或其他序列改变来敲低或敲除这些一个或多个基因的表达。实际上，GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_5、GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因中的一者或多者的启动子和/或调节区或序列、或5’-UTR、3’UTR和/或内含子序列可被大量缺失或突变。另选地，GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_5、GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因中的一者或多者的编码(外显子)、5-UTR、3’UTR和/或内含子序列的全部或一部分可被编辑、缺失、突变或以其他方式修饰以敲低或敲除这些基因的表达或活性。对GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_5、GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因座的此类靶向修饰可使用本领域已知的任何合适的基因组编辑技术实现，诸如通过由位点特异性核酸酶引入的双链断裂(DSB)或切口的修复，该位点特异性核酸酶例如锌指核酸酶、经工程改造或天然的大范围核酸酶、TALE核酸内切酶、或RNA引导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)。DSB或切口的此类修复可在引入DSB或切口的靶向位点处引入自发或随机的缺失、添加、突变等，或者该位点的修复可涉及使用供体模板分子在靶向位点处指导或引起优选或特异性的缺失、添加、突变等。
如本文所提供的，通包含编码可转录DNA序列(其编码靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子)的转基因的重组DNA分子或转化载体转化的植物可包括多种单子叶植物或谷类植物，诸如玉蜀黍/玉米以及具有分离的雄花和雌花(类似于玉米)并因此可能容易在具有GA途径突变的雌性生殖器官、结构或组织中产生异型的其他单子叶植物或谷类植物。
本发明的组合物和方法还可适用于将受益于降低的植株高度和/或增加的抗倒伏性的其他谷类植物。可根据本文提供的方法和方式用重组DNA分子或构建体转化此类植物以遏制植物中的一种或多种内源GA20和/或GA3氧化酶基因，以产生可较矮和/或抗倒伏的谷类植物。实际上，除了如本文提供的其他改善的产量相关和/或耐旱性性状之外，相对于不具有转基因或可转录DNA序列的野生型或对照植物，异位表达编码靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的谷类植物还可具有多种有益性状，诸如较矮的株型或植株高度、较短的节间长度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性。如下文进一步描述的，已经通过GA途径中的突变进行修饰以具有增加的产量且抵抗倒伏的谷类作物植物，诸如小麦、水稻、粟米、大麦和高粱，可替代地用如本文所提供的重组DNA分子或构建体转化。与在这些作物中可能是隐性的许多GA途径突变不同，在这些作物中表达靶向内源生物合成GA氧化酶基因的遏制元件的转基因构建体可以是显性的，甚至当是半合的或作为单拷贝存在于植物中时。因此，可用表达遏制构建体的重组DNA分子或构建体转化的植物可潜在地包括多种单子叶植物或谷类作物。由于育种和性状整合方面的益处，具有引起半矮化、抗倒伏表型的显性转基因基因座可比相同表型的隐性突变等位基因更有利和优选。
根据本公开的实施方案，进一步提出，其他谷类植物中与在本文显示出当用重组DNA遏制构建体遏制时产生矮小的半矮化表型和其他有益性状的玉米中的GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_5、GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因具有最大的序列同一性/相似性的GA氧化酶基因也可以是遏制的靶标，以产生具有类似的半矮化和/或抗倒伏性表型的转基因谷类植物。表3提供了来自其他谷类植物(高粱—甜高粱(Sorghum bicolor)；水稻—Oryza sativa；粟米—Setaria italica；小麦—普通小麦(Triticum aestivum)；以及大麦—Hordeum vulgare)的GA氧化酶基因的列表，它们与当被遏制时产生矮小的半矮化表型的玉米中的GA氧化酶基因中的一者具有高度序列同一性。
表3.来自其他谷类作物植物的玉米GA氧化酶基因的同源物。
根据本公开的另一方面，提供了一种用于遏制谷类植物中的内源GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因的重组DNA分子、载体或构建体，该重组DNA分子、载体或构建体包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中该非编码RNA分子包含以下序列，该序列(i)与SEQ IDNO:84、85、87、88、89、91、92、93、95、96、98、99、100、102、103、105、106、107、109、110、111、113、114、115、119、120、122、123、124、126、127、128、130、131、132、134、135和/或137中的任何一者或多者的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，和/或(ii)与编码谷类植物中的与SEQ ID NO:86、90、94、97、101、104、108、112、116、118、121、125、129、133和/或136中的任何一者或多者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的蛋白质的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。同样，非编码RNA分子可靶向谷类植物中与在玉米中显示出影响植株高度的GA氧化酶基因具有同一性百分比的内源GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因。因此，还提供了非编码RNA分子，其包含与编码谷类植物中的与SEQ ID NO:9、12、15、30和/或33中的任何一者或多者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的内源蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。如上所提及，非编码RNA分子可靶向GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因的外显子、内含子和/或UTR序列。
还提供了用于将前述构建体、载体、或根据本文所述的方法中的任一种可以本文所述的任何合适的方式(包括不同的堆叠或联合靶向排列)构建的构建体中的任一者引入或转化到谷类植物、植物部分、或植物细胞中的方法，以及由此制备和/或包含任何此类重组DNA分子、载体或构建体的经修饰的谷类植物、植物部分、植物组织和植物细胞。由于由以上构建体表达的非编码RNA分子将被设计成靶向内源GA氧化酶基因，因此用此类重组DNA分子、载体或构建体转化的谷类植物应优选地对应于靶序列来源的物种，或密切相关的物种、株系、种质、品系等。例如，应使用与SEQ ID NO:84互补的遏制构建体转化高粱植物，诸如甜高粱植物，或将预期具有密切相关或类似的GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因序列的可能相关的高粱物种、株系等。
表3还提供了来自谷类植物的以上鉴定基因中的每一者的基因组序列，其可用于靶向那些基因以根据任何已知的技术进行基因组编辑。可如本文所述使用任何位点特异性核酸酶和方法在基因的基因组基因座处或附近产生DSB或切口，其可被不完全修复或通过模板介导的重组在该基因附近或该基因内产生突变等。合适的核酸酶可选自由以下组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、RNA引导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶、转座酶、或它们的任何组合。对于RNA引导的核酸内切酶，提供了一种重组DNA构建体或载体，其包含可用于将核酸酶导向至靶标位点的引导RNA。因此，用于编辑谷类作物中的GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因的引导RNA可包含引导序列，该引导序列与SEQ ID NO:84、85、87、88、89、91、92、93、95、96、98、99、100、102、103、105、106、107、109、110、111、113、114、115、119、120、122、123、124、126、127、128、130、131、132、134、135和/或137中的任何一者或多者的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。对于非RNA引导的位点特异性核酸酶，诸如锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶和/或转座酶，用于编辑的基因组靶特异性是由其蛋白质结构、特别是其DNA结合结构域决定的。此类位点特异性核酸酶可被选择、设计或工程改造以在谷类植物基因组内的任何上述GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因处或附近结合并切割期望的靶标位点。与用遏制构建体转化类似，用特定的引导RNA、或编码引导RNA的重组DNA分子、载体或构建体转化的谷类植物应优选地是其中存在靶向基因组序列的物种，或密切相关的物种、株系、种质、品系等，使得引导RNA能够识别并结合期望的靶切割位点。
还提供了用于可能除了RNA引导的核酸酶之外根据本文所述的方法中的任一种将上述任何引导RNA、或任何构建体、载体或编码此类引导RNA的构建体引入或转化到谷类植物、植物部分或植物细胞中的方法，以及由此制备和/或包含任何此类重组DNA分子、载体或构建体和/或经编辑的GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因的经修饰的谷类植物、植物部分、植物组织和植物细胞。具有经编辑的GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因、和/或靶向GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因的遏制元件的经修饰的谷类植物相对于不具有任何此类编辑或遏制元件的野生型或对照植物可具有本文提供的一个或多个有益性状，诸如较矮的植株高度、较短的节间长度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性和/或耐旱性。除了基因组编辑之外，可通过如本文所述的其他诱变技术引入GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因中的突变
根据本公开的另一方面，提供了转基因植物、植物细胞、种子和植物部分，其包含到其至少一个植物细胞的基因组中的转化事件或插入，其中该转化事件或插入包括包含编码靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA序列、构建体或表达盒，其中该可转录DNA序列可操作地连接到植物可表达启动子，诸如组成型、维管和/或叶启动子。此类转基因植物可通过如上提供的任何合适的转化方法产生，以产生转基因R0植物，然后其可自交或与其他植物杂交以生成R1种子和后续子代以及通过附加杂交产生的种子等。本公开的实施方案还包括包含一种或多种转基因细胞的植物细胞、组织、外植体、植物部分等，这些转基因细胞具有包含编码靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA或多核苷酸序列的一个或多个转化事件或基因组插入。
本公开的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分对于到其至少一个植物细胞的基因组中的用于遏制GA氧化酶基因的可转录DNA序列的转基因事件或插入、或靶向基因组编辑事件可以是纯合的或半合的，并且本发明实施方案的植物、植物细胞、种子和植物部分可含有此类转基因事件、插入和/或编辑的任何数量的拷贝。转基因或可转录DNA序列的表达的剂量或量可通过其接合性和/或拷贝数改变，这可能影响转基因植物中表型变化的程度或限度等。如上所述，本文提供的转基因植物可包括多种单子叶植物或谷类植物，甚至是作物植物，诸如小麦、水稻和高粱，由于先前的育种工作和这些植物中GA途径的突变，它们已经具有增加的产量和/或抗倒伏性。使用转基因或可转录DNA序列表达靶向生物合成GA氧化酶基因的遏制元件的优点不仅包括能够以组织特异性或组织偏好性方式限制表达，而且还包括可转录DNA序列的单个或半合拷贝的潜在优势(例如，显性负效应)，以在作物植物中引起有益的矮小的半矮化性状或表型。因此，本公开的重组DNA分子或构建体可用于仅使用转基因事件、插入或构建体的单拷贝在多种单子叶植物或谷类植物中产生有益性状且没有异型。与先前描述的GA途径中的突变或等位基因是隐性的并且需要植物对于突变等位基因是纯合的不同，用本公开的GA修饰转基因和遏制构建体转化的植物可通过促进杂种谷类植物的产生来改善性状、产量和作物育种工作，因为它们仅需要转基因或遏制构建体的单个或半合拷贝。
根据一些实施方案，包含GA氧化酶转基因或用于遏制内源GA氧化酶基因的可转录DNA序列或基因组编辑的GA氧化酶基因的转基因或经修饰的谷类或玉米植物可进一步表征为具有一个或多个有益性状，诸如相对于野生型或对照植物较矮的株型或半矮化的植株高度、减小的节间长度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、在限水条件下增加的叶片含水量和/或较高的气孔导度、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和/或面积、改善的产量相关性状，包括更大的雌性生殖器官或穗、穗重量、收获指数、产量、种子或籽粒数和/或种子或籽粒重量的增加。此类转基因谷类或玉米植物还可具有增加的胁迫耐受性，诸如增加的耐旱性、氮利用率、和/或对高密度种植的耐受性。
出于本公开的目的，“植物”包括再生或发育的任何阶段的外植体、植物部分、幼苗、小植株或完整植物。如本文所用，“转基因植物”是指其基因组已通过重组DNA分子、构建体或序列的整合或插入而改变的植物。转基因植物包括由最初转化的植物细胞发育或再生的R0植物以及来自R0转基因植物的后代或杂交种中的子代转基因植物。如本文所用，“植物部分”可指植物的任何器官或完整组织，诸如分生组织、嫩枝器官/结构(例如，叶、茎或节)、根、花或花器官/结构(例如，苞片、花萼、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(例如，胚、胚乳和种皮)、果实(例如，成熟子房)、繁殖体、或其他植物组织(例如，维管组织、皮组织、基本组织等)，或它们的任何部分。本公开的植物部分可以是能存活的、不能存活的、可再生的和/或不可再生的。“繁殖体”可包括能够生长成整株植物的任何植物部分。
根据本发明的实施方案，用包含用于遏制内源GA氧化酶基因的可转录DNA序列的构建体或分子或用于GA氧化酶基因的基因组编辑的构建体转化的植物细胞可包括如本领域所理解的能够基于转化方法进行转化的任何植物细胞，诸如分生组织细胞、胚细胞、愈伤组织细胞等。如本文所用，“转基因植物细胞”简单地指用稳定整合的重组DNA分子、构建体或序列转化的任何植物细胞。转基因植物细胞可包括最初转化的植物细胞、再生或发育的R0植物的转基因植物细胞、从另一转基因植物细胞培养的转基因植物细胞、或来自转化的R0植物的任何子代植物或后代的转基因植物细胞，包括植物种子或胚的细胞，或培养的植物细胞、愈伤组织细胞等。
本公开的实施方案还包括用于制备或产生转基因或经修饰的植物的方法，诸如通过转化、基因组编辑、杂交等，其中该方法包括将包含GA氧化酶转基因或用于遏制内源GA氧化酶基因的可转录DNA序列的重组DNA分子、构建体或序列引入植物细胞中，或编辑内源GA氧化酶基因的基因组基因座，以及然后由转化或编辑的植物细胞再生或发育转基因或经修饰的植物，这可在有利于转基因事件的选择压力下进行。此类方法可包括用包含用于遏制内源GA氧化酶基因的可转录DNA序列的重组DNA分子、构建体或序列转化植物细胞，并选择在一个或多个发育阶段具有一个或多个改变的表型或性状的植物，这些性状诸如以下性状中的一者或多者：与野生型或对照植物相比较矮或半矮化的株型或植株高度、一个或多个节间中较短的节间长度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、在限水条件下增加的叶片含水量和/或较高的气孔导度、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和/或面积、改善的产量相关性状(包括更大的雌性生殖器官或穗、穗重量、收获指数、产量、种子或籽粒数和/或种子或籽粒重量的增加)、增加的胁迫耐受性(诸如增加的耐旱性)、增加的氮利用率和/或增加的对高密度种植的耐受性。
根据本公开的另一方面，提供了用于在田间以正常/标准或高密度种植本文提供的经修饰或转基因植物的方法。根据一些实施方案，可通过在田间以更高的密度种植本公开的经修饰或转基因植物来增加每英亩(或每土地面积)的作物植物的产量。如本文所述，表达编码靶向内源GA氧化酶基因进行遏制的非编码RNA分子的可转录DNA序列、或具有基因组编辑的GA氧化酶基因的经修饰或转基因植物可具有降低的植株高度、更短的节间、增加的秆/茎直径和/或增加的抗倒伏性。提出经修饰或转基因植物可耐受高密度种植条件，因为茎直径的增加可抵抗倒伏并且较矮的植株高度可允许在高密度种植条件下增加对下方叶子的光穿透。因此，本文提供的经修饰或转基因植物可以较高的密度种植以增加田间每英亩(或土地面积)的产量。对于行作物，可通过每行长度种植更大数量的种子/植物和/或通过减少行间距来实现更高的密度。
根据一些实施方案，经修饰或转基因作物植物可以比根据标准农艺学实践的作物植物的正常种植密度高至少5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、或250％的田间密度(每土地/田间面积的植物)进行种植。经修饰或转基因作物植物可以每英亩至少38,000株植物、每英亩至少40,000株植物、每英亩至少42,000株植物、每英亩至少44,000株植物、每英亩至少45,000株植物、每英亩至少46,000株植物、每英亩至少48,000株植物、每英亩50,000株植物、每英亩至少52,000株植物、每英亩至少54,000株、或每英亩至少56,000株植物的田间密度进行种植。例如，不同于标准密度范围诸如每英亩约18,000株植物至每英亩约38,000株植物，玉米植物可以更高的密度种植，诸如在以下范围内：每英亩约38,000株植物至每英亩约60,000株植物、或每英亩约40,000株植物至每英亩约58,000株植物、或每英亩约42,000株植物至每英亩约58,000株植物、或每英亩约40,000株植物至每英亩约45,000株植物、或每英亩约45,000株植物至每英亩约50,000株植物、或每英亩约50,000株植物至每英亩约58,000株植物、或每英亩约52,000株植物至每英亩约56,000株植物、或每英亩约38,000株植物、每英亩约42,000株植物、每英亩约46,000株植物、或每英亩约48,000株植物、每英亩约50,000株植物、或每英亩约52,000株植物、或每英亩约54,000株植物。
根据本公开的实施方案，提供了一种或多种经修饰的玉米植物，其包含(i)小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植株高度，和/或(ii)至少18mm、至少18.5mm、至少19mm、至少19.5mm、至少20mm、至少20.5mm、至少21mm、至少21.5mm、或至少22mm的平均茎或秆直径。以不同方式来陈述，提供了一种或多种经修饰的玉米植物，其包含小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植株高度，和/或大于18mm、大于18.5mm、大于19mm、大于19.5mm、大于20mm、大于20.5mm、大于21mm、大于21.5mm、或大于22mm的平均茎或秆直径。以毫米(mm)表示的任何此类植株高度性状或范围可基于已知的换算关系(例如，一英寸等于2.54cm或25.4毫米，并且毫米(mm)、厘米(cm)和米(m)仅相差一个或多个十的次方)来换算成不同的计量单位。因此，本文提供的任何测量结果都进一步以根据已知和确定的换算的任何其他类似测量单位描述。然而，经修饰的玉米植物的精确植株高度和/或茎直径可取决于环境和遗传背景。因此，经修饰的玉米植物的植株高度和/或茎直径的变化可替代地关于相对于对照植物的最小差异或百分比变化来描述。经修饰的玉米植物还可包括至少一个基本上不含雄性生殖组织或结构或其他异型的穗。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米植物，所述经修饰的玉米植物包含在晚期营养和/或生殖发育阶段期间(例如在R3阶段时)在1000mm与1800mm之间、在1000mm与1700mm之间、在1050mm与1700mm之间、在1100mm与1700mm之间、在1150mm与1700mm之间、在1200mm与1700mm之间、在1250mm与1700mm之间、在1300mm与1700mm之间、在1350mm与1700mm之间、在1400mm与1700mm之间、在1450mm与1700mm之间、在1000mm与1500mm之间、在1050mm与1500mm之间、在1100mm与1500mm之间、在1150mm与1500mm之间、在1200mm与1500mm之间、在1250mm与1500mm之间、在1300mm与1500mm之间、在1350mm与1500mm之间、在1400mm与1500mm之间、在1450mm与1500mm之间、在1000mm与1600mm之间、在1100mm与1600mm之间、在1200mm与1600mm之间、在1300mm与1600mm之间、在1350mm与1600mm之间、在1400mm与1600mm之间、在1450mm与1600mm之间、在1000mm与2000mm之间、在1200mm与2000mm之间、在1200mm与1800mm之间、在1300mm与1700mm之间、在1400mm与1700mm之间、在1400mm与1600mm之间、在1400mm与1700mm之间、在1400mm与1800mm之间、在1400mm与1900mm之间、在1400mm与2000mm之间、或在1200mm与2500mm之间的植株高度，和/或在17.5mm与22mm之间、在18mm与22mm之间、在18.5与22mm之间、在19mm与22mm之间、在19.5mm与22mm之间、在20mm与22mm之间、在20.5mm与22mm之间、在21mm与22mm之间、在21.5mm与22mm之间、在17.5mm与21mm之间、在17.5mm与20mm之间、在17.5mm与19mm之间、在17.5mm与18mm之间、在18mm与21mm之间、在18mm与20mm之间、或在18mm与19mm之间的平均茎直径。经修饰的玉米植物可在所述经修饰的玉米植物的一个或多个穗中大致上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米植物，所述经修饰的玉米植物具有(i)相比于野生型或对照植物的高度，小至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％的植株高度，和/或(ii)相比于所述野生型或对照植物的茎直径，大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的茎或秆直径。根据本公开的实施方案，经修饰的玉米植物可具有相比于野生型或对照植物的高度，矮至多20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的降低的植株高度，和/或相比于野生型或对照植物的茎或秆直径，大小于(或不超过)10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的茎或秆直径。例如，经修饰的植物可具有(i)相比于野生型或对照植物，小至少10％、至少15％、或至少20％或更矮(即矮大于或等于10％、15％或20％)，但矮不大于或超过50％的植株高度，和/或(ii)相比于野生型或对照植物，大至少5％、至少10％、或至少15％，但大不超过30％、35％或40％的茎或秆直径。为明晰起见，短语“矮至少20％”和“矮大于或等于20％”将排除例如矮10％。同样地，为明晰起见，短语“矮不大于50％”、“矮至多50％”和“矮不超过50％”将排除矮60％；短语“大至少5％”将排除大2％；并且短语“大不超过30％”和“大至多30％”将排除大40％。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米植物，该经修饰的玉米植物包含相比于野生型或对照植物的高度，小在5％与75％之间、在5％与50％之间、在10％与70％之间、在10％与65％之间、在10％与60％之间、在10％与55％之间、在10％与50％之间、在10％与45％之间、在10％与40％之间、在10％与35％之间、在10％与30％之间、在10％与25％之间、在10％与20％之间、在10％与15％之间、在10％与10％之间、在10％与75％之间、在25％与75％之间、在10％与50％之间、在20％与50％之间、在25％与50％之间、在30％与75％之间、在30％与50％之间、在25％与50％之间、在15％与50％之间、在20％与50％之间、在25％与45％之间、或在30％与45％之间的高度，和/或相比于野生型或对照植物的茎或秆直径，大在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间、在50％与75％之间、在8％与20％之间、或在8％与15％之间的茎或秆直径。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米植物，所述经修饰的玉米植物包含相比于野生型或对照植物的相同或平均节间长度，小至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％的平均节间长度(或相对于穗的位置的负2节间长度和/或负4节间长度)。玉米植物的“负2节间”是指在植物的穗以下第二节间，并且玉米植物的“负4节间”是指在植物的穗以下第四节间。根据许多实施方案，提供了经修饰的玉米植物，所述经修饰的玉米植物具有相比于野生型或对照植物的相同或平均节间长度，小在5％与75％之间、在5％与50％之间、在10％与70％之间、在10％与65％之间、在10％与60％之间、在10％与55％之间、在10％与50％之间、在10％与45％之间、在10％与40％之间、在10％与35％之间、在10％与30％之间、在10％与25％之间、在10％与20％之间、在10％与15％之间、在10％与10％之间、在10％与75％之间、在25％与75％之间、在10％与50％之间、在20％与50％之间、在25％与50％之间、在30％与75％之间、在30％与50％之间、在25％与50％之间、在15％与50％之间、在20％与50％之间、在25％与45％之间、或在30％与45％之间的平均节间长度(或相对于穗的位置的负2节间长度和/或负4节间长度)。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米植物，所述经修饰的玉米植物包含相比于野生型或对照植物的穗重量，大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的穗重量(单独地或平均地)。本文提供的经修饰的玉米植物可包含相比于野生型或对照植物的穗重量，大在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间、或在50％与75％之间的穗重量。
根据本公开的实施方案，提供了具有至少0.57、至少0.58、至少0.59、至少0.60、至少0.61、至少0.62、至少0.63、至少0.64、或至少0.65(或更大)的收获指数的经修饰的玉米或谷类植物。经修饰的玉米植物可具有在0.57与0.65之间、在0.57与0.64之间、在0.57与0.63之间、在0.57与0.62之间、在0.57与0.61之间、在0.57与0.60之间、在0.57与0.59之间、在0.57与0.58之间、在0.58与0.65之间、在0.59与0.65之间、或在0.60与0.65之间的收获指数。经修饰的玉米植物可具有相比于野生型或对照植物的收获指数，大至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％的收获指数。经修饰的玉米植物可具有相比于野生型或对照植物的收获指数，大在1％与45％之间、在1％与40％之间、在1％与35％之间、在1％与30％之间、在1％与25％之间、在1％与20％之间、在1％与15％之间、在1％与14％之间、在1％与13％之间、在1％与12％之间、在1％与11％之间、在1％与10％之间、在1％与9％之间、在1％与8％之间、在1％与7％之间、在1％与6％之间、在1％与5％之间、在1％与4％之间、在1％与3％之间、在1％与2％之间、在5％与15％之间、在5％与20％之间、在5％与30％之间、或在5％与40％之间的收获指数。
根据本公开的实施方案，提供了相对于野生型或对照植物可收获产量增加至少1蒲式耳/英亩、至少2蒲式耳/英亩、至少3蒲式耳/英亩、至少4蒲式耳/英亩、至少5蒲式耳/英亩、至少6蒲式耳/英亩、至少7蒲式耳/英亩、至少8蒲式耳/英亩、至少9蒲式耳/英亩、或至少10蒲式耳/英亩的经修饰的玉米或谷类植物。经修饰的玉米植物的可收获产量的增加可在在1蒲式耳/英亩与10蒲式耳/英亩之间、在1蒲式耳/英亩与8蒲式耳/英亩之间、在2蒲式耳/英亩与8蒲式耳/英亩之间、在2蒲式耳/英亩与6蒲式耳/英亩之间、在2蒲式耳/英亩与5蒲式耳/英亩之间、在2.5蒲式耳/英亩与4.5蒲式耳/英亩之间、或在3蒲式耳/英亩与4蒲式耳/英亩之间。经修饰的玉米植物在可收获产量方面相比于野生型或对照植物的可收获产量可具有至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、或至少25％的增加。经修饰的玉米植物可具有相比于野生型或对照植物的可收获产量，大在1％与25％之间、在1％与20％之间、在1％与15％之间、在1％与14％之间、在1％与13％之间、在1％与12％之间、在1％与11％之间、在1％与10％之间、在1％与9％之间、在1％与8％之间、在1％与7％之间、在1％与6％之间、在1％与5％之间、在1％与4％之间、在1％与3％之间、在1％与2％之间、在5％与15％之间、在5％与20％之间、在5％与25％之间、在2％与10％之间、在2％与9％之间、在2％与8％之间、在2％与7％之间、在2％与6％之间、在2％与5％之间、或在2％与4％之间的可收获产量。
根据本公开的实施方案，提供了具有相比于野生型或对照植物小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的倒伏频率的经修饰的谷类或玉米植物。经修饰的谷类或玉米植物可具有相比于野生型或对照植物，小或低在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间、或在50％与75％之间的倒伏频率。还提供了具有增加的抗倒伏性和降低的倒伏频率的谷类或玉米植物的群体。提供了具有相比于野生型或对照植物的群体小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的倒伏频率的经修饰的谷类或玉米植物的群体。经修饰的玉米植物的群体可包含相比于野生型或对照植物的群体，小或低在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间、或在50％与75％之间的倒伏频率，其可表示为特定数量的植物或相等密度的作物面积的平均值。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米植物，相对于野生型或对照植物，所述经修饰的玉米植物具有显著降低或减小的植株高度(例如2000mm或更小)和显著增加的茎直径(例如18mm或更大)。根据这些实施方案，植株高度的降低或减小以及茎直径的增加可在本文所列举的任何高度、直径或百分比范围内。相对于野生型或对照植物具有降低的植株高度和增加的茎直径的此类经修饰的玉米植物可用编码非编码RNA分子的可转录DNA序列转化，该非编码RNA分子靶向至少一种GA20氧化酶基因和/或至少一种GA3氧化酶基因进行遏制，和/或可在一种或多种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因中包含一个或多个突变或编辑。相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或显著增加的茎直径的经修饰的玉米植物还可具有至少一个基本上不含雄性生殖组织或结构和/或其他异型的穗。相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或增加的茎直径的经修饰的玉米植物可在植物的一种或多种组织诸如植物的一种或多种维管组织和/或叶组织中，相对于野生型或对照植物的相同的一种或多种组织，具有一种或多种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因的降低活性。根据许多实施方案，经修饰的玉米植物可包含至少一种可操作地连接到启动子的编码非编码RNA分子的多核苷酸或可转录DNA序列，所述启动子可为组成型、组织特异性或组织偏好性启动子，其中所述非编码RNA分子靶向至少一种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因以达成如本文提供的阻抑。非编码RNA分子可以是miRNA、siRNA、或miRNA或siRNA前体分子。根据一些实施方案，经修饰的玉米植物对于一种或多种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因中的一个或多个突变或编辑可以是纯合的或杂合的。根据一些实施方案，相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或增加的茎直径的经修饰的玉米植物还可相对于野生型或对照植物具有增加的收获指数和/或增加的抗倒伏性。
相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或显著增加的茎直径的经修饰的玉米或谷类植物可在GA氧化酶基因中包括通过基因编辑技术或其他诱变技术引入的突变(例如，插入、缺失、取代等)，其中GA氧化酶基因的表达在经修饰的植物的一个或多个组织中减少或消除。相对于野生型或对照植物具有降低的植株高度和/或增加的茎直径的此类经修饰的玉米植物还可相对于野生型或对照植物具有增加的收获指数和/或增加的抗倒伏性。此类经修饰的玉米植物可在经修饰的植物的至少一个穗中基本上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构和/或其他异型。植物诱变技术(不包括基因组编辑)可包括化学诱变(即，用化学诱变剂处理，该化学诱变剂诸如叠氮化物、羟胺、亚硝酸、吖啶、核苷酸碱基类似物、或烷化剂—例如，EMS(甲磺酸乙酯)、MNU(N-甲基-N-亚硝基脲)等)、物理诱变(例如，γ射线、X射线、紫外线、离子束、其他形式的辐射等)、以及插入诱变(例如，转座子或T-DNA插入)。可对植物或各种植物部分、植物组织或植物细胞进行诱变。经处理的植物可再生以收集种子或产生子代植物，并且经处理的植物部分、植物组织或植物细胞可发育或再生为植物或其他植物组织。用化学或物理诱变技术生成的突变可包括导致靶基因(诸如GA3或GA20氧化酶基因)的功能或表达丧失的移码、错义或无义突变。
一种用于基因诱变的方法称为“TILLING”(用于靶向诱导基因组中的局部损伤)，其中例如使用诱变剂，诸如EMS处理，在植物细胞或组织中，优选地在植物的种子、生殖组织或种系中产生突变。使所得的植物生长并自体受精，并使用子代制备DNA样品。GA氧化酶基因的核酸序列的PCR扩增和测序可用于鉴定经突变的植物是否在GA氧化酶基因中具有突变。然后可测试在GA氧化酶基因中具有突变的植物的改变的性状，诸如降低的植株高度。另选地，可测试经诱变植物的改变的性状，诸如降低的植株高度，然后可使用GA氧化酶基因的核酸序列的PCR扩增和测序来确定具有改变的性状的植物是否也在GA氧化酶基因中具有突变。参见例如Colbert等人,2001,Plant Physiol 126:480-484；以及McCallum等人,2000,Nature Biotechnology 18:455-457。TILLING可用于鉴定改变基因的表达或由基因编码的蛋白质的活性的突变，其可用于在玉米或谷类植物的GA氧化酶基因中引入和选择靶向突变。
可基于可观察的表型(例如，本文所述的任何表型，诸如较矮的植株高度、增加的茎/秆直径等)，或使用具有可选择标记的选择剂(例如，除草剂等)、可筛选标记、或分子技术(例如，较低的GA水平、较低的GA氧化酶转录物或蛋白质水平、转基因或可转录序列的存在等)筛选和选择已经历诱变或基因组编辑处理的玉米或谷类植物。此类筛选和/或选择技术可用于鉴定和选择在GA氧化酶基因中具有导致期望植物表型的突变的植物。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米或谷类植物的群体，其中该经修饰的玉米或谷类植物的群体具有比野生型或对照植物的群体显著更小的平均植株高度、和/或显著更大的平均茎或秆直径。经修饰的玉米或谷类植物的群体可与单个经修饰的玉米或谷类植物共享祖先和/或具有共同的单个转基因GA氧化酶遏制构建体的插入、事件或编辑。经修饰的玉米植物的群体内的经修饰的玉米植物通常可包括至少一个基本上不含雄性生殖组织或结构和/或其他异型的穗。与野生型或对照植物的群体相比，经修饰的玉米或谷类植物的群体可具有平均或每植物数量或田间面积增加的抗倒伏性。经修饰的玉米或谷类植物的群体可具有相比于对照玉米或谷类植物的群体小(或低)至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％至少80％、至少90％或100％的倒伏频率。经修饰的玉米植物的群体可具有至少0.57或更大的收获指数。
根据本发明的实施方案，提供了经修饰的玉米或谷类植物，其在至少茎和节间组织(诸如茎、节间、叶和/或维管组织)中与野生型或对照植物的相同组织相比具有降低的赤霉素含量(活性形式)。根据许多实施方案，提供了相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或显著增加的茎直径的经修饰的玉米或谷类植物，其中该经修饰的玉米或谷类植物还在一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中相对于野生型或对照植物的一个或多个相同组织具有显著降低或减小的活性赤霉素或活性GA(例如，GA1、GA3、GA4、和/或GA7中的一者或多者)水平。例如，一种或多种活性GA的水平在经修饰的玉米或谷类植物的茎、节间、叶和/或维管组织中相比于在野生型或对照玉米植物的相同组织中可小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。
根据一些实施方案，经修饰的玉米或谷类植物在一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中可包含相比于在野生型或对照玉米植物的一个或多个相同组织中，少(或低)在5％与50％之间、在10％与100％之间、在20％与100％之间、在30％与100％之间、在40％与100％之间、在50％与100％之间、在60％与100％之间、在70％与100％之间、在80％与100％之间、在80％与90％之间、在10％与90％之间、在10％与80％之间、在10％与70％之间、在10％与60％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在50％与100％之间、在20％与90％之间、在20％与80％之间、在20％与70％之间、在20％与60％之间、在20％与50％之间、在20％与40％之间、在20％与40％之间、在20％与30％之间、在30％与90％之间、在30％与80％之间、在30％与70％之间、在30％与60％之间、在30％与50％之间、在30％与40％之间、在40％与90％之间、在40％与80％之间、在40％与70％之间、在40％与60％之间、在40％与50％之间、在50％与90％之间、在50％与80％之间、在50％与70％之间、在50％与60％之间、在60％与90％之间、在60％与80％之间、在60％与70％之间、在70％与90％之间、或在70％与80％之间的活性赤霉素(GA)水平(例如，GA1、GA3、GA4和/或GA7中的一者或多者)。在一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中具有降低的活性赤霉素(GA)水平的经修饰的玉米或谷类植物还可在经修饰的玉米植物的至少一个穗中基本上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构和/或其他异型。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰的玉米或谷类植物，其在经修饰的植物的一种或多种组织(诸如一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织)中与野生型或对照植物的相同组织相比具有显著降低或消除的一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因转录物和/或蛋白质的表达水平和/或活性。根据许多实施方案，提供了一种相对于野生型或对照植物包含显著降低的植株高度和/或显著增加的茎直径的经修饰的玉米或谷类植物，其中该经修饰的玉米或谷类植物在经修饰的植物的一种或多种组织(诸如一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织)中与野生型或对照玉米植物的相同组织相比具有显著降低或消除的一种或多种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因转录物和/或蛋白质的表达水平和/或活性。例如，经修饰的玉米或谷类植物在经修饰的植物的一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中与野生型或对照植物的相同组织相比具有显著降低或消除的GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因转录物和/或蛋白质的表达水平和/或活性，和/或显著降低或消除的GA3氧化酶_1、GA3氧化酶_2和/或GA3氧化酶_3基因转录物和/或蛋白质的表达水平。例如，一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因转录物和/或蛋白质、或一种或多种GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因转录物和/或蛋白质的水平和/或活性在经修饰的玉米植物的一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中相比于在野生型或对照玉米或谷类植物的相同组织中，可小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。
根据一些实施方案，经修饰的玉米或谷类植物在一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中可包含相比于在野生型或对照玉米或谷类植物的一个或多个相同组织中，小或低在5％与50％之间、在10％与100％之间、在20％与100％之间、在30％与100％之间、在40％与100％之间、在50％与100％之间、在60％与100％之间、在70％与100％之间、在80％与100％之间、在80％与90％之间、在10％与90％之间、在10％与80％之间、在10％与70％之间、在10％与60％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在50％与100％之间、在20％与90％之间、在20％与80％之间、在20％与70％之间、在20％与60％之间、在20％与50％之间、在20％与40％之间、在20％与40％之间、在20％与30％之间、在30％与90％之间、在30％与80％之间、在30％与70％之间、在30％与60％之间、在30％与50％之间、在30％与40％之间、在40％与90％之间、在40％与80％之间、在40％与70％之间、在40％与60％之间、在40％与50％之间、在50％与90％之间、在50％与80％之间、在50％与70％之间、在50％与60％之间、在60％与90％之间、在60％与80％之间、在60％与70％之间、在70％与90％之间、或在70％与80％之间的一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因转录物和/或蛋白质、或一种或多种GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因转录物和/或蛋白质的水平和/或活性。在一种或多种组织中具有降低或消除的至少一种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因的表达水平和/或活性的经修饰的玉米或谷类植物还可在经修饰的玉米植物的至少一个穗中基本上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构和/或其他异型。
根据一些实施方案，提供了包括减少或消除至少一种GA20氧化酶基因和/或至少一种GA3氧化酶基因在作物植物(诸如作物植物的一个或多个茎、节间、维管和/或叶组织)中的表达的方法，其中与野生型或对照植物相比，该至少一种GA20氧化酶基因和/或该至少一种GA3氧化酶基因的表达在植物的至少一个生殖组织中没有显著改变或变化，以及/或者其中一种或多种活性GA的水平在植物的至少一个生殖组织中没有显著改变或变化。根据许多实施方案，利用重组DNA构建体减少或消除至少一种GA20氧化酶或GA3氧化酶基因在经修饰的植物的至少一个组织中的表达水平，该重组DNA构建体包含编码GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的遏制元件的可转录DNA序列(诸如至少一种成熟miRNA或被加工为成熟miRNA的miRNA前体)，其中miRNA能够降低或遏制该至少一种GA20氧化酶或GA3氧化酶基因的表达水平，并且其中该可转录DNA序列可操作地连接到组成型、组织特异性或组织偏好性启动子。
提供了用于针对靶向编辑、突变或转基因的存在对细胞或植物等进行筛选和/或鉴定，并且选择包含靶向编辑、突变或转基因的细胞或植物的方法和技术，这可基于一种或多种表型或形状，或基于细胞或植物中存在或不存在分子标记或多核苷酸或蛋白质序列。可使用本领域已知的技术分离和检测核酸。例如，可使用但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链反应(PCR)分离和检测核酸。一般性PCR技术例如描述于PCR Primer:A LaboratoryManual,Dieffenbach和Dveksler编,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995中。重组核酸技术包括例如限制酶消化和连接，其可用于分离核酸。分离的核酸还可以单一核酸分子形式或以一系列寡核苷酸形式化学合成。可通过已知方法诸如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟磷灰石色谱法从天然来源(例如生物样品)纯化多肽。还可例如通过在表达载体中表达核酸来纯化多肽。此外，可通过化学合成获得纯化的多肽。可使用任何适当方法例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析测量多肽的纯度。本领域中已知的任何方法都可用于筛选和/或鉴定在它的基因组中具有转基因或基因组编辑的细胞、植物等，此可基于任何适合形式的目视观察、选择、分子技术等。
在一些实施方案中，提供了用于检测植物细胞中的重组核酸和/或多肽的方法。例如，可如本领域中所知使用杂交探针或通过采用引物使用PCR产生扩增子来检测核酸。核酸之间的杂交讨论于Sambrook等人(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)中。可使用抗体检测多肽。用于使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀、免疫荧光等。本文提供的抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。可使用本领域中已知的方法产生对本文提供的多肽具有特异性结合亲和力的抗体。可使用本领域中已知的方法使抗体或杂交探针连接于固体载体，诸如管、板或孔。
可使用可与杂交探针或抗体连接或缔合的可检测标记实现检测(例如对扩增产物、杂交复合物、多肽的检测)。术语“标记”意图涵盖对直接标记以及间接标记的使用。可检测标记包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。
经修饰、经编辑或转基因的植物或植物细胞的筛选和选择可通过分子生物学领域的技术人员已知的任何方法进行。筛选和选择方法的实例包括但不限于Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、RNA酶保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、Sanger测序、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的新一代测序技术(例如，Ion TorrentTM等)酶促测定、以及用于检测多肽的蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定。其他技术诸如原位杂交、酶染色和免疫染色也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于执行所有参考技术的方法在本领域中是已知的。
实施例
实施例1.GA20氧化酶遏制元件的跨转化事件的近交玉米品系中降低的植株高度。
利用具有包含可转录DNA序列的表达构建体的转化载体经由土壤杆菌介导的转化对近交玉米植物系进行转化，该可转录DNA序列具有在已知引起在植物的维管组织中的表达的水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子(SEQ ID NO:65)的控制下编码miRNA的靶向序列(SEQ ID NO:40)的序列(SEQ ID NO:39)。由该构建体编码的miRNA包含靶向玉米植物中的GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因进行遏制的RNA序列。利用该构建体生成若干转化事件，并且在温室中对这些转化体进行测试以确定它们相对于非转基因野生型对照植物是否具有降低的植株高度。如在图1中可见，相对于野生型(WT)对照植物，跨若干转化事件(参见事件1-8)在表达遏制构建体的转基因植物中一致地观察到植株高度的显著降低。将每个转化事件的植株高度计算为每个事件的大约10株植物的平均值，并与对照植物的平均高度进行比较。计算每个事件和对照植物的标准误差，其在图1中表示为误差条。此外，这些转化体中的每一者的穗发育似乎是正常的。
从该实验的结果可以看出，表达靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因进行遏制的miRNA的植物中的平均植株高度跨多个事件相对于对照植物一致地降低了高达35％的植株高度。该数据支持这样的结论：利用该遏制构建体观察到的效果不是由于在植物基因组内的任何一个基因座处插入构建体。
该数据进一步表明，使用RTBV维管启动子表达该GA20氧化酶遏制构建体在引起这些植株高度表型方面是有效的。此外，在不同组成型启动子的控制下组成型地表达相同GA20氧化酶遏制构建体的R0玉米植物中的早期数据也产生矮小植物(参见以下实施例15)。因此，鉴于包括维管和组成型表达的不同表达模式提供类似的植株高度表型且在穗中没有明显的异型，靶向GA20氧化酶遏制构建体的表达可有效降低植株高度并提供本文所述的其他有益的抗倒伏和产量相关性状。
实施例2.表达GA20氧化酶遏制元件的杂种玉米植物中降低的植株高度。
携带实施例1中所述的GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物当在田间条件下生长时也显示出相对于野生型对照植物降低的植株高度。计算10个微地块中表达GA20氧化酶遏制元件的转基因杂种玉米植物的平均植株高度，并与32个微地块中(非转基因)野生型对照杂种玉米植物的平均植株高度进行比较。转基因和非转基因对照的每个微地块包括大约6株植物，但每块地的实际植物数量可根据发芽并发育成具有穗的植物的植物数量而变化。如在图2A中可见，相对于野生型杂种玉米植物(对照)，在表达遏制构建体的转基因杂种植物(SUP-GA20ox杂种)中观察到平均植株高度的显著降低。计算转基因杂种和对照植物的标准误差，其在图2A中表示为误差条。图2B中进一步示出了表达GA20氧化酶遏制元件的转基因杂种植物(右)旁边的杂种对照植物(左)的图像。
在该实验中，相对于野生型杂种对照植物，表达靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的miRNA的田间生长的杂种玉米植物的平均植株高度降低约40％。该数据显示，除了近交系之外，杂种玉米植物中也存在植株高度表型。然而，与对照相比，该实验中的总体生物量在半矮化玉米植物中似乎是无变动的。
实施例3.表达GA20氧化酶遏制元件的杂种玉米植物中增加的茎直径。
携带实施例1中所述的GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物当在田间条件下生长时也显示出相对于野生型对照植物增加的茎直径。在初生穗下方的第二节间上测量茎直径。计算8个微地块中表达GA20氧化酶遏制元件的转基因杂种玉米植物的平均茎直径，并与8个微地块中(非转基因)野生型对照杂种玉米植物的平均茎直径进行比较。每个微地块包括大约6株植物。如在图3A中可见，相对于野生型杂种玉米植物(对照)，在表达遏制构建体的转基因杂种植物(SUP-GA20ox杂种)中观察到平均茎直径的显著增加。计算转基因杂种和对照植物的标准误差，其在图3A中表示为误差条。在来自表达GA20氧化酶遏制元件的转基因杂种植物的秆的横截面(SUP_GA20ox；右)旁边示出的来自杂种对照植物的秆的横截面(对照；左)的图像在图3B中进一步示出。
在该实验中，相对于野生型杂种对照植物，表达靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的miRNA的田间生长的杂种玉米植物的平均茎直径增加约13％。该数据显示，表达GA20氧化酶miRNA的杂种玉米植物除了降低的植株高度表型之外还可具有较粗的秆。
实施例4.表达GA20氧化酶遏制元件的杂种玉米植物具有鲜穗重量的增加。
携带实施例1中所述的GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物当在田间条件下生长时也显示出相对于野生型对照植物鲜穗重量的增加。计算24个微地块中表达GA20氧化酶遏制元件的转基因杂种玉米植物的每块地平均鲜穗重量，并与8个微地块中(非转基因)杂种玉米对照植物的平均鲜穗重量进行比较。同样，每个微地块包括约6株植物。如在图4中可见，相对于野生型杂种玉米植物(对照)，在表达遏制构建体的转基因杂种植物(SUP-GA20ox杂种)中观察到每块地平均鲜穗重量的增加，并且穗和籽粒发育似乎是正常的。对于转基因杂种和对照植物计算该实验的标准偏差，其在图4中表示为误差条。如图5所示，在另一个也经历了风害的田间测试场地也获得了类似的结果。
在该实验中，相对于野生型杂种对照植物，表达靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的miRNA的田间生长的杂种玉米植物的平均鲜穗重量增加，表明这些转基因植物还可具有改善的产量相关性状。然而，这些结果是基于观测数据而没有与对照进行大规模统计比较，并且应在广亩条件下测试产量表现。
实施例5.表达GA20氧化酶遏制元件的杂种玉米植物表现出增加的抗倒伏性。
在田间测试位置处，相对于野生型杂种对照植物，对开花前杂种玉米植物的风害证明实施例1中所述的表达GA20氧化酶遏制构建体的植物的抗倒伏性增加。虽然野生型(非转基因)杂种对照植物响应于该大风事件而在视觉上倒伏，但邻近田间位置中的表达GA20氧化酶遏制元件的转基因杂种玉米植物抵抗倒伏损害。为了评价表达GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物的抗倒伏性的效果，将经历倒伏损害的跨两个田间试验位置的转基因GA20氧化酶遏制性杂种玉米植物的每块地的平均鲜穗重量与野生型杂种对照植物的平均鲜穗重量进行比较。从这两个试验中收集的数据表明，相对于表达GA20氧化酶遏制构建体的杂种植物，杂种对照植物的平均鲜穗重量在两个试验中分别降低约57％和81％。
视觉观察到转基因GA20氧化酶遏制性杂种玉米植物比非转基因对照植物具有增加的抗倒伏性，并且在这些试验中转基因GA20氧化酶遏制性植物的平均鲜穗重量增加，表明增加的抗倒伏性可转化为平均鲜穗重量的增加。因此，GA20氧化酶遏制性植物中增加的抗倒伏性可通过抵抗恶劣天气事件期间倒伏的效果而进一步增加这些转基因玉米植物的产量潜力/稳定性。
实施例6.表达GA20氧化酶遏制元件的杂种玉米植物具有收获指数的增加。
携带实施例1中所述的GA20氧化酶遏制构建体的杂种玉米植物当在田间条件下生长时相对于野生型对照植物进一步显示出收获指数的增加。表达GA20氧化酶遏制元件的转基因杂种玉米植物的收获指数由在8个微地块中生长的植物确定，并与非转基因杂种玉米对照植物进行比较。每个微地块包括大约6株植物。如在图6中可见，相对于野生型杂种玉米植物(对照)，在表达遏制构建体的转基因杂种植物(SUP-GA20ox杂种)中观察到收获指数的显著增加。计算转基因杂种和对照植物的标准误差，其在图6中表示为误差条。
在该实验中，相对于野生型杂种对照植物，表达靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的miRNA的田间生长的杂种玉米植物的收获指数增加约11％。与野生型对照植物相比，收获指数的这种增加进一步与秸秆重量的减少相关联，但在转基因植物中未观察到总干生物量重量的差异。
实施例7.表达GA20氧化酶遏制元件的杂种玉米植物具有平均谷粒产量估计值的增加。
表达GA20氧化酶遏制元件的杂种玉米植物(在实施例1中鉴定)的平均谷粒产量估计值由田间的16个微地块计算(每块地大约6株植物)。这些遏制GA20氧化酶的转基因杂种玉米植物的计算平均谷粒产量估计值比玉米杂种对照植物增加约15％(图7)。谷粒产量估计值是基于穗性状度量提供预期产量的一般估计的度量。谷粒产量估计值得自小块地上手工收获的穗，并且单位为kg/ha(而不是bu/ac)。通过下式(每单位面积的籽粒数(籽粒/m2)x单个籽粒重量(mg)x 15.5％/100)来计算谷粒产量估计值(kg/ha)。
实施例8.表达GA20氧化酶遏制元件的杂种玉米植物具有平均多产性得分的增加。
与非转基因杂种对照植物相比，表达GA20氧化酶遏制元件(在实施例1中鉴定)的杂种玉米植物在微地块实验中也显示出具有增加的多产性和次生穗。从田间转基因杂种玉米植物的10个微地块确定多产性得分(每块地大约6株植物)。如图8所示，遏制GA 20氧化酶的转基因杂种玉米植物的平均多产性得分为3，而对照植物的平均多产性得分为1。为了确定多产性得分，测定植物在R1发育阶段的次生穗发育。将植物按以下等级评级：1＝很少或没有次生穗形成；2＝次生穗上主要是丝；3＝从穗叶鞘中出现发育的次生穗；以及4＝类似于初生穗的良好次生穗发育。季末收获进一步表明，至少一些次生穗能够产生正常发育的籽粒。
实施例9.用利用GA20氧化酶遏制构建体转化的杂种玉米植物进行的田间广亩产量和性状试验。
将实施例1中所述的GA20氧化酶遏制构建体转化到雌性商业玉米近交系中，并产生多个转化事件。使转化植物生长并自交以累积足够的种子，然后与各种雄性商业玉米近交系杂交以产生杂种玉米植物。用于产生雄-雌杂种的每种不同的雄性近交系被称为测试种。然后根据标准农艺学实践(SAP)，使具有不同测试种的杂种玉米植物在田间广亩生长。SAP的种植密度为每英亩34,000株植物，行间距为30”。
对于产量试验，将表达GA20氧化酶遏制构建体的四个不同的转化事件与2个不同的商业测试种品系杂交。然后在跨6个美国中西部州的16个地理位置中测试杂种玉米植物。计算这些位置之间的转基因杂种玉米植物的产量，并与非转基因杂种玉米对照植物的产量进行比较。表4提供了与非转基因对照相比，每个事件的转基因杂种玉米植物之间的产量差异(蒲式耳/英亩)。负数指示产量降低。统计p值小于0.2的产量差异在表4中用粗斜字体表示。除非另外指明，否则该符号也用于表示这些实施例中其余表格的统计显著性。如在表4中在SAP标题下所示，相对于野生型杂种玉米植物(对照)，在SAP条件下在表达遏制构建体的转基因杂种玉米植物(转基因植物)中观察到产量的显著增加。在4个转基因事件和2个测试种品系之间观察到产量的显著增加。
在高密度(HD)种植条件下以每英亩42,000株植物和30”行间距进行相当的广亩产量试验，并与标准农艺学实践(SAP)密度进行比较。HD条件下的产量差异在表4中在HD标题下提供。在这些高密度条件下获得混杂结果，其中产量跨事件和测试种而变化。然而，针对两个事件用两个测试种之一观察到产量的增加，并且在不同的高密度条件下，在更多数量的种质之间保持更高产量的可能性。
表4.在SAP和HD下，转基因植物与对照之间的广亩产量差异
还在田间进行了性状试验，以测量多个发育和生殖性状。这些试验在如上所述的正常密度(SAP)和行间距为20”的每英亩54,000株植物的超高密度(UHD)种植条件下进行。利用7个转化事件和3个测试种在杂种玉米植物中进行试验，并且汇集7个事件中每个测试种的数据。
表5汇总了杂种玉米植物的性状试验结果。测量结果是转基因植物与对照之间的百分比差异、或天数或叶数量的差异。在适当的情况下，进行测量的发育阶段，诸如R3等，在“性状名称”栏中以括号表示。花粉散落是关于从萌发到50％的植物散落花粉的天数测量的。吐丝出苗是关于从萌发到50％的植物吐丝的天数测量的。花粉-花丝间隔是从50％的植物散落花粉到吐丝的天数的量度。秆强度是使用秆破碎仪器使秆段横向断裂的力的量的量度。叶面积指数(LAI)是表征植物冠层的范围的无量纲量，定义为阔叶冠层空间内每单位地面面积的单侧绿叶面积。
表5.在SAP和UHD下转基因植物与对照植物之间的性状差异。
如表5所示，相对于对照，在转基因植物中观察到植株高度、穗高度和节间长度的显著降低。转基因植物一致地表现出低于6英尺的植株高度以及高于18英寸的穗高度，从而允许在不改进机械的情况下进行联合收获。在该实验中，观察到增加的秆直径，特别是在较高密度种植条件下。
表6汇总了针对杂种玉米的穗性状试验结果。利用7个转化事件和3个测试种在杂种玉米植物中进行试验，并且汇集7个事件中每个测试种的数据。测量结果是转基因植物与对照之间的百分比Δ差异。在适当的情况下，进行测量的发育阶段，诸如R3等，在“性状名称”栏中以括号表示。穗面积是关于通过对穗(包括籽粒和空隙)成像所获得的二维视图得到的面积的穗的地块平均尺寸的量度。穗直径是作为穗在其最宽截面上的最大“宽”轴测量的穗直径的地块平均值的量度。穗长度是从穗的尖端沿直线到穗节的基部测量的穗长度的地块平均值的量度。穗尖端空隙_pct是从通过对穗(包括籽粒和空隙)成像所获得的二维视图得到的在穗的顶部30％面积处空隙的面积百分比的地块平均值的量度。穗空隙是从通过对穗(包括籽粒和空隙)成像所测量的二维视图得到的穗上空隙的面积百分比的地块平均值的量度。谷粒产量估计值在实施例7中定义。每单位面积的籽粒被测量为每单位面积田间的籽粒数的地块平均值。从设定的行长度(通常为一米)中收集穗，脱壳并合并以对籽粒计数，并且然后将计数转化为每单位面积田间的总籽粒。单个籽粒重量是每个籽粒的重量的地块平均值的量度。它被计算为(调节至15.5％湿度的样品籽粒重量)/(样品籽粒数)的比率。每个穗的籽粒是每个穗的籽粒数的地块平均值的量度。它被计算为(总籽粒重量/(单个籽粒重量*总穗计数)，其中总籽粒重量和总穗计数是由在0.19至10平方米之间的面积上的穗样品测量的。
表6.在SAP和UHD下转基因植物与对照植物之间的穗性状差异。
如表6所示，与对照相比，在这些实验中观察到转基因植物的穗面积和穗长度的显著增加。穗直径也存在明显减小。在该实验中，谷粒产量估计值在转基因植物与对照之间大多是无变动的。
跨与一个测试种杂交的8个事件在田间以标准密度收集到附加数据，其示出与对照相比植株高度、穗高度和节间长度的减小、以及茎直径和收获指数的增加(数据未示出)。植株高度在R3阶段从地面到最上方的舌状叶进行测量。穗高度在R3阶段从地面到穗节进行测量。除非另外指明，否则秆直径在穗下方的秆节间2节的中间进行测量。这些数据证明了植株高度和秆性状跨事件的高外显率，但是在这些研究中多产性(或次生穗的数量)的增加不显著或不明显。
在单独的实验中，从V11至R1阶段和之后测量植株高度生长。图9示出在该时间范围内转基因植物与对照之间的植株高度差异。图上绘制了5英尺和6英尺高度的虚线用于参考。
实施例10.转基因植物在受控环境条件中在氮和水胁迫条件下表现出增强的性状。
该实施例例示了在自动温室(AGH)或所指示的田间中，具有实施例1中所述的GA20氧化酶遏制构建体的转基因玉米植物相对于对照的增强的水和氮胁迫响应。用于AGH中植物的自动表型测定的设备和方法公开于例如美国专利公开号2011/0135161，其全文以引用方式并入本文。
在AGH环境中，在五种不同的条件(包括非胁迫、轻度和中度氮亏缺、以及轻度和中度水亏缺胁迫条件)下对玉米植物进行测试。玉米植物在表7所示的胁迫特异性条件下生长。
表7.五种AGH生长条件的描述。
水亏缺被定义为比未受胁迫的植物的VWC低的特定体积含水量(VWC)。例如，未受胁迫的植物可维持在50％ VWC，并且用于水亏缺测定的VWC可限定在35％至40％ VWC之间。使用可见光和高光谱成像以及在每日基础上直接测量盆重和施加到个体植物的水和营养物的量来收集数据。氮亏缺被(部分地)定义为低于未受胁迫的植物的氮浓度的氮的特定mM浓度。例如，未受胁迫的植物可维持在8mM氮下，而在氮亏缺测定中施加的氮浓度可维持在介于4mM至6mM之间的浓度下。
每个筛选最多测量十个参数。基于可见光颜色成像的测量结果是：植株高度、生物量和冠层面积。植株高度(PlntH)是指从侧面图像得出的从盆的顶部到植物的最高点的距离(mm)。生物量(Bmass)被定义为在从多个视角获取的图像中获得的植物的芽鲜重估计值(g)。冠层面积(Cnop)被定义为如在自上而下的图像中看到的叶面积(mm2)。花青素得分和面积、叶绿素得分和浓度以及含水量得分用高光谱成像测量。花青素得分(AntS)是从自上而下的高光谱图像中获得的叶冠中花青素的估计值。花青素面积(AntA)是从侧视高光谱图像中获得的茎中花青素的估计值。叶绿素得分(ClrpS)和叶绿素浓度(ClrpC)都是从自上而下的高光谱图像获得的叶冠层中叶绿素的度量值，其中叶绿素得分以相对单位度量，并且叶绿素浓度以百万分率(ppm)单位度量。叶片含水量(FlrWtrCt)是从自上而下的高光谱图像获得的叶冠中的水的测量结果。水利用效率(WUE)源自每升添加的水中植物生物量的克数。施加的水(WtrAp)是在实验过程中添加到盆(没有孔的盆)中的水的直接测量结果。建立这些生理学试验，以便将所测试的转基因植物与对照进行比较。与对照相比，测量两个转化事件的转基因植物。所有数据均为转基因植物相对于对照的百分比Δ差异。统计p值<0.1的数据点以粗斜体示出。其他数据点的p值>0.1。
表8汇总了在营养阶段在种植后21天测量的AGH性状试验结果，而表9汇总了在生殖阶段在种植后55天测量的AGH性状试验结果，所有这些都是相对于对照植物在具有实施例1中所述的GA20氧化酶遏制构建体的两个事件之一的转基因植物中进行的。
表8.在正常和胁迫条件下在种植后21天温室中的转基因植物相对于对照植物。
表9.在正常和胁迫条件下在种植后55天温室中的转基因植物相对于对照植物。
如表8所示，与对照相比，转基因植物表现出与胁迫抗性相关的一些增强性状，并且在胁迫条件下维持其他阳性性状。在所有处理中植株高度显著降低，并且不受胁迫条件的影响。生物量和冠层面积在无胁迫条件下是无变动的，但在更严重的胁迫条件下增加。叶片含水量在无胁迫和胁迫条件下显著增加，表明转基因植物在叶组织中保留了更多的水。花青素面积在无胁迫和胁迫条件下显著减小，表明转基因植物中没有氮缺乏。
如表9所示，与对照相比，转基因植物表现出施加的水、WUE、生物量和秸秆重量的性状面积的显著减少，表明转基因植物具有改善的水利用效率，其中较低生物量的植物需要较少的水。在非胁迫和胁迫条件下收获指数显著增加。
实施例11.标准和高密度的田间转基因植物在生殖阶段表现出增加的耐旱性、气孔导度和根下扎速度。
与对照植物相比，直接观察在田间干旱条件下具有来自实施例1的GA20氧化酶遏制构建体的转基因玉米植物中减少的叶卷曲。当叶水势下降到大约-1.1MPa的阈值以下时发生玉米叶卷曲。在水胁迫下气孔导度也降低。稳定氧同位素比率(δ18O)用作气孔导度的指数，其与气孔导度成反比。从在R5阶段收集的穗叶样品中观察到相比于对照，转基因植物中的δ18O显著降低，以及因此气孔导度的显著增加(参见图10)。数据获自跨两个转化事件的转基因植物，并跨10个测试种求平均，其中每个测试种重复2次。对照植物叶中增加的δ18O表明对照的气孔导度较低。结合在田间观察到的减少的叶卷曲，来自16个田间位置中的15个田间位置处的产量试验的转基因植物的叶中气孔导度的显著增加表明在转基因植物的后期营养生长期间改善的叶水分状态。
根的有效吸水是植物生长的重要因素。为了测量生根深度的发育进展，将SOLO土壤水分电容探针在V4阶段安装在一个田间位置的植物之间的行内。用电容传感器在距离地面10cm、20cm、30cm、50cm、70cm、90cm、120cm和150cm的深度处每小时测量土壤水分。由传感器记录的土壤水分耗尽的日间模式的存在推断生根下扎的深度。在V4阶段安装时，在10cm、20cm和30cm深度处已存在根活力。我们在50cm、70cm和90cm深度处检测到首次出现土壤水分耗尽。120cm和150cm深度处的土壤在整个生长季节是饱和的。虽然根生长可能已经达到这些深度，但由于不能检测饱和区中的土壤水分耗尽，我们无法在这些实验中检测这些深度处的根活力。图11示出了植物的前根到达Y轴上的各种深度的时间(种植后的天数)。带圆圈的线针对行间距为30英寸且种植密度为每英亩34,000株植物的植物，并且带正方形的线针对行间距为20英寸且种植密度为每英亩55,000株植物的植物。生长阶段在X轴上示出。
如图11所示，在该实验中，最多到V12转基因植物与对照植物之间的根生长相似，其中根分别在种植后约30天和36天达到50cm和70cm深度。然而，转基因植物根在R1处或之前(即，在种植后约第50天)达到90cm深度，或比对照植物根早约20天。转基因植物在V11/V12阶段后表现出增加的生根下扎速度，这可能导致在开花前后植物发育的关键时期更好避免干旱。生根下扎速度的这种增加可允许转基因植物在R1阶段前后的关键时期期间利用更深的土壤水分储备，从而可能允许避免、降低或最小化干旱对开花和授粉的影响。干旱条件下改善的授粉可能提高结实率和产量潜力。
为了补充以上利用水分传感器的田间实验，在根盒实验中测量具有来自实施例1的GA20氧化酶遏制构建体的转基因玉米植物(n＝10)的根下扎速度，并与野生型对照植物(n＝9)进行比较。树脂玻璃根盒(5英尺高且横截面为6x8英寸；1/2英寸壁厚)用#10田间土壤/蛭石/珍珠岩(1:1:1比率)的混合物填充并用于每株植物的根可视化。在种植后定期间隔(大约每两天)测量每个盒中的最大生根深度。在该实验中，从种植后约21天开始(即，在约V4阶段)并且持续直到种植后至少34天当测量停止时，转基因植物的中值根下扎深度一致地比WT对照植物更大或更深(数据未示出)。在受控环境根盒中的这种观察与在田间利用水分传感器观察到的根深度增加一致，并且表明在早期发育阶段可发生较深的根，尽管在田间实验中直到V11/V12阶段之后都未检测到根深度的差异。
尽管在以下实施例14中描述的受控环境实验中测量的根性状通常未显示出根深度的显著差异(或仅最小差异)，但实施例14中的蛭石实验是在该实施例11中的根盒实验中观察到根深度差异之前的V3阶段进行的(即，在V4阶段前后开始)，并且尽管实施例14中的气培设备实验在V5阶段进行，但气培系统不具有任何可能影响正常(或更自然)的根生长和发育的植物-土壤相互作用(与蛭石实验不同)。
实施例12.转基因植物在正常和干旱条件下具有较高的气孔导度并在干旱胁迫下维持较高的光合作用能力。
还在温室中测量了正常和干旱条件下叶中的气孔导度和光合作用水平。对于该实验，对具有来自实施例1的GA20氧化酶遏制构建体的转基因植物和野生型对照植物进行充分浇水(每天1500ml水)或有限水/慢性干旱(每天1000ml水)处理。对野生型对照植物的二十(20)个重复和GA20氧化酶遏制构建体的每个事件(总共两个事件)十个(10)重复进行充分浇水处理，并且对野生型对照植物的一百四十(140)个重复和GA20氧化酶遏制构建体的每个事件(总共两个事件)七十个(70)重复进行有限水/慢性干旱处理。将适当高度的边护植物(用于WT植物的杂种和用于转基因植物的近交种)放置在温室中的实验植物的周边，以使遮光效应正常化。根据制造商的说明，在V12阶段使用LI-装置在早上和下午进行日间气孔导度和光合作用测量。如图12A所示，在两个每日时间点，在充分浇水和干旱条件两者下，发现转基因植物的气孔导度一致地较高。还观察到转基因植物在干旱条件下具有较少的叶卷曲。如图12B进一步所示，与在下午特别是在干旱条件下显示出光合作用速率下降的对照植物不同，还观察到响应于干旱条件的更高的光合作用速率，其对下午增加的日照没有显著响应。
这些结果(结合以上单独的田间观察)证明，具有GA20氧化酶遏制构建体的转基因植物不仅在叶中具有更高的气体交换和光合作用，而且还响应于水限制/慢性干旱条件而在叶中维持更高的气体交换和光合作用。还观察到，转基因植物具有比对照植物更低的叶温度(数据未示出)。因此，预测表达GA20氧化酶遏制构建体的转基因植物与对照相比可具有更大的耐旱性和在水限制条件下维持光合作用的能力。不受理论的束缚，进一步提出，对于具有GA20氧化酶遏制构建体的转基因植物(特别是在后期营养阶段和早期生殖阶段)观察到的较深的根可能有助于这些转基因植物的耐旱性。
实施例13.转基因植物在温室条件中表现出与对照相当的生殖性状。
使具有实施例1中所述的GA20氧化酶遏制构建体的转基因玉米植物和对照植物在温室中在盆中生长至生殖R1阶段，并在V8和R1阶段测量生殖性状。获得两个转化事件的转基因植物的数据(表10)。关于转基因植物与野生型对照相比的天数差异或作为差异百分比提供数据，并且显著变化为粗体。性状名称在以上实施例9和实施例10中定义。表中汇总了开花、未成熟穗、成熟穗和雄穗的性状和性状类别的具体观察结果。总体而言，转基因植物中的生殖发育几乎等同于对照植物，只有少量轻微或微小的变化。
表10.转基因植物相对于对照的温室生殖性状。
实施例14.温室条件中转基因植物和对照植物的根性状。
使具有实施例1中所述的GA20氧化酶遏制构建体的转基因植物和对照植物在温室中在蛭石培养基中生长至V3阶段或在气培设备中生长至V5阶段。提取植物并将根洗涤以进行根性状的直接或光学成像测量。与对照相比，测试4个转化事件的转基因植物。来自蛭石培养基生长的植物或在气培生长设备中的植物的测量结果分别汇总于表11和表12中。根分支点数通过植物根的成像来测量植物的根分支尖端点的数量。将根系图像骨架化以用于根长度测量。在根竖直轴周围以各种角度获取最多40个图像，并且在图像上对测量结果求平均。根总长度通过植物根系的成像来测量植物根的累积长度，如同根全部排成一行。将根系图像骨架化以用于根长度测量。在根竖直轴周围以各种角度获取最多40个图像，并且在图像上对测量结果求平均。表11和表12中的数据是转基因植物与对照相比的百分比Δ差异，其中显著变化以粗体呈现。
表11.在蛭石培养基中转基因植物相对于对照在V3的温室根性状
表12.在气培设备中转基因植物相对于对照在V5的温室根性状。
如表11和表12中所示，转基因植物在V3和V5阶段表现出植株高度的显著降低，但在这些实验中在转基因植物与对照植物之间仅观察到总体根构架的微小变化。
实施例15.利用另选启动子的转基因植物的表型观察结果。
在实施例1至实施例14中，转基因植物含有与RTBV启动子可操作地连接的GA20氧化酶遏制元件。也用与各种其他启动子可操作地连接的相同遏制元件转化玉米植物，以测试GA20氧化酶遏制元件的不同表达模式如何影响植株高度和其他表型。
在温室中，在R5生长阶段观察由用与各种启动子可操作地连接的构建体转化的外植体再生的转基因植物(R0植物)，并且在剥开以彻底干燥后观察穗。所测试的各种启动子在表13中鉴定。与不具有GA20氧化酶遏制构建体的相同育种品系的对照植物相比，针对含有不同启动子的每种构建体对多个转化事件的植物进行观察。每个构建体的转化事件的这些观察结果汇总于表13中。
表13.具有在不同启动子控制下的GA20氧化酶的miRNA遏制构建体的转基因植物的R0观察结果的汇总。
如表13中所示，与对照相比，通过观察所有所测试的启动子，具有GA20氧化酶遏制构建体的R0转基因植物不表现出任何显著的异型。即使直接在生殖穗组织中表达也不引起任何可观察到的异型。植株高度不仅对于RTBV启动子构建体(在先前的实施例中)明显降低，而且对于具有与各种组成型启动子、不同表达水平的叶启动子、一些维管启动子和具有高表达水平的一些根启动子可操作地连接的相同GA20氧化酶遏制构建体的转基因植物也明显降低。测试了与GA20氧化酶遏制构建体连接的具有组成型表达的经工程改造的启动子(C1)，并且还发现其引起矮小表型。类似地，除了维管水稻Cyp2启动子之外，发现与GA20氧化酶遏制构建体连接的具有维管表达的至少一个经工程改造的启动子(V1)引起矮小表型，但具有两个其他经工程改造的维管启动子(V2、V3)和三个经工程改造的茎启动子(S1、S2、S3)的植物不具有降低的植株高度。然而，改变在RTBV启动子控制下的GA20氧化酶遏制构建体的转录终止子序列并不改变矮小表型(在表11中未示出)。如本文所用，术语“中矮”是指植株高度的中度降低(相对于在RTBV启动子的情况下观察到的植株高度的降低)，并且“略矮”的观察意指植株高度降低的量存在略微变化。
这些结果表明，用组成型启动子表达GA20氧化酶遏制元件一致地产生矮小表型，但在用这些组成型启动子观察到的植株高度表型中存在一些可变性。同样，将表达模式从维管转化为组成型的RTBV启动子与增强子元件的组合仍然产生矮小表型(表明RTBV启动子的充分性)。包括RTBV启动子在内的几个维管启动子产生矮小表型，但若干其他经工程改造的维管启动子不产生矮小表型，这可能归因于在这些启动子下较低的表达水平。没有一个茎启动子产生矮小表型，表明GA20遏制构建体在茎中的表达不足以产生这种表型。令人惊讶地，GA20遏制构建体在叶中的表达一致地产生具有不同表达水平的矮小表型，尽管结果在某种程度上是可变的。该数据表明，在叶组织中产生活性GA有助于植物生长和最终的植株高度，即使此类竖直生长发生在植物的茎或秆中。利用各种根启动子表达GA20氧化酶遏制构建体通常不产生矮小表型，但一个根启动子确实产生中度表型，这可能是由于在地上植物组织中的附加表达。
然后使R0植物自交并使所得种子在苗圃中生长以产生纯合的近交子代植物(R1植物)。在R1发育阶段进行具有一些启动子构建体(每个构建体至少4个转化事件)的R1子代转基因植物的观察，与不具有GA20氧化酶遏制构建体的相同育种品系的对照植物进行比较。与R0植物一样，也发现用RTBV、CAMV e35S和薏苡多泛素启动子中的每一者表达GA20氧化酶遏制构建体的R1子代植物具有矮小的半矮化表型且没有观察到任何显著的异型。
实施例16.具有靶向不同GA氧化酶基因的构建体的转基因玉米植物的表型观察结果。
以上实施例证明，靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因进行遏制且可操作地连接到植物可表达的维管、组成型和/或叶启动子的表达miRNA的构建体可用于产生矮小的半矮化玉米植物。为了测试靶向不同的GA20或GA3氧化酶基因、或GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的不同部分进行遏制可如何影响植株高度，生成若干构建体并将它们转化到玉米植物中。还使用与以上实施例中相同的靶向序列制备构建体，但利用不同的miRNA骨架序列(两个来自玉米miRNA，一个来自大豆miRNA，并且一个来自棉花miRNA-以上实施例中的构建体使用水稻miRNA骨架序列)。表14提供了这些附加的遏制构建体的列表，连同在温室中对包含这些构建体的转基因R0植物的观察结果(与野生型对照植物相比)。靶向(i)GA20氧化酶_1/GA20氧化酶_2、(ii)GA20氧化酶_3/GA20氧化酶_9、(iii)GA20氧化酶_7/GA20氧化酶_8和(iv)GA20氧化酶_3/GA20氧化酶_5(具有不同的miRNA骨架)的构建体，各自编码具有与两个基因靶标互补的单个靶向序列的miRNA，而(i)单独的GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5靶向序列、(ii)单独的GA20氧化酶_4和GA20氧化酶_6靶向序列和(iii)单独的GA20氧化酶_4和GA20氧化酶_7/8靶向序列的堆叠各自被表达为具有串联排列的两个靶向序列的单个pre-miRNA，其被切割并分离成两个成熟miRNA。表14提供了miRNA靶向序列和与miRNA靶向序列互补的cDNA序列。对于GA20氧化酶_1/GA20氧化酶_2构建体，星号(*)指示miRNA的靶向序列与mRNA靶标或识别位点之间的比对长度对于GA20氧化酶_1比对于GA20氧化酶_2更短(17个核苷酸对20个核苷酸)。类似地，对于GA20氧化酶_3/GA20氧化酶_9构建体，星号(*)指示miRNA的靶向序列与mRNA靶标或识别位点之间的比对长度对于GA20氧化酶_9比对于GA20氧化酶_3更短(17个核苷酸对20个核苷酸)。对于表14中列出的每个构建体，除了表中提供的观察结果之外，未观察到显著的异型。
表14.具有靶向不同GA氧化酶基因的miRNA遏制构建体的转基因植物的R0观察结果的汇总。
表14中汇总的观察结果证明，靶向几种其他GA20氧化酶基因不产生矮小的半矮化表型。靶向(i)相关的GA20氧化酶_1和GA20氧化酶_2基因、(ii)相关的GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_9基因、(iii)相关的GA20氧化酶_7和GA20氧化酶_8基因、或(iv)单独的GA20氧化酶_9基因的构建体中没有一种在R0植物中产生可观察到的矮小的半矮化表型。相反，编码在转基因R0和R1植物中联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的单个miRNA的那些构建体确实产生矮小的半矮化表型，即使使用不同的转录终止序列或不同的miRNA骨架(测试了总共5个miRNA骨架序列)。此外，靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的不同序列仍产生半矮化植物。有趣的是，不同于联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的构建体，被设计成单独靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因中的任一者的遏制构建体不产生矮小的半矮化表型，但单独靶向GA20氧化酶_3基因的构建体确实产生植株高度的略微降低。然而，具有单独靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的遏制构建体的串联载体堆叠的转基因植物确实产生矮小的半矮化表型，类似于编码联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的单个miRNA的构建体。这些数据证明，利用靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因两者的构建体观察到矮小的半矮化表型，但利用单独靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因进行遏制未观察到完全半矮化的表型(在靶向GA20氧化酶_3的情况下高度仅略微降低，并且在靶向GA20氧化酶_5的情况下未观察到植株高度表型)。此外，如所述靶向GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8和/或GA20氧化酶_9基因未观察到植株高度表型。
除了GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因之外，在具有包含串联互补以联合靶向(i)GA20氧化酶_4和GA20氧化酶_6基因、或(ii)GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_7和GA20氧化酶_8基因的两个靶向序列(这两个靶向序列中的一者靶向GA20氧化酶_7和GA20氧化酶_8基因两者)的遏制构建体的R0转基因植物中观察到植株高度的中度降低。鉴于靶向GA20氧化酶_7和GA20氧化酶_8基因的单独构建体不产生植株高度表型，并且靶向GA20氧化酶_4和GA20氧化酶_6基因的遏制构建体产生类似于靶向GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_7和GA20氧化酶_8基因的遏制构建体的植株高度表型，据信GA20氧化酶_4基因的靶向在很大程度上(如果不是完全地)负责在这些转基因植物中观察到的植株高度表型。此外，具有靶向GA3氧化酶_1或GA3氧化酶_2基因的构建体的转基因玉米植物也表现出植株高度的降低，但该表型取决于组成型启动子存在一些可变性。因此，除了GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因之外，GA20氧化酶_4、GA3氧化酶_1和GA3氧化酶_2基因也可被靶向进行遏制以产生矮小的半矮化植物。
实施例17.具有经编辑的GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的玉米植物的表型观察结果。
除了以上遏制构建体之外，在玉米植物中的内源GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因中产生了若干基因组编辑的突变，以测试敲除这些基因中的每一者的表型效应。针对GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因中的每一者产生编码靶向构建体的一系列十个单链引导RNA(sgRNA)，其沿每个基因的基因组序列靶向不同位置。产生附加系列的十个sgRNA，其在沿每个基因的基因组序列的类似或不同位置处各自靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因两者。靶向基因组编辑通过以下方式进行：将sgRNA与Cas9蛋白的表达一起递送至玉米外植体以引起在gRNA的基因组靶标位点处或附近发生DSB或切口，该DSB或切口然后可被不完全修复以在靶标位点处或附近引入突变。随后通过RFLP分析和/或植物的测序来确认突变的存在。下表15提供了被测试的引导RNA(gRNA)构建体的列表，其可用于利用RNA引导的核酸内切酶对GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因中的一者或两者进行基因组编辑。这些引导RNA构建体通常被设计成靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的编码序列，但是一些联合靶向构建体可替代地靶向两个基因中的一者的UTR序列。这些gRNA可与合适的核酸内切酶一起使用，以在基因组中在相应gRNA的基因组靶标位点处或附近产生双链断裂(DSB)或切口，该双链断裂或切口可被不完全修复以产生突变(例如，插入、缺失、取代等)。对于经编辑的GA20氧化酶_3基因纯合或对于经编辑的GA20氧化酶_5基因纯合的转基因植物由少数几个构建体产生(参见粗体文本)。还由靶向两个基因进行编辑的构建体产生事件。对于联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的构建体，参考如括号中指示的两个基因中的一者提供编码序列(CDS)坐标。表15还示出哪些构建体产生基因编辑事件、那些事件在R0植物中是纯合的还是杂合的、以及括号中的±数字指示随突变的可能的序列变化(例如，+1意指插入1个核苷酸等等，并且更大或更复杂的Indel被标记“缺失”或“插入”)。对于GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5的堆叠靶向，突变基因的同一性也在括号中提供。与遏制构建体的结果一致，对于经编辑的GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因纯合的转基因植物不具有矮小的半矮化表型并且相对于对照植物具有正常的植株高度(参见表15中的构建体GA20氧化酶_3-D和GA20氧化酶_3-G，以及构建体GA20氧化酶_5-B和GA20氧化酶_5-G)，表明这些基因中仅一者的敲除不足以产生半矮化表型。
表15.靶向GA20氧化酶_3和GA氧化酶_5基因进行编辑的引导RNA(gRNA)。
实施例18.靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的遏制构建体降低植物中的GA20氧化酶转录物和活性GA水平。
为了确定GA20氧化酶转录物水平在具有靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的遏制构建体的转基因植物中如何受到影响，在不同的营养阶段(V3、V8和V14)从在温室中生长的转基因植物的各个部分获取全部组织，并使用测定来分析GA20氧化酶基因中的每一者的mRNA转录物水平。对于这些实验，使用来自Zymo ResearchTM的Direct-Zol RNA提取试剂盒提取总RNA，并用TurboTM DNA酶处理以减少基因组DNA污染。然后逆转录RNA以产生双链cDNA。在Bio-CFX96实时系统上用基因特异性引物和FAM标记的探针进行逆转录定量PCR。使用组织特异性标准来计算质量控制度量以确定qPCR效率和未经历逆转录的总RNA以考虑残留的基因组DNA污染。感兴趣的基因相对于标准化基因的循环阈值之间的差异确定了每种组织中每个基因转录物的相对量。使用一个(18S)或两个(18S和ELF1A)标准化基因的几何平均值来计算该相对量。
在该实验中，GA20氧化酶_3转录物的水平在这些阶段的大多数营养组织中降低，包括V3时的叶和茎组织、V8时的节间组织、以及V14时的叶和节间组织，但GA20氧化酶_3转录物的水平在V3根和V8叶中似乎是没有变化的(数据未示出)。此外，该实验的GA20氧化酶_5转录物的水平在所测试的营养组织中通常没有变化(数据未示出)，但GA20氧化酶_5转录物的表达水平在这些组织中相对较低。GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5均未在转基因植物的根组织样品中显著降低。其他GA20氧化酶基因(即，1、2、4和6-9亚型)中的每一种在转基因植物的一些组织中通常没有变化或增加。
用来自表达相同遏制构建体的转基因植物的生殖组织进行类似的实验。在不同的生殖阶段(R1和R3)从在温室中生长的转基因植物的各个部分获取全部组织，并且使用测定来分析GA20氧化酶基因中的每一者的mRNA转录物水平。在该实验中，相对于对照，GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5转录物的水平在R1叶、穗、雄穗和节间以及R3叶和节间中大部分没有变化(数据未示出)。其他GA20氧化酶基因的结果大部分是混杂的或无变动的(数据未示出)。
这些数据显示，在该实验中转基因玉米植物中的GA20氧化酶_3转录物的水平在营养阶段期间通常降低，但在后期生殖阶段相对于对照植物组织似乎大部分没有变化。尽管在这些转基因植物组织中通常观察不到GA20氧化酶_5基因转录物水平的明显降低，但该基因的表达水平相对较低。因此，用这种方法可能难以检测其表达水平的变化。此外，遏制构建体似乎对靶向GA20氧化酶基因具有特异性，因为在该实验中没有观察到任何其他GA20氧化酶基因的表达水平的一致降低。
在单独的实验中，与野生型对照相比较，在表达来自先前实施例的遏制构建体(在RTBV启动子的控制下靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因进行遏制)的转基因植物的茎组织中确定GA20氧化酶表达水平。从V3-V6茎/秆中获取组织样品，并进一步解剖那些茎的部分以分离维管和非维管组织，以确定这些组织之间的差异表达水平。使用RNA测序(RNA-Seq)方法确定转录物表达水平，以用于转基因植物组织与野生型植物组织之间的定量比较。图13A中呈现的数据由具有两个事件中的一者的转基因植物和具有两个种质中的一者的野生型对照植物生成，其中图13中的每个条分别代表两个转基因事件或种质中的一者。对于这些实验，将单独的维管束与样品的其余茎/秆组织分离并进行单独分析。如图13A所示，在整体植物茎组织(“整体”；即，不分离维管和非维管组织)、以及在来自整体茎/秆样品的分离的维管(“Vasc”)和非维管(“Non-Vasc”)组织中检测到由遏制构建体表达的miRNA。然而，miRNA的表达水平在维管组织中比在非维管组织中高得多，这表明RTBV启动子的维管表达模式。
还在类似的RNA-Seq实验中分析整体茎/秆样品以及分离的维管和非维管样品，以测量和比较转基因植物相对于野生型对照植物中GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因转录物的水平(连同其他GA20氧化酶基因)，但针对每种组织类型仅示出一个野生型样品。对于这些实验，将来自对照或转基因植物(两个事件)的秆组织如上所述切片以分离维管束和非维管组织。对每个样品的总sRNA和mRNA进行测序，并使用主成分分析对数据进行分析和比较。
如图13B所示，相对于野生型对照(WT)，GA20氧化酶_3基因的转录物水平在转基因植物(TG)的整体茎组织(Bulk)和分离的茎维管组织(Vasc)中显著降低，但在分离的非维管(Non-Vasc)组织中似乎没有变化。然而，GA20氧化酶_5基因的转录物水平在整体茎组织(Bulk)中显著降低，但在转基因植物的分离的维管(Vasc)和非维管(非Vasc)组织中相对没有变化，但是对于来自转基因植物的维管(Vasc)组织样品中的GA20氧化酶_5转录物存在下降趋势线。GA20氧化酶_5基因的表达水平低，特别是在非维管组织中。所有其他GA20氧化酶基因在所分析的转基因植物组织中未显示出其转录物水平的显著降低，但一对GA20氧化酶基因确实显示出其表达水平的略微上升趋势。该数据进一步证明，相对于对照，GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的表达水平在具有遏制构建体的转基因植物的一种或多种组织中降低至不同程度。实际上，维管组织中miRNA的更高表达和内源GA20氧化酶_3基因的更大遏制与RTBV启动子的维管表达模式一致，并且可能的情况是野生型植物的维管组织相对于非维管组织存在更高水平的GA20氧化酶_3基因表达。对于GA20氧化酶_5基因也观察到类似的模式，但不如维管与非维管组织之间的GA20氧化酶_3基因那样显著。
在转基因植物中利用GA20氧化酶遏制观察到的矮小的半矮化表型很可能是通过茎或节间组织和/或产生活性GA的植物组织中存在的活性GA水平的降低来介导的。为了确定活性GA(特别是G1、G3和G4)相对于激素的其他无活性形式的水平，在从不同发育阶段的转基因和野生型对照植物获取的不同组织样品中测量GA水平。对于这些实验，将每种组织的新鲜冷冻样品研磨并与内标一起分配到96孔玻璃管中。在4℃下使用甲醇:水:乙酸(80:19:1v/v/v)溶剂将样品萃取两次持续4小时。在氮气下使用多通道SPE从萃取物中蒸发溶剂至接近干燥。使用SPE筒进一步纯化样品。纯化之后，使用标准LC-MS/MS方法利用UPLC和triple quad 5500质谱仪器运行样品。使用内标对色谱图进行分析和定量。
利用从营养阶段植物的各种组织获取的样品进行两组实验。如表16所示，对于温室中的一个实验，在不同营养阶段的转基因植物的各种组织中观察到活性GA(GA1、GA3和GA4)水平降低。表16中的数据显示为对于给定组织每种GA激素的量具有显著变化的转基因植物的数量(“U”＝上升或增加；“D”＝下降或减少；“N”＝无变动或没有变化；并且“T”＝植物总数)。在组织样品中显示出至少部分减少的GA以粗体呈现。活性GA1在V8阶段的叶和节间组织以及V14阶段的节间组织中降低，并且活性GA4在V3茎以及V8和V14节间中降低。然而，在该实验中，活性GA3没有可观察到的减少。GA的其他非活性形式在转基因植物的各种组织中改变，如表16所示。一般来讲，在赤霉酸途径中在GA20氧化酶基因下游的GA(例如，GA9、GA20和GA34)倾向于降低，而在GA20氧化酶基因上游的GA倾向于更高(例如，GA12和GA53)，这可能是由于GA氧化酶基因的较低活性引起上游前体GA累积。该数据与这些组织中GA20氧化酶活性的遏制以及转基因植物的茎和叶中活性GA激素的较低水平一致。
在单独的实验中，在发育的营养阶段期间从各种植物组织进行GA激素的类似测量。如表17所示，对于使用从温室和田间植物获取的组织进行的实验，在V3和V8阶段的转基因植物的叶和节间中观察到一种或多种活性GA(GA1、GA3和GA4)的水平降低。用于该实验的V8阶段的叶样品从田间植物获取，与从温室中的植物获取的其他样品不同。表17中的数据以类似于如针对表16所述的方式显示。GA的其他非活性形式在转基因植物的各种组织中改变，如表17所示。类似于以上观察结果，在赤霉酸途径中在GA20氧化酶基因下游的GA(例如，GA9、GA20和GA34)倾向于降低，而在GA20氧化酶基因上游的GA倾向于更高(例如，GA12和GA53)。该数据再次与这些组织中GA20氧化酶活性的遏制以及转基因植物的茎和叶中活性GA激素的较低水平一致。
表16.温室中表达GA20氧化酶遏制构建体的转基因玉米植物的组织中GA激素水平的变化。
表17.温室(GH)中或田间表达GA20氧化酶遏制构建体的转基因玉米植物的组织中GA激素水平的变化。
在转基因玉米植物中GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的遏制降低了包括茎、节间、维管组织和叶的各种组织中靶向GA氧化酶转录物的水平，并且这些GA20氧化酶基因的遏制还与包括茎和节间的转基因植物组织中活性GA水平的降低相关联，这些活性GA是在营养阶段期间影响植物生长以及直到后期营养和生殖阶段的最终植株高度的作用位点。类似于GA20氧化酶转录物水平在生殖阶段组织中大部分没有变化或为混杂的观察结果，包括活性GA的GA激素的水平在生殖阶段组织中也大部分没有变化或为混杂的(数据未示出)。
已经详细描述了本公开，显而易见的是，在不脱离本文和所附权利要求中描述的本公开的精神和范围的情况下，修改、变化和等效实施方案是可能的。此外，应当理解，本公开中的所有实施例均作为非限制性实施例提供。

Claims (121)

1.一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:30、33或173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一，并且其中所述可转录DNA序列可操作地连接到植物可表达启动子。
2.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、171或172的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
3.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是维管启动子。
4.如权利要求3所述的重组DNA构建体，其中所述维管启动子包括以下各项中的一项：蔗糖合酶启动子、蔗糖转运蛋白启动子、Sh1启动子、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)启动子、小麦矮化双生病毒(WDV)大基因间区域(LIR)启动子、玉蜀黍条斑双生病毒(MSV)外壳蛋白(CP)启动子、水稻类黄色条纹1(YS1)启动子、或水稻黄色条纹2(OsYSL2)启动子。
5.如权利要求3所述的重组DNA构建体，其中所述维管启动子包含与SEQ ID NO:67、SEQID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71中的一者或多者、或其功能部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的DNA序列。
6.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是RTBV启动子。
7.如权利要求6所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子包含与SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:66中的一者或多者、或其功能部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的DNA序列。
8.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是叶启动子。
9.如权利要求8所述的重组DNA构建体，其中所述叶启动子包括以下各项中的一项：RuBisCO启动子、PPDK启动子、FDA启动子、Nadh-Gogat启动子、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子、或Myb基因启动子。
10.如权利要求8所述的重组DNA构建体，其中所述叶启动子包含与SEQ ID NO:72、SEQID NO:73或SEQ ID NO:74中的一者或多者、或其功能部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的DNA序列。
11.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述植物可表达启动子是组成型启动子。
12.如权利要求11所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子选自由以下组成的组：肌动蛋白启动子、CaMV 35S或19S启动子、植物泛素启动子、植物Gos2启动子、FMV启动子、CMV启动子、MMV启动子、PCLSV启动子、Emu启动子、微管蛋白启动子、胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子、或玉蜀黍醇脱氢酶，或其功能部分。
13.如权利要求11所述的重组DNA构建体，其中所述组成型启动子包含与SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:83中的一者或多者、或其功能部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的DNA序列。
14.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中由所述可转录DNA序列编码的所述非编码RNA分子是在植物细胞中被加工或切割以形成成熟miRNA或siRNA的前体miRNA或siRNA。
15.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQ ID NO:30至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。
16.如权利要求15所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:28或29的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
17.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQ ID NO:33至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。
18.如权利要求17所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:31或32的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
19.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA3氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述内源GA3氧化酶蛋白与SEQ ID NO:173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。
20.如权利要求19所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:171或172的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。
21.一种转化载体，其包含如权利要求1所述的重组DNA构建体。
22.一种转基因谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含如权利要求1所述的重组DNA构建体。
23.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物相对于对照植物具有以下性状中的一者或多者：较矮的植株高度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量和/或增加的多产性。
24.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物具有较矮的植株高度和/或改善的抗倒伏性。
25.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的高度比野生型对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
26.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物在一个或多个茎节间处的秆或茎直径比野生型对照植物在相同的一个或多个节间处的秆或茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
27.如权利要求22中的任一项所述的转基因谷类植物，其中所述转基因谷类植物是玉米植物，并且其中所述转基因玉米植物在穗下方第一节间、第二节间、第三节间和/或第四节间中的一者或多者处的秆或茎直径比野生型对照植物的相同节间大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
28.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物的相同节间组织。
29.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物的茎或秆的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比野生型对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
30.如权利要求22所述的转基因谷类植物，其中所述转基因植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著的异型。
31.一种转基因玉米植物、植物部分或植物细胞，其包含如权利要求1所述的重组DNA构建体。
32.一种用于产生转基因谷类植物的方法，其包括：(a)用如权利要求1所述的重组DNA构建体转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所转化的外植体再生或发育所述转基因谷类植物。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述谷类植物通过土壤杆菌介导的转化或粒子轰击进行转化。
34.一种重组DNA构建体，其包含编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其中所述非编码RNA分子包含第一靶向序列和第二靶向序列，其中所述第一靶向序列和所述第二靶向序列各自与编码单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的内源GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补，所述内源GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:30、33和173中的一者或多者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。
35.如权利要求34所述的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子的所述第一靶向序列和所述第二靶向序列各自与SEQ ID NO:28、29、31、32、171和172中的一者或多者的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补。
36.一种玉米或谷类植物，其包含通过诱变技术引入的在内源GA3氧化酶基因处或附近的突变，其中所述内源GA3氧化酶基因的表达水平在所述玉米或谷类植物中降低或消除，并且其中所述玉米或谷类植物相对于野生型对照植物具有较矮的植株高度。
37.如权利要求36所述的玉米或谷类植物，其中包含所述突变的所述玉米或谷类植物相对于所述对照植物具有以下附加性状中的一者或多者：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量和增加的多产性。
38.如权利要求36所述的玉米或谷类植物，其中所述玉米或谷类植物的所述高度比所述对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
39.如权利要求36所述的玉米或谷类植物，其中所述玉米或谷类植物在一个或多个茎节间处的秆或茎直径比所述对照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
40.如权利要求36所述的玉米或谷类植物，其中所述玉米或谷类植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于所述对照植物的相同节间组织。
41.一种玉米或谷类植物，其包含经由靶向基因组编辑技术在内源GA3氧化酶基因的基因座处或附近引入的基因组编辑，其中所述内源GA3氧化酶基因的表达水平在所述玉米或谷类植物中相对于对照植物降低或消除，并且其中所述经编辑的玉米或谷类植物相对于所述对照植物具有较矮的植株高度。
42.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物相对于所述对照植物具有以下附加性状中的一者或多者：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量和增加的多产性。
43.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物的所述高度比所述对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
44.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物在一个或多个茎节间处的所述秆或茎直径比所述对照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
45.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于所述对照植物的相同节间组织。
46.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比所述对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
47.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经编辑的植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著的异型。
48.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述基因组编辑是使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA引导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶引入的。
49.如权利要求41所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述基因组编辑包括相对于所述对照植物中的所述内源GA3氧化酶基因的序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入或倒位。
50.一种组合物，其包含引导RNA，其中所述引导RNA包含与玉米或谷类植物的内源GA3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补的引导序列。
51.如权利要求50所述的组合物，其中所述引导RNA分子包含与SEQ ID NO:36、37、168、169或170、或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的引导序列。
52.如权利要求50所述的组合物，其中所述引导RNA分子包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、171或172、或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的引导序列。
53.如权利要求50所述的组合物，还包含RNA引导的核酸内切酶。
54.如权利要求53所述的组合物，其中所述RNA引导的核酸内切酶在所述引导RNA分子的存在下在所述玉米或谷类植物的基因组中的所述靶DNA序列处或附近导致双链断裂或切口。
55.如权利要求50所述的组合物，还包含重组DNA供体模板，所述重组DNA供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶DNA序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列是所述玉米或谷类植物的所述内源GA3氧化酶基因的所述基因组基因座处或附近的基因组序列。
56.一种重组DNA构建体，其包含编码非编码引导RNA分子的可转录DNA序列，其中所述引导RNA分子包含与玉米或谷类植物的内源GA3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的引导序列。
57.如权利要求56所述的重组DNA构建体，其中所述引导RNA包含与SEQ ID NO:36、37、168、169或170、或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的引导序列。
58.如权利要求56所述的重组DNA构建体，其中所述引导RNA分子包含与SEQ ID NO:28、29、31、32、171或172、或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的引导序列。
59.如权利要求56所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列可操作地连接到植物可表达启动子。
60.如权利要求56所述的重组DNA构建体，其中所述引导RNA分子是CRISPR RNA(crRNA)或单链引导RNA(sgRNA)。
61.如权利要求56所述的重组DNA构建体，其中所述引导RNA包含与所述谷类植物的基因组中存在的紧邻所述内源GA3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的所述靶DNA序列的原间隔序列邻近基序(PAM)序列互补的序列。
62.如权利要求56所述的重组DNA构建体，其中所述内源GA3氧化酶基因编码与SEQ IDNO:30、33或173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的蛋白质。
63.一种DNA分子或载体，其包含如权利要求56所述的重组DNA构建体。
64.一种细菌或宿主细胞，其包含如权利要求56所述的重组DNA构建体。
65.一种玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含如权利要求56所述的重组DNA构建体。
66.一种组合物，其包含如权利要求56所述的重组DNA构建体，其中所述组合物还包含RNA引导的核酸内切酶。
67.一种组合物，其包含如权利要求56所述的重组DNA构建体，其中所述组合物还包含第二重组DNA构建体，所述第二重组DNA构建体包含编码RNA引导的核酸内切酶的第二可转录DNA序列。
68.如权利要求67所述的组合物，包含含有所述重组DNA构建体和所述第二重组DNA构建体的DNA分子或载体。
69.一种组合物，其包含第一DNA分子或载体和第二DNA分子或载体，其中所述第一DNA分子或载体包含编码靶向玉米或谷类植物的内源GA3氧化酶基因的引导RNA分子的重组DNA构建体，并且所述第二DNA分子或载体包含编码RNA引导的核酸内切酶的第二重组DNA构建体。
70.如权利要求50、66或69所述的组合物，还包含重组DNA供体模板，所述重组DNA供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶DNA序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列是玉米或谷类植物的内源GA3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
71.一种重组DNA供体模板，其包含至少一个同源序列，其中所述至少一个同源序列与靶DNA序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列是玉米或谷类植物的内源GA3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
72.如权利要求71所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列相对于所述内源GA3氧化酶基因的所述基因组基因座处或附近的所述靶DNA序列的互补链包含至少一个突变。
73.如权利要求71所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列与SEQ ID NO:36、37、168、169或170、或其互补序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
74.如权利要求71所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列与SEQ ID NO:28、29、31、32、171或172、或其互补序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
75.一种重组DNA供体模板，其包含两个同源臂，所述两个同源臂包括第一同源臂和第二同源臂，其中所述第一同源臂包含与第一侧接DNA序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，其中所述第二同源臂包含与第二侧接DNA序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，并且其中所述第一侧接DNA序列和所述第二侧接DNA序列是玉米或谷类植物的内源GA3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
76.如权利要求75所述的重组DNA供体模板，还包含位于所述第一同源臂与所述第二同源臂之间的插入序列。
77.如权利要求75所述的重组DNA供体模板，其中每个同源臂与SEQ ID NO:36、37、168、169或170、或其互补序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
78.如权利要求75所述的重组DNA供体模板，其中每个同源臂与SEQ ID NO:28、29、31、32、171或172、或其互补序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
79.一种玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含如权利要求75所述的重组DNA供体模板。
80.一种经工程改造的位点特异性核酸酶，其与玉米或谷类植物的内源GA3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶标位点结合并在所述靶标位点处导致双链断裂或切口。
81.如权利要求80所述的经工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是大范围核酸酶或归巢核酸内切酶。
82.如权利要求80所述的经工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是包含DNA结合结构域和切割结构域的锌指核酸酶(ZFN)。
83.如权利要求80所述的经工程改造的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是包含DNA结合结构域和切割结构域的转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。
84.如权利要求80所述的经工程改造的位点特异性核酸酶，其中由所述位点特异性核酸酶结合的所述靶标位点与SEQ ID NO:36、37、168、169或170、或其互补序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
85.如权利要求80所述的经工程改造的位点特异性核酸酶，其中由所述位点特异性核酸酶结合的所述靶标位点与SEQ ID NO:28、29、31、32、171或172、或其互补序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
86.一种重组DNA构建体，其包含编码位点特异性核酸酶的转基因，其中所述位点特异性核酸酶与单子叶植物或谷类植物的内源GA3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶标位点结合并在所述靶标位点处导致双链断裂或切口。
87.如权利要求86所述的重组DNA构建体，其中所述转基因可操作地连接到植物可表达启动子。
88.如权利要求86所述的重组DNA构建体，其中所述位点特异性核酸酶是大范围核酸酶或归巢核酸内切酶、锌指核酸酶、或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。
89.一种玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含如权利要求86所述的重组DNA构建体。
90.一种重组DNA供体模板，其包含至少一个同源臂和插入序列，其中所述至少一个同源臂与玉米或谷类植物的基因组DNA序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，并且其中所述插入序列包含含有编码非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体，其中所述非编码RNA分子靶向单子叶植物或谷类植物或植物细胞中的一种或多种内源GA3氧化酶基因进行遏制，并且其中所述可转录DNA序列可操作地连接到植物可表达启动子。
91.如权利要求90所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源臂包含两个同源臂，所述两个同源臂包括第一同源臂和第二同源臂，
其中所述第一同源臂包含与第一侧接DNA序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，并且所述第二同源臂包含与第二侧接DNA序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的序列，
其中所述第一侧接DNA序列和所述第二侧接DNA序列是单子叶植物或谷类植物的相同基因组基因座处或附近的基因组序列，并且其中所述插入序列位于所述第一同源臂与所述第二同源臂之间并且包含含有编码非编码RNA分子的可转录DNA序列的重组DNA构建体。
92.如权利要求90所述的重组DNA供体模板，其中所述可转录DNA序列可操作地连接到植物可表达启动子。
93.如权利要求90所述的重组DNA供体模板，其中所述非编码RNA分子包含与编码GA氧化酶蛋白的mRNA分子的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，所述GA氧化酶蛋白与SEQ ID NO:30、33或173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。
94.一种转基因玉米或谷类植物、植物部分或植物细胞，其包含如权利要求90所述的重组DNA供体模板的插入序列。
95.一种用于产生转基因玉米或谷类植物的方法，其包括：(a)用如权利要求94所述的重组DNA供体模板转化外植体的至少一个细胞，以及(b)由所转化的外植体再生或发育所述转基因玉米或谷类植物，其中所述转基因玉米或谷类植物包含所述重组DNA供体模板的插入序列。
96.一种用于产生在内源GA3氧化酶基因处或附近具有基因组编辑的玉米或谷类植物的方法，其包括：
(a)向所述玉米或谷类植物的外植体的至少一个细胞中引入位点特异性核酸酶或包含编码所述位点特异性核酸酶的转基因的重组DNA分子，其中所述位点特异性核酸酶与所述内源GA3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶标位点结合并在所述靶标位点处导致双链断裂或切口，以及
(b)由所述至少一个外植体细胞再生或发育经编辑的玉米或谷类植物，所述至少一个外植体细胞在所述经编辑的玉米或谷类植物的所述内源GA3氧化酶基因处或附近包含所述基因组编辑。
97.如权利要求96所述的方法，其中所述引入步骤(a)还包括引入非编码引导RNA分子或包含编码非编码引导RNA分子的可转录DNA序列的第二重组DNA构建体，其中所述引导RNA分子包含与玉米或谷类植物的内源GA3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的引导序列。
98.如权利要求96所述的方法，其中所述引入步骤(a)还包括引入包含至少一个同源序列或同源臂的DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列或同源臂与靶DNA序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述靶DNA序列是所述玉米或谷类植物的所述内源GA3氧化酶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列。
99.如权利要求96所述的方法，还包括：
(c)选择所述经编辑的玉米或谷类植物。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述选择步骤(c)包括使用分子测定来确定所述内源GA3氧化酶基因基因座是否被编辑。
101.如权利要求99所述的方法，其中所述选择步骤(c)包括通过观察植物表型来确定所述内源GA3氧化酶基因是否被编辑。
102.一种经修饰的玉米植物，其具有小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植株高度，以及(i)大于18mm、大于18.5mm、大于19mm、大于19.5mm、大于20mm、大于20.5mm、大于21mm、大于21.5mm、或大于22mm的平均茎或秆直径，(ii)相对于野生型对照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相对于野生型对照植物改善的耐旱性。
103.如权利要求102所述的经修饰的玉米植物，其中所述玉米植物相对于野生型对照植物具有以下性状中的一者或多者：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量和/或增加的多产性。
104.如权利要求102所述的经修饰的玉米植物，其中所述玉米植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物的相同节间组织。
105.一种经修饰的谷类植物，其具有相对于野生型对照植物降低的植株高度，以及(i)相对于野生型对照植物增加的茎或秆直径，(ii)相对于野生型对照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相对于野生型对照植物改善的耐旱性。
106.如权利要求105所述的经修饰的谷类植物，其中所述谷类植物的茎或秆中的一种或多种活性GA的水平低于野生型对照植物。
107.一种经修饰的玉米或谷类植物，其包含内源GA3氧化酶基因的突变等位基因，其中所述经修饰的玉米或谷类植物相对于对照植物具有较矮的植株高度。
108.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物对于所述内源GA3氧化酶基因的所述突变等位基因是纯合的。
109.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物包含所述内源GA3氧化酶基因的两个不相同的突变等位基因。
110.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物对于所述内源GA3氧化酶基因的所述突变等位基因是杂合的。
111.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述内源GA3氧化酶基因的所述突变等位基因包含通过诱变技术引入的所述内源GA3氧化酶基因中的一个或多个突变。
112.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述内源GA3氧化酶基因的所述突变等位基因包含通过靶向基因组编辑技术引入的所述内源GA3氧化酶基因中的一个或多个编辑或突变。
113.如权利要求112所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述一个或多个编辑或突变是使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA引导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶引入的。
114.如权利要求107所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述突变等位基因包括相对于所述对照植物中的所述内源GA3氧化酶基因的序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入或倒位。
115.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中相对于对照植物，所述玉米或谷类植物中所述内源GA3氧化酶基因的所述突变等位基因的活性和/或表达水平被降低或消除。
116.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物相对于所述对照植物具有以下附加性状中的一者或多者：增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层郁闭、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下叶中减少的花青素含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量和增加的多产性。
117.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物的所述高度比所述对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
118.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物在一个或多个茎节间处的秆或茎直径比所述对照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
119.如权利要求107所述的经修饰的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于所述对照植物的相同节间组织。
120.如权利要求107所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的所述植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比所述对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
121.如权利要求107所述的经编辑的玉米或谷类植物，其中所述经修饰的植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著的异型。
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